CH632343A5 - Process for the detection or for the determination of polyiodothyronines - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der Schilddrüsenhormone Trijodthyronin und Thyroxin in einem Medium, von dem vermutet wird, dass es diese Hormone enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer gepufferten wässrigen flüssigen Zone das Medium, ein inhibiertes Enzym und einen für das zu bestimmende Hormon spezifischen Antikörper zusammenbringt, wobei das Enzym durch direkte Bindung oder über eine Kupplungskomponente mit einem Inhibitor, der sich an den Antikörper binden lässt, reversibel inhibiert ist und wobei der Antikörper in einer solchen Konzentration vorhanden ist, dass eine wesentliche Vergrösserung der Enzymaktivität in Abwesenheit des freien Hormons auftritt; und dass man in der genannten Zone in Anwesenheit von Enzymsubstraten die Wirkung des Mediums auf die enzymati-sche Aktivität des reversibel inhibierten Enzyms untersucht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Thyroxin nachweist bzw. bestimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das inhibierte Enzym inhibierte Malatdehydrogenase ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das inhibierte Enzym inhibierte Triosephosphatisomerase ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige flüssige Zone bei einem pH-Wert im Bereich von 7 bis 10,5 puffert, und dass das inhibierte Enzym weniger als 50% der Enzymaktivität vor der Inhibierung, jedoch nicht weniger als 0,5% der Enzymaktivität vor der Inhibierung hat.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das inhibierte Enzym inhibierte Malatdehydrogenase ist und die enzymatische Aktivität durch Zusatz von NAD und Malat zu der wässrigen flüssigen Zone bei einem pH-Wert im Bereich von 8,5 bis 10,5 bestimmt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das inhibierte Enzym inhibierte Triosephosphatisomerase ist und die enzymatische Aktivität durch Zugabe von Glyceral-dehyd-3-phosphat, a-Glycerophosphatdehydrogenase und NADH zu der wässrigen flüssigen Zone bei einem pH-Wert im Bereich von 7 bis 9 bestimmt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Medium und den Antikörper vor der Zugabe der inhibierten Malatdehydrogenase kombiniert.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die inhibierte Malatdehydrogenase 1 bis 10, Inhibitormoleküle je Malatdehydrogenase hat, die Malatdehydrogenase mitochondrische Malatdehydrogenase ist und bis zu 65-99,5% der Enzymaktivität der Malatdehydrogenase vor der Inhibierung desaktiviert ist.

10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die inhibierte Malatdehydrogenase mitochondrische Malatdehydrogenase ist.

11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige flüssige Zone bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 10,5 puffert, dass das Enzym ein Dehydroge-nase-Enzym ist und dass man die enzymatische Aktivität mit NAD bzw. NADH bestimmt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das inhibierte Enzym inhibierte Malatdehydrogenase ist und die Analyse mit NAD und Malat erfolgt.

13- Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst das Medium und der Antikörper und dann das inhibierte Enzym zusammengebracht werden.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als inhibiertes Enzym ein solches der Formel

ENZ-

X Y C0oD

11 „x 11 I 2

C=A) -CNH-CHCH_ Z

a d.

n verwendet, worin die Symbole folgende Bedeutungen haben: ENZ ist ein reversibel inhibiertes Enzym; a ist 0 oder 1 ; n ist durchschnittlich mindestens 1 und nicht mehr als 10; X und Y, die gleich oder voneinander verschieden sind, sind Chalcogen io oder Imino; D ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; Z ist 3-Jod-4-(3 ' ,5' -Dijod-4 ' -hydroxy-phenoxy-1 ')-phenyl-l, 3,5-Dijod-4-(3'-jod- oder 3',5'-dijod-4'-hy-droxyphenoxy-l')-phenyI-l oder 3,5-Dijod-4-hydroxyphenoxy; und A ist eine Bindung oder eine organische zweiwertige 15 Gruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und 0 bis 6 Heteroato-men, nämlich Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff, wobei die Gesamtzahl der heterofunktionellen Gruppen zwischen 0 und 4 liegt.

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Die Konzentration von Thyroxin im Blut ist innerhalb verhältnismässig enger Grenzen für die ordnungsgemässe Funk-25 tion des Körpers kritisch. Die Thyroxinkonzentration ist äusserst gering und kann nur nach sehr empfindlichen Methoden nachgewiesen werden.

Die Trijodthyronine (T-3) sind ebenfalls ein wichtiger Faktor für die einwandfreie Funktion des Körpers. Die Trijodthy-30 ronine unterscheiden sich vom Thyroxin (T-4) dadurch, dass das Jod in 5- oder 5'-Stellung fehlt. Man nimmt an,«dass die (T-3) die gesamten Stoffwechselwirkungen der Schilddrüsenhormone merklich beeinflussen.

Eine Methode zur Bestimmung der Schilddrüsenhormone 35 ist die Radioimmunoanalyse (Radioimmunoassay). Obwohl diese Methode viele Varianten hat, besteht sie im Prinzip darin, dass ein Antikörper für das Schilddrüsenhormon und ein radioaktives oder «heisses» Schilddrüsenhormon mit Blutserum kombiniert werden und das gebundene Hormon vom ungebun-4o denen Hormon getrennt wird. Die Menge des «heissen» Hormons, das an den Antikörper gebunden ist oder frei bleibt, ist eine Funktion der Menge des Hormons im Serum. Durch Bestimmung der Radioaktivität der vom Antikörper befreiten Lösung kann man die Hormonmenge, bezogen auf Standards 45 mit bekannten Hormonmengen, berechnen.

Bei der Radio-Immunoanalyse ist eine Trennstufe erforderlich, durch die Fehler eingeschleppt werden und die sehr zeitraubend sein kann. Weiterhin muss mit radioaktiven Substanzen gearbeitet werden, die zerfallen und deshalb nur eine so begrenzte Lagerfähigkeit haben. Weiterhin ist das Arbeiten mit radioaktiven Substanzen im allgemeinen wegen der damit verbundenen Gesundheitsrisiken unerwünscht. Es besteht ein fortgesetztes Bedürfnis nach einer einfachen Methode, bei der die Zahl der Behandlungsstufen auf ein Minimum herabgesetzt 55 werden kann, während gleichzeitig eine hohe Empfindlichkeit gewährleistet ist.

In der US-Patentschrift 3 817 837 ist eine Enzymanalyse (Enzymassay) beschrieben, die sich ganz allgemein für eine grosse Vielzahl von Liganden als brauchbar erwiesen hat. 6o Die Erfindung betrifft nun ein homogenes Enzym-Immu-noanalyse-Verfahren, mit welchem die Schilddrüsenhormone (Thyroidhormone) T-3 und T-4 nachgewiesen bzw. bestimmt werden können. Das erfindungsgemässe Verfahren ist im Patentanspruch 1 definiert.

65 In dem Verfahren wird ein Enzymreagens in Form eines inhibierten Enzyms verwendet, insbesondere ein enzymgebundenes T-3 oder T-4 (EBP), in welchem das Enzym nach der Konjugation mit dem Inhibitor zu vorzugsweise mehr als 50% deak-

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tiviert ist und das nach der Bindung des Antikörpers, d. h. eines Enzymen diese Aktivität hat, insbesondere Malatdehydroge-Rezeptors für T-3 und T-4, teilweise oder vollständig reaktiviert nase, und davon wieder die mitochondrische, vorzugsweise die wird. Das verwendete konjugierte Enzym hat also eine geringe mitochrondische Malatdehydrogenase (MDH) aus Schweine-Umsatzgeschwindigkeit, die in Gegenwart eines Rezeptors, herzen; sowie Triosephosphatisomerase, insbesondere Trioseeines Antikörpers für T-3 und T-4, beträchtlich zunimmt. 5 phosphatisomerase (TIM) aus Kaninchenmuskeln. Gewöhnlich Die Analyse wird beispielsweise so durchgeführt, dass man ist das Polyjodthyronin über eine verbindende Gruppe, die mit in einer gepufferten wässrigen Zone eine zu bestimmende der Aminogruppe des Polyjodthyronins verbunden ist, mit dem Serumprobe, den geeigneten Rezeptor, EBP und die Enzym- Enzym verbunden, wobei die Carboxygruppe verestert ist, ins-substrate miteinander kombiniert und die Geschwindigkeit der besondere mit einer niederen Alkylgruppe, die gewöhnlich 1 durch das Enzym katalysierten Reaktion bestimmt. Gegebe- io bis 3 Kohlenstoffatome enthält. Zweckmässig kann das Poly-nenfalls können eine oder mehrere Inkubationsperioden zwi- jodthyronin durch eine funktionelle Gruppe gebunden sein, die sehen der Zugabe der einzelnen Reagenzien zwischengeschal- zwei Carboxylfunktionen enthält. In diesem Zusammenhang tet werden. Indem man Standards mit bekannten Mengen an versteht man unter Carboxyl-Funktion die sauerstoffhaltige T-3, reziprokem T-3 oder T-4 herstellt, kann man eine Eichkurve Carboxygruppe erhalten, mit der die unbekannten Proben in Beziehung gesetzt ts werden können.

Bei den EBP-Zusammensetzungen ist in der Regel durch- _p_oh schnittlich mindestens ein Inhibitor über ein aliphatisches Kohlenstoffatom oder eine Carboxylgruppe (bzw. ein Stickstoffoder Thioanaloges derselben) an das Enzym gebunden, wobei 20 die stickstoffhaltige Imidingruppe ein Amid (Amidin bzw. Thioamid) und/oder ein Ester gebildet wird. IT

Mit den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausfüh- II

rungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens können Poly- - C- OH

jodthyronine (T-3 und T4) bei Konzentrationen von nur 10~7" 25

molar oder darunter bestimmt werden. In Analogie zu der in die schwefelhaltige Thionocarboxygruppe der US-Patentschrift 3 817 837 beschriebenen Erfindung sind

T-3 und T4 die Liganden, der enzymgebundene Ligand ist z. B. S

enzymgebundenes T-3 oder T-4, und der Antiligand ist ein Anti-

körper für T-3 oder T4. Insbesondere handelt es sich bei den 30 -U-UH

Enzymen um Malatdehydrogenase oder Triosephosphatisomerase. und deren Derivate, z. B. Amide, Ester und Anhydride.

Bei einer bevorzugten Enzym-Immunoanalyse werden als Die Anzahl der mit dem Enzym konjugierten Polyjodthyro-

Reagenzien inhibiertes Enzym (insbesondere T-3- und T4-inhi- nine beträgt durchschnittlich mindestens 1 und nicht mehr als biert), ein Rezeptor für Polyjodthyronin, nämlich Anti-T-3 und 35 etwa 10 je Enzym, gewöhnlich 1 bis 8 und üblicherweise 2 bis 6. Anti-T4, Substrate für das Enzym und ein wässriges, normaler- Die Polyjodthyronine können an verfügbare Stellen gebunden weise alkalisches Puffermedium, das gewöhnlich ein oder meh- sein (z. B. Amino- oder Hydroxygruppen zur Bildung von Ami-rere Zusätze zur Verbesserung der Enzymstabilität enthält, zur den und Estern), und zwar durch passende verknüpfende Grup-Bestimmung des Produktes der Enzymreaktion oder derglei- pen, die von der Aminogruppe oder der Carboxygruppe (insbe-chen verwendet. Die Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien 40 sondere von der Aminogruppe des Polyjodthyronins) ausge-zum wässrigen Analysenmedium ist nicht kritisch, obgleich hen. Da die Aminogruppe während der Konjugation geschützt man bestimmte Verfahrensweisen vorzieht. Weiterhin kann werden muss, wenn die Carboxylgruppe bei der Konjugation eine Inkubation nach Zusatz bestimmter Reagenzien beteiligt ist, werden die verknüpfenden Gruppen in den mei erwünscht sein. sten Fällen an die Aminostelle angehängt. Zweckmässig wird

Nach Zugabe aller Reagenzien wird die Reaktionsge- 45 der Ester des Polyjodthyronins verwendet, und eine Gruppe schwindigkeit des Enzyms verfolgt, normalerweise spektropho- mit einer Carboxylfunktionalität (vgl. die vorstehende Defini-tometrisch. Durch Vergleich des mit der unbekannten Substanz tion) wird zur Konjugation an die Amino- und Hydroxylgrup-erhaltenen Ergebnisses mit den unter Verwendung von bekann- pen des Enzyms verwendet.

ten Mengen T-3 und T-4 erhaltenen Ergebnissen kann man die Eine Bindung oder eine verbindende oder verknüpfende

Menge des T-3 und T-4 in der unbekannten Probe bestimmen. 50 Gruppe kann das Polyjodthyronin mit dem Enzym verbinden.

Nachstehend sind zunächst die Reagenzien beschrieben, Die verbindende Gruppe als solche ist für die Erfindung nicht anschliessend das eigentliche Analysenverfahren. kritisch, obgleich gewisse Klassen von verbindenden Gruppen bevorzugt werden. Die Anzahl der Atome in der verbindenden Die Reagenzien Gruppe (ausser Wasserstoff) beträgt im allgemeinen nicht

Inhibierte Enzyme 55 mehr als 20, gewöhnlich nicht mehr als 16; die verbindende

Bei der Herstellung des inhibierten Enzyms kann man den Gruppe kann 0 bis 7, gewöhnlich 1 bis 6 Heteroatome, insbe-Inhibitor direkt verwenden, wobei man die Carboxylgruppe, sondere Chalcogenatome (O und S), die normalerweise nur an die an verfügbare Gruppen des Enzyms, z. B. Lysine und Tyro- Kohlenstoff gebunden sind, sowie Stickstoff enthalten, der nur sine, gebunden werden soll, aktiviert, oder vorzugsweise aus an Kohlenstoff und Wasserstoff gebunden ist und der neutral den verfügbaren Funktionalitäten z. B. der Aminogruppe oder 60 ist, wenn er an Wasserstoff gebunden ist, z. B. in Form von Ami-Carboxygruppe, insbesondere der Aminogruppe, eine verlän- dostickstoff. Das speziell verwendete Enzym kann durch ein gerte Kette erzeugt. Die phenolische Hydroxylgruppe wird als Polyjodthyronin reversibel deaktiviert werden, so dass das Konjugationsstelle nicht verwendet. Enzym in Abwesenheit des Rezeptors für Polyjodthyronin

Brauchbare Enzyme sind solche, die bei der Konjugation weniger als etwa 50%, gewöhnlich weniger als etwa 35% und mit einem Polyjodthyronin praktisch reversibel deaktiviert 65 üblicherweise weniger als 25% seiner ursprünglichen Enzymakwerden, so dass bei der Bindung an einen Antikörper für das tivität vor der Konjugation besitzt, wobei aber mindestens 0,5, Polyjodthyronin die Aktivität weitgehend wiedergewonnen gewöhnlich mindestens 1 % der ursprünglichen Enzymaktivität .wird. Es wurde gefunden, dass nur eine bestimmte Gruppe von vor der Konjugation vorhanden sind. Bei Zusatz von über-

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schüssigem Rezeptor für Polyjodthyronin zum Enzymkonjugat erhöht sich die Enzymaktivität um mindestens 50%, üblicherweise um mindestens 100% und häufig um 200% oder mehr. Der Wert der Aktivitätszunahme hängt zu einem grossen Teil von der ursprünglichen Aktivitätsabnahme bei der Konjugation ab. Andere Enzyme, insbesondere Dehydrogenasen, die durch Thyroxin inhibiert werden, sind bei Wolff und Wolff, Biochimica et Biophysica Acta, 26,387 (1957) angegeben. Bei diesen Enzymen handelt es sich z. B. um Glutamindehydrogenase, Lac-tatdehydrogenase, Hefe-Alkoholdehydrogenase, Hefe-Glu-cose-6-phosphatdehydrogenase und Glycerinaldehyd-3-phos-phatdehydrogenase.

Im allgemeinen hat das enzymgebundene Polyjodthyronin (EBP) die nachstehende Formel

ENZ =

' W 0CGHGH„Z l 2

(NHW )

m x

worin die Symbole folgende Bedeutungen haben:

ENZ ist ein Enzym, das insbesondere durch T-3 und/oder T4 reversibel inhibiert wird, so dass das Enzym aktiviert wird, wenn der Inhibitor durch einen Rezeptor, d. h. einen Antikörper, gebunden wird; das Enzym ist im allgemeinen eine Dehydrogenase oder eine Triosephosphatisomerase; x ist 0 oder 1, Z ist

J J

worin m10 oder 1 ; G und G1 Wasserstoff oder Jod sind, mit der Massgabe, dass G1 Jod ist, wenn m10 ist und dass mindestens 3 Jodatome vorliegen, wenn m11 ist; eines von W und W1 ist eine verbindende Gruppe, insbesondere eine aliphatische Gruppe mit 0 bis 1 äthylenisch ungesättigten Stellen und 1 bis 20 anderen Atomen als Wasserstoff, wobei es sich um Kohlenstoff, Chalcogenatome bzw. Stickstoff handelt, wobei die Chalco-genatome als Oxy- oder Oxo-Atome (einschliesslich der Thio-analogen) nur an Kohlenstoff gebunden sind, insbesondere Car-boxyl; und wobei der Stickstoff nur an Kohlenstoff und Wasserstoff gebunden ist und neutral ist, wenn er an Wasserstoff gebunden ist, z. B. als Amidostickstoff; die Anzahl der Hetero-atome liegt gewöhnlich im Bereich von 1 bis 8, üblicherweise im Bereich von 2 bis 7 und vorzugsweise zwischen 2 und 4; es sind normalerweise nicht mehr als 5, gewöhnlich nicht mehr als 4 und vorzugsweise 2 bis 3 Funktionalitäten in der Kette der verbindenden Gruppe vorhanden, z. B. tert.-Amino, Oxy,

Amido usw., mit der Massgabe, dass W1 eine Bindung sein kann, insbesondere für x - 0; wenn es sich nicht um eine verbindende Gruppe handelt, ist W Wasserstoff und W1 eine Hydroxylgruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, insbesondere die Methylgruppe; und m ist durchschnittlich mindestens 1 und nicht mehr als 10, gewöhnlich 1 bis 8, üblicherweise 2 bis 6.

Das verwendete EBP kann insbesondere die nachstehend angegebene Formel haben worin die Symbole folgende Bedeutungen haben: ENZ ist ein Enzym, das durch insbesondere T-3 und T-4 reversibel inhibiert wird, so dass das Enzym aktiviert wird, wenn der Inhibitor durch einen Rezeptor gebunden wird; das Enzym ist gewöhn-5 lieh eine Dehydrogenase, insbesondere Malatdehydrogenase, oder Triosephosphatisomerase; n beträgt durchschnittlich mindestens 1 und nicht mehr als 10, gewöhnlich 1 bis 8, üblicherweise 2 bis 6; a ist 0 oder 1, gewöhnlich 1 ; X und Y, die gleich oder voneinander verschieden sind, sind Chalcogen (O oder S) io oder Imino (-NH), wobei Y normalerweise nicht Imino ist; D ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffato-men, gewöhnlich 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise einem Kohlenstoffatom; Z ist 3,3',5-, 3,5,3'-Trijod- oder 3,3',5,5'-Tetrajod4-(hydroxyphenoxy-l')-phenyl-l oder i5 3,5-Dijod-4-hydroxyphenoxy; und A ist eine Bindung oder eine zweiwertige organische Gruppe mit mindestens 1 Kohlenstoffatom, gewöhnlich mindestens 2 Kohlenstoffatomen und gewöhnlich nicht mehr als 12 Kohlenstoffatomen, üblicherweise nicht mehr als 10 Kohlenstoffatomen, wobei 0 bis 12, 20 gewöhnlich 1 bis 10, üblicherweise 2 bis 9 und vorzugsweise 3 bis 7 Atome in der Kette (bei cyclischen Gruppen ist die grössere Zahl von Ringatomen eingeschlossen) zwischen den Car-boxylgruppen bzw. Analogen vorhanden sind und wobei 0 bis 4, gewöhnlich 0 oder 1 bis 3, üblicherweise 1 bis 2 Heteroatome in 25 der Kette vorhanden sind, die Chalcogen (O oder S) (als Oxy-, Thio- oder Sulfonylgruppen) oder Stickstoff (tertiärer Amino-oder Amido-Stickstoff) sein können; die Gesamtzahl an Hete-roatomen beträgt 0 bis 6, im allgemeinen 0 bis 5, gewöhnlich 0 oder 1 bis 4, insbesondere 1 bis 3, wobei es sich um Chalcogen 30 (O oder S) (als Carboxyl, Thiocarboxyl, Oxy, Thio oder Sulfo-nyl) oder um Stickstoff (Imino, tert.-Amino oder Amido) handelt; gewöhnlich befinden sich 2 Kohlenstoffatome zwischen den Heteroatomen in der Kette; A kann eine Kohlenwasserstoffgruppe (eine aliphatische, alicyclische, aromatische bzw. 35 eine Kombination dieser Gruppen) oder eine nicht-Kohlenwasserstoffgruppe (eine substituierte aliphatische, alicyclische, aromatische, heterocyclische oder eine Kombination dieser Gruppen) sein, wobei im allgemeinen 0 bis 1 cyclische Gruppen in der Kette vorhanden sind, normalerweise 5 bis 6 Ringglieder 40 mit 0 bis 2 Heteroringgliedern, gewöhnlich mit 0 bis 1 Heteroringgliedern, wobei die Substituenten der cyclischen Gruppe gewöhnlich durch 2 bis 4, üblicherweise durch 3 bis 4 Ringglieder voneinander getrennt sind; normalerweise hat die Kohlenwasserstoffgruppe als einzige aliphatische Unsättigung 0 bis 1 45 äthylenische Gruppen; sie ist vorzugsweise gesättigt und stellt insbesondere eine Alkylengruppe mit 0 bis 1 Carboxamido-, Imino- oder Oxygruppen in der Kette dar; wenn A eine carbo-cyclische aromatische Gruppe ist, enthält diese gewöhnlich 6 bis 10, üblicherweise 6 bis 8 Kohlenstoffatome.

so Die Gesamtzahl der funktionellen Gruppen in der Kette (Oxy-, Amino-, Amidogruppen bzw. die Schwefel- und Stickstoffanalogen) beträgt im allgemeinen 0 bis 4, gewöhnlich 0 bis 3 und üblicherweise 0 oder 1 bis 2.

In der allgemeinen Gruppe sind auch ENZ-gebundene T-3-55 oder T4-Zusammensetzungen enthalten, die ein Di-Carboxyl-Bindeglied mit einer aliphatischen Kette besitzen, die durch Heteroatome nicht unterbrochen ist oder die durch etwa 1 bis 2 Heteroatome, nämlich Chalcogen und Stickstoff, unterbrochen ist. Diese Verbindungen haben im allgemeinen die nachstehend 6o angegebene Formel

ENZ-

X Y C0oD II s II I 2 C=A) -CNH-CHCH0Z

n e? X1 Y1 C02D

ENZ- (C- d -oc - B - r - C-NHCHCH0Z) 1 s p 'q 'r 2 n

5

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worin die Symbole folgende Bedeutungen haben: ENZ, D und Z sind wie vorstehend definiert; n1 hat die gleichen Grenzwerte wie n, liegt jedoch im Durchschnitt zwischen 1 und 10, vorzugsweise zwischen 1 und 8 und insbesondere zwischen 2 und 6; X1 und Y1 haben die gleiche Bedeutung wie X bzw. Y, wobei X1 5 normalerweise Chalcogen und Y1 vorzugsweise Sauerstoff ist; p, q und r sind jeweils 0 oder 1, wobei die Summe aus p, q und r vorzugsweise mindestens = 1 ist (p+q+r^l);sistObis 2, gewöhnlich 0 oder 1 ; a und y sind Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 8, gewöhnlich 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, üblicherweise mit io 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, wobei insgesamt 1 bis 12 Kohlenstoffatome, üblicherweise insgesamt 2 bis 10 Kohlenstoffatome, vorzugsweise insgesamt 2 bis 8 Kohlenstoffatome und insbesondere 2 bis 6 Kohlenstoffatome vorliegen; für p oder r = 0 enthalten a oder y vorzugsweise 1 bis 8 Kohlenstoffatome, 15 insbesondere 1 bis 6 Kohlenstoffatome; a und y können aliphatisch, alicyclisch, aromatisch oder heterocyclisch sein; zusammen mit ß und 8 können sie die Definition von A erfüllen; vorzugsweise sind a und y gesättigte aliphatische Gruppen, insbesondere unverzweigte Gruppen, z. B. Methylen- oder Polyme- 20 thylengruppen, bzw. aromatische, insbesondere monocyclische Gruppen, wobei nur eines von a und y eine aromatische Gruppe ist; ß ist Oxy (-0-), Thio (-S-), Sulfonyl (-SO2-) oder

Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 Kohlenstoffatom; R hat die gleiche Definition wie A, ist jedoch vorzugsweise eine zweiwertige aliphatische Gruppe mit 0 bis 1 äthylenisch ungesättigten Stellen und 0 bis 1 Heteroatomen mit den Atomzahlen 7 bis 8, wobei die Heteroatome nur an Kohlenstoffatome gebunden sind und 1 bis 6 Kohlenstoffatome vorhanden sind; und E ist Hydroxyl oder kann zusammen mit einem endständigen Stickstoffatom von R eine Doppelbindung bilden, z. B. Isocyanat oder Isothiocyanat.

Eine weitere brauchbare Verbindungsreihe hat einen car-bocyclischen oder heterocyclischen Ring mit 5 bis 6 Ringgliedern in der Kette, wobei der heterocyclische Ring 1 bis 2, gewöhnlich 1 Heteroringglied enthält, wobei es sich um O, S oder N handelt. Vorzugsweise haben diese Verbindungen eine Isocyanat- oder Isothiocyanat-Gruppe, die direkt oder indirekt mit einem Ringglied verbunden ist, insbesondere wenn es sich um einen aromatischen Ring handelt. In den meisten Fällen haben diese Verbindungen die nachstehend angegebene Formel

Y2 CCLD 0 II I

X =C=NArGNHGHCH2Z

Amino (-N-), worin T eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, oder Wasserstoff ist; wenn ß mit einer Carboxylfunktion verbunden ist (p = 0), so ist ß eine Amino- oder Alkylaminogruppe; und ô ist

0 II

-CH-NH-C-

I1

worin T1 Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet.

Bei einer bevorzugten Untergruppe kann der Inhibitor mit einer Dicarbonsäure kombiniert sein, um eine Amidsäure (Monoamid einer Dicarbonsäure) zu bilden. Die Dicarbonsäure enthält gewöhnlich 2 bis 8 Kohlenstoffatome, normalerweise 2 bis 6 Kohlenstoffatome und 0 bis 1 äthylenisch ungesättigte Stellen in der Kette; sie enthält ferner 0 bis 1 Atome mit Atomzahlen 7 bis 8 (Stickstoff oder Sauerstoff), wobei die Stickstoffoder Sauerstoffatome nur an Kohlenstoffatome verbunden sind, d. h. in Form von tertiären Aminogruppen oder Äthergruppen. Bevorzugte Dicarbonsäuren bilden cyclische Anhydride mit 5 bis 7, insbesondere 5 bis 6 Ringgliedern. Um zu gewährleisten, dass die Carboxylgruppe der Dicarbonsäure, die mit dem Inhibitor konjugiert ist, diejenige ist, die mit dem ENZ reagiert, wird die ursprüngliche Carboxylgruppe des Inhibitors normalerweise mit einer Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit einem Kohlenstoffatom (Methyl) verestert.

Der modifizierte Inhibitor, der zur Konjugation mit dem ENZ verwendet wird, hat im allgemeinen die nachstehend angegebene Formel

Z-GHo-CH-C0oD'

I 2 2

NH X (CY) (RG)aE

worin die Symbole folgende Bedeutungen haben: X, Y, Z und a sind wie vorstehend definiert; D' ist Wasserstoff oder eine

25 worin die Symbole folgende Bedeutungen haben:

D und Z sind wie vorstehend definiert; X2 und Y2 sind Chalcogen (O oder S), wobei X2 vorzugsweise S ist; Ar ist eine Ary-len- oder Aralkylengruppe, einschliesslich carbocyclischer und heterocyclischer Gruppen mit 5 bis 6 Ringgliedern, wobei 1 bis 30 2, vorzugsweise 1 Heteroringglieder, nämlich O, N bzw. S vorhanden sind und wobei 4 bis 10 Kohlenstoffatome, gewöhnlich 4 bis 8 Kohlenstoffatome, und wenn es sich um heterocyclische Verbindungen handelt, vorzugsweise 4 bis 6 Kohlenstoffatome, und wenn es sich um carbocyclische Verbindungen handelt, 35 vorzugsweise 6 bis 8 Kohlenstoffatome vorliegen.

Das ENZ-Konjugat der vorstehend angegebenen Verbindungsreihe hat die Formel

X

G0„D I 2

ENZ-(C-NHA rGNHGHGH2 Z) 1

worin alle Symbole wie vorstehend definiert sind. 45 Der modifizierte Inhibitor wird in einer aktiven oder aktivierten Form verwendet, so dass er in der Lage ist, mit verfügbaren, mit Carboxyl reagierenden Gruppen von ENZ, z. B. Amino- und Hydroxylgruppen, zu reagieren.

Für die Carboxygruppe wird ein gemischtes Anhydrid, ein so N-Hydroxysuccinimid, ein p-Nitrophenyl, ein Phenylthio- usw. -Esterderivat oder ein Carbodiimid als Kupplungsmittel verwendet, während die Imidat-Ester und die Isothiocyanate direkt für die Konjugation mit ENZ verwendet werden. Die Reaktion wird bei mässigen Temperaturen, die im allgemeinen 55 im Bereich von etwa -5 bis 30 °C liegen, durchgeführt, wobei ein gemischtes wässriges Puffermedium verwendet wird, das gewöhnlich einen milden alkalischen pH-Wert im Bereich von etwa 7 bis 10 hat. Als Hilfslösungsmittel kann z. B. Hexamethyl-phosphoramid verwendet werden. Dieses wird gewöhnlich in 60 Mengen von etwa 10 bis 40%, vorzugsweise von etwa 20 bis Vol.-% verwendet.

Das Mol-Verhältnis zwischen dem Inhibitor zu den ENZ-Molekülen liegt im allgemeinen zwischen etwa 1:1 bis 20:1, üblicherweise zwischen etwa 3:1 bis 10:1.

65 Der Inhibitor kann in mehreren Anteilen oder auf einmal zugesetzt werden, und die Reaktionszeit liegt im allgemeinen zwischen etwa 1 Minute und etwa 48 Stunden. Danach kann das Reaktionsgemisch in üblicher Weise aufgearbeitet werden.

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Vorzugsweise wird das Gemisch chromatographiert, um allen nicht umgesetzten Inhibitoren vom ENZ-gebundenen Inhibitor abzutrennen. Ein bequemes chromatographisches Material ist Sephadex. Man kann die Fraktionen isolieren, ihre Enzymaktivität bestimmen und die Fraktionen mit Enzymaktivität sammeln. Anstelle des modifizierten T-3 oder T-4, das durch Kombination des T-3 oder T-4 mit einer Dicarbonsäure gebildet wird, kann man Desamino-T-3 oder -T-4 mit ENZ konjugieren. Beim T-3 bzw. T-4 muss die Aminogruppe geschützt werden, wenn ENZ mit der Aminosäure konjugiert wird, während beim Des-aminopolyjodthyronin keine Schutzgruppe erforderlich ist und die Carboxygruppe in der gleichen Weise wie die anderen Car-boxygruppen aktiviert werden kann.

Das Desaminopolyjodthyronin bzw. sein monocyclisches Analoges sind durch die nachstehend angegebene Formel definiert:

H02CCH2(CH2)tZ

worin Z die vorstehend angegebene Bedeutung hat und 10 oder 1 ist; das ENZ-Konjugat dieser Verbindungen hat die nachstehend angegebene Formel:

ENZ-(COCH2(CH2)tZ)nl worin alle Symbole wie vorstehend definiert sind.

Das ENZ-gebundene-T-3 oder -T-4 ist normalerweise zu mindestens etwa 50% desaktiviert (verglichen mit der Enzymaktivität vor der Konjugation) gewöhnlich mindestens etwa 65% und nicht mehr als etwa 99,5%. Zweckmässig sollte das Enzym fast vollständig desaktiviert sein, und seine Aktivität sollte bei Zusatz von überschüssigem Anti-T-3 oder -T4 praktisch vollständig wiederhergestellt werden. Es wurde jedoch gefunden, dass das konjugierte Enzym bei der Bindung an den Rezeptor bis zwischen etwa 5 bis 60% der ursprünglichen Aktivität des unkonjugierten Enzyms, gewöhnlich zwischen etwa 10 bis 50% der ursprünglichen Aktivität des unkonjugierten Enzyms aktiviert wird. In erster Linie kommt es auf die Spannweite der gemessenen Einheiten zwischen ENZ-gebunde-nem-T-3 oder -T4 in Abwesenheit des Antikörpers bzw. in Anwesenheit des überschüssigen Antikörpers an. Unter einem Überschuss versteht man, dass genügend Antikörper vorhanden sind, um praktisch alles verfügbare T-3 oder T4 zu binden.

Das Enzym ist zweckmässig mitochondrische Malatdehydrogenase aus Schweineherzen oder Triosephospatisomerase aus Kaninchenmuskeln.

Anti-T-3 oder -T-4

Die geeigneten Antikörper werden durch Injektion eines an T-3 oder T-4 gebundenen Antigens in ein Wirbeltier, gewöhnlich ein Haustier, z. B. ein Schaf, ein Kaninchen oder eine Ziege, erzeugt. Da das Antigen normalerweise ein Polypeptid oder Protein ist, das normalerweise ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis 10 Millionen hat, wird das konjugierte Antigen durch Kombination eines T-3- oder T-4-Analogen mit dem antigenen Polypeptid oder Protein gebildet. Es kann entweder das gleiche oder ein anderes Analoges, wie es für die Konjugation mit ENZ gebraucht wird, verwendet werden. Neben den Analogen, die zur Herstellung des Konjugats verwendet werden, können auch andere Analoge verwendet werden. Weiterhin kann Thyroglobulin zur Herstellung der Antikörper verwendet werden.

Je nach dem verwendeten Analogen können verschiedene, aus der Literatur bekannte Methoden zur Herstellung der Antigene verwendet werden. Die Antigene haben mindestens ein Analogmolekül, vorzugsweise ein Molekül auf etwa 2000 bis etwa 50 000 Molekulargewichtseinheiten des Antigens. Das Verhältnis zwischen den T-3- oder T-4-Analogen und dem

Molekulargewicht nimmt mit abnehmendem Molekulargewicht des Antigens zu.

Die Injektion des Antigens in das Tier erfolgt in der üblichen Weise, obgleich es vorteilhaft sein kann, vollständiges Freundsches Adjuvans mit der Booster injection zu verwenden.

Es kann eine grosse Vielzahl von Proteinen als Antigene verwendet werden, z. B. Albumine, Globuline, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und dergleichen.

Puffer

Es können die unterschiedlichsten Puffer verwendet werden, z. B. Phosphat-, Carbonat-, Glycinat-, Tris- und ähnliche Puffer. Phosphatpuffer sollten nicht in hohen Konzentrationen verwendet werden, und zwar vorzugsweise in Konzentrationen von weniger als etwa 0,1-molar. Gewisse Puffer sind vorzuziehen, beispielsweise Glycinat- oder Triäthanolamin-Puffer.

Andere Zusätze

Je nach dem Ablauf der Reaktion sind die Substrate für MDH Malat und NAD oder Oxaloacetat und NADH. Für Triosephosphatisomerase (TIM) wird die enzymatische Reaktion des Enzyms mit einem zweiten Enzym gekoppelt, so dass eine spektrophotometrische Bestimmung möglich ist. Das Analysenmedium enthält also das Substrat für TIM, Glycerinaldehyd-phosphat, NADH und a-Glycerophosphatdehydrogenase. Das zuletzt genannte Enzym und NADH werden in einem beträchtlichen Überschuss verwendet, so dass sie nicht die geschwindigkeitsbestimmenden Substanzen sind.

Zweckmässig wird eine kleine Menge Äthylendiamintetra-essigsäure zugesetzt, um das Bakterienwachstum zu vermindern und Schwermetalle zu binden. Ein Protein sowie Glycerin können dem Analysenmedium ebenfalls zugesetzt werden, um die Enzymstabilität zu verbessern. Weitere Stabilisatoren, wie Dithioerythrit oder andere Antioxidantien können ebenfalls zugesetzt werden. Weiterhin können kleine Mengen an Natriumazid als Konservierungsmittel zugesetzt werden.

Analysenverfahren Reagenslösungen

Die verwendete Pufferlösung hat normalerweise eine solche Konzentration, dass im Analysenmedium eine Konzentration von etwa 0,001- bis 0,5-molar, gewöhnlich von etwa 0,01-bis 0,2-molar und vorzugsweise von etwa 0,05- bis 0,15-molar erhalten wird. Das zugesetzte Protein, das zweckmässig ein Albumin, wie Kaninchenserumalbumin und/oder Gelatine ist, liegt im fertigen Analysengemisch im allgemeinen in Mengen von etwa 0,005 bis 0,5 Gew.-%, gewöhnlich in Mengen von etwa 0,01 bis 0,2 Gew.-%, vor. Glycerin kann in Mengen von 0,1 bis 5, gewöhnlich in Mengen von 0,4 bis 4 Gew.-% vorliegen. Der pH-Wert der Lösung liegt im allgemeinen zwischen etwa 6,0 und 10,5, gewöhnlich zwischen etwa 7 und 10,5, zweckmässig zwischen etwa 8 und 10 und vorzugsweise zwischen 8,5 und 10,5, wenn NAD und Malat oder NADH und Oxaloacetat verwendet werden; er liegt vorzugsweise zwischen 7 und 9, wenn Glycerinaldehydphosphat verwendet wird.

Im Analysenmedium kann die Konzentration an ENZ innerhalb weiter Bereiche schwanken; sie liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von etwa IO-5- bis 10~12- molar, gewöhnlich von etwa 10~7- bis 10_11-molar. Die Antikörperkonzentration hängt von dem Verhältnis zwischen den Antikörper-Bindungsstellen und der Konzentration der an ENZ gebundenen Inhibitoren ab. Im allgemeinen beträgt das Verhältnis der Bindungsstellen zu T-3 oder T-4 (als ENZ-gebundenes-T-3 oder -T-4) mindestens 0,5 und nicht mehr als 1000, üblicherweise etwa 1 bis 100 und zweckmässig etwa 1 bis 25. Gewöhnlich wird eine ausreichende Menge Antikörper zugesetzt, um 25 bis 75, vorzugsweise 25 bis 50% der wiedergewinnbaren Enzymaktivität zu

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gewinnen.

Bei abnehmenden Bindekonstanten werden grössere Mengen an Antikörpern benötigt. Die spezifische Menge des in einer bestimmten Analyse verwendeten Antikörpers wird normalerweise empirisch bestimmt.

Andere Zusätze, die gegebenenfalls in kleineren Mengen zugegeben werden können, sind Äthylendiamintetraessigsäure, die in Mengen von etwa 0,001 bis 0,1 Gew.-% vorhanden sein kann, Natriumazid, das in Mengen von etwa 10~5- bis 10~3-molar vorhanden sein kann, und ein oberflächenaktives Mittel, wie Triton X-100, das in Mengen von etwa 0,0001 bis 0,03 Gew.-% vorhanden sein kann.

Wird MDH verwendet, so werden je nach der Richtung der Reaktion entweder Malat und NAD oder Oxaloacetat und NADH verwendet, wobei die zuerst genannten Substanzen bevorzugt werden. Die Konzentration dieser Substanzen be-einflusst unmittelbar die Empfindlichkeit der Analyse und muss empirisch bestimmt werden, um die Differenz der Reaktionsgeschwindigkeiten in Anwesenheit und in Abwesenheit des zugesetzten Antikörpers zu optimieren. Die Konzentration an Malat und Oxaloacetat ist im allgemeinen etwa 0,01- bis 0,5-molar, insbesondere etwa 0,05-bis 0,3-molar. Die Konzentration an NAD oder NADH ist im allgemeinen etwa 0,01- bis 0,05-molar, üblicherweise etwa 0,005- bis etwa 0,2-molar. Normalerweise werden die Konzentrationen an Enzym, Antikörper und Substraten so gewählt, dass die Empfindlichkeit der Analyse optimiert wird.

Wird TIM verwendet, so liegt das Glyceraldehydphosphat im allgemeinen in einer Konzentration im Bereich von etwa 10"1- bis 10~4-molar vor; a-Glycerophosphatdehydrogenase wird im allgemeinen in Mengen von etwa 10~5- bis 10~9-molar verwendet, während die NADH-Konzentrationen im allgemeinen zwischen etwa 10-2- und 10_4-molar liegen.

Die einzelnen Reagenzien können zweckmässig in Form von wässrigen Lösungen zugesetzt werden. Normalerweise ist ein grosser Anteil der gesamten Analysenprobe die Pufferlösung.

Die Analysenstufen

Die Reihenfolge der Kombination der einzelnen Reagenzien ist nicht kritisch, obgleich einige Reihenfolgen bevorzugt werden und in einigen Fällen eine bestimmte Reihenfolge gegenüber einer anderen vorgezogen wird. Nach Zugabe eines bestimmten Reagens oder nach Zugabe aller Reagenzien kann eine Inkubation vorgenommen werden. Gewöhnlich wird das Analysengemisch vor dem Beginn der Geschwindigkeitsmessung nicht mehr als 10 Minuten in Gegenwart der Enzymsubstrate inkubiert.

Alle Reagenzien können gleichzeitig zugegeben werden. Es kann aber auch die Probe, z. B. Serum, Pufferlösung und Antikörper, kombiniert werden, worauf gegebenenfalls eine Inkubation folgt. In den meisten Fällen werden der Antikörper und das konjugierte ENZ vor der Zugabe der Probe nicht konjugiert. Wenn aber ein einwertiger Antikörper verwendet wird, um eine Präcipitinbildung zu vermeiden, so kann es für gewisse Anwendungen erwünscht sein, ein Gemisch aus Antikörper und Enzym aufzubewahren.

Je nach der Reihenfolge der Zugabe verlaufen die Ereignisse unterschiedlich. Werden die Probe und der Antikörper vereinigt, so wird das zu bestimmende Hormon an den Antikörper gebunden, wobei die verfügbaren Stellen zur Bindung an das ENZ-gebundene-T-3 oder -T4 vermindert werden. Die Konzentration der verfügbaren Bindungsstellen ist deshalb eine Funktion der Menge von T-3 oder T-4 in der Probe. Wenn das ENZ-gebundene-T-3 oder -T-4 zugesetzt wird, so ist die Menge des Antikörpers, die sich mit dem konjugierten T-3 oder T-4 verbindet, eine Funktion von T-3 oder T-4 in der Probe. Diese Arbeitsweise ist weniger empfindlich gegenüber Unterschieden in den Bindungskonstanten zwischen T-3 oder T-4 und ENZ-gebundenem-T-3 bzw. -T-4.

Man kann aber auch die Probe, den geeigneten Antikörper und das konjugierte ENZ kombinieren und das freie T-3 oder T-4 mit dem an ENZ konjugierten T-3 oder T-4 bezüglich der verfügbaren Bindungsstellen in Wettbewerb treten lassen.

Gegebenenfalls kann das Analysengemisch nach jeder Zugabe eines Reagens inkubiert werden, entweder vor oder nach der Zugabe der Enzymsubstrate oder der anderen Reagenzien. Die Inkubation kann etwa 2 Minuten bis 1 Stunde dauern und wird im allgemeinen bei Temperaturen im Bereich von etwa 15 bis 40 °C, gewöhnlich bei etwa 25 °C (Raumtemperatur) bis 37 °C durchgeführt.

Nach Zugabe des Gemisches zu den Substraten für das Enzym kann das Gemisch bis etwa 10 Minuten vor der Anfangsablesung inkubiert werden; diese Ablesung kann entweder mit einer Strömungszelle oder mit einer Küvette vorgenommen werden. Die Geschwindigkeit wird bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 40 °C, gewöhnlich bei etwa 25 bis 37 °C, bestimmt. Im allgemeinen dauern die Ablesungen etwa 0,1 bis 45 Minuten, gewöhnlich etwa 0,5 bis 2 Minuten, wenn eine Strömungszelle verwendet wird, und etwa 5 bis 45 Minuten, wenn eine Küvette verwendet wird. Messperioden von etwa 5 bis 20 Minuten sind für gewisse automatisierte Instrumente geeignet.

Verwendet man Standards mit bekannten Mengen an T-3 oder T-4 im Serum, so kann man eine Eichkurve aufstellen, die zur Bestimmung von T-3 oder T-4 in einer unbekannten Probe verwendet werden kann.

Obgleich spektrophotometrische Methoden zur Bestimmung des Verlaufes der Enzymreaktion am bequemsten sind (d. h. durch Bestimmung des Absorptionsspektrums) können auch andere Methoden angewendet werden, z. B. Fluorimetrie, Titrimetrie usw.

Die nachstehenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung der Erfindung. Alle Temperaturen sind in °C, falls nichts anderes angegeben ist. Alle Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, falls nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

N-Methyl, N-Carboxymethylglycyl-Thyroxin-Methylester (T-4-MEMIDA)

In einen 25-ml-Kolben mit Rührer und Membranstopfen wurden 1,054 g (1,27 x 10~3 Mol) des Methylesters von Thyro-xinhydrochlorid eingebracht. Das Thyroxinester-Hydrochlorid wurde unter einer Argonatmosphäre in 8 ml Dimethylform-amid (DMF) gelöst, worauf 10 ml trockenes Tetrahydrofuran (THF) zugesetzt wurden; schliesslich wurden 253 (il trockenes Triäthylamin zugesetzt.

Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt, worauf 0,279 g (2,16x 10~3 Mol) N-Methyliminodiessigsäureanhydrid in 2,5 ml trockenem THF auf einmal zugesetzt wurden. Die Reaktion setzte offensichtlich sofort ein. Die flüchtigen Substanzen wurden unter Vakuum in einem Drehverdampfer entfernt, wobei eine schaumartige feste Substanz zurückblieb, die in 25 ml THF gelöst wurde. Die THF-Lösung wurde mit einem Gemisch aus 30 ml entionisiertem Wasser und 50 ml Äthylacetat extrahiert. Nach der Extraktion und Trennung wurde die wässrige Schicht dreimal mit je 25 ml Äthylacetat extrahiert. Die organischen Schichten wurden dann vereinigt, einmal mit 50 ml gesättigter NaCl-Lösung extrahiert und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abnutschen der organischen Schicht wurde das Lösungsmittel in einem Drehverdampfer entfernt, wobei eine feste weisse Substanz erhalten wurde, die in 30 ml THF gelöst wurde. Dem THF wurden 35 ml Chloroform zugesetzt, die Lösung wurde unter Rückfluss erhitzt, und n-Heptan wurde langsam zugegeben. Das Volumen der Lösung wurde solange vermindert, bis eine dauerhafte Trübung auftrat.

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Die Lösung wurde auf Raumtemperatur und dann in einem Gefrierschrank abkühlen gelassen, wobei ein weisses, flockiges Produkt erhalten wurde, das mit 1-Hexan gewaschen und unter Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet wurde. Es wurden 1,26 g (75%) eines weissen, flockigen Produktes erhalten. 5

Beispiel 2

Carboxymethoxyacetyl-Thyroxin-Methylester(DGMA)

Zu einer Lösung von 1,65 g des Methylesters von Thyroxin-hydrochlorid in 80 ml trockenem THF und 30 ml Chloroform in io einem gegen Licht geschützten Kolben wurden 300 jjJ Tri-äthylamin injiziert, während das Gemisch gerührt wurde. Dann wurden 255 mg (0,0022 Mol) Diglykolsäureanhydrid zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Die Lösung wurde dann dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat 15 getrocknet und die flüchtigen Bestandteile wurden in Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde auf einer 30-g-Sephadex-LH-20-Säule gereinigt, wobei eine Lösung von 20% Methanol in Di-chlormethan als Eluierungsmittel verwendet wurde. Die klaren Fraktionen wurden gesammelt, das Lösungsmittel entfernt und 20 der Rückstand mit Wasser aus Methanol ausgefällt, wobei 1,53 g Substanz (84%) erhalten wurden.

Beispiel 3

(N-Carboxymethyl-3-Aza-3-methylglutaramsäureamid von 25 Methylthyroxinat)-Konjugat zu MDH.

A. Einer gerührten Lösung von 0,201 g (0,22 mMol) T-4-MEM1DA, 1 ml trockenem THF, 25 mg (0,22 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 30 jxl trockenem Triäthylamin von

0° wurden 0,048 g (0,25 mMol) ECDI zugesetzt. Das Gemisch 30 wurde 35 Minuten bei 0°, dann 14 Stunden bei 4° gerührt.

Zu 0,033 g (0,44 mMol) Glycin in 1,5 ml entionisiertem Wasser und 0,5 ml Pyridin, die mit 1 n NaOH auf einen pH-Wert von 9 eingestellt waren, wurde bei 0 °C die vorstehend angegebene Lösung unter kräftigem Rühren zugetropft. Nachdem das Rüh- 35 ren bei 4 °C 36 Stunden im Dunklen fortgesetzt worden war, wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der Rückstand wurde in 5 ml abs. Äthanol gelöst und der Äthanol abgedampft, wobei die Behandlung mit Äthanol dreimal wiederholt wurde, um einen weissen schaumigen Festkörper zu erhalten. 40

Der Rückstand wurde in 10 ml Methanol gelöst, und die Lösung wurde in 15 ml entionisiertes Wasser gegossen und dreimal mit jeweils 25 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylace-tatschichten wurden kombiniert, mit 25 ml gesättigter Kochsalzlösung extrahiert und über MgSC>4 getrocknet. 45

Die flüchtigen Substanzen wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 2 ml Methanol gelöst und auf Silikagel chromatographiert (Ät3N:CH30H:CHzCl2-2,l :10:90). Das Produkt wurde mit CH3OH/CH2CI2 im Verhältnis 1:1 desorbiert, das Gemisch filtriert, die flüchtigen Substanzen abgedampft 50 und der Rückstand in 5 ml THF gelöst und erneut filtriert. Nach der Entfernung der flüchtigen Substanzen wurde der Rückstand in THF aufgenommen und aus THF/HCCla/Cyclohexan umkristallisiert, wobei eine Ausbeute von 0,046 g (21,6%) erhalten wurde. 55

B. In ein 1-ml-Gefäss wurden 4,9 mg mit radioaktivem C14 markiertes N-Carboxymethyl-3-aza-3-methylglutaramsäure-amid von Methylthyroxinat, gelöst in 39 jo.1 DMF eingefüllt und auf 4 °C abgekühlt. Der DMF-Lösung wurden unter Rühren 51

jil einer 0,11 -molaren ECDI-Lösung in DMF von 4° sowie 10 ^1 6o 0,5-moIarer N-Hydroxysuccinimid-Lösung in DMF von 4° zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht im Dunklen gerührt.

C. Mitochondrisches Schweineherz-MDH wurde gegen 0,05 m Carbonatpuffer (pH = 9,0) dialysiert, wobei 4 ml einer 1,31 x 10_5-molaren Lösung von MDH erhalten wurden. Der 65 Lösung wurden 445 ul DMF mit einer Geschwindigkeit von 15 ul/min zugegeben. Der vorstehend hergestellte Ester wurde in Anteilen von 2 jo.1 zugesetzt, und die Enzymaktivität wurde nach einer Wartezeit von 5 Minuten bestimmt. In einer ersten Reaktion wurden 5 |il Ester verwendet, während in einer zweiten Reaktion 10 jj.1 zugesetzt wurden, wobei ein Verhältnis von Thyroxin zu MDH von 4,1 bzw. 7,4 eingestellt wurde.

Beide Reaktionsgemische wurden dreimal gegen 300 ml 1-molare KzHP04-Lösung (pH = 9,8) einmal gegen 300 ml 0,05-molaren Carbonatpuffer (pH = 9,0) und dann zweimal gegen den Phosphatpuffer dialysiert. Die beiden Reaktionsgemische wurden dann bei 4° an einer Sephadex G-50M-Säule (0,9x54 cm), die mit dem Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gesetzt worden war, chromatographiert und mit dem gleichen Phosphatpuffer bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 Tropfen/min eluiert und in Fraktionen von jeweils 20 Tropfen gesammelt. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, das Volume« mit dem Phosphatpuffer auf 5 ml eingestellt, und ein Anteil von 0,5 ml wurde gegen einen Anteil von 50 ml entionisiertem Wasser bei 4° dialysiert. Es wurde die Radioaktivität eines Ali-quots bestimmt, und, unter der Annahme, dass kein Protein verlorengegangen war, betrug die Anzahl der Haptene je Proteinmolekül 2,0 bzw. 3,0.

Beispiel 4

T-4-MEMIDA-Konjugat zu Malatdehydrogenase

In 250 jxl trockenem DMF wurden 10 mg (11 jiMol) T-4-MEMIDA und 1,3 mg N-Hydroxysuccinimid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde unter einer Stickstoffatmosphäre unter Rühren auf 0° gehalten, worauf 2,3 mg ECDI zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde auf 0° gehalten, bis sich das gesamte ECDI gelöst hatte. Die Lösung wurde bei 4° über Nacht stehengelassen.

Es wird eine allgemeine Arbeitsweise zur Herstellung des Konjugats mit grösseren oder geringeren Haptenzahlen angegeben, was von der Menge des T4-MEMIDA-Hydroxysuccin-imidesters im Verhältnis zu MDH abhängt. Zu 4 ml einer gerührten Lösung von MDH (aus Schweineherzen, mitochon-drisch, Miles, 5,0 mg/ml) in Carbonatpuffer (pH = 9,2) wurde 1 ml DMF gegeben. Die drauffolgenden Zugaben des T-4-MEMIDA-Esters erfolgten in Abständen von etwa 60 bis 90 Minuten, wobei Aliquots entnommen und auf Enzymaktivität untersucht wurden. Die nachstehende Tabelle zeigt die Reihenfolge der Zugabe, die Menge der Zusätze, den Zeitpunkt der Zugabe, das Verhältnis zwischen zugesetztem T-4 und MDH und die beobachtete prozentuale Desaktivierung. Für die Bestimmungen der Konjugatzahlen wurden 2 bis 20 jj.1 des Konjugationsgemisches zu 0,5 ml Im Kaliummonohydrogen-phosphat bei 0° gegeben. Zur Bestimmung der Enzymaktivitäten wurden 2 bis 20 jü - Aliquots des verdünnten Konjugats mit 0,l%igem Kaninchenserumalbumin in Glycinpuffer (0,1 m, pH = 9,5) dem 100 |il 0,108 m NAD und 100 ul 2m Natriummalatlö-sung (pH = 9,5) zugesetzt waren, auf 0,8 ml verdünnt. Die Geschwindigkeiten wurden zwischen 60 und 120 Sekunden nach der Einführung in ein Gilford-Spektrophotometer, Modell 300-N bei 30° gemessen.

Uhrzeit Zugabe Gesamtvo- T4/MDH T4-2 %

von lumen1 Konjugat Desaktivierung

T-4-Ester |xl

Ml

10:34 13 4996 0/1 0

11:24 5007 2/1

5003 2/1 30,1

1 ml als Konj.c entnommen 1,3 11:30 10,5 4011 4/1

4009 4/1 85,7

1 ml als Konj.d entnommen 2,8 13:10 8 3001 6/1

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Uhrzeit Zugabe Gesamtvo- T-4/MDH T-4-2 %

von lumen' Konjugat Desaktivierung

T-4-Ester p.1

13:37

2991 6/1

94,0

1 ml als Konj.e entnommen

3,7

13:58

5,5 1977 8,1/1

14:49

4 1941 9,6/1

98,8

1 ml als Konj.f entnommen

5,6

1 Die Proben wurden zur Bestimmung der Enzymaktivität, die nicht angegeben ist, periodisch entnommen, was das angegebene Gesamtvolumen beeinflusst.

1 Anzahl der T-4-Einheiten, gebunden an MDH.

Beispiel 5

T-4-MEMIDA-Konjugat an Triosephosphatisomerase (TIM)

In 500 (il trockenes DMF in einem Glasröhrchen wurden

6.0 mg (6,8 (iMol) T-4-MEMIDA und 0,8 mg (7,3 jiMol) N-Hydroxysuccinimid gegeben; das Röhrchen wurde mit trok-kenem Argon gespült und bedeckt, und das Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt. Dem gerührten Gemisch wurden dann 1,5 mg ECDI zugesetzt, und das Röhrchen wurde mit trockenem Argon gespült und gerührt, bis sich alles gelöst hatte. Das Röhrchen wurde trockengewischt, in einen abgedeckten Kunststoffbehälter mit einem Trockenmittel (Drierite®)

gestellt, mit Folie umwickelt und über Nacht bei 4° unter Rühren stehengelassen.

Zu 1 ml Triosephosphatisomerase (2 mg) in wässrigem Carbonatpuffer (0,1-molar, pH = 9,2) bei 4° wurden 0,3 ml DMF langsam mit einer Injektionsspritze gegeben. Die Esterlösung wurde langsam in Anteilen mit Hilfe einer Injektionsspritze zugesetzt, und die Enzymaktivität wurde überwacht. Als das Enzym zu etwa 42% desaktiviert war, wurde DMF zugesetzt, um eine Lösung mit 50 Vol.-% DMF zu erzeugen.

Das kalte Reaktionsgemisch wurde durch eine Sephadex G-25-Säule (mittlere Säule), die mit 0,1 m Carbonatpuffer (pH = 9,2) ins Gleichgewicht gebracht worden war, hindurchgeleitet. Die Säule war eine 50-ccm-Bürette mit einem Durchmesser von

1.1 cm und einem Bettvolumen von etwa 19 ml. Die Eluierung erfolgte mit einer Lösung aus 60 Volumteilen einer wässrigen Lösung von 0,1m Carbonatpuffer (pH = 9,2) und 0,3m Ammoniumsulfat sowie 40 Teilen DMF. Die Fraktionen, deren Volumen von etwa 1 bis 4 ml schwankte, wurden gesammelt. Die Fraktionen 5 und 6 wurden vereinigt (2,4 ml) und zuerst gegen etwa 100 ml wässriges, 20 Vol.-%iges DMF mit 0,02m Triäthanolamin (TEA) (pH = 7,9) und dreimal gegen je 250 ml wässriges 0,02-molares TEA (pH = 7,9) dialysiert. Das Verhältnis zwischen konjugiertem T-4 zu Enzym betrug etwa 6:1.

Beispiel 6

Desaminothyroxin-Konjugat zu MDH

9,1 x 10~3 g Desaminothyroxin (1,2 x 10~5 Mol), 1,4 x 10-3 g (l,2x 10"5 Mol) NHS und 0,25 ml trockenes DMF wurden nacheinander in ein Reaktionsgefäss von 1 ml eingefüllt. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem Eisbad gekühlt, worauf 2,5 x 10~3 g ( 1,3 x 10~5 Mol) ECDI unter einer Stickstoffschicht zugegeben wurden. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4° gerührt.

Unter Kühlen auf einem Eisbad und unter Rühren wurden 0,23 ml DMF langsam zu 1,9 x 10-3 g (2,8 x 10~8 Mol) MDH in 0,83 ml 0,05m NaHC03-Na2CCb (pH = 9,0) zugegeben. Dann wurde die vorstehend angegebene Esterlösung (5,8 jil) unter Rühren zugegeben, und das Rühren wurde noch 1 Stunde fortgesetzt, während die angegebene Temperatur aufrechterhalten wurde. Das Konjugationsgemisch wurde einer Gelfiltration auf drei Sephadex-G-50M-Kolonnen mit den Abmessungen 0,9 x 13

cm unterzogen, wobei ein Desaminothyroxin/MDH-Konjugat erhalten wurde, das zu 91% desaktiviert war und das eine Hap-tenzahl von 2,5 (nach der Jodanalyse hatte). Die Enzymaktivität des Konjugats wurde um 30% aktiviert, wenn es mit Anti-T-4-Serum behandelt wurde.

Beispiel 7

T-4-M EM ID A-Gly ein

Ein 3 ml Pierce Reacti-Vial® wurde mit 0,201 g (2,18 x 10~4 Mol) T-4-MEMIDA und 0,025 g (2,17 x IO"4 Mol) N-Hydroxysuccinimid (NHS) beschickt. Dann wurden 2 ml trockenes THF und 30 (il (2,15x 10~4 Mol) trockenes Triäthylamin zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde mit Hilfe eines Eisbades auf 0° abgekühlt. Dann wurden 0,048 g ECDI (2,50 x 10-4 Mol) in Pulverform zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 35 Minuten bei 0° gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in einen kalten Raum (2°) gebracht und 15 Stunden gerührt. Ein Dünnschichtchromatogramm des Reaktionsgemisches nach 15 Stunden zeigte zwei Flecken mit Ri-Werten von 0,06 (T-4-MEMIDA) und 0,60 (T-4-MEMIDA-NHS-Ester) auf einer analytischen Silikagelplatte, wobei 10% Methanol in Dichlormethan als Spülmittel verwendet wurden. Ein 25-ml-Kolben mit Rührstab und Membranstopfen wurde mit 0,033 g (4,39 x 10~4 Mol) Glycin, dann mit 1,50 ml destilliertem Wasser, 0,50 ml Pyridin und 100 jj,1 ( 1,00x 10~4 Mol) l.O-n-NaOH beschickt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Hilfe eines Eisbades auf 0° abgekühlt. Unter kräftigem Rühren wurde die vorstehend hergestellte T-4-MEMIDA-NHS-Esterlösung zugetropft, und nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch in einem kalten Raum (2°) 36 Stunden gerührt. Die Lösungsmittel wurden dann mit einem Drehverdampfer entfernt, wobei ein öliger, nach Pyridin riechender fester Stoff erhalten wurde. Dieser feste Stoff wurde in 10 ml Methanol aufgenommen und in 15 ml H2O gegossen, und die Lösung wurde zweimal mit je 25 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden einmal mit 25 ml gesättigter Kochsalzlösung extrahiert und dann über wasserfreiem MgSOt getrocknet. Nach dem Filtrieren wurde das Äthylacetat auf einem Drehverdampfer abgezogen, wobei ein weisser kristalliner Feststoff hinterblieb. Der feste Stoff wurde in 2 ml Methanol aufgenommen und auf vier präparative Silikagelplatten für die Dünnschichtchromatographie ausgebreitet, welche in Triäthylamin/Methanol/Dichlor-methan (2,1:10:90) entwickelt wurden. Die Platten wurden zweimal behandelt, dann abgekratzt und das Produkt mit Me-thanol/Dichlormethan (1:1) desorbiert. Das Silikagel wurde abfiltriert, und das Filtrat im Vakuum auf 2 ml eingeengt. Ein Dünnschichtchromatogramm des Produktes in THF zeigte nur einen Fleck mit einem RpWert von 0,50 auf einer Silikagelplatte für die analytische Dünnschichtchromatographie in Triäthylamin/Methanol/Dichlormethan (2,1:10:90). Das Produkt wurde aus THF/Chloroform/Cyclohexan umkristallisiert.

Beispiel 8

T-4-MEMIDA-Glycylglycin

In ein 3-ml-Pierce-Reacti-Gefäss wurden 0,202 g (2,20 x 10-4 Mol) T-4-MEMIDA und 0,025 g (2,17 x 10"4 Mol) NHS eingefüllt. Dann wurden 2 ml THF und 31 jj.1 trockenes Triäthylamin zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde auf 0° abgekühlt. Dann wurden 0,051 g (2,66 x 10-4 Mol) ECDI zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde in einem kalten Raum (2°) 8,25 Stunden gerührt. Ein Dünnschichtchromatogramm zeigte die Bildung des T-4-MEMIDA-NHS-Esters an (RrWert 0,63 auf einer analytischen Silikagelplatte mit Triäthylamin/Methanol/Di-chlormethan im Verhältnis 2,1:10:90). Ein 25-ml-Kolben mit Rührstab und Membranstopfen wurde mit 0,058 g (4,39 x 10~4 Mol) Glycylglycin und dann mit 1,50 ml H2O und 0,50 ml Pyridin und 100 (il (l,0x 10-4 Mol) l,0n NaOH beschickt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0° abgekühlt, und die T4-MEMIDA-

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NHS-Ester-Lösung wurde unter Rühren zugetropft. Nach 2,1:10:90 entwickelt wurden. 4,0 ml MDH in einer Konzentra-

Zugabe des aktivierten Esters wurden 1,0 ml entionisiertes tion von 1,5 x 10-5 Mol in 0,05m NaHCC>3-Na2CC>3-Lösung (pH Wasser und 0,50 ml Pyridin zugesetzt. Das Reaktionsgemisch = 9,2) wurden in einen 10-ml-Rundkolben mit Rührstab und wurde in einem kalten Raum (2°) 93 Stunden gerührt, in der Membranstopfen gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde mit gleichen Weise, wie T-4-MEMIDA-Glycin aufgearbeitet, wobei 5 einem Eisbad auf 0° abgekühlt, worauf 440 ul trockenes DMF 0,018 g (Ausbeute 9%) einer braungoldenen festen Substanz mit einer Geschwindigkeit von 50 jxl zugesetzt wurden. Die erhalten wurden. Das Produkt war nach der Dünnschichtchro- Enzymaktivität wurde vor und nach Zugabe des DMF matographie auf Silikagel mit Triäthylamin/Methanol/Dichlor- bestimmt. Die 1,9 x 10_2-molare T-4-MEMIDA-GlycyIglycin-methan (2,1:10:80) homogen; der RrWert betrug 0,81, wenn die NHS-Esterlösung wurde dem Reaktionsgemisch in Aliquots Platte zweimal entwickelt wurde. io von 3-10 jxl zugesetzt, worauf die Enzymaktivität nach jeder

Zugabe bestimmt wurde. Bei Zusatz von 29 |il aktivierter Ester-Beispiel 9 lösung wurde ein zu 82% desaktiviertes Enzymkonjugat erhal-

T-4-MEMIDA-Glycin/MDH-Konjugat ten. Das Reaktionsgemisch wurde dann erschöpfend gegen

Ein 1-ml-Pierce-Reacti-Gefäss mit Rührstab wurde mit 1,0m K2HPO4 (mit l,0x 10-3M NaN3) bei 2° dialysiert. Nach der

0,049 g (5,0 x 10 6 Mol) T-4-MEMIDA-Glycin und 39 ul trocke- 15 Dialyse wurde das Konjugat durch drei Sephadex-G-50M-Säu-nem DMF beschickt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0° abge- ien (vorgequollen in 1,0m K2HPO4 mit l,0x 10"3M NaNs) gelei-kühlt, worauf 10 jxl (5,2 x 10-6 Mol) ein er 5,0 x 10~1 m -NHS-Lö- tet und mit dem gleichen Puffer eluiert. Die Säulenabmessun-sung in DMF von 0° und 51 (il (6,1 x 10~6 Mol) einer l,2x 10_1m- gen waren 0,9x55 cm, 0,9x56 cm und 0,9x56 cm, die Strö-ECDI-Lösung in DMF von 0° zugesetzt wurden; das Reaktions- mungsgeschwindigkeiten 4 bis 5 Tropfen je Minute, und es wur-gemisch wurde in einem kalten Raum (2°) 49 Stunden gerührt. 20 den 20 Tropfenfraktionen gesammelt. Die Proteinfraktionen Ein Dünnschichtchromatogramm des Reaktionsgemisches wurden unter Verwendung einer Kollodiumbeutelvorrichtung nach 49 Stunden zeigte zwei Flecken mit Rf-Werten von 0,49 jn einem kalten Raum konzentriert. Die Haptenzahl wurde (T-4-M EM IDA-Glycin) und 0,68 (T-4-MEMIA-Glycin-NHS- nach der vorstehend beschriebenen Methode zu 3,9 bestimmt. Ester) auf analytischen Silikagelplatten, die mit Triäthylamin/ Unter Verwendung der Antigenkonjugate wurden Antikör-

Methanol/Dichlormethan im Verhältnis 2,1:10:90 entwickelt 25 per hergestellt. Zunächst wurden 2 mg Konjugat injiziert. Dann wurden. MDH (4,0 ml, l,3x 10-5 Mol, 0,05 m NaHCCh-NazCCh, wurden 0,25 mg Konjugat in Abständen von zwei Wochen inji-pH = 9,2) wurde in einen 10-ml-Rundkolben mit Rührstab und ziert. Bei Schafen betrug die einzelne Injektion insgesamt 2 ml, Membranstopfen bei 0° eingefüllt, und die Enzymaktivität von denen 0,5 ml auf das Konjugat, gelöst in Kochsalzlösung,

wurde in der vorstehend beschriebenen Weise bestimmt. Dem und 1,5 ml auf Freundsches vollständiges Adjuvans entfielen. Es Reaktionsgemisch wurden 445 jj.1 trockenes DMF mit einer 30 wurden Aliquots von 0,25 ml subkutan an jeweils 4 Stellen und Geschwindigkeit von 15 (il/min zugesetzt, bis ein Reaktionsge- Aliquots von 0,5 ml intramuskulär in jedes Hinterbein injiziert, misch mit 10% DMF erhalten wurde. Die Enzymaktivität wurde Bei Kaninchen betrug das Volumen der Injektion insgesamt dann erneut bestimmt. Die 4,3 x 10~2-molare T-4-MEMIDA-Gly- 0,75 ml, wobei 25 mg des Konjugats in 0,25 ml Kochsalzlösung cin-NHS-Esterlösung wurde dem Reaktionsgemisch in Aliquots gelöst waren und 0,5 ml vollständiges Freundsches Adjuvans von 1 bis 2 jj.1 zugesetzt, und die Enzymaktivität wurde nach 35 zugesetzt wurden. Es wurden Injektionen von 0,09 ml subkutan jeder Zugabe bestimmt. 9 \x\ der vorstehend aktivierten Esterlö- an 4 Stellen und Injektionen von 0,19 ml in jedes Hinterbein sung ergaben ein zu 82% desaktiviertes Enzymkonjugat. Nach vorgenommen.

der letzten Zugabe von aktiviertem Ester wurde das Enzym- Die Tiere werden normalerweise 5 bis 7 Tage nach jeder

Reaktionsgemisch erschöpfend gegen 0,1 m K2HPO4 (mit Injektion geblutet, und die Antikörper werden nach an sich l,0x 10~3m NaN3) bei 2° dialysiert. Nach der Dialyse wurde das 40 bekannten Methoden isoliert.

Enzymkonjugat sorgfältig aus dem Dialysebeutel entfernt und Um die Brauchbarkeit des Thyroxin-MDH-Konjugats für durch zwei Sephadex-G-50M-Säulen (in 1,0m K2HPO4, mit die T-4-Analyse zu zeigen, wurden eine Anzahl von Analysen 1,0 x 10-3M NaN3 vorgequollen) hindurchgeleitet. Die Grössen durchgeführt. Bei der ersten Analysenserie wurden die Analy-der beiden Säulen waren 0,9x54,0 cm und 0,9x51,0 cm, die sen mit wechselnden Mengen an Antikörper durchgeführt, um Strömungsgeschwindigkeiten betrugen 4-5 Tropfen je Minute, 45 die Aktivitätszunahme des Enzymkonjugats mit zunehmenden und es wurden 20 Tropfenfraktionen gesammelt. Die Protein- Mengen Antikörper zu zeigen. Bei einer zweiten Analysenreihe fraktionen wurden unter Verwendung einer Kollodiumbeutel- wurden wechselnde Mengen T-4 dem Antikörper zugesetzt, um Vorrichtung in einem kalten Raum konzentriert. Die Hapten- die effektive Konzentration des Antikörpers, der zur Bindung zahl wurde zu 3,0 bestimmt. an das MDH-gebundene-Thyroxin zur Verfügung steht, zu ver so ändern. Diese Ergebnisse zeigen, dass man durch Aufstellung Beispiel 10 einer Standardkurve aus Proben mit bekannten Mengen an

T-4-MEMIDA-Glycylglycin/MDH-Konjugat Thyroxin die Menge des freien Thyroxins im Serum feststellen

0,015 g (7,8x 10~5 Mol) ECDI wurden in 0,50 ml trockenem kann, indem man die beobachteten Werte der Enzymaktivität DMF zu einer l,6x 10-1-molaren Lösung gelöst. 0,75 g mit der Standardkurve in Beziehung setzt.

(6,5 x 10~4 Mol) NHS wurden in 1,0 ml trockenem DMF zu einer 55 Das Analysenverfahren ist wie folgt: 0,8 ml einer Lösung 6,5x lO-'-molaren Lösung gelöst. Beide Lösungen wurden vor von 0,1 Gew.-% Kaninchenserumalbumin (KSA) in einem Gebrauch in einem Eisbad auf 0° abgekühlt. Ein 1-ml-Pierce- 0,1-molaren Glycinatpuffer (pH = 9,5) der 10~3 Mol EDTA ent-Reacti-Gefäss mit Rührstab wurde mit 2,4 x 10-3 g hält, wird aus der Antikörperlösung und dem MDH-gebunde-

T-4-MEMIDA-Glycylglycin und dann mit 78 jj.1 eiskaltem trok- nen-T-4 hergestellt. Die Lösung wird 45 Minuten inkubiert, kenem DMF (in einem Eisbad abgekühlt) beschickt, worauf 4 ul60 worauf Substrate (100 ul 2m Malat und 100 (il 0,108m NAD) einer 6,5x I0~1m NHS-Lösung in DMF von 0° und 18 (il einer zugesetzt werden; die Lösung wird in ein Spektrophotometer l,6x 10-1m-ECDI-Lösung in DMF von 0° zugesetzt wurden. gebracht und die Werte werden bei 30 °C als Änderung der

Das Reaktionsgemisch wurde in einem kalten Raum (2°) 20 optischen Dichte zwischen 120 und 60 Sekunden nach Einfüh-Stunden gerührt. Danach zeigte ein Dünnschichtchromato- rung in das Spektrophotometer abgelesen. Für die Konjugate gramm des Reaktionsgemisches zwei Flecken bei RpWerten 65 nach Beispiel 4 mit Schafantikörpern sind die Ergebnisse in der von 0,25 (T-4-MEMIDA-Glycylglycin) und 0,59 (T-4-MEMIDA- nachstehenden Tabelle angegeben.

Glycylglycin-NHS-Ester) auf analytischen Silikagelplatten, die in Triäthylamin/Methanol/Dichlormethan im Verhältnis

11

632343

Tabelle II

Konjugat von Beispiel 4

AbjV

c2

d2

e2

f2

Hl

%

%

%

%

Änderung

Änderung

Änderung

Änderung

0

1

+ 17

113

246

34

2

+ 17

124

358

111

3

+ 17

130

389

190

4

+ 17

126

399

290

5

+ 17

129

427

376

10

+ 17

130

467

665

15

+ 17

136

471

725

20

+ 17

139

503

829

25

+ 17

144

485

825

1. Etwa 9,0 x 10~6m AbT4, bezogen auf die Bindungsstellen K = l,12xl0"9

2. Molare Konzentration an Enzym c-5X10"10 e - l,4x 10-8 d-2.56X10"9 f-3,7xl0"8

Es wurde nun eine Reihe von Analysen durchgeführt, bei denen eine Thyroxinlösung von 9,7 mg in 25 ml 0,05-N Natriumhydroxidlösung hintereinander mit 0,05n Natriumhydroxidlösung verdünnt wurde. Die Analysen wurden durch Vereinigung von 600 jj.1 0,l%igem Kaninchenserumalbumin, 100 |il Antikörper in 0,1 m Glycinpuffer (pH = 9,5), 10-3m EDTA und 100 jo.1 der T-4-Lösung durchgeführt, und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Lösung wurde dann ein bestimmtes Volumen der MDH-gebundenen-T-4-Lösung zugesetzt, und das Gemisch wurde 10 Minuten inkubiert. Dann wurden die Substrate zugesetzt, und die Ablesungen wurden in einem Spektrophotometer bei 30 °C in der vorstehend beschriebenen Weise vorgenommen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben:

Tabelle III3

T-4-Probe

Konjugate1'2

molare Konz.

AODc

AODd

AODe

91

81

248

5xlO"10

89

83

254

5xl0"9

88

82

255

5xl0"8

90

81

249

5xl0"7

88

77

212

5xl0"6

95

54

93

5x10-5

99

56

85

1. Volumen und Konzentration des verwendeten Enzym-konjugats c — 15 jal l,llxl0"7-molar d- 5 jxl 5,12x10~7-molar e - 5 jil 2,81 x 10"6-molar

2. Anti-Thyroxin 9x 10-6-molar an Bindestellen, verdünnt auf 1:33 vor der Zugabe zu 100 jj.1

3. AODxlO3

Nach der Arbeitsweise von Beispiel 4 wurde ein anderes

Konjugat hergestellt, das auf einer Sephadex-G-50-Säule, die mit 1-molarer Kalium-Monohydrogenphosphatlösung ins

Gleichgewicht gebracht worden war, chromatographiert wurde. Die Strömungsgeschwindigkeit war gering, und es wurden Fraktionen von 20 Tropfen bis zum Röhrchen 39 gesam melt, worauf Fraktionen von 99 Tropfen gesammelt wurden.

Das Verfahren wurde mit einer zweiten G-50-Säule wiederholt, wobei jedes Mal die gesammelten Fraktionen mit Sephadex

G-200 durch Ultrafiltration konzentriert wurden. Durch UV-Analyse wurde die Anzahl der T-4-Gruppen je Enzym zu 4,3 bis 5,3 (Durchschnitt 4,8) bestimmt.

Es wurde eine Reihe von Analysen unter Verwendung verschiedener Antiserumquellen und wechselnder Thyroxinkon-zentrationen durchgeführt. Wie in der vorstehend angegebenen Arbeitsweise beschrieben ist, wurden der Antikörper und das Thyroxin in 0,l%iger, mit Glycin gepufferter KSA-Lösung kombiniert und 15 Minuten inkubiert, worauf die angegebene Menge der Enzymlösung zugesetzt wurde; das Analysengemisch wurde nochmals 10 Minuten inkubiert, die Substrate zugesetzt und das Gemisch wurde dann in ein Spektrophotometer eingeführt, wobei in der zweiten Minute die Änderung der optischen Dichteeinheiten abgelesen wurde. Das Volumen des zugesetzten Antikörpers beträgt 1 jxl, und das Volumen des zugesetzten Enzyms ebenfalls 1 jil. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Tabelle IV1

T-4-Analyse molare Konz.

Antiseren AODA

AODB

AODc

76

61

87

5x 10"5

20

24

26

5xl0"6

28

29

29

5X10-7

30

39

32

5X10-8

38

50

62

5X10"9

73

59

84

5X10-10

81

61

94

5X10-»

78

63

92

1. AODxlO3

Bei der Durchführung der T-4-Analyse unter Verwendung von TIM-T-4-Konjugat wurden folgende Reagenzien verwendet:

Reagenzien für die TIM-T-4-Analyse

Puffer: 0,02mTriäthanolamin(TEA)-HCl, pH = 7,9;

0,0054m Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA)

Kaninchenserumalbumin-Lösung: 0,2 Gew.-% KSA, in Pufferlösung

TIM-T-4-Lösung: Etwa 7x 10"3 jiMolT-4 alsTIM-T-4,in KSA-Lösung (ergibt Analysengeschwindigkeit von etwa 200 OD-Einheiten/min).

Anti-T-4-Lösung: Etwa 4 x 10_5m Anti-T-4, bezogen auf Bindestellen in KSA-Lösung.

NADH-Lösung: 2,5 mg NADH/ml in Pufferlösung (Stammlösung), hergestellt nach den TEKIT-Anweisungen und verdünnt im Gewichtsverhältnis 1:7 mit Pufferlösung).

DL-Glyceraldehyd-3-phosphatlösung (GAP): Hergestellt aus DL-glyceraldehyd-3-phosphat-Diäthylacetal, Ba-Salz von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.: 1,5 g Salz wurden so behandelt, dass ein Endvolumen von 10 ml erhalten wurde.

a-Glycerophosphat-Dehydrogenase (a-GPDH)-Lösung: 0,2 mg/ml in Pufferlösung (Boehringer-Mannheim).

Thyroxin (T-4-Lösung): 2,57 x 10-4 in KSA-Lösung.

Die Analyse wurde wie folgt durchgeführt:

Es wurde eine Anzahl von Verdünnungen der T-4-Lösung hergestellt. Zunächst wurden 0,4 ml der T-4-Lösung, 0,4 ml der TIM-T-4-Lösung und 0,4 ml der Antikörperlösung miteinander vermischt und 12 Minuten in ein Wasserbad von 30 °C gestellt. Der Lösung wurden dann 200 jil der NADH-Lösung, 25 ul der a-GPDH-Lösung und 100 jj.1 der GAP-Lösung zugesetzt. Das Analysenröhrchen wurde mit Parafilm bedeckt, und ein Aliquot

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

632343

12

wurde dann in einer Thermoküvette in einem 300N Gilford- und 30 °C abgelesen. Der Rest der Analysenlösung wurde in

Spektrophotometer eingesaugt. Die erste Ablesung wurde einem Bad von 30 °C gehalten und nach 13 Minuten abgelesen,

nach 30 Sekunden bei einer Temperatur von 30 °C in der Vor- Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben, richtung durchgeführt. Die optische Dichte wurde bei 366nm

Tabelle V

Probe Nr.

T-4-Lösung Konzentration

Abnahme der optischen Dichte in 13 min

1

0

0,543

2

3,84xl0-6

0,550

3

7,68xl0-6

0,550

4

l,54xl0-5

0,490

5

6,14x10-5

0,448

6

l,29xl0-4

0,422

7

5,14x 10-4

0,409

Die Ergebnisse der vorstehenden Tabelle zeigen, dass äus- 20 und das Gemisch gegebenenfalls inkubiert und anschliessend serst niedrige Konzentrationen sowie äusserst geringe Mengen die Enzymsubstrate zusetzt, kann man das T4 durch eine spek-an Thyroxin nach dem erfindungsgemässen Verfahren nachge- trophotometrische Ablesung über einen kurzen Zeitraum wiesen bzw. bestimmt werden können. Das Verfahren ist sehr bestimmen. Das System kann automatisiert werden, so dass die einfach und erfordert nur wenige Handhabungsstufen. Indem Proben und die Reagenzien automatisch gemischt und die man die Reagenzien in einem gepufferten Medium kombiniert 25 Ablesungen automatisch vorgenommen werden können.