CH634549A5 - Polypeptides et leur preparation. - Google Patents

Description

La présente invention est relative à des Polypeptides et à leur préparation.

L'encéphaline, qui est un agoniste naturel des récepteurs d'opia-tes dans le cerveau, a été identifiée [voir Hugues et coll., «Nature» 256,577 (1975)] comme étant un mélange de deux pentapeptides: H—Tyr—Gly—Gly—Phe—Met—OH (méthionine/encéphaline) et H—Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu—OH (leucine/encéphaline). Ces deux peptides imitent ou reproduisent la capacité de la morphine à bloquer les contractions, provoquées par voie électrique, du canal déférent de la souris et de l'iléon du cobaye, et ils inhibent tous deux la liaison aux récepteurs stéréospécifiques de l'antagoniste d'opiate constitué par la 3H-naloxone dans des homogénats de cerveau.

On a suggéré que les récepteurs d'encéphaline peuvent être des sites où des médicaments du type morphine exercent leurs activités analgésiques, et que l'encéphaline peut être le modulateur ou le transmetteur des effets d'analgésie ou de suppression des douleurs dans les systèmes cérébraux. Il a été signalé que la méthionine/encéphaline et la leucine/encéphaline, lorsqu'on les administre par injection dans le ventricule du cerveau des rats, produisent une analgésie profonde qui est totalement réversible par la naloxone [voir Belluzzi et coll., «Nature» 260,625 (1976)]. Les encéphalines sont toutefois inactives lors d'une administration périphérique et on croit qu'elles sont rapidement détruites par les enzymes du sang et/ou qu'elles sont mal transportées à travers la barrière hématoméningée.

La séquence d'aminoacides de la méthionine/encéphaline est identique à celle de la portion terminale en N du fragment C (ß-endorphine ou a-LPH[61-91]) du peptide ß-lipotropine, que l'on retrouvé en concentrations importantes dans le liquide pituitaire et en des concentrations nettement moindres dans le cerveau. D'autres fragments naturels de la ß-lipotropine sont connus, par exemple: a-endorphine (ß-LPH[61-76]) et y-endorphine (ß-LPH[61-77]). La ß-lipotropine et les endorphines montrent toutes des propriétés ressemblant à celles de la morphine dans divers systèmes d'essai et on a suggéré que la méthionine/encéphaline est un produit de dissociation des peptides importants du type opiates. L'encéphaline, ses relations avec la ß-lipotropine et avec les endorphines, et ses propriétés pharmaco-logiques ont été mises en évidence dans un article de Iversen et coll., «Nature» 262,738 (1976). Des développements récents ont également été décrits en détails dans «Proceedings of the International Narcotics Research Club Meeting», Aberdeen, Grande-Bretagne, juillet 19-22,1976», publié dans «Opiates and Endogenous Opioid Peptides», North Holland Publishing Company, Amsterdam, 1976.

Diverses variations structurales de la méthionine/encéphaline et de la leucine/encéphaline ont été décrites dans la littérature. A titre d'exemple, le pentapeptide H—Tyr—Gly—Gly—Phe—Thr—OH, dans lequel le cinquième reste aminoacide (méthionine ou leucine) est remplacé par de la thréonine, a été décrit par Chang et coll., «Life Sciences» 18,1473 (1976). De même, un pentapeptide synthétique à longue durée d'action, Tyr—D—Ala—Gly—Phe—Met—amide a été décrit par Pert et coll., «Science» 194, 330 (1976); ce composé, de même que les encéphalines naturelles, est inactif lors d'une administration périphérique. Baxter et coll., «British Journal of Pharmaco-logy», mars 2 (1977), pp. 455-456 et 523, ont signalé que le composé Tyr—D—Ala—Gly—Phe—D—Leu montre une activité lors d'une administration intracérébroventriculaire.

Suivant la présente invention, on a prévu un groupe de Polypeptides, actifs en médecine, de la formule:

H—N—Tyr—D—Ala—Gly—N—Phe—D—Pro—R2

I I (D

R R1

dans laquelle:

R représente l'hydrogène ou un radical méthyle, allyle ou cyclo-propylméthyle;

R1 représente l'hydrogène ou le radical méthyle, et

R2 représente —OH, — NH2, ou —NHCnH2n+1, où n est égal à 1,2,3 ou 4.

L'invention englobe également les sels pharmaceutiquement acceptables de ces composés.

Tous les restes aminoacides chiraux, dans la formule I précédente et dans la description suivante, se trouvent dans la configuration naturelle ou L, à moins d'indications contraires.

Les composés préférés sont ceux qui répondent à la formule II suivante:

R—NH—Tyr—D—Ala—Gly—N —Phe—D - Pro —R2 (H)

R1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

634549

dans laquelle:

R représente l'hydrogène ou un radical méthyle, allyle ou cyclo-propylméthyle;

R, représente l'hydrogène ou le radical méthyle, et

R2 représente —NH2 ou —NHC2H5 5

ou les sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables de ces composés préférés.

Les sels pharmaceutiquement acceptables des polypeptides suivant l'invention sont des sels d'addition d'acide de la base libre, dans lesquels l'acide peut être organique ou minéral, par exemple l'acide 10 chlorhydrique, l'acide phosphorique, l'acide maléique, l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide succinique, l'acide malique et des acides similaires. De même, des sels de l'acide peptidique libre sont englobés par l'expression sels pharmaceutiquement acceptables et il s'agit notamment des sels de sodium, de potassium, d'ammonium et d'alcoyl- 15 aminés inférieurs. Les sels se préparent et s'isolent suivant des méthodes traditionnelles.

Les polypeptides analgésiques de la présente invention peuvent se préparer par des procédés classiques en phase solide, en utilisant ou bien une résine à base de benzhydrylamine/polystyrène pour la pro- 20 duction des amides terminaux en C, ou bien une résine de polystyrène réticulée par divinylbenzène, chlorométhylée ou hydroxy-méthylée pour la production de l'acide carboxylique ou des alcoyl-amides inférieurs terminaux en C. Le polypeptide se sépare de façon traditionnelle du support de résine grâce à de l'acide fluorhydrique et 25 on le purifie par une filtration sur gel. De même, les composés de la présente invention se préparent facilement par des méthodes traditionnelles en solution, par lesquelles les réactifs aminoacides individuels sont combinés, par l'intermédiaire de dérivés activés, dans l'ordre approprié avec une protection temporaire des groupes fonction- 30 nels compétitivement réactifs en vue d'obtenir le produit désiré.

Les réactifs tyrosine et phénylalanine N-substitués, que l'on utilise dans la production des composés décrits ici, se préparent facilement par réaction de chlorure de méthyle, de chlorure d'allyle ou de chlorure de cyclopropylméthyle avec un ester de Boc-tyrosyle ou un 35 ester de Boc-phénylalanine en présence d'oxyde d'argent. Le produit N-alcoylé est ensuite saponifié et hydrolysé pour obtenir le réactif désiré.

L'activité analgésique des polypeptides de la présente invention a été démontrée par la méthode de D'Amour et Smith, «J. Pharmacol. 40 Exp. Ther.» 72,74 (1941). Le polypeptide représentatif de l'invention, à savoir le Tyr—D—Ala—Gly—Phe—D—Pro—NH2, a donné les résultats suivants lors de l'essai classique d'effleurement de la queue du rat.

45

Réponse

Nombre de rats montrant une analgésie/ Nombre de rats traités

200 400

0/6 3/6

0/6 2/6

0/6 2/6

0/6 2/6

Dose intraveineuse

Minutes après administration

(mg/kg)

15

30

60

5,0*

5/5

5/5

2,5

6/6

5/6

3/6

1,0

4/6

3/6

1/6

0,5

2/6

2/6

1/6

0,25

0/6

0/6

0/6

Dose sous-cutanée

Minutes après administration

(mg/kg)

30

60

90 .

120

5,0

3/6

0/6

0/6

0/6

20,0+

6/6

6/6

5/6

3/6

Voie orale Minutes après administration

( mg/kg) 30 60 90 120

50 0/6 1/6 0/6 0/6

100 0/6 0/6 0/6 0/6

* Dans un groupe de 6 rats, l'un mourait avant l'essai; 2 des 5 rats restants montraient une dépression respiratoire et l'un mourait après avoir été remis en cage.

+ Le groupe complet des 6 rats a montré une dépression respiratoire modérée à 20 mg/kg par voie sous-cutanée.

Les résultats d'essai démontrent que les composés de la présente invention provoquent une analgésie lors d'une administration d'une seule injection intraveineuse d'environ 0,5 mg/kg ou plus. Pour des raisons pratiques, on a considéré, sur la base des résultats d'essai précédents, qu'une dose intraveineuse d'environ 0,5 à environ 20 mg/kg en dose unique ou en doses multiples constitue la dose appropriée pour atteindre le degré d'analgésie désiré dans diverses applications. Lors d'une administration par voie orale, une dose d'environ 400 mg/kg ou plus produit l'effet désiré. La dose exacte à utiliser dépendra évidemment dans une certaine mesure du composé spécifique utilisé, du patient et du degré d'analgésie désiré. La détermination d'une dose précise pour l'obtention d'un effet désiré se fait aisément de manière empirique par le médecin.

Les exemples suivants illustrent plus complètement encore la préparation des polypeptides suivant l'invention.

Exemple 1:

L- Tyrosyl—D—A lanylglycyl — L-Phénylalanyl—D—Pro—Amide

Dans un récipient de réaction de 200 ml, on place 9,2 g de résine de benzhydrylamine (teneur d'amine libre de 3,7 mmol). La résine est alors traitée de la manière suivante;

1. chlorure de méthylène (trois fois);

2. prélavage de 5 min avec du chlorure de méthylène/acide trifluoroacétique (30%) (volume/volume), contenant 0,5% de dithio-érythritol;

3. traitement pendant 25 min avec l'acide trifluoroacétique ci-dessus;

4. chlorure de méthylène (trois fois);

5. traitement pendant 10 min avec de la triéthylamine/diméthyl-formamide (volume/volume);

6. •diméthylformamide (trois fois);

7. chlorure de méthylène (trois fois).

On permet une durée de contact de 2 min pour chaque lavage sauf indications contraires.

La résine est agitée modérément avec de la t—Boc—D—Proline et du 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) dans du diméthylformamide/ chlorure de méthylène (50%) (3,17 g, 14,7mmol det—Boc—D—Pro et 3,4 g, 22 mmol de HOBT). Après l'addition des réactifs précédents, on traite le mélange avec 2,6 ml de diisopropylcarbodiimide (DIC) (on ajoute ce dernier en deux portions égales sur une période de 30 min). Après agitation pendant la nuit, la résine-peptide est lavée successivement avec du diméthylformamide (deux fois), du diméthyl-formamide/triéthylamine (12%) (une fois) et du chlorure de méthylène (trois fois). Pour vérifier le caractère complet de la réaction, la résine-peptide est soumise à l'essai de coloration à la ninhydrine en suivant le procédé de E. Kaiser et coll., « Analytical Chemistry» 34, 595 (1970).

La suppression de la protection de l'aminoacide attaché est réalisée de la façon décrite dans les phases 2 à 7 précédentes.

Les restes aminoacides suivants sont ensuite introduits en succession: t — Boc—L—phénylalanine (3,90 g, 14,7 mmol, 3,4 g, 22 mmol de HOBT et 2,6 ml, 16,2 mmol de DIC), t—Boc—glycine (2,58 g, 14,7 mmol, 3,4 g de HOBT et 2,6 ml de DIC), t—Boc—D—alanine (2,78 g, 14,7 mmol, 3,4 g de HOBT et 2,6 ml de DIC), t—Boc—O—benzyl—L—tyrosine (5,46 g, 14,7 mmol, 3,4 g de HOBT et 2,6 ml de DIC). La résine-peptide est séchée (production de 16,9 g).

La résine-pentapeptide décrite ci-dessus (16,9 g) est traitée sous vide avec de l'acide fluorhydrique liquide anhydre (100 ml) et de

634549

4

l'anisole (10 ml) à 0°C pendant 1 h. L'acide fluorhydrique et l'anisole sont séparés sous pression réduite et le reste est mis en suspension dans de l'acide acétique 2N, puis filtré, et le filtrat est lyophilisé pour donner le produit cité en rubrique ci-dessus, en une quantité de 7,0 g.

Exemple 2:

Purification et caractérisation du L-Tyrosyl—D—Alanylglycyl— L-Phénylalanyl —D—Pro—Amide

Le produit brut issu de l'exemple 1 est purifié de la façon suivante: 2,3 g de matière sont dissous dans une quantité minimale d'acide acétique 2N et on applique la solution à une colonne (2,5 x 200 cm) de Sephadex G-10 dans de l'acide acétique 2N. La colonne est éluée avec de l'acide acétique 2N et on récolte des fractions de 8,2 ml. L'effluent de la colonne est contrôlé à 254 nm. On combine les fractions 50-59 et on lyophilise pour obtenir 0,780 g de produit cité en rubrique sous la forme acétate. Le produit (0,780 g) est encore purifié par application de la matière dans un petit volume d'une phase supérieure B-A-E, 4/1/5 (n-butanol/acide acétique/eau) sur une colonne (2,5 x 100 cm) d'un milieu de Sephadex G-25 préalablement équilibré avec une phase inférieure du système précédent et ensuite équilibré vers le haut avec une phase inférieure du système précédent et ensuite une phase supérieure. La colonne est éluée avec une phase supérieure B-A-E et on récolte des fractions de 4 ml. L'effluent est contrôlé comme précédemment. Les tubes 35-47 se sont montrés homogènes dans des systèmes de Chromatographie en couche mince 4/ 1/5; Rf= 0,40, et 7/7/6 (alcool isoamylique/pyridine/eau); Rf=0,72 sur gel de silice. Les chromatogrammes en couche mince ont été visualisés avec de la ninhydrine et un réactif de peptide/chlore.

L'analyse des aminoacides, après hydrolyse avec de l'acide méthanesulfonique, a donné les proportions suivantes: Pro 1,00; Gly 0,94; Tyr 1,01 ; Phe 1,00; Ala 0,98.

Exemple 3:

L-Tyrosyl —D—Ala—Glycyl -L-Phénylalanyl—D—Pro—OH

Une résine de polystyrène chlorométhylée est estérifiée avec du Boc—D—Pro—OH suivant le procédé de Gisin, «Helv. Chim. Acta.» 56,1976 (1973), et l'ester polymère est traité suivant le procédé de l'exemple 1 pour l'incorporation de Boc—Phe—OH, de Boc—Gly—OH, de Boc—D—Ala—OH, et de Boc—Tyr (Bzl)—OH. La résine-peptide résultante est traitée suivant le procédé de l'exemple 2 pour donner l'acide pentapeptidique cité en rubrique.

Exemple 4:

Lr Tyrosyl—D—Ala—Glycyl -L-Phénylalanyl—D—Pro— Ethylamide

Le traitement de la résine-peptide de l'exemple 3 avec de l'éthyl-amine dans un flacon bouché pendant 10 h, avec ensuite séparation de l'excès d'éthylamine, extraction avec du diméthylformamide, fil-tration et évaporation du filtrat, donne l'éthylamide cité en rubrique.

Exemple 6:

N-Méthyl—L-Tyrosyl—D—Alanylglycyl—L-Phénylalanyl— D_—Pro—Ethylamide

Le procédé de l'exemple 3 a été répété sauf que le dernier amino-acide combiné est le Boc—N—Méthyl—Tyr—(Bzl)—OH. La résine-peptide est traitée avec un excès d'éthylamine pendant la nuit dans une bouteille sous pression en verre. Le mélange brut est filtré et l'excès d'éthylamine est séparé sous vide. Le produit est lyophilisé au dé-( part de dioxane. La suppression de la protection est réalisée avec du HF et de l'anisole et l'excès de ce HF et de cet anisole est séparé sous pression réduite. Le reste est dissous dans de l'acide acétique 2N et lyophilisé. Le produit brut est purifié par le procédé de l'exemple 2. Les tubes 27-37 contiennent le produit homogène, ce qui est démon-; tré par Chromatographie en couche mince avec des systèmes alcool isoamylique/pyridine/eau, 4/1/5, Rf=0,53; 7/7/6, RF=0,70 sur gel de silice.

L'analyse des aminoacides donne les proportions suivantes: Pro 1,00; Phe 1,00; Gly 1,02; Ala 1,00; N—MeTyr: non déterminé.

Le produit de l'exemple 6 a été essayé suivant la méthode de D'Amour et Smith, «J. Pharmacol. Exp. Ther.» 72,74 (1941) avec obtention des résultats suivants:

Nombre de rats présentant analgésie/

25

Nombre de rats essayés

Dose

Minutes après administration

(mg/kg)

Administration

15 30

60

90 120

5,0

intraveineuse

4/6 (2 décès)

1,0

intraveineuse

5/6 (1 décès)

30 0,5

intraveineuse

5/6

1,0

sous-cutanée

3/6

5,0

sous-cutanée

5/6

0,1

intraveineuse

0/6

5,0

sous-cutanée

5/6

5/6

5/6 5/6

35 1,0

sous-cutanée

2/6

1/6

0/6 0/6

50

L-Phénylalanyl—D—

Exemple 5:

N-Méthyl— L-Tyrosyl—D—Ala—Glycyl -Pro—Amide

Le procédé de l'exemple 1 a été répété, sauf que le dernier amino-acide introduit dans le réacteur en phase solide est le Boc—N—méthyl—L—tyrosyl(Bzl)—OH. La résine-peptide est scindée et traitée suivant le procédé de l'exemple 2 pour donner le composé cité en rubrique.

Exemple 7:

N-Méthyl — Tyrosyl—D—Alanyl — Glycyl—N-Méthyl— Phényl-alanyl—D—Pro—Ethylamide

Le procédé de l'exemple 3 a été répété sauf que la N-Méthyl-phénylalanine a été introduite dans la résine-peptide à titre de second reste aminoacide. Le produit est traité et purifié en suivant le procédé de l'exemple 2 pour obtenir le composé cité en rubrique. Une Chromatographie en couche mince est réalisée sur gel de silice avec le système butanol/acide acétique/eau (4/1/5), Rf = 0,34.

L'analyse des aminoacides donne les proportions suivantes: Pro: 0,92; Gly: 1,00; Ala: 0,99; N—Me—Phe: non déterminé; N—MeTyr: non déterminé.

Lors d'un essai par la méthode classique d'effleurement de la queue du rat, le produit de l'exemple 7 donne les résultats suivants:

Nombre de rats présentant analgésie/ Nombre de rats essayés

Dose Minutes après administration

(mg/kg)

Administration

15

30

60

5

intraveineuse

5/5

5/5

4/4

1

intraveineuse

1/6

1/6

0/6

Claims (8)

634 549

1. Polypeptides thêrapeutiquement actifs répondant à la formule:

H—N—Tyr—D—Ala—Gly—N—Phe—D—Pro —R2

I I

R R1

dans laquelle:

R représente l'hydrogène ou un radical méthyle, allyle ou cyclo-propylméthyle;

R1 représente l'hydrogène ou un groupe méthyle, et R2 représente —OH, —NH2 ou — NHCnH2n+i, où n est égal à 1, 2,3 ou 4;

ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

2. Composés suivant la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit du Tyr—D—Ala—Gly—Phe—D—Pro—NH2 ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

2

REVENDICATIONS

3. Composés suivant la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit du Tyr—D—Ala—Gly—Phe—D—Pro—OH ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

4. Composés suivant la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit de Tyr—D—Ala—Gly—Phe—D—Pro—NHC2 H 5 ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

5. Composés suivant la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit du

N-méthy I—Tyr—D—Ala—Gly—Phe—D—Pro—NH2

ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

6. Composés suivant la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit du

N-méthyl -Tyr - D - Ala - Gly - Phe - D - Pro - NHC2H5

ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

7. Composés suivant la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit du

N-méthyl—Tyr—D—Ala—Gly—N-méthyl — Phe—D— Pro—NHC2H5

ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

8. Procédé de production d'un composé répondant à la formule:

H —N—Tyr—D—Ala—Gly—N—Phe—D—Pro—R2

I I

R R1

dans laquelle:

R représente l'hydrogène ou un radical méthyle, allyle ou cyclo-propylméthyle;

R1 représente l'hydrogène ou le méthyle, et R2 représente —OH, — NH2 ou — NHCnH2n+i, où n est égal à 1, 2,3 ou 4,

ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable d'un tel composé, caractérisé en ce qu'il comprend la condensation des aminoacides correspondants ou de leurs dérivés activés avec formation de liaisons —CO—NH — dans l'ordre désiré de succession, avec protection temporaire des groupes fonctionnels réactifs.