CH628990A5 - Densitometer for the analysis of electrophoretic traces, in particular for diagnostic applications - Google Patents

Description

La presente invenzione si riferisce ad un densitometro, cioè ad un apparecchio che serve a determinare l'intensità di colorazione di sostanze distribuite su un supporto. In particolare è capace di valutare quantitativamente le frazioni proteiche di un dato liquido particolare, ad esempio del sangue, separate per via elettroforetica, generalmente per scopi di diagnosi clinica.

Con particolare riferimento al campo della diagnosi clinica, è noto che l'elettroforesi è una indagine sulla variazione quantitativa di alcune proteine sieriche. In questa indagine, una certa quantità di siero (di cui si è previamente determinato il contenuto proteico tolale) viene deposta su un supporto, ad es. di acetato di cellulosa. Applicando una data differenza di potenziale e adoperando particolari celle con elettroliti, le proteine sieriche migrano lungo il supporto con velocità diversa in dipendenza della loro carica elettrica,

peso, dimensioni, ecc. La striscia viene poi «sviluppata» per immersione in una soluzione di un colorante specifico che, fissandosi, alle proteine, evidenzia le frazioni in cui si sono suddisive nonché, in base all'intensità della colorazione, la distribuzione quantitativa delle proteine stesse. In particolare, su supporto di acetato di cellulosa le proteine possono frazionarsi in cinque gruppi: albumina, e alfa I, alfa 2, beta e gamma globuline. La determinazione quantitativa delle singole frazioni evidenziate sulla striscia è affidata ad un densitometro, che misura l'intensità di colorazione e che effettua il calcolo percentuale e/o assoluto di ogni gruppo di proteine presenti.

Gli attuali densitometri sono schematicamente così rappresentabili: un sistema di traslazione orizzontale a velocità costante fa passare il supporto tra una sorgente luminosa monocromatica ed una fotocellula, la cui uscita, proporzionale alla colorazione e quindi alla concentrazione delle proteine, viene applicata ad un registratore potenziometrico XY (sulle cui ordinate sono riportate le densità ottiche in funzione della mobilità delle proteine), nonché ad un sistema di calcolo che attraverso l'individuazione dei minimi di assorbimento luminoso elabora i dati e trasmette su un visore o tramite una stampante direttamente le percentuali e/o i g/100 mi di ogni singola frazione proteica. Gli attuali densitometri non specificano a quale frazione o gruppo tali dati (percentuali o g/100 mi) si riferiscono ed è quindi fatto carico all'operatore l'abbinamento del dato numerico alla particolare frazione o gruppo proteico. Inoltre in alcuni casi patologici, il numero delle frazioni in cui si suddividono le proteine può essere superiore alle cinque usualmente ricorrenti (albumina, e alfa 1, alfa 2, beta e gamma globuline); ciò significa che una o più frazioni si è subfrazionata. I densitometri noti non indicano quale delle frazioni si è subfrazionata e questa individuazione è quindi subordinata all'intervento dell'operatore ed alla sua abilità ed esperienza.

I densitori tradizionali, inoltre, sono provveduti di scale di sensibilità diverse, selezionabili dall'operatore, per adattare lo strumento alla intensità di colorazione dei tracciati quando siano troppo o troppo poco colorati: da ciò la necessità

di effettuare, talvolta, anche più registrazioni prima di trovare la sensibilità adeguata.

Scopo della presente invenzione è quello di realizzare un densitometro molto compatto, efficiente, versatile e di facile utilizzazione, fondato sull'impiego di un microcalcolatore.

Questo scopo viene raggiunto dal densitometro definito nella rivendicazione 1.

L'invenzione sarà meglio compresa dalla seguente descrizione dettagliata, fornita a puro titolo esemplificativo, di una sua preferita forma di realizzazione illustrata nell'annesso disegno, in cui:

la fig. 1 mostra lo schema di blocchi del densitometro secondo l'invenzione;

la fig. 2 mostra una vista in pianta schematica del lettore di tracciati mobili in due direzioni ortogonali tra loro a mezzo di motori passo-passo comandati da un calcolatore;

la fig. 3 mostra una vista nel senso del lettore presa nel senso della freccia III con alcune parti connesse per motivi di chiarezza.

Con. riferimento alle figure, con 1 è indicato il supporto, ad es. di acetato di cellulosa, sul quale sono presenti una o più tracciati elettroforetici ciascuno dei quali corrisponde all'analisi di proteine appartenenti a sieri diversi.

II supporto 1 viene montato su un telaio 2 provvisto di una coppia di lamine elastiche che ne trattengono le estremità.

Il supporto 1 montato sul telaio 2 viene infilato in guide fisse 3 e a fine corsa chiude un microinterruttore 4 che può consentire la predisposizione al funzionamento del densitometro.

Con il supporto 1 così disposto può iniziarsi l'esplorazione della prima striscia elettroforetica da parte del lettore,

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complessivamente indicato con 5 e che comprende un telaio fisso sostanzialmente ad U, la cui base è indicata con 6,

mentre i suoi bracci o spalle sono indicati con 7 ed 8 rispettivamente. Alla spalla 7 è fissato un motore passo-passo 9 azionante una vite senza fine 10 la cui altra estremità è supportata folle nell'altra spalla 8. La vite 10 attraversa un foro corrispondentemente filettato presente in un blocchetto 11 solidale ad una slitta 12 montata scorrevole in guide di alta precisione 13 fissate lungo i bordi paralleli della base 6. È evidente che l'azionamento della vite 10 fa compiere alla slitta 12 movimenti nella direzione A, direzione che corrisponde alla esplorazione dei tracciati elettroforetici.

La slitta 12 presenta una forma sostanzialmente ad L, la cui base è indicata con 14 e la sua ala verticale con 15,

Sull'ala 15 è supportato un motore passo-passo 15A che aziona una vite a sbalzo 16 che attraversa un foro corrispondentemente filettato di un blocchetto 17 solidale ad una seconda slitta 18. Questa seconda slitta si muove lungo guide di precisione 19 della base 14 della prima slitta 12.

La seconda slitta 18 presenta un andamento sostanzialmente a C (vedi fig. 3), la cui base 20 presenta una sorgente luminosa monocromatica o meno 21 con parte ottica (condensatore) 21A e la cui ala contrapposta 22 presenta in coincidenza con la sorgente 21 un trasdutore fotoelettrico 23,

ad es. una fotocellula o fotodiodo. Da quanto precede risulta che la seconda slitta può muoversi perpendicolarmente alla prima. Questo movimento perpendicolare serve a permettere la lettura di tracciati successivi paralleli al primo.

Il densitometro secondo l'invenzione è inoltre corredato da una stampante 24 che serve a stampare su carta, ad es. sensibile all'impatto, non solo la curva della densità ottica o dell'assorbimento luminoso corrispondente alla striscia elettroforetica di volta in volta analizzata, ma anche una serie di dati, quali: la data, il numero di riferimento, la densità ottica massima, il tipo di frazione proteica, le percentuali di quest'ultima; i valori normali delle proteine ed altri dati che possono servire all'operatore. La stampante utilizzata è del tipo DMTP-6 SERIES della Practical Automation Inc. di Trap Falls Road, Shelton, Connecticut 06484, U.S.A. citata nel bollettino 911.

Tale stampante è munita di testa stampante magnetica 25 a 7 aghi DM 101 e l'avanzamento della carta è affidato ad un motore passo-passo 28.

Nella stampante usuale l'azionamento della testa 25 è affidato ad un motore sincrono, mentre nella esecuzione qu; prevista tale motore è sostituito da un motore passo-passo 29 ed anche l'interfaccia elettronica è sostituita da altra adatta alla diversa funzionalità della stampante cioè alla presenza di motori passo-passo, al comando di un solo ago della testa della stampante nella fase di tracciamento del grafico, ed alla scrittura di simboli diversi, quali quelli dell'alfabeto greco, nella fase di scrittura.

II densitometro comprende inoltre una tastiera 30 per l'impostazione manuale dei dati a cui si farà cenno in seguito. La tastiera 30 è connessa ad una interfaccia elettronica d'ingresso (memoria centrale dei dati = data input) 31 pure connessa al trasduttore fotoelettrico 23 attraverso un convertitore tensione frequenza 32 e ad un contatore d'ingresso (input counter) 33.

Alla interfaccia 31 sono pure connessi: a) i vari dispositivi di controllo quali il microinterruttore 4 ed i microinterruttori 35, 36, 36A di inizio e fine corsa delle slitte 12, 18 del lettore 5; b) la stampante 24; c) i motori passo-passo 9 e 15A del gruppo lettore di cui alle figg. 2 e 3; d) i diodi emettitori di luce (led) 37 indicatori dello stato di funzionamento del densitometro nonché gli indicatori visivi o visori (display) 38.

L'interfaccia 31 è collegata ad un microcalcolatore, costituito da una scheda elettronica 39 del tipo SPC - 80/10 prodotta dalla Intel-Corporation, di Santa Clara, California (USA) e composta da un calcolatore CPU connesso con una memoria veloce programmabile ROM, con una memoria programmata RAM e due orologi a diversa frequenza 40, 41.

Il calcolatore CPU è connesso con una interfaccia elettronica d'uscita (data output) 42 che è a sua volta connessa con: a) i motori passo-passo 9, 15 A del lettore di cui alle figg. 2, 3; b) con i motori passo-passo 28, 29 e la testa 25 della stampante 24; c) con la tastiera 30; d) con il visore 38 ed i leds 37.

Il funzionamento è il seguente:

Si supponga che un supporto 1 con più strisce elettro-foretiche parallele sia montato nel densitometro come già descritto e che le due slitte 12, 18 si trovino nelle loro posizioni di inizio corsa, cioè la prima slitta 12 spostata tutta a sinistra e la seconda 18 tutta in alto (con riferimento alla fig. 2).

L'operatore imposta in successione sulla tastiera i seguenti dati:

a) la data del giorno comprimendo i tasti numerici corrispondenti ed il necessario segno di intervallo 50 e poi il tasto «IN» in modo che il dato venga memorizzato;

b) la lunghezza del tracciato elettroforetico previamente misurato in mm (nonché il tasto della virgola — punto 50 — nelle posizioni necessarie) e poi il tasto «IN»;

c) l'interesse tra i tracciati elettroforetici (qualora sul supporto 1 ve ne sia più di uno) e poi il tasto «IN»;

d) il numero dei tracciati che si vogliono analizzare e poi il tasto «IN».

e) il numero d'ordine o di riferimento che si vuole assegnare ad ogni singolo tracciato elettroforetico, schiacciando poi, dopo ogni numero, il tasto «IN»;

f) il valore delle proteine totali (previamente determinato con altro noto metodo d'analisi) per ogni tracciato elettroforetico schiacciando poi, dopo ogni valore, il tasto «IN».

Quando l'ultimo dato è stato introdotto, il microcalcolatore 39 pone in funzione il motore passo-passo 9 per cui la prima slitta 12 si sposta verso destra, con riferimento alla fig. 2, a velocità uniforme grazie al corrispondente comando impartito al motore passo-passo 9. Il movimento si arresta quando lo spostamento coincide con la lunghezza, impostata, del tracciato elettroforetico. Quindi il movimento s'inverte, sempre con velocità uniforme. Durante questa fase di ritorno avviene una prima esplorazione del tracciato elettroforetico. Il convertitore 32 emette frequenze diverse in relazione al diverso assorbimento del fascio luminoso. Tali frequenze vengono immesse nell'interfaccia d'ingresso 31 attraverso il contatore di ingresso 33 e costituiscono la misura della densità ottica (o dell'assorbimento luminoso) istantanea del tracciato elettroforetico analizzato. Se il valore massimo delle densità ottiche supera il valore oltre il quale non sussiste la proporzionalità diretta tra assorbimento della luce e concentrazione della sostanza (cioè della proteina), il microcalcolatore 39 linearizza la curva assorbimento/concentrazione fino ad un massimo di D.O. = 3 ed immagazzina tale dato nella memoria ROM ad esso associata ed allo scopo programmata. Sempre durante questa corsa di ritorno l'interfaccia d'ingresso 31 fornisce al calcolatore le informazioni per la determinazione di una media mobile per stabilire la posizione dei minimi della curva di assorbimento.

Inoltre, il microcalcolatore determina lo zero delle ordinate, cioè la posizione dell'asse X, come media della lettura all'inizio ed alla fine della striscia elettroforetica ed immagazzina tale dato nella memoria ROM. Terminata questa corsa attiva, inizia una corsa in senso opposto, chiamata seconda corsa attiva, durante la quale sulla carta della stam5

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pante viene disegnato la curva del tracciato elettroforetico, (cioè la curva dell'assorbimento luminoso) e, al termine di questa, i dati o informazioni, in forma alfa-numerica, che si ricavano dall'analisi del tracciato elettroforetico.

Nella seconda corsa attiva i motori 9, 28, 29 vengono azionati tramite il microcalcolatore a velocità variabile, ma correlate. In particolare, la velocità del motore 9 diminuisce nelle zone di maggiore assorbimento luminoso; il motore 28 viaggia sincronizzato con il motore 9, mentre il motore 29 della testa 25 viaggia con una velocità che è sostanzialmente inversa a quella dei motori 9 e 28. Nei minimi di assorbimento il microcalcolatore agisce arrestando per brevissimo tempo i motori 9 e 28, mentre dà velocità al motore 29 per il tracciamento di brevi segmenti paralleli all'asse Y della curva.

Sempre in questa fase sei dei sette aghi della testa non vengono abilitati, il che significa che ad un solo ago è affidato il tracciamento della curva. In questa fase inoltre viene effettuata una nuova media mobile per determinare i minimi che vengono paragonati con quelli memorizzati nella prima corsa attiva per comandare la stampante in modo da avere una curva effettiva anziché fittizia. In corrispondenza dei minimi la stampante traccia come già detto, delle linee parallele all'asse Y del piano cartesiano in cui giace la curva. Il moto longitudinale del lettore 5 si arresta al raggiungimento del dato impostato, relativo alla lunghezza del tracciato ed interviene il motore passo-passo trasversale 15A che porta il lettore in coincidenza con il secondo tracciato elettroforetico da analizzare secondo le modalità già descritte.

Terminato il tracciamento della curva, avviene la stampa dei dati sotto il comando del microcalcolatore, in base alle informazioni disponibili nelle memorie ad esso associate.

La stampa dei dati è affidata alla stampante 24 a mezzi della testa in cui, in questa fase, si utilizzano tutti i sette aghi ed i due motori passo-passo 28, 29 relativi rispettivamente all'avanzamento della carta ed al movimento della testa stampante 25.

Le informazioni che vengono trasmesse alla stampante sono, in questo esempio: la data originariamente impostata sulla tastiera 30; il.numero d'ordine preimpostato; il. valore della densità ottica, corrispondente al picca più alto della curva e determinato durante Ja prima corsa attiva del lettore; le percentuali riscontrate delle singole proteine con il rela-5 tivo nome ed i valori normali ed i g/100 mi, affiancando al nome il segno più o meno a seconda che le percentuali riscontrate siano superiore o inferiore ai valori normali; il totale percentuale ed il peso totale; il rapporto albumina/globuline ed una classificazione dei tracciati in seguito ad una io comparazione con alcuni quadri clinici impostati in memoria.

Il valore della densità ottica corrispondente al picco più alto è determinato dal microcalcolatore per confronto tra un valore impostato in memoria ed il valore massimo perve-15 nutogli durante la lettura.

Le percentuali riscontrate delle singole proteine sono ricavate attraverso una operazione di integrazione complessiva della curva della densità ottica o assorbimento luminoso, da una serie di operazioni d'integrazione parziale di tale 20 curva tra due minimi consecutivi e dal rapporto percentuale tra gli integrali parziali con quello complessivo ed attribuendo un rapporto ad una proteina piuttosto che ad un'altra (nel caso di subfrazionamento delle frazioni proteiche) se entrambi i minimi tra i quali viene operata l'integrazione par-25 ziale ricadono in un tratto della curva o della striscia elettroforetica ove possono essere solo presenti proteine di un dato gruppo (cioè del gruppo delle albumine delle alfa-glo-buline e così via).

I pesi vengono determinati moltiplicando le singole fra-30 zioni percentuali con il peso complessivo delle proteine impostato sulla tastiera. Il rapporto albumine/globuline è una operazione immediatamente intuibile così come lo sono gli altri dati.

Se nelle memorie associate al microcalcolatore vengono 35 accumulati dati relativi a casi patologici ben identificati è possibile a mezzo del calcolatore confrontare tali dati con quelli derivanti dalla particolare analisi e trarre delle indicazioni circa l'esistenza di una o determinate patologie che possono essere indicate sulla carta ad opera dèlia stampante.

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1 foglio disegni

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1. Densitometro per l'analisi di tracciati elettroforetici, in particolare per applicazioni diagnostiche, ove tali tracciati sono formati da frazioni, comprendente un lettore (5) mobile relativamente al tracciato elettroforetico ,un dispositivo (24) per il tracciamento di curve di assorbimento ed un dispositivo di calcolo (39) dei valori percentuali o assoluti di ogni frazione del tracciato elettroforetico, caratterizzato dal fatto che il dispositivo di tracciamento è una stampante (24) con testa ad aghi, e che lettore (5) e stampante (24) sono azionati da motori passo-passo (9, 29) attraverso un microcalcolatore (39) costituito da microprocessori (CPU).

2. Densitometro secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che è congegnato in modo che l'esplorazione del tracciato elettroforetico a mezzo del lettore (5) avvenga durante due corse attive del lettore stesso, una a velocità costante e l'altra a velocità variabile.

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RIVENDICAZIONI

3. Densitometro secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il lettore (5) comprende, oltre al primo motore (9) azionantelo attraverso il microcalcolatore (39), un secondo motore passo-passo (15A) per il suo passaggio dalla esplorazione di un tracciato all'esplorazione di altri tracciati paralleli situati su uno stesso supporto.

4. Densitometro secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che il lettore (5) comprende una prima slitta (12) azionata dal primo motore passo-passo (9) tramite un accoppiamento a vite (11) senza fine, nonché una seconda slitta (18) portata dalla prima (12) ed azionata dal secondo motore passo-passo (15A) montato su tale prima slitta.

5. Densitometro secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che la seconda slitta (18) porta mezzi di esplorazione del tracciato elettroforetico comprendenti una sorgente luminosa (21) ed un trasduttore fotoelettrico (23).

6. Densitometro secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che il segnale proveniente dal trasduttore (23) viene applicato ad un convertitore tensione/frequenza (32) ed attraverso un contatore d'ingresso (33) ed una interfaccia elettronica d'ingresso (31) ad un microcalcolatore associato a memorie programmate, il quale attraverso una interfaccia elettronica d'uscita (42) comanda i motori passo-passo (9, 15A, 29) e la testa (25) della stampante (24).

7. Densitometro secondo una delle rivendicazioni 2 a 6, caratterizzato dal fatto che è congegnato in modo che nella seconda corsa attiva i motori del lettore e della stampante vengano azionati a velocità variabile correlata con l'assorbimento.