CH628682A5 - Diagnostisches mittel zum testen der suszeptibilitaet von bakterien gegenueber die bildung von folsaeure hemmenden mitteln. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel, insbeson- stark die Einschätzung des Bakterienwuchses nach der Inkuba-dere ein Kulturmedium zum Testen der Suszeptibilität von Bäk- tion stört. So setzt beispielsweise bei flüssigen Medien die stär-terien gegenüber antimikrobiellen, die Folsäurebildung hem- so kere Färbung die Transparenz des Mediums herab, und macht menden Mitteln, wie beispielsweise Sulfamethoxazol (SMX) optische Dichtemessungen wesentlich ungenauer. Bei festen und/oder Trimethoprim (TMP). Medien resultiert eine Abnahme des Kontrast des Agar-Agar,

Seit einer Reihe von Jahren ist es bekannt, dass Kulturme- wodurch die genaue Messung der Hemmzonengrössen dien im allgemeinen oft ungeeignet zur Bestimmung der Emp- erschwert wird und ebenso die Bestimmung, ob ein partielles findlichkeit von Bakterien gegenüber Sulfonamiden oder Tri- 55 Wachstum innerhalb der Hemmzonen vorliegt oder nicht. Dar-hiethoprim sind, d. h. Mitteln, welche die Synthese der Folsäure überhinaus bedeutet die erforderliche Zugabe von lysiertem in diesen Organismen stören. Pferdeblut zu dem Bakterienkulturmedium, dass es eigentlich

Diese Ungeeignetheit zeigt sich in «langschwänzigen» End- unmöglich ist, die Medien zu definieren, eine etwas uner-punkten, wenn die Serien-Verdünnungsmethode angewendet wünschte Eigenschaft. Ein weiterer Nachteil bei der Verwen-wird oder durch partielles Wachstum innerhalb der Hemmzo- 60 dung von Pferdeblut ist der, dass dieses nur in sehr begrenzten nen, sobald die Diffusionsmethode angewendet wird. Von Mengen im Handel erhältlich ist und es in der ganzen Welt nur

Bushby (Med. J. Aust. Special Supplement (1973) Band 1 : S. 10) sehr wenige Lieferanten gibt.

und Koch and Burchall (Applied Microbiology (1971) Aus- Kürzlich hat sich herausgestellt, dass die Zugabe des isolier-

gabe 22: S. 812) wurde festgestellt, dass Thymidin ein sehr star- ten und gereinigten Enzyms Thymidinphosphorylase bakteriel-ker Antagonist gegen die hemmenden Wirkungen der Sulfona- 65 len Ursprungs zu einer grossen Anzahl häufig verwendeter mide und des Trimethoprims ist. Nährmedien diese zum Testen der Suszeptibilität von Bakte-

1945 zeigten Harper und Cawston ( J. Path. Bact., Ausgabe rien auf Substanzen, welche die Folsäurebildung verhindern, 57, Seite 59), dass durch Zugabe von lysiertem Pferdeblut zu verbessert.

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Demgemäss ist das erfindungsgemässe diagnostische Mit- Die Überwachung der Elutionen auf Enzymaktivität in tel zum Testen der Suszeptibilität von Bakterien gegenüber allen Stufen des Reinigungsverfahrens kann für gewöhnlich Mitteln, welche die Folsäurebildung hemmen, dadurch gekenn- mittels spektrofotometrischen Messungen bei einer ausgewählzeichnet, dass es ein Nährmedium für Bakterien zusammen mit ten Wellenlänge durchgeführt werden.

gereinigter Thymidinphosphorylase bakteriellen Ursprungs s Das so gereinigte Enzym lässt sich für gewöhnlich als aufweist. — Suspension in wässriger Ammoniumsulfatlösung gewinnen.

Die Zugabe des Enzyms Thymidinphosphorylase verbes- Das Enzym liegt auch in mehreren Wirbeltiergeweben vor und sert viele Nährmedien zum Testen der Suszeptibilität von Bäk- kann daraus gereinigt werden, jedoch sind die Mengenverhält-

terien auf Stoffe, welche die Folsäurebildung hemmen, wie bei- nisse in tierischem Gewebe im allgemeinen wesentlich niedri-

spielsweise Sulfamethoxazol und Trimethoprim. Diese Nähr- 10 ger als in Bakterien. Darüberhinaus ist die gereinigte Thymidin-

medien sind beispielsweise «Mueller-Hinton Broth» und Phosphorylase aus Mikroben wesentlich aktiver als das gerei-

«-Agar», «Oxoid Sensitivity Test Broth» und «-Agar», «Wellco- nigte Pendent aus Säugetieren.

test Sensitivity Test» «-Agar», «Brain Heart Infusion Broth» Es hat sich herausgestellt, dass tatsächlich Pferdeblut unge-

und «-Agar» und «Typtone Soya Agar». fähr 40 bis 100 Einheiten Thymidinphosphorylase-Aktivität

Vorläufig wurde die Thymidinphosphorylase aus Bakterien is (wie bereits definiert) pro ml aufweist. Der Gehalt des mit gereinigt gewonnen, wie beispielsweise aus den Stämmen Sai- Ultraschall behandelten Präparates aus E. coli aus der weiter monelle typhimurium, Bacillus cereus, Bacillus stearothermo- unten beschriebenen Thymidinphosphorylase-Reinigung ist philus & Haemophilus influenzae, insbesondere aber aus einem jedoch 1000 mal grösser. Es erweist sich somit, dass die Vor-

Stamm von Escherichia coli, welcher Thymin und Methionin teile eines wirtschaftlichen Verfahrens zur Herstellung des zum Wachstum benötigt. Die letztere Reinigung umfasst einen 20 gereinigten Enzyms aus einem bakteriellen Ausgangsstoff

äusserst langwierigen Prozess, der sich aus einem Ausfällver- umfangreich und von Bedeutung sind. In diesem Fall liegt nicht fahren, einer Fraktionierung, verschiedenen chromatografi- nur ein wesentlich einfacher erhältlicher, billiger Ausgangsstoff sehen Stufen und einer Dialyse zusammensetzt (Schwartz, M. für das Enzym vor, sondern es ist auch das Verfahren zum

1971, Eur. J. Biochem. 21 : Seiten 191 bis 198). Die aus diesem Extrahieren und Reinigen bedeutend wirtschaftlicher.

Verfahren erhaltene Enzymzubereitung war jedoch nur 25 x 25 Die Konzentration der Thymidinphosphorylase, welche in reiner als der rohe Zellextrakt. das Medium eingearbeitet werden soll, liegt vorzugsweise bei

Kürzlich hat es sich nun herausgestellt, dass gewisse Bakte- ungefähr 2 bis 200 Einheiten Enzymaktivität/ml Medium, besser rienstämme, besonders ein bestimmter Stamm von E. coli, aus- noch zwischen 5 und 100 Einheiten/ml Medium und am bevor-

sergewöhnliche Mengen Thymidinphosphorylase bei entspre- zugtesten zwischen 7 und 50 Einheiten/ml Medium. Eine Ein-

chenden Wachstumsbedingungen produzieren und dass dieses 30 heit Enzymaktivität des gereinigten Enzyms bedeutet die

Enzym isoliert und dadurch gereinigt werden kann, dass der Menge Enzym, welche die Bildung eines Nanomols Thymin/

Zellextrakt auf spezifische Adsorbention aufgebracht wird und Minute aus einer millimolaren Lösung Thymidin bei 25 °C in daraus eluiert wird. Dabei resultiert eine wesentlich höhere Gegenwart eines 200 mM Kaliumphosphatpuffers bei einem

Ausbeute einer sehr viel reineren Zubereitung, als bisher erzielt pH von 7,4 katalysiert.

werden konnte. Darüberhinaus ist dieses neue Isolierungs/Rei- 35 Die Medien, welchen die gereinigte Thymidinphosphory-

nigungsverfahren auch für die grosstechnische Herstellung des läse zugesetzt worden ist, können zum Testen der Suszeptibili-

Enzyms geeignet. tät der nachfolgend genannten Organismen gegenüber Sub-

Für die Erzeugung von Thymidinphosphorylase eignet sich stanzen, welche die Folsäurebildung hemmen, verwendet wer-

besonders gut der Stamm Escherichia coli B-96 (ATCC13473), den: Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Vibrio der am 28. April 1959 bei der American Type Culture Collée- 40 comma, Erysipelothrix rhusiopathiae, Serratia marcescens,

tion (ATCC) hinterlegt wurde und seither der Öffentlichkeit Klebsiella pneumoniae, Kleb, aerogenes, Sai. typhosa, E. coli,

zugänglich ist. Salmonella typhimurium LT-2 (ATCC 15277) ist Shigella flexneri, Shig. dysenteriae, Enterobacter aerogenes,

ein Beispiel für einen weiteren Bakterienstamm, der grosse Entero. cloacae, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Pr. mira-

Mengen Thymidinphosphorylase produziert und sich ebenfalls biles, Pr. rettgeri und Pseudomonas aeruginosa. Strep. faecalis für die Durchführung der vorliegenden Erfindung eignet. In 45 ist eine einzelne Ausnahme, weil bei diesem Organismus das gewissen Fällen, bei denen ein thermostabileres Enzym Thymin ebenso wirksam ist wie das Thymidin und tatsächlich erwünscht ist, hat sich das aus dem Stamm B. stearothermophi- der Wirkung der Hemmer der Folsäurereduktase, beispiels-

lus isolierte Enzym als besonders wirksam erwiesen. weise dem Trimethoprim, entgegenwirkt.

Der Stamm E. coli ATCC 13473 kann in einem Medium mit Das gereinigte Enzym kann dem gewünschten Medium einem minimalen Salzgehalt gezüchtet werden, welches eine 50 während jeder geeigneten Herstellungsstufe zugesetzt werden,

geeignete Kohlenstoffquelle und zusätzliche Purine enthält. so kann es beispielsweise aseptisch als sterile Lösung nach dem

Andererseits kann das Bakterium auch in einem Hefeextrakt- Autoklavieren des Mediums und sobald die Temperatur auf medium gezüchtet werden. Ein roher Enzymextrakt kann ungefähr 50 bis 55 °C gesunken ist, zugesetzt werden. Nach der sodann durch die Ultraschallbehandlung der Bakterienzellen in Zugabe des Enzyms sollte das Medium so schnell als möglich einem Phosphatpuffer hergestellt werden, gefolgt von einer 55 weiterverarbeitet werden, so dass das enzymbehandelte

Zentrifugierung, um die Zellrückstände zu entfernen. Medium nicht länger als 5 bis 10 Minuten bei 50 bis 55 °C gehal-

Der rohe Extrakt wird beispielsweise mit einer kleinen ten wird, um eine Inaktivierung des Enzyms zu vermeiden.

Menge Calciumphosphatgel versetzt und sodann zentrifugiert, Die Herstellung des erfindungsgemässen diagnostischen um unerwünschtes Protein zu entfernen. Die so erhaltene über- Mittels geschieht in der Weise, dass man eine gereinigte Zube-

stehende Flüssigkeit kann sodann mit einer weiteren aliquoten eo reitung der Thymidinphosphorylase bakteriellen Ursprungs

Menge Calciumphosphatgel vermischt werden, wobei das mit einem Nährmedium für Bakterien vermischt.

Enzym darauf absorbiert wird. Die Enzymaktivität kann aus Ein besonderer Vorteil des so hergestellten Kulturmediums dem Gel durch aufeinanderfolgende Waschungen mit Phos- ist der, dass es nur schwach gefärbt und durchsichtig ist, was die phatpuffer eluiert werden. Das Enzym kann sodann auf DEAE- genaue Feststellung des Bakterienwuchses und somit die

Cellulose adsorbiert werden, ausgewaschen und daraus eluiert 65 Bestimmung der bakteriellen Empfindlichkeit gegenüber Stof-

werden. Nach der Dialyse kann die Zubereitung auf fen, welche die Folsäurebildung hemmen, erleichtert.

ECTEOLA-Cellulose adsorbiert und daraus ebenfalls eluiert Mit besonderem Vorteil wird eine stabilisierte Thymidin-

werden. phosphorylase-Zubereitung, welche Ammoniumsulfat enthält,

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verwendet. Diese Zubereitung mit erhöhter Stabilität kann z. B. Die Enzymaktivität wurde aus der Gelplatte durch zwei eine Suspension des Enzyms in einer Ammoniumsulfatlösung aufeinanderfolgende Waschungen eluiert; die erste Waschung sein. erfolgte mit 100 ml 10 mM Kaliumphosphatpuffer mit pH 8,0

Es ist bereits seit längerem bekannt, dass die Thymidinphos- und die zweite mit 100 ml 20 mM Kaliumphosphatpuffer mit phorylase bakteriellen Ursprungs bei -20 °C stabil ist, dass ihre 5 pH 8,0. Die beiden Waschflüssigkeiten wurden vereinigt (Stufe Aktivität jedoch bei 4 °C äusserst rasch abnimmt. Es hat sich II).

nun gezeigt, dass es gelingt, die Stabilität der Zubereitungen Der restliche Vorgang wurde bei 25 °C durchgeführt. Die des gereinigten Enzyms gegenüber der Zersetzung ausseror- vereinigten Waschflüssigkeiten wurden in eine DEAE-Cellulo-dentlich stark zu erhöhen, wenn man der Zubereitung Ammoni- sesäule mit einem Durchmesser von 1,8 cm und einer Höhe von umsulfat zusetzt, vorausgesetzt, dass der Proteingehalt der io 6 cm gegeben, welche vorher mit einer 20 mM Kaliumphos-Zubereitungen mindestens 5 mg Protein/ml ist. phatlösung und einem pH von 6,4 (Puffer B) ausgeglichen wor-

Der Proteingehalt muss nicht unbedingt vollständig von den war. Die beladene Säule wurde mit 100 ml Puffer B ausge-dem Enzym stammen. Konzentrierte Enzymlösungen (5 mg waschen und das Enzym sodann mit einem Phosphatpuffer mit Protein/ml oder mehr) in einem Phosphatpuffer, welche bei- linearem Verdünnungsgrad eluiert. Dieser Verdünnungsgrad spielsweise 10% Ammoniumsulfat enthalten, können ohne oder is wurde derart hergestellt, dass man unter sorgfältigem Mischen mit nur geringem Aktivitätsverlust über längere Zeit aufbe- 200 ml eines 200 mM Kaliumphosphatpuffers mit pH 6,4 in eine wahrt werden. So können auch stabile Suspensionen der Thy- Mischkammer gibt, welche ursprünglich mit 200 ml Puffer B midinphosphorylase in wässriger Ammoniumsulfatlösung her- gefüllt war, und zwar in einer Geschwindigkeit, dass in der gestellt werden. Mischkammer ein konstantes Volumen aufrechterhalten wird.

Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung sind 20 Die Fraktionen mit der höchsten Enzymaktivität wurden vernachfolgend anhand der Beispiele noch näher beschrieben. einigt (Stufe III) und unter Verwendung einer Cellulose-Dialy-

satorröhre (Durchmesser: 0,6 cm) gegen 21 Wasser eine Stunde Thymidinphosphorylase-Reinigung lang dialysiert. Die Dialyse wurde wiederholt und das Dialysat

E. Coli B-96 (ATCC 13473) wurde bei 34 °C in belüfteten in eine «ECTEOLA-»Cellulosesäule (1,8x5 cm), welche zuvor Gefässen in einem Medium mit minimalem Salzgehalt gezüch- 25 mit Puffer A ausgeglichen worden war, eingefüllt. Die beladene tet, welches 18,9 g/1 NazHPCk, 6,3 g/1 KH2PO4,0,2 g/1 Säule wurde sodann mit 100 ml Puffer A ausgewaschen. Das

MgSCUHJHïO, 2,0 g/1 (NH4)2SC>4,0,5 g/1 Adenosin und 8,0 g/1 Enzym wurde daraufhin mit einem linear verdünnten Eluie-Casaminosäuren enthielt. Die Zellen wurden durch Zentrifugie- rungsmittel, welches wie oben beschrieben unter Verwendung ren dann geerntet, sobald die optische Dichte der Kultur bei eines Mischbehälters hergestellt worden war, der anfänglich 600 nm ohne Verdünnen 2,0 betrug. Die nachfolgenden Vor- 30 mit 200 ml Puffer A gefüllt ist, und durch den 200 ml mM Kaligänge wurden bei 3 °C ausgeführt, sofern nichts anderes ver- umphosphatpuffer durch die Schwerkraft absinken, in der die merkt ist 25 g der Zellmasse wurdeinder zweifachen Lösung in der Säule fortschreitet, eluiert. Die Fraktionen mit

Gewichtsmenge eines 5 mM Kaliumphosphatpuffers mit einem Enzymaktivität wurden zusammengegeben (Stufe IV) und mit pH-Wert von 8,0 (Puffer A) suspendiert. Gleiche Mengen von 5 genügend Ammoniumsulfat versetzt, so dass eine Suspension ml der Zellsuspension wurden mit Ultraschall behandelt und 35 des Enzyms in einer 80%igen Ammoniumsulfatlösung resul-zwar jeweils 2x 12 Sekunden lang mit einem Abkühlungsinter- tierte. Als Ergebnis der gesamten Prozedur resultierte ein vali von 50 Sekunden. Dazu wurde ein «Branson Model 5125 1 OOfaches Ansteigen der spezifischen Aktivität hinsichtlich des Sonic Oscillator» auf der Stufe sechs verwendet. Die mit Ultra- Proteins und das vollständige Entfernen der Nukleinsäuren, schall behandelten Suspensionen wurden zusammengegeben Die Thymidinphosphorylaseaktivität wurde spektrofoto-

und 20 Minuten lang bei 48 000 g zentrifugiert. Zu der überste- 40 metrisch geprüft, indem die Abnahme der Absorbenz bei 290 henden Flüssigkeit (Stufe I - siehe Tabelle I unten) wurden nm begleitet von der Phosphorolyse des Thymidins zum Thy-

langsam 25 ml Calciumphosphatgelsuspension (31 mg trocke- min gemessen wurde. Bei 290 nm und einem pH von 7,4 hat das ner Feststoff/ml, bei 3 °C 5 Monate lang gealtert) langsam hin- Thymidin einen höheren Extinktionskoeffizienten als Thymin zugefügt Die resultierende Suspension wurde 10 Minutenlang (Ae = -480M—'cm—'). Das Versuchsgemisch enthielt 200 mM gerührt und sodann bei 12 000 g 5 Minuten lang zentrifugiert. 45 Kaliumphosphatpuffer mit einem pH von 7,4 und 1 mM Thymi-Die überstehende Flüssigkeit wurde mit weiteren 100 ml der din mit dem Gesamtvolumen von 2,5 ml. Eine Enzymaktivität-Calciumphosphatgelsuspension vermischt und die Mischung 10 Einheit bedeutet die Menge, welche die Bildung eines Nano-Minuten lang gerührt und bei 9700 g 15 Minuten lang zentrifu- mois Thymins pro Minute aus Thymidin bei 25 °C katalysiert, giert. Die resultierende Gelplatte wurde durch Resuspension Die Tabelle I fasst die Ergebnisse der in diesem Beispiel mit 100 ml Puffer A ausgewaschen und bei 9700 g 15 Minuten 50 beschriebenen Reinigung zusammen. Die Prozedur wurde 60 x lang zentrifugiert mit ähnlichen Ergebnissen aufgezeichnet.

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Tabelle I

Reinigung der Thymidinphosphorylase aus Escherichia coli B-96

Vorgang Stufe Vol. Aktivitäts- Geamt- Protein Aktivitäts- Aus- Reini-

Nr. (ml) Einheiten/ Einheiten mg/ml Einheiten/ beute gung ml mg Prot. % fach

Überstehende Flüssigkeit aus der Überschallbe-

handlung I 65,6 106 000 6 943 000 40 2 650 100

Eluat aus dem

Calciumphos-

phat-Gel

II

206

27 600

4685 600

0,99

27880

82

11

DEAE-Zellulose-

Eluat

III

52

80500

4 186 000

0,61

132000

60

50

«ECTEOLA»-Zel-

lulose-Eluat

IV

66

50 700

3346200

0,19

266800

48

101

Beispiel 1 Festes Medium

Auf die herkömmliche Weise wurde ein «Mueller-Hinton» (Difco)-Agar hergestellt und autoklaviert. Nachdem das Medium aus dem Autoklaven entfernt und auf 50 bis 55 °C abgekühlt war, wurde eine sterile Lösung gereinigter Thymidinphosphorylase hergestellt auf die oben beschriebene Weise, unter aseptischen Bedingungen zugesetzt, wobei die Thymidin-phosphorylase-Lösung genügend Enzym enthielt, um eine endgültige Konzentration von 40 Einheiten des gereinigten Enzyms/ml Medium zu ergeben. Das Medium wurde sorgfältig gemischt, in sterile Petrischalen gegossen und auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen.

Beispiel 2 Sensitivitätstest

Auf die herkömmliche Weise wurden «Mueller-Hinton Agar» (Wilson) und «Brain-Heart Infusion Agar» (Difco) hergestellt und autoklaviert (jeweils 3 Chargen). Nach dem Entfernen aus dem Autoklaven wurde eine Charge jedes Mediums in sterile Petrischalen gegossen. Die anderen zwei Chargen der jeweiligen Medien wurden auf 55 °C abkühlen gelassen. Zu der 20 einen Charge eines Mediums wurde sodann lysiertes Pferdeblut zugesetzt, um eine Endkonzentration von 5% zu erreichen und zu der letzten Charge eines jeden Mediums wurde eine sterile Lösung von soviel Thymidinphosphorylase zugesetzt, dass eine Endkonzentration von 40 Einheiten/ml resultierte. Jede Charge 25 wurde sorgfältig vermischt und sodann in sterile Petrischalen gegossen. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde jede Agarplatte mit 2 ml einer verdünnten (10~4), über Nacht stehen gelassenen Fleischbrühekultur («Mueller-Hinton»-Fleischbrühe) von E. coli beimpft. Überschüssige Flüssigkeit 30 wurde entfernt und die Platten trocknen gelassen. Filterpapierscheiben, welche 1,25 mg TMP, 1,26 mg TMP + 23,75 mg SMX und 23,75 mg SMX enthielten, wurden sodann auf die Oberfläche der Platten gelegt, und das Ganze draufhin bei 37 °C 16 Stunden lang inkubiert, wobei ein Rasen von nicht ganz gleich-35 mässigem Wachstum resultierte. Die Hemmzonen wurden bestimmt und als die Abstände von der Kante der Scheibe bis zur Kante der nicht besiedelten Zonen ausgedrückt. In der Tabelle II sind die Ergebnisse zusammengefasst:

Tabelle II Sensitivitäts-Test

Medium

«Brain-Heart

Infusion-Agar»

(Difco)

«Mueller-

Hinton-Agar»

(Wilson)

Antagonist

Grösse der Zone in mm

Trimetho- Sulfametho-prim(TMP) xazol(SMX) 1,25 |ig 23,75 ng

TMP 1,25 (ig

+

SMX 23,75 p.g

Thymidinphosphorylase 40 Einheiten/ml Lysiertes Pferdeblut 5%

Nichts

Thymidinphosphorylase 40 Einheiten/ml Lysiertes Pferdeblut 5%

Nichts

22(25)

14(22) (22)

24(27)

25(28) (25)

17(20)

12(20) (23)

24(26)

24(26) (26)

26(31)

2U9Q)

(31)

32(36)

31(35) (35)

() Schliesst die Zonen mit teilweiser Hemmung ein.

Der «Mueller-Hinton»-Agar wird bei dem Sensitivitätstest Pferdeblut. Darüberhinaus können die nach dem vorliegenden durch die Zugabe von bakterieller Thymidinphosphorylase 65 Verfahren hergestellten tatsächlich farblosen Platten wesent-sowie durch Zugabe von lysiertem Pferdeblut ungefähr auf die lieh leichter und schneller abgelesen und ausgewertet werden gleiche Weise verbessert. Jedoch verbessert das Enzym den als die gefärbten Pferdeblutplatten.

«Brain-Heart Infusion»-Agar wesentlich stärker als das lysierte

G

Claims (10)

628682 2 PATENTANSPRÜCHE einem nur wenig empfindlichen Testmedium dieses in ein Test-

1. Diagnostisches Mittel zum Testen der Suszeptibilität von medium mit befriedigender Empfindlichkeit übergeführt wer-Bakterien gegenüber Mitteln, welche die Folsäurebildung hem- den kann. Nach dieser frühen Arbeit und nach verschiedenen men, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nährmedium für anderen Arbeiten hat es sich eingebürgert, lysiertes Pferdeblut Bakterien zusammen mit gereinigter Thymidinphosphorylase 5 den Testmedien für die antibakterielle Suszeptibilität zuzuge-bakterielien Ursprungs aufweist. ben, um das oft beobachtete, in den von den Sulfonamiden ver-

2. Diagnostisches Mittel nach Patentanspruch 1, dadurch ursachten Hemmzonen auftretende partielle Wachstum zu gekennzeichnet, dass die Konzentration der Thymidinphospho- reduzieren. Erst kürzlich hat es sich gezeigt, dass diese rylase in dem Nährmedium von 2 bis 200 Einheiten Enzymakti- Methode ähnlich wirksam beim Testen von Trimethoprim ist vität/ml Medium beträgt. 10 (Bushby, Postgraduate Med. J. (1969) 45: S. 10; and Darrelletal.,

3. Diagnostisches Mittel nach Patentanspruch 2, dadurch J. Clin. Path. (1968) 21 : S. 202).

gekennzeichnet, dass die Konzentration der Thymidinphospho- Harper und Cawston stellten fest, dass rylase 5 bis 100 Einheiten/ml Medium beträgt. a) bei der Neutralisierung von Sulfonamid-Antagonisten

4. Diagnostisches Mittel nach Patentanspruch 2, dadurch lysiertes Pferdeblut wirksamer ist als unversehrtes Blut, gekennzeichnet, dass die Konzentration der Thymidinphospho- ■ s b) Blut von verschiedenen anderen Individuen inaktiv ist, rylase 7 bis 50 Einheiten/ml Medium beträgt. c) die Aktivität des Lysats mit der Inkubationszeit und der

5. Diagnostisches Mittel nach Patentanspruch 1, dadurch Temperatur (bis zu 30 °C) wächst, und gekennzeichnet, dass es eine Thymidinphosphorylase von d) das Lysat keine Aufhebung der Sulfonamidhemmung einem Escherichia-coli-Stamm enthält. durch Paraaminobenzoesäure bewirkt.

6. Diagnostisches Mittel nach Patentanspruch 5, dadurch 20 Sie schlössen daraus, dass das lysierte Blut einen Faktor entgekennzeichnet, dass der E.-coli-Stamm der Stamm der B-96 hält, welcher die Sulfonamid-Anagonisten neutralisiert. ATCC13 473 ist. Dieser sogenannte Harper-Cawston-Faktor ist nur bei

7. Verfahren zur Herstellung des diagnostischen Mittels Medien wirksam, welche einen mässigen Thymidingehalt, d. h. nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine von ungefähr 0,1 bis 15 |ig/ml, aufweisen. Unter 0,1 ng/ml wird gereinigte Zubereitung von Thymidinphosphorylase bakteriel- 25 der Wirksamkeit der Drogen nicht entgegengewirkt, deshalb len Ursprungs mit einem Nährmedium für Bakterien vermischt, hat das Entfernen dieser kleinen Thymidinmenge keine Wir-

8. Stabilisierte Thymidinphosphorylase-Zubereitung zur kung auf die beobachteten Drogenhemmung. Bei sehr hohem Durchführung des Verfahrens nach Patentanspruch 7, dadurch Thymidingehalt, d. h. grösser als 15 (ig/ml, genügt die Wirksamgekennzeichnet, dass sie eine konzentrierte Enzymlösung, keit des Harper-Cawston-Faktors nicht, die Aufhebung der welche mindestens 5 mg Protein/ml enthält, in einer einen 30 Wirksamkeit der Sulfonamide und des Trimethoprims zu über-Phosphatpuffer enthaltenden Ammoniumsulfatlösung aufweist, winden, wahrscheinlich weil diese Konzentration des Thymins,

9. Thymidinphosphorylase-Zubereitung nach Patentan- ein Spaltprodukt des Thymidins, das wesentlich aktivere Thy-spruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Ammoniumsulfat- midin bei der Aufhebung ersetzt.

konzentration ungefähr 10% beträgt. Der Harper-Cawstons-Faktor hat sich als Thymidinphos-

10. Verwendung des diagnostischen Mittels nach Patentan- 35 phorylase herausgestellt (Bushby in Trimethoprim/Sulfa-spruch 1 zum Testen der Suszeptibilität von Bakterien methoxazol in Bacterial Infections: A Wellcome Foundation gegenüber antimikrobiellen Mitteln, welche die Folsäurebil- Symposium. Ed Bernstein & Salter, Churchill Livingston, Edin-dung hemmen, dadurch gekennzeichnet, dass man es mit Bakte- burgh & London, 1973, Seite 31 bis 38; und Byshby, med. J. Aust. rien beimpft, diese sich vermehren lässt, auf den dabei gebilde- Special Supplement, 1973, Band 1 : Seiten 10 bis 18). Im letzten ten Bakterienrasen Filterpapierscheiben, welche Mittel, die die «o Literaturzitat wird ausgedrückt, dass «obwohl Thymidin die Bildung der Folsäure hemmen, enthalten, auflegt und die Kultur Aktivität in vitro von Trimethoprim/Sulfamethoxyd beeinträch-weiter inkubiert. tigt, liegt es bei Tieren für gewöhnlich nicht in genügend hoher

Konzentration vor, um die Aktivität in vivo zu beeinflussen».

Ein Nachteil beim Einarbeiten von lysiertem Pferdeblut in 45 ein Kulturmedium ist der, dass es letzterem eine rot-braune Färbung verleiht. Je grösser die Pferdeblutmenge ist, um so tiefer ist die Färbung. Diese Färbung ist unerwünscht, da sie sehr