CH634100A5 - Procede d'obtention de supports pour cultures cellulaires et supports obtenus. - Google Patents

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Description

La présente invention concerne le domaine des cultures cellulaires, et plus particulièrement l'utilisation de plastiques thermodurcis-sables pour l'amélioration des supports utilisés pour la croissance cellulaire.
On sait que les cultures cellulaires sont en général réalisées soit en monocouches sur des supports en présence de milieux nutritifs liquides, soit en suspension dans un milieu nutritif liquide, soit en présence d'un milieu nutritif semi-solide (agarose).
Les supports appropriés pour la croissance cellulaire sont surtout le verre neutre ou les plastiques, en général à base de polystyrène, qui ont subi un traitement spécial pour les rendre aptes à la croissance cellulaire. Ces plastiques sont à usage unique et ils sont stérilisés par un traitement physique à l'exclusion de la chaleur. Dernièrement, on a commencé à utiliser pour les cultures cellulaires des microsupports à base de verre, de Polysaccharides (Séphadex) ou de plastiques.
Les supports pour cultures cellulaires doivent être d'une nature telle que les cellules y adhèrent aisément; ils ne doivent pas être toxiques pour les cellules ni inhiber leur croissance. De plus, ils doivent permettre de réaliser aisément des observations microscopiques.
En ce qui concerne les microsupports, des essais ont été effectués avec des billes en verre ou en polystyrène; mais ces microsupports ne sont pas satisfaisants pour obtenir des cultures à l'échelle industrielle ou ne sont satisfaisants que dans certaines conditions.
A cet effet, on peut se référer à l'article de A.L. Van Wezel intitulé «Microcarrier Cultures of Animal Cells» dans l'ouvrage «Tissue Culture Methods and Application» édité par Paul F. Kruse, Jr. et M.K. Patterson, Jr., Academic Press, New York et Londres, 1973. Il est, par exemple, indiqué que les cellules n'adhèrent pas de façon suffisamment solide sur les billes plastiques, telles que les billes en polystyrène ou Rilsan ayant subi un traitement spécial. D'autre part, il est indiqué que des essais ont été effectués avec des billes de Sphérosil; ces billes ne semblent pas appropriées pour des cultures industrielles, étant donné la densité relativement élevée de ces billes dans les milieux de culture. Il est noté par ailleurs que les différents types de produits connus sous la dénomination commerciale DEAE-Séphadex n'ont pas tous les mêmes propriétés de supports pour cultures cellulaires.
Pour améliorer les propriétés des billes de DEAE-Séphadex A-50, on a déjà proposé de les revêtir de nitrocellulose (voir article de A.L. Van Wezel-cité ci-dessus).
On a maintenant trouvé un moyen pour traiter les supports pour cultures cellulaires, qui permet leur utilisation dans des conditions opératoires variées et notamment leur utilisation pour l'ensemencement, la croissance et la trypsination des cultures cellulaires, en particulier des cultures de cellules diploïdes humaines ou animales, ledit moyen de l'invention consistant à appliquer sur des supports de base un polymère thermodurcissable dans les conditions indiquées ci-après en détail.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé pour l'obtention de supports pour cultures cellulaires, qui consiste à appliquer sur des supports de base une solution d'un polymère thermodurcissable et à soumettre ensuite lesdits supports ainsi revêtus à l'action de la chaleur dans des conditions suffisantes pour permettre le durcissement dudit polymère thermodurcissable et la stérilisation dudit support ainsi revêtu.
La présente invention concerne également les supports pour cultures cellulaires constitués d'un support de base portant un revêtement thermodurci.
Dans la présente description, on désigne par supports de base tous les supports couramment utilisés dans le domaine considéré qui sont à base de verre ou de Polysaccharides; ces supports peuvent présenter une surface plane ou une surface sphérique.
A titre d'exemples de tels supports, on peut citer par exemple les boîtes de Pétri, les boîtes de Roux, les billes, notamment les billes constituées de produits connus sous la dénomination commerciale de DEAE-Séphadex et tout autre flacon en verre ou matériel utilisé pour les cultures cellulaires. Les polymères thermodurcissables qui conviennent aux fins de l'invention ne doivent pas être toxiques pour les cellules; ils doivent de préférence être transparents pour permettre les observations microscopiques; de plus, ils doivent être tels que les cellules adhèrent aisément et solidement sur lesdits supports revêtus. En ce qui concerne l'application aux microsupports, ces plastiques doivent former un film autour de chaque microsupport sans former d'agrégat. De plus, ces polymères doivent résister à un autoclavage terminal en phase liquide (stérilisation).
Parmi les polymères thermodurcissables qui conviennent aux fins de la présente invention, on peut notamment citer les produits de réaction d'un aldéhyde avec un alcool polyvinylique, par exemple les produits de réaction de formaldéhyde ou de butyraldéhyde avec un alcool polyvinylique.
A titre de polymères thermodurcissables préférés selon l'invention, on citera les produits connus sous les dénominations
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commerciales Rhovinal B et Rhovinal F vendus par la société Rhône-Poulenc-Polymères.
Les produits connus sous la dénomination commerciale Rhovinal B sont des polymères butyrals polyviniliques qui résultent de la réaction du butyraldéhyde avec des alcools polyvinyliques parmi ces produits, on préfère tout particulièrement le Rhovinal B 10/20.
Dans les dénominations ci-dessus, le premier chiffre indique la viscosité en millipoiseuilles d'une solution dudit produit à 5% de l'alcool éthylique 95° à 20°C et le second chiffre indique le pourcentage en poids des groupements alcool polyvinylique dans la molécule.
Les produits connus sous la dénomination commerciale Rhovinal F sont des formais polyvinyliques qui résultent et la réaction du formol avec un alcool polyvinylique.
Le polymères thermodurcissables sont mis en œuvre dans le procédé de l'invention sous forme de solutions dans des solvants appropriés. Les solvants qui conviennent sont les solvants desdits polymères qui sont de préférence volatils. L'utilisation de solvants non volatils nécessite des lavages intensifs pour éliminer toute trace de solvants qui seraient toxiques pour les cultures. On utilise de préférence le chloroforme, le méthanol ou des mélanges de chloroforme et de méthanol.
Les solutions de polymères thermodurcissables mises en œuvre selon le procédé de l'invention contiennent une quantité de polymère thermodurcissable suffisante pour obtenir dans les conditions opératoires un film continu permettant une culture cellulaire optimale, c'est-à-dire une multiplication cellulaire pendant au moins une semaine. Il appartiendra à l'homme de l'art de déterminer la concentration de la solution à utiliser.
A titre d'exemple, on indiquera que, lorsque le polymère thermodurcissable est du Rhovinal B 10/20, les solutions à 0,5-2%, de préférence 1 % de Rhovinal B 10/20 sont appropriées.
Les microsupports traités selon le procédé de l'invention sont de préférence lavés avant l'application de la solution de polymère thermodurcissable, à l'aide par exemple d'un tampon isotonique, tel qu'un tampon phosphate pH 7, 2, et passés à l'autoclave.
Les supports traités avec la solution de polymère thermodurcissable sont ensuite traités à la chaleur, dans un four ou un autoclave, à une température suffisante pour permettre le durcissement dudit polymère thermodurcissable et la stérilisation dudit support ainsi revêtu. En général, on opère à une température comprise entre environ 120C (autoclave) et 180°C (four).
Lorsque les supports se présentent sous forme sphérique, par exemple sous forme de fines particules d'une grosseur allant de 100 à 200 |im (après gonflement), il est avantageux de maintenir le gel constitué des fines particules en suspension dans la solution polymère thermodurcissable à une température d'environ 3TC pendant un temps suffisant, par exemple pendant 24 à 48 h, pour que le polymère thermodurcissable adhère sur toute la surface des fines particules.
Après le traitement à la chaleur dans un autoclave, les supports, en particulier les microsupports en Séphadex, doivent être lavés dans un tampon isotonique pour éliminer les traces de solvant, puis stérilisés et conservés jusqu'à leur utilisation.
Selon une variante de mise en œuvre du procédé de l'invention, il est avantageux de laver les supports (billes et microsupports) après le traitement à la chaleur avec un tampon isotonique contenant des ions Ca+ + ou Mg+ + et de les passer à l'autoclave; ce traitement améliore l'adhérence des cellules sur les microsupports.
Dans la présente description, l'expression passer dans un autoclave signifie que les supports sont traités dans un autoclave à la température d'environ 120°C pendant un temps suffisant pour la stérilisation.
Avant leur utilisation, il est avantageux de rincer les microsupports dans du milieu de culture contenant environ 10% de sérum de veau.
Les supports préférés selon la présente invention sont les supports pour cultures cellulaires, constitués, d'un support de base, tel que du verre ou des Polysaccharides, de forme plane ou sphérique, par exemple boîtes de Pétri, boîtes de Roux ou billes portant un revêtement thermodurci constitué d'un polymère résultant du produit de la réaction d'un aldéhyde et d'un alcool polyvinylique, tel qu'un polymère butyral ou formai polyvinylique.
Les supports selon l'invention peuvent être utilisés pour la culture des cellules diploïdes humaines ou animales ou toute autre cellule (explant primaire, lignée continue) adaptée à la culture en monocouches. En outre, ces supports peuvent être utilisés pour toutes les manipulations classiques d'ensemencement et de trypsination de cultures cellulaires.
Les cellules qui se multiplient sur les microsupports selon l'invention peuvent être utilisées comme substrat pour la production de virus. La récolte du virus est réalisée par prélèvement du milieu après décantation des billes. Ce virus peut être ensuite purifié pour la préparation de vaccins et d'antigènes viraux. Les cultures cellulaires obtenues par ce procédé peuvent également servir à la production d'interféron, d'enzymes ou d'hormones ou de toutes autres substances d'origine cellulaire.
La présente invention va maintenant être illustrée plus en détail par les exemples non limitatifs ci-après.
Exemple 1
Traitement d'une surface plane: boîte de Roux
On a dissous du Rhovinal B 10/20 dans du chloroforme à la concentration de 0,5 à 1%. La solution de Rhovinal a été versée dans une boîte de culture cellulaire de façon à remplir le flacon. Le contenu a été versé dans une seconde boîte, puis successivement dans toutes les boîtes. On a'laissé égoutter les boîtes pendant 5 min sur la paillasse, puis on les a stérilisées au four pendant 1 h à 180°C; pendant la stérilisation, le film de la solution de Rhovinal qui a adhéré à la surface de la boîte a été durci par la chaleur.
Exemple 2
Traitement d'une surface sphérique
On a utilisé des billes constituées du produit connu sous la dénomination commerciale DEAE-Séphadex A-50; ces billes avaient un diamètre de 80 à 100 um.
10 g de billes de DEAE-Séphadex A-50 ont été plusieurs fois lavées à l'aide d'un tampon phosphate isotonique pH 7, 2 dans un autoclave. Les billes ont été mises en suspension dans 600 ml de solution chloroformique de Rhovianal B 10/20 (11 de chloroforme contenait 15 g de Rhovinal). On a laissé la suspension ainsi obtenue pendant 1 h à 37°C. On a éliminé l'excès de solution chloroformique (phase inférieure) en conservant le gel de DEAE-Séphadex (phase supérieure). On a placé le gel 24 h à 37° C, puis 1 h à l'autoclave (120^). Les billes ont ensuite été lavées plusieurs fois pendant 24 h dans un tampon phosphate isotonique pH 7,2, puis passées à l'autoclave en présence d'un tampon phosphate contenant des ions Ca++ etMg+ + .
Les billes ainsi traitées peuvent être conservées stérilement jusqu'à leur utilisation; il est alors recommandé de les rincer une fois dans un milieu de culture contenant 10% de sérum de veau.
Exemple 3
Traitement d'une surface sphérique
On a également utilisé des billes constituées du produit connu sous la dénomination commerciale DEAE-Séphadex A-50.
Après lavage en tampon phosphate isotonique, 10 g de DEAE-Séphadex A-50 ont été rincés dans 600 ml de méthanol. Après 24 h à 37°C, on a éliminé l'excès de méthanol au-dessus du gel et on a mis les billes en suspension dans 600 ml de solution de Rhovinal B 10/20 0,5%; le solvant utilisé était constitué d'un mélange de chloroforme (75%) et de méthanol (25%). Après 48 h à 37 C, on a éliminé l'excès de solution de Rhovinal et on a traité le gel 1 h à l'autoclave (120! C). Les billes ont ensuite été lavées et rincées selon le mode opératoire décrit à l'exemple 2.
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Exemple 4
Utilisation des boîtes de Roux traitées selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1.
Dans une boîte de Roux, traitée selon l'exemple 1, on a introduit 100 ml de milieu de culture (milieu de base Eagle ou milieu minimal de Eagle) contenant environ 10% de sérum de veau; on l'a ensemencé avec 50 000 cellules diploïdes humaines par millilitre de milieu de culture. Au bout de 24 h, les cellules ont adhéré à 100% sur le support selon l'invention. Puis la culture a été poursuivie pendant 7 à 8 d de façon à obtenir une concentration finale minimale de 200 000 cellules par centimètre carré de support.
Exemple 5
Utilisation des billes de DEAE-Séphadex traitées selon le mode opératoire décrit à l'exemple 2.
Dans un flacon à agitation, on a introduit le milieu de culture (milieu de base Eagle ou milieu minimal de Eagle) contenant environ 10% de sérum de veau et 1 à 2 mg/ml de DEAE-Séphadex A-50 traités par le Rhovinal selon l'exemple 2. On l'a ensemencé avec s 10^ cellules diploïdes humaines par millilitre de milieu de culture (lignée cellulaire MRC 5).
Pendant 24 h à 37°C, les cellules ont été agitées lentement (60 tr/min) et ont adhéré à 100% sur les billes, puis la culture cellulaire a été poursuivie pendant 7 à 8 d (90 tr/min) de façon à io obtenir une concentration cellulaire finale de 10^ cellules par millilitre. Pendant les 7 à 8 d de culture, il a été nécessaire de maintenir le pH à une valeur constante : 7,2-7,4.
A titre de comparaison, on a effectué une culture de cellules diploïdes dans les mêmes conditions que ci-dessus, mais en utilisant 15 des billes de DEAE-Séphadex A-50 n'ayant pas été traitées conformément au procédé de l'invention. Après 7 à 8 d de culture, la concentration cellulaire finale n'était que de 10$ cellules par millilitre.

Claims (11)

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1. Procédé d'obtention de supports pour cultures cellulaires, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer sur des supports de base une solution d'un polymère thermodurcissable et à soumettre ensuite lesdits supports ainsi revêtus à l'action de la chaleur dans des conditions suffisantes pour permettre le durcissement dudit polymère thermodurcissable et la stérilisation desdits supports ainsi revêtus.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère thermodurcissable est le produit de réaction d'un aldéhyde avec un alcool polyvinylique.
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REVENDICATIONS
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le polymère thermodurcissable est un polymère de butyral polyvinylique résultant de la réaction du butyraldéhyde avec un alcool polyvinylique dont la viscosité à 20°C d'une solution à 5% dans l'alcool éthylique 95° est de 10 mPl et dont le pourcentage en poids des groupes alcool polyvinylique est de 20.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les supports de base sont des boîtes de Pétri, des boîtes de Roux, des billes de Polysaccharides ou des supports en verre.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit support revêtu de la solution de polymère thermodurcissable est soumis à l'action de la chaleur à une température comprise entre 120 et 180C.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, avant l'application de la solution de polymère thermodurcissable, les supports sont lavés à l'aide d'un tampon isotonique et passés à l'autoclave.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, après traitement à la chaleur, les billes ou microsupports sont rincés avec un tampon isotonique contenant des ions Ca+ + et Mg+ + et passés à l'autoclave.
8. Supports pour cultures cellulaires obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 7.
9. Supports pour cultures cellulaires selon la revendication 8, caractérisés en ce qu'ils consistent en un support de base de forme plane, tel qu'une boîte de Pétri ou une boîte de Roux, ou de forme sphérique, telles des billes portant un revêtement thermodurci.
10. Supports selon la revendication 8, caractérisés en ce que le revêtement themodurci est constitué d'un polymère butyral polyvini-que ou formai polyvinylique.
11. Supports selon la revendication 9, caractérisés en ce que le revêtement thermodurci est constitué d'un polymère de butyral polyvinylique résultant de la réaction du butyraldéhyde avec un alcool polyvinylique dont la viscosité à 20°C d'une solution à 5% dans l'alcool éthylique 95° est de 10 mPl et dont le pourcentage en poids des groupes alcool polyvinylique est de 20.
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