CH634105A5 - Procedimento per l'ossidazione selettiva del colesterolo mediante microorganismi. - Google Patents

Description

634105

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RIVENDICAZIONE

Procedimento per l'ossidazione selettiva del colesterolo mediante microorganismi con produzione del A4-colesten--3-one e del A1,4-androstadien-3,17-dione, caratterizzato dal fatto che per la modificazione del colesterolo sono impiegati batteri dei ceppi NRRL B-11 112, NRRL B-11 113, NRRL B-11 114 e NRRL B-11 115 in medi di cultura contenenti n-paraffine C15 a C20 come sola fonte di carbonio e di energia.

Le trasformazioni microbiologiche di steroidi da lungo tempo sono sfruttate per la produzione di derivati aventi particolari attività farmacologiche o per la preparazione di intermedi utili nella produzione di questi derivati (W. Char-ney and W.L. Herzog-Microbial Transformations of Steroids Handbook - Academic Press, N.Y. 1967).

Queste trasformazioni vengono normalmente eseguite coltivando opportuni ceppi microbici culturali contenenti dei carboidrati e/o altri substrati complessi come fonte di C e di energia.

In queste condizioni le trasformazioni microbiologiche dei substrati steroidi non hanno una diretta relazione con il metabolismo dei ceppi microbici che le eseguono, e sembrano piuttosto doversi attribuire a meccanismi di de-tossi-ficazione (A. Capek, O. Hanc and M. Tadra — Microbial transformations of Steroids — Academia, Praha 1966 pagg. 63-64).

Ora noi abbiamo trovato che le trasformazioni microbiologiche su steroidi di maggiore importanza idustriale (idrossilazione, deidrogenazione, demolizione della catena laterale) possono essere favorite usando idrocarburi piuttosto che carboidrati nei terreni di cultura.

I ceppi microbici utilizzati nella realizzazione della presente invenzione erano stati isolati da campioni di diversa origine (suolo, acque di scarico) di solito prelevati in vicinanza di raffinerie o di impianti petrolchimici.

Con questi campioni venivano inoculate delle culture di arricchimento, contenenti miscele di idrocarburi come unica fonte di C e di energia. I ceppi venivano purificati seguendo i normali procedimenti microbiologici. I ceppi isolati venivano mantenuti su slant di agar PS (Tabella I).

TABELLA I

Composizione dei terreni di cultura (g/l)

Terreno

PS (mantenimento)

AM 3 (precultura)

M9-YE (cultura)

Peptone

6

5

—

Autolisato di lievito

3

—

—

Idrolizzato di caseina

4

—

—

Estratto di carne

1,5

1,5

—

Estratto di lievito

—

1,5

0,1

Glucosio

—

1

—

NaCl

—

3,5

0,5

NH4c1

—

—

1

MgS04 • 7 H20

—

—

0,2

kh2po4

—

1,32

3

k2h po4

—

3,68

—

Na2HP04 • 12H20

—

—

6

Agar

25

—

—

PH

7,3

7

6,9

La fonte di C nel terreno M9-YE è specificata negli esempi.

Il procedimento per l'ossidazione selettiva del colesterolo mediante microorganismi con produzione del A4-coIesten-3--one e del A1,4-androstadien-3,17-dione secondo l'invenzione è caratterizzato nella rivendicazione precedente.

Per l'esecuzione del procedimento che è oggetto della presente invenzione, dallo slant venivano inoculate delle pre-culture di terreno AM 3 (Tabella I) e con queste preculture venivano inoculate delle culture di terreno minimo M9-YE (Tabella I) contenente una miscela di n-paraffine CI5 - C20 come unica fonte di C e di energia.

La composizione della miscela di paraffine è riportata nella Tabella II.

TABELLA II

Caratteristiche della miscela di n-paraffine d15/4°c 0,7470

n-paraffine (% peso)

99,40

n-C13

1,0

n-C14

3,4

n-C15

9,7

n-C16

16,2

HrCjij

19,1

17,3

n-C19

14,7

H~C2o

11,3

n-C2i

5,2

H'^22

1,2

ß-C23

0,3

iso- e ciclo-paraffine

0,40

aromatici

0,20

Quando le culture mostravano una buona crescita, ad esse venivano aggiunte le sostanze steroidee da trasformare come sospensione, in acqua o nella miscela di n-paraffine, micronizzata mediante ultrasuoni, oppure come soluzione in un solvente organico (etanolo, acetone, dimetilformammide).

Dopo un tempo opportuno le culture venivano estratte con un solvente immiscibile con acqua come cloroformio o acetato di etile.

Gli estratti venivano evaporati ed esaminati mediante cromatografia su strato sottile (TLC) e/o mediante gas-cromatografia.

La struttura dei prodotti di modificazione degli steroidi veniva assegnata mediante confronto delle proprietà cromatografiche (TLC e gas-cromatografia) con quelle di un campione autentico e/o mediante spettrometria nell'infrarosso, spettrometria di massa, risonanza magnetica nucleare.

Per stabilire che le trasformazioni osservate fossero effettivamente causate o potenziate dall'uso di idrocorburi come unica fonte di C e di energia, vennero condotte delle culture in parallelo in cui la fonte di C era costituita rispettivamente da glucosio, una miscela di n-paraffine e dallo steroide senza altre fonti di C.

Le reazioni osservate in condizioni di co-ossidazione con idrocarburi sono:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

634105

- demolizione della catena laterale di steroidi, come il colesterolo o il progesterone, a 17-chetosteroidi;

- ossidazione del gruppo -OH in C-3 di diversi steroidi a

3-CO gruppo;

- A'-deidrogenazione di diversi steroidi.

Come reazioni secondarie sono state osservate:

- riduzione del gruppo 3-CO a 3-OH;

- riduzione del gruppo 20-C0 a 20-OH;

- riduzione del doppio legame tra C-4 e C-5.

E' da notare che con questo metodo di co-ossidazione la demolizione della catena laterale avviene senza che si verifichi in notevole misura la demolizione del nucleo ste-roideo.

La presente invenzione è illustrata, ma non limitata,

dagli esempi che seguono.

Esempio 1

Effetto della fonte di C sulla selettività della ossidazione del colesterolo a t^-colesten-3-one

Uno slant dei ceppi batterici NRRL B-11 112, NRRL B-11 113, NRRL B-11 114 e NRRL B-11 115 di 48 h di età veniva lavato con 6 mi di acqua sterile; con 2 mi della sospensione veniva inoculata una beuta di Erlenmeyer da 500 mi contenente 100 mi del terreno AM3.

Le beute di precultura venivano incubate per 24 ore a 30°C su un agitatore rotatorio (220 giri/min, 3,5 cm spostamento).

Con 2 mi delle precolture venivano inoculate altre beute dello stesso tipo, contenenti 100 mi del terreno minimo M9-YE contenenti rispettivamente l'l% v/v di n-paraffine C15-C20, l'I % p/v di glucosio o lo 0,1% p/v di colesterolo, come sospensione acquosa micronizzata.

Dopo 24 ore di incubazione nelle stesse condizioni delle preculture, alle beute contenenti n-paraffine o glucosio, venivano aggiunti 100 mg/100 di colesterolo, come sospensione micronizzata in miscela di n-paraffine o HaO.

Dopo 40 ore di incubazione le culture venivano estratte con acetato di etile: gli estratti, essiccati con Na4S04 anidro, venivano evaporati a secco e portati ad un volume finale di 2 mi con etanolo assoluto.

Queste soluzioni degli estratti venivano analizzate mediante cromatografia su strato sottile: le lastre venivano eluite dapprima con pentano e quindi con una miscela costituita da cloroformio + etere etilico = 80 + 20 (v/v).

Dopo la seconda eluizione le lastre venivano spruzzate con una miscela di H2S04 conc. ed etanolo = 1 + 1 (v/v) e scaldate per 8 minuti a 110°C.

Sulle lastre, assieme al residuo di colesterolo (RP = 0,37 macchie di colore viola) appariva una macchia più o meno intensa, color giallo oro, con RF = 0,61.

Mediante cromatografia preparativa il composto avente Rp = 0,61 veniva isolato e purificato, cristallizzato da metanolo e identificato, in base allo spettro infrarosso ed allo spettro di massa, come A4-colesten-3-one.

Per la determinazione quantitativa del prodotto di ossidazione gli estratti delle culture venivano analizzati mediante gas-cromatografia usando una colonna di XE-60 al 3% su Chromosorb 80-10 mesh.

I risultati dell'analisi gas-cromatografica sono riportati nella Tabella III.

TABELLA III

Selettività della co-ossidazione del colesterolo con n-paraffine

CEPPO

Fonte di C

Coleste- À4-colesten-rolo -3-one mg/100 mi mg/100 mi

NRRL

Colesterolo

58,8

36,3

B-11 112

n-paraffine+colesterolo

5,2

89,8

glucosio+colesterolo

58,1

36,9

NRRL

Colesterolo

56,6

38,4

B-11 113

n-paraffine+colesterolo

3,7

91,3

glucosio+colesterolo

54,7

40,4

NRRL

Colesterolo

64,7

30,3

B-11 114

n-paraffine+colesterolo

4,1

90,8

glucosio+colesterolo

67,6

27,3

NRRL

Colesterolo

58,8

36,2

B-11 114

n-paraffine+colesterolo

1,2

93,8

glucosio+colesterolo

63,4

31,6

Come si può vedere, in presenza di glucosio come fonte C, la quantità di colesterolo ossidato è dello stesso ordine di grandezza di quella ottenuta con solo colesterolo, mentre in presenza di idrocarburi la trasformazione è quasi quanti-30 tativa.

Esempio 2

Trasformazione del colesterolo in A1,4-androstadien-35 -3,17-dione

Con 2 mi di una precultura del ceppo NRRL B-11 115 ottenuta come nell'esempio 1 vennero inoculate delle beute di Erlenmeyer da 500 mi, contenenti 100 mi del terreno 40 minimo M9-YE con l'I % v/v della miscela di n-paraffine ci5-c20.

Dopo 24 ore di incubazione a 30°C su un agitatore rotatorio a 220 giri/min con uno spostamento di 3,5 cm, vennero aggiunti in ogni beuta 100 mg di colesterolo come so-45 luzione di dimetilformammide.

Dopo 70 ore di ulteriore incubazione, gli estratti di bro-doculture vennero esaminati mediante cromatografia su strato sottile, come descritto nell'esempio 1.

Negli estratti, oltre alla macchia con RP = 0,61 (cole-50 sten-3-one) comparve una macchia di colore arancio, avente un RP di 0,3.

Il prodotto veniva identificato come A^-androstadien--3,17-dione (1,4-ADD) per confronto con un campione autentico.

55 Mediante analisi gas-chromatografica dell'estratto venne stabilito che il prodotto era presente nella brodocultura nella quantità di 6,8 mg/100 mi, con una resa del 9,23%.

50 Esempio 3

Effetto del tempo di aggiunta del colesterolo e della quantità di inoculum nella produzione A1,4-androstadien-3,17-dione

Operando sostanzialmente come nell'esempio 2, ma ag-65 giugendo il colesterolo prima della inoculazione con la precultura ed aumentando l'inoculum dal 2% v/v al 5% ed al 10% rispettivamente, vennero ottenuti i risultati riportati nella Tabella IV.

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TABELLA IV

Effetto dell'inoculum sulla produzione di k1,4-androstadien-3,17-dione (1,4-ADD) da colesterolo

Inoculum Tempo colesterolo

5%

steroidi (mg/100 mi) À4-colestenone

1,4-ADD

colesterolo

10%

steroidi (mg/100 mi) A4-colestenone

1,4-ADD

0 ore

100

0

0

100

0

0

24 ore

0

75,4

tracce

0

44

tracce

48 ore

0

61,8

6,2

0

18,8

8,4

72 ore

0

28,6

10,4

0

18,3

13,4

Come si vede dalla tabella, con un inoculum del 10% la resa in A1,4-androstadien-3,17-dione sale al 18,4% del teorico.

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