CH634550A5

CH634550A5 - Analogues de somatostatine.

Info

Publication number: CH634550A5
Application number: CH1052778A
Authority: CH
Inventors: Dimitrios Sarantakis
Original assignee: American Home Prod
Priority date: 1977-12-13
Filing date: 1978-10-10
Publication date: 1983-02-15
Also published as: DE2843737A1; GB2010280B; IT1099705B; DK432878A; FR2411827A1; IT7828705A0; SE7810156L; LU80335A1; FR2411827B1; NL7810197A; GB2010280A; JPS5484573A; BE871051A

Description

La présente invention est relative à de nouveaux analogues de somatostatine.

On sait que le facteur inhibant la libération de somatotropine (SRIF), de type cyclique, que l'on connaît sous le nom de somatosta-tine, présente, suivant Brazeau et coll., «Science», 179,77 (1973), la structure suivante:

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

I i

S S

tous les aminoacides étant de la configuration naturelle ou L.

On a décrit dans la littérature plusieurs procédés de synthèse de la somatostatine, notamment le procédé en phase solide de Rivier, « J. Am. Chem. Soc.», 96,2986 (1974), et les méthodes à dissolution de Sarantakis et coll., «Biochemical Biophysical Research Communications», 54,234 (1973), et d'Immer et coll., «Helv. Chim. Acta», 57, 730 (1974). Il y a également de nombreuses recherches en cours sur les peptides, dont le but est d'améliorer l'activité pharmacologique de la somatostatine en modifiant sa structure par voie synthétique, s La présente invention concerne de nouveaux analogues de somatostatine, dans lesquels les restes Ala1-Gly2 peuvent exister ou être remplacés par H, Gly, Ala-Ala, ou Gly-Gly-Gly; le reste L-Trps est remplacé par D-Trp8, et les restes L-Lys4-L-Asns sont remplacés soit par Gly soit par un reste dérivant d'un D-aminoacide particulier, io Le remplacement du reste L-Trp dans la somatostatine par D-Trp! a été décrit par J. Rivier et coll., «Biochemical Biophysical Research Communications», 65,746 (1975).

Les analogues de somatostatine, dans lesquels les restes L-Lys4-L-Asn5 sont remplacés par divers restes aminoacides, ont été décrits 15 dans le brevet belge N° 839405.

L'invention concerne des composés chimiques thérapeutiquement actifs choisis dans la classe répondant à la formule:

SA

I

20 X1-L-Cys-X2-X3-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-

L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

I

SA

dans laquelle A représente l'hydrogène ou bien les deux groupes A 25 forment une liaison directe entre les atomes de soufre; X1 représente H, Gly, L-Ala-Gly, L-Ala-D-Ala, ou Gly-Gly-Gly; X2 et X3, qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis parmi Gly, D-Leu, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Met, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Asp ou D-Asn, à la condition que X2 et X3 ne soient pas simultanément le 30 reste Gly, l'invention englobant également les sels d'addition acceptables en pharmacologie des composés ci-dessus.

Les composés suivant la présente invention sont, de façon inhérente, des matières solides de couleur blanche à tan clair, ils sont pratiquement insolubles dans le chloroforme, le benzène, etc., mais ils 35 montrent une solubilité dans l'eau et dans des solutions acides aqueuses, par exemple des solutions aqueuses d'acide chlorhydrique et d'acide acétique. Les composés de l'invention ne présentent pas de point de fusion nettement défini et ils peuvent être purifiés, par exemple, par des voies chromatographiques. Une hydrolyse des composés 40 suivant l'invention, par exemple dans de l'acide méthanesulfonique 4N, permet la détermination de la teneur en aminoacides, qui est compatible avec les structures mentionnées ci-dessus.

Les composés suivant l'invention et les compositions en contenant présentent la caractéristique d'inhiber la libération des hormo-45 nés somatotropine, glucagon et insuline, ce qui est mis en évidence par des méthodes d'essai pharmacologiques classiques.

Suivant un aspect plus particulier, l'invention englobe des composés chimiques répondant à la formule :

SA

50 I

H-L-Cys-X2-X3-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

I

SA

55 dans laquelle A représente l'hydrogène ou bien les deux groupes A forment une liaison directe entre les atomes de soufre; X2 et X3, qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis parmi Gly, D-Leu, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Met, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Asp ou D-Asn, à la condition que X2 et X3 ne représentent pas simultané-60 ment le reste Gly, l'invention englobant également les sels d'addition acceptables en pharmacologie de ces composés.

Suivant une forme de réalisation plus particulière, l'invention englobe également les composés chimiques répondant à la formule:

SA

65 1

H-L-Cys-X4-X5-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

I

SA

3

634 550

dans laquelle A représente l'hydrogène ou bien les deux groupes A forment une liaison directe entre les atomes de soufre; X4 et X5, qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis parmi D-Tyr, D-Trp, D-His ou D-Arg, l'invention englobant également les sels d'addition acceptables en pharmacologie de ces composés.

L'invention englobe plus particulièrement encore le composé chimique répondant à la formule:

H-L-Cys-D-Arg-D-Tyr-L-Phe-L-Phe-D-Trp-

I

S S

I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

L'invention englobe également de façon plus particulière le composé chimique répondant à la formule:

H-L-Cys-D-Ty r-D-T rp-L-Phe-L-Phe-D-T rp-

I

S S

I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

L'invention englobe également le composé chimique plus particulier répondant à la formule:

H-L-Cys-D-His-D-Tyr-L-Phe-L-Phe-D-Trp-

I

s S

I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

Les polypeptides finals produits et leurs intermédiaires nécessaires se préparent par la méthode en phase solide bien connue, telle que décrite, par exemple, par Merrifield, «J. Am. Chem. Soc.», 85, 2149 (1963). Dans l'application de ce procédé aux composés de l'invention, de la cystéine protégée en a-amino et en sulfhydryle est d'abord attachée à une résine de polystyrène chlorométhylée, avec ensuite séparation du groupe protecteur en a-amino par de l'acide trifluoro-acétique dans du chlorure de méthylène, par de l'acide trifluoro-acétique seul ou par du HCl dans du dioxanne. La suppression de la protection est réalisée à une température comprise entre environ 0°C et la température ambiante. On peut utiliser d'autres réactifs et conditions classiques de séparation pour l'enlèvement des groupes protecteurs particuliers en a-amino, de la façon décrite par Schröder E. Lubke, «The Peptides», 1,12-15 (Academic Press, 1965). Après séparation du groupe protecteur en a-amino, les aminoacides protégés désirés suivants sont combinés individuellement à la séquence supportée par la résine, et ce en série. A titre de variante, de petits fragments de peptide peuvent être préparés, par exemple par la méthode à dissolution, et ils peuvent être introduits dans le système réactif en phase solide dans l'ordre désiré. Chaque aminoacide protégé ou chaque séquence d'aminoacides protégés est introduit dans le système réactif en phase solide en un excès d'environ quatre fois. La combinaison est réalisée dans du diméthylformamide, du chlorure de méthylène ou un mélange de ces deux solvants. Le succès de chaque réaction de combinaison à chaque stade de la synthèse est déterminé par la réaction à la ninhydrine, telle que décrite par E. Kaiser et coll., «Analyt. Biochemical», 34, 595 (1970). Lorsqu'une combinaison incomplète se produit, la réaction est refaite avant que le groupe protecteur d'a-amino soit séparé pour l'introduction de l'aminoacide suivant ou de la séquence suivante d'aminoacides.

Les réactifs préférés de combinaison sont le 1-hydroxybenzo-triazole et le diisopropylcarbodiimide, mais d'autres réactifs intéressants de ce genre sont connus des spécialistes.

Après que la séquence désirée d'aminoacides a été synthétisée, le Polypeptide est séparé du support de résine par traitement, par exemple, avec de l'acide fluorhydrique et de l'anisole, en vue d'obtenir le Polypeptide linéaire totalement débarrassé de ses protections. Le di-sulfure cyclique peut être produit par oxydation à l'air.

Les sels d'addition non toxiques des polypeptides linéaires et cycliques sont produits par des procédés bien connus en pratique, au départ d'acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, phosphori-que, polyphosphorique, maléique, acétique, citrique, benzoïque, suc-cinique, malonique, ascorbique, etc. On préfère le sel d'acide acétique.

Les groupes protecteurs utilisés dans la totalité de la synthèse en phase solide sont bien connus en pratique. Les groupes protecteurs d'a-amino, utilisés avec chaque aminoacide introduit dans la séquence du polypeptide final, sont: 1) des groupes protecteurs du type acyle, illustrés par: formyle, trifluoroacétyle, phtalyle, p-toluène-sulfonyle (tosyle), nitrophénylsulfényle, etc.; 2) des groupes protecteurs du type uréthanne aromatiques, illustrés par le benzyloxy-carbonyle et un benzyloxycarbonyle substitué, tel que le p-chloro-benzyloxycarbonyle et le p-nitrobenzyloxycarbonyle; 3) des groupes protecteurs du type uréthanne aliphatiques, illustrés par: tert.-butyloxycarbonyle, diisopropylmêthoxycarbonyle, isopropyloxy-carbonyle, allyloxycarbonyle, 2,2,2-trichloroéthoxycarbonyle, amyloxycarbonyle; 4) des groupes protecteurs du type uréthanne cycloalcoyliques, illustrés par: cyclopentyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle, cyclohexyloxycarbonyle; 5) des groupes protecteurs du type thio-uréthanne, tels que le phénylthiocarbonyle; 6) des groupes protecteurs du type alcoyle, illustrés par le triphényl-méthyle (trityle); 7) des groupes de trialcoylsilane, tels que le triméthylsilane. Le groupe protecteur d'a-amino préféré est le tert.-butyloxycarbonyle. Les atomes d'azote de chaîne latérale de l'arginine, désignés par N«n, sont protégés par un groupe qui peut être un groupe nitro, tosyle, benzyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle ou tert.-butyloxycarbonyle, avec une préférence pour le groupe tosyle.

La protection pour le groupe amino de chaîne latérale de la lysine peut se faire par un groupe pouvant être: tosyle, t-amyloxycarbonyle, t-butyloxycarbonyle, diisopropyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, halobenzyloxycarbonyle, nitrobenzyloxycarbonyle, etc., le groupe 2-chlorobenzyloxycarbonyle étant préféré. La protection pour le groupe hydroxyle de la thréonine et de la sérine peut se faire par un groupe acétyle, benzoyle, tert.-butyle, benzyle, avec une préférence pour le groupe benzyle.

Le groupe protecteur pour le groupe sulfhydryle du fragment aminoacide de cystéinyle est un groupe choisi dans la classe comprenant: le benzyle; un benzyle substitué, dans lequel le substituant est constitué par au moins un des radicaux suivants : méthyle, méthoxy, nitro, ou halo (par exemple 3,4-diméthylbenzyle, p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle, etc.); le trityle, le benzyloxycarbonyle, le benzhydryle, le p-méthoxybenzyloxycarbonyle, le benzylthiométhyle, l'éthylcarbamoyle, le thioéthyle, le tétrahydro-pyrannyle, l'acétamidométhyle, le benzoyle, le sel s-sulfonate, etc., le groupe p-méthoxybenzyle étant préféré.

L'activité pharmacologique démontrée des peptides suivant l'invention caractérise ces composés comme étant intéressants dans le traitement de l'acromegalie et du diabète juvénile, ainsi que du diabète commençant à l'âge adulte, de la même manière que la somatostatine elle-même. L'administration des peptides peut se faire par les voies traditionnelles, qui sont courantes pour la somatostatine et les polypeptides apparentés, sous la surveillance d'un médecin, en une quantité imposée par le degré de la dysfonction déterminée par ce médecin. On peut administrer les composés seuls ou en combinaison avec des supports et des adjuvants traditionnels, acceptables en pharmacie, sous forme de doses posologiques.

Les exemples suivants illustreront plus complètement encore la présente invention.

Exemple 1 :

N-a-tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-N8"-To-syl-D- Arginy 1-0-2,6-Dichlorobenzyl-D-Tyrosyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-Ns-2-Chlorobenzyloxycarbonyl-L-Lysyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Ben-zyl-L-Séryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl Hydroxymêthyl Polystyrène.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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4

Une résine de polystyrène chlorométhylée (Lab Systems, Inc.), réticulée à 1 % avec du divinylbenzène, est estérifiée avec du Boc-Cys (SMBzl)-OH suivant Gisin, «Helv. Chim. Acta», 56,1976 (1973). L'ester de résine de polystyrène est traité suivant le programme A ci-après pour l'incorporation de Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr (Bzl)-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-D-Tyr(Cl2Bzl)-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH et Boc-Cys(SMBzl)-OH, en vue d'obtenir la peptidoré-sine citée en rubrique.

Programme A

1. Lavage avec du CH2C12x 3

2. Traitement avec du TFA-CH2Cl2-EDT (1/1/5%, v/v) pendant 5 min

3. Traitement suivant 2 pendant 25 min

4. Lavage avec du CH2C12 x 3

5. Lavage avec du DMF

6. Traitement avec du TEA à 12% dans du DMF x 2 pendant 3 min

7. Lavage avec du DMF

8. Lavage avec du CH2C12 x 3

9. Traitement avec 4 équivalents du dérivé aminoacide correspondant dans du CH2C12-DMF et agitation pendant 5 min

10. Addition en deux portions de 5 équivalents de DIC en dissolution dans du CH2C12, sur une période de 30 min, durée de réaction de 6 h

11. Lavage avec du DMF x 3

12. Lavage avec du CH2C12 x 3

13. Réaction d'essai à la ninhydrine suivant Kaiser et coll.,

«Anal. Biochemical», 34, 595 (1970); dans le cas d'une réaction incomplète, on répète les phases 9 à 13 susdites.

Exemple 2:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystêinyl-D-Arginyl-D-Tyrosyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phènylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-L-Cystêine (A)

La peptidorésine de l'exemple précédent (10,2 g) est mélangée avec de l'anisole (20 ml) et traitée avec du HF liquide (200 ml) pendant 45 min dans un bain de glace. On sépare l'excès de HF sous vide et le reste est extrait avec du AcOH aqueux à 25%. La solution aqueuse est extraite avec de l'éther et ensuite la phase aqueuse est neutralisée avec du NH4OH dilué jusqu'au pH 7 et laissée au repos pendant 2 d à l'air libre. Le mélange est acidifié avec du AcOH glacial jusqu'au pH 5 et lyophilisé. Le produit brut est appliqué sur une colonne de Sephadex G-15 et élué avec du AcOH aqueux à 10%. On récolte des fractions de 5,5 ml et la matière qui émerge entre les fractions 96 à 126 est récoltée pour former 260 mg de disulfure cyclique (1 -12) de L-cystéinyl-D-arginyl-D-tyrosyl-L-phénylalanyl-L-phényl-alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-L-phénylalanyl-L-thréonyl-L-sêryl-L-cystéine sous la forme du sel d'acide diacétique.

Rf(BWA, 4/5/1, v/v): 0,52

Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,77

BWA=butanol/eau/acide acétique

BWAP=butanol/eau/acide acétique/pyridine

Analyse des aminoacides : Thr (2): 1,76; Ser (1): 0,88; Tyr (1): 0,95; Phe (3): 3; Lys (1): 1,09; Arg (1): 0,89; Trp et Cys: non déterminés.

Exemple 3:

L'activité pharmacologique in vivo du composé préparé suivant l'exemple 2 (composé désigné par A) a été établie par les procédés suivants avec les résultats indiqués.

Suppression de l'hormone de croissance

Une injection sous-cutanée de peptide solubilisé ou mis en suspension dans une solution saline physiologique est faite à des rats mâles Charles River CD, qui ne sont pas à jeun. Des rats correspondants ayant subi une injection sous-cutanée d'une solution saline témoin servent d'animaux témoins de manière que chaque rat expérimental soit accompagné d'un rat témoin. Les rats sont maintenus dans des cages séparées et, 20 min avant la fin de la période d'essai, ils reçoivent une injection de Nembutal (marque déposée) dans le péritoine à une dose de 50 mg/kg. On obtient des échantillons de sang par une ponction cardiaque et on sépare le plasma pour la détermination par voie radio-immunologique de la concentration d'hormone de croissance (GH) en nanogrammes par millilitre. On prévoit des périodes de 2,4, 5 et 6 h après injection pour vérifier la durée de réactivité du peptide dans la suppression des taux de GH périphérique en circulation. Des comparaisons entre les valeurs de GH obtenues sur les rats témoins et sur les rats expérimentaux à chacun des moments indiqués sont estimées par la méthode d'essai t de Student et la signification statistique (p) au taux de 0,05 ou à un taux inférieur est utilisée à titre d'indice d'activité.

20

30

Composé (dose)

2h

4h

5 h

6h

Témoin A (1 mg/kg)

171+20 17+8 p <0,001

73 ±21

23+8

p<0,05

60± 11

32+7 p<0,05

82 ±21 74+14 p>0,05

Suppression de l'hormone de croissance, du glucagon et de l'insuline

On répartit des rats mâles albinos en trois groupes (9 rats par groupe) et on leur injecte dans le péritoine du Nembutal à raison de 50 mg/kg. 15 min après l'injection de Nembutal, on injecte par voie sous-cutanée suivant le groupe: a) le composé essayé, normalement à raison de 10-2000 jig/kg; b) du SRIF à raison de 200 ng/kg, ou c) une solution saline physiologique. 10 min plus tard, on injecte dans le cœur 0,5 ml d'arginine (300 mg/ml, pH de 7,2). Les rats sont décapités 5 min après avoir reçu l'arginine et on récolte leur sang dans du Trasylol-EDTA. De petites quantités appropriées sont alors soumises à une détermination quant à l'hormone de croissance, au glucagon et à l'insuline. Un composé actif est un composé qui modifie de façon significative le taux, dans le plasma, de l'une quelconque de ces hormones par rapport aux animaux témoins traités par la solution saline. Des comparaisons entre les valeurs témoins et les valeurs expérimentales sont estimées de manière statistique par l'analyse de va-riance, et la signification statistique (p) au taux de 0,05 ou moins est utilisée à titre d'indice d'activité.

55

Composé (dose, ng/kg)

Hormone de croissance (ng/ml)

Insuline (nU/ml)

Glucagon (Pg/ml)

Témoin

164+38

213 ± 12

37 ±8

A (2000)

20+2

97+18

8 + 5

p <0,001

p<0,01

Témoin

—

221 ±9

71 ±6

A (100)

—

127 ± 9

24+4

p<0,01

Témoin

163+29

278 + 32

69 ±13

A (10)

11 ±3

312 ± 52

39+7

p<0,01

p>0,05

p<0,05

60 Exemple 4:

Tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-0-2,6-Di-chlorobenzyl-D-Tyrosyl-D-Tryptophyl-L-Phénylalanyl-L-Phényl-alanyl-D-Tryptophyl-e-2-ChlorobenzyloxycarbonyI-L-Lysyl-O-Ben-zyl-L-Thréonyl-L-Phênyl-alanyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Benzyl-L-

65 Sèryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl Hydroxymèthylpolystyrène

Une résine de polystyrène chlorométhylée (Lab. Systems, Inc.), réticulée à 1 % avec du divinylbenzène, est estérifiée avec du Boc-Cys(SMBzl)-OH suivant Gisin, citation précédente. L'ester de résine de polystyrène est traité suivant le programme A de l'exemple 1 pour

5

634 550

l'incorporation de Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Lys(Clz)-OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-D-Tyr(ClzBzl)-OH et Boc-Cys(SMBzl)-OH pour donner la peptidorésine citée en rubrique.

Exemple 5:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-D-Tyrosyl-D-Tryptophyl-L-Phênylalanyl-L-Phênylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phènylalanyl-L-Thrèonyl-L-Sèryl-L-Cystëine (B)

La peptidorésine de l'exemple 4 (7,9 g) est traitée avec du HF liquide (150 ml) en présence d'anisole (15 ml) sous vide et dans un bain de glace pendant 45 min. L'excès de HF est séparé aussi vite que possible sous vide (environ 45 min) et le reste est repris dans du AcOH aqueux à 25%. Le support polymère est séparé par filtration et le filtrat est lavé à l'éther, puis la phase aqueuse est versée dans 3,51 d'eau désaérée et le pH est amené à 7 avec du NH40H dilué. Le dodéca-peptide disulfhydryle est oxydé avec du K3Fe(CN)6, puis le pH est amené à 5 avec du AcOH glacial. L'excès d'oxydant est séparé avec une résine échangeuse d'ions Bio-Rad AG 3 et le peptide est absorbé sur une résine de Bio-Rex 70. Une élution avec un tampon de Pyridine de pH 7 donne le dodécapeptide brut (300 mg).

La matière brute (150 mg) est chromatographiée à travers du Se-phadex G-15 (1,5 x 90 cm) et éluée avec du AcOH aqueux à 15%. Les matières qui émergent dans les fractions (3,1 ml chacune) 49 à 77 sont rassemblées et lyophilisées pour donner le disulfure cyclique (1-12) de L-cystéinyl-D-tyrosyl-D-tryptophyl-L-phénylalanyl-L-phényl-alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-L-phénylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-L-cystéine (69 mg).

Rf(BWA, 4/1/1): 0,68

Rf (BWAP, 30/24/6/20): 0,86

Analyse des aminoacides: Thr (2): 2,05; Ser (1): 1,05; Tyr (1): 0,96; Phe (3): 3; Lys (1): 1,04; Cys et Trp: non déterminés.

Exemple 6:

L'activité pharmacologique in vivo du composé préparé suivant l'exemple 5 (composé désigné par B) est établie par les procédés décrits dans l'exemple 3 et on obtient les résultats suivants.

Suppression de l'hormone de croissance

Composé (dose)

2h

4h

5 h

Témoin B (1 mg/kg)

199±27 111 + 14 p<0,01

303 ±95 133 ± 34 p < 0,05

161 ±30 67 ±14 p<0,01

158 ±26 151 ± 18 p > 0,05

Suppression de l'hormone de croissance, du glucagon et de l'insuline

Composé (dose, Hg/kg)

Hormone de croissance (ng/ml)

Insuline (|iU/ml)

Glucagon (Pg/ml)

Témoin

197 ±26

166±8

50 ±5

B(500)

38 ±6

116±8

18 ±4

p<0,01

Témoin

—

171 ±6

86±6

B (300)

—

153 ± 9

38 ±8

p>0,05

p<0,01

Témoin

—

278 ±26

71 ±9

B(200)

—

239± 17

44±9

p>0,05

p<0,05

Témoin

171 ±29

251 ±50

32±6

B (100)

43 ±7

170± 15

5± 1

p<0,01

p>0,05

p<0,01

Témoin

197 ±26

166±8

50 ±5

B (10)

125 ± 26

162± 13

36±4

p>0,05

p<0,05

Exemple 7:

Tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-N'm-Tosyl-D-Histidyl-0-2,6-Dichlorobenzyl-D-Tyrosyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-N£-2-Chlorobenzyloxycarbonyl-L-Lysyl-O-Benzyl-L- Thrêonyl-L-Phénylalanyl-O-Benzyl-L- Thrèonyl-O-Ben-zyl-L-Séryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-Hydroxyméthyl-polystyrène, ester

Une résine de polystyrène chlorométhylée est estérifiée avec du Boc-Cys(SMBzl)-OH suivant Gisin, citation précédente, et l'ester polymère est traité suivant le programme A de l'exemple 1 pour l'incorporation de Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Lys(Clz), Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-D-Tyr(ClBzl)-OH, Boc-D-His(Tos)-OH, et Boc-Cys(SMBzl)-OH, en vue d'obtenir la peptidorésine citée en rubrique.

Exemple 8:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystèinyl-D-Histidyl-D-Tyrosyl-L-Phênylalanyl-L-Phênylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phênylalanyl-L-Thrëonyl-L-Séryl-L-Cystëine (C)

La peptidorésine de l'exemple 7 (9,8 g) est mélangée avec 18 ml d'anisole et le mélange est traité avec du HF liquide en l'absence d'air et dans un bain de glace pendant 60 min, puis on sépare l'excès de HF sous vide et le reste est extrait avec du AcOH aqueux 2M et filtré. Le filtrat est versé dans 71 d'eau désaérée et le pH est ajusté à la valeur de 7,2 avec du NH4OH. Le mélange est agité pendant la nuit (l'oxydation est totale), puis le pH est ajusté à 5 avec du AcOH glacial, et le peptide est absorbé sur de l'Amberlite CG-50 (forme H+). La matière peptidique est éluée avec du AcOH aqueux à 30% et lyophilisée pour donner 250 mg de produit brut.

La matière précédente est chromatographiée à travers une colonne de Sephadex G-25 (2,5 x 57 cm) et éluée avec du AcOH aqueux à 10%. Les matières qui émergent dans les fractions (5,4 ml chacune) 61 à 111 sont rassemblées et lyophilisées pour donner le dodécapeptide cité en rubrique. Chromatographie en couche mince, plaques de verre préalablement enrobées d'Avicel, pulvérisation de chlorox-tolidine:

Rf (BWA, 4/11, v/v) : 0,62 Rf (tert.-AmOH, P, W, 7/7/6, v/v): 0,80

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,89; Ser (1): 0,91 ; Cys (2): 1,52; Tyr (1): 0,95; Phe (3): 3; Lys (1): 1,03; His (1): 0,93; Trp (1): 0,85.

(tert.-AmOH, P, W = alcool amylique tertiaire, pyridine, eau). Les composés suivants se préparent d'une manière similaire à celle des exemples précédents.

Exemple 9:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystêinyl-D-Arginyl-D-Tryptophyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thrêonyl-L-Séryl-L-Cystéine (D)

Chromatographie en couche mince, plaques de verre préalablement enrobées d'Avicel, pulvérisation de chlorox-tolidine:

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,49 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,77.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 2,04; Ser (1): 1,09; Cys (2): 1,42; Phe (3): 3; Lys (1): 1,04; Trp (1): 0,77; Arg (1): 0,99.

Exemple 10:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystêinyl-D-Histidyl-D-Histidyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-L-Cystéine (E)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,43 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,67.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,93; Ser (1): 0,91 ; Cys (2): 1,53; Phe (3): 3; Lys (1): 1,06; His (2): 1,78.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

634550

6

Exemple 11:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-D-Tyrosyl-D-Arginyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-D-Cystéine (F)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,55 Rf (tert.-AmOH, W, P, 7/6/7, v/v): 0,81.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,91 ; Ser (1): 0,83; Cys (2): 1,45; Phe (3): 3; Tyr (1): 0,89; Lys (1): 1,02; Arg (1): 0,93; Trp: non déterminé.

Exemple 12:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystëinyl-D-Leucyl-D-Tyrosyl-L-Phênylalanyl-L-Phënylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thrèonyl-L-Phênylalanyl-L-Thrêonyl-L-Sèryl-L-Cystèine (G)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,53 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,85

Analyse des aminoacides: Thr (2) : 1,93 ; Ser (1) : 0,86 ; Cys (2) : 1,28; Leu (1): 0,95; Tyr (1): 0,91 ; Phe (3): 3; Trp: non déterminé.

Exemple 13:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystêinyl-D-Arginyl-D-Tyrosyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phênylalanyl-L-Thréonyl-L-Sêryl-D-Cystéine (H)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,48 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,69.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,79; Ser (1): 0,85; Phe (3): 3; Tyr(l): 0,95; Lys (1): 1,03; Trp (1): 0,69; Arg(l): 0,96; Cys (2):

1,22.

Exemple 14:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-D-Tyrosyl-D-Tryptophyl-L-Phënylalanyl-L-Phënylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thrèonyl-L-Phênylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-D-Cystéine (I)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,55 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,87

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,89; Ser (1): 0,86; Cys (2): 1,29; Tyr (1): 1; Phe (3): 3; Lys (1): 1,07; Trp (2): 0,93.

Exemple 15:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystêinyl-D-Tyrosyl-D-Glutamyl-L-Phénylalanyl-L-Phênylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-L-Cystéine (J)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,55 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,69.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,83; Ser (1): 0,82; Glu (1): 0,98; Cys (2): 1,33; Tyr (1): 0,95; Phe(3): 3; Lys (1): 1,01; Trp (1): 0,81.

Exemple 16:

Les composés des exemples 8 à 15 ont été essayés pour ce qui concerne la suppression de l'hormone de croissance et la suppression de l'hormone de croissance, du glucagon et de l'insuline, suivant les procédés mis en évidence dans l'exemple 3. On a obtenu les résultats suivants.

Suppression de l'hormone de croissance

Composé

Dose (Hg/kg)

Heures

GH (ng/ml)

Témoin

_

2

100 + 16

C

1000

2

34+1*

Témoin

—

4

145 + 35

C

1000

4

33±2*

Témoin

—

5

161+28

C

1000

5

51+8**

Témoin

—

6

202 ±39

C

1000

6

36±3**

Témoin

—

7

105 ±13

C

1000

7

37±5**

Témoin

—

8

175 ±52

C

1000

8

37±6 +

Témoin

—

2

302 ±67

D

1000

2

28±3**

Témoin

—

4

177 ±50

D

1000

4

11±2*

Témoin

—

2

93 ±17

E

1000

2

36± 16 +

Témoin

—

4

34± 11

E

1000

4

45 ±10

Témoin

—

2

170±23

F

1000

2

113 ± 34

Témoin

—

4

133 ±25

F

1000

4

99 ±11

Témoin

—

2

212±37

G

1000

2

84±11*

Témoin

—

4

173 ±25

G

1000

4

94+23 +

Témoin

—

5

243 ±44

G

1000

5

93 ±30

Témoin

—

6

109 ±61

G

1000

6

72 ±68

Témoin

—

2

191 ±18

H

1000

2

75±4**

Témoin

—

4

169±32

H

1000

4

144±21

Témoin

—

2

187 ±28

I

1000

2

49±5**

Témoin

—

4

148 ±23

I

1000

4

86±11 +

Témoin

—

2

392 ±59

J

1000

2

311 ±68

Témoin

—

4

185 ± 27

J

1000

4

179±39

*p<0,01; **p<0,001; + p<0,05.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

7 634 550

Suppression de l'hormone de croissance, du glucagon et de l'insuline

Composé

Dose (Hg/kg)

GH

(Hg/ml)

Insuline (nU/ml)

Glucagon (Pg/ml)

Témoin

268 ±46

323 ±28

379 ±109

C

200

76± 14*

254 ±31

84±25 +

Témoin

—

365 ±31

379 ±47

336+51

C

200

109 ±10*

273 ±36

184±22 +

C

10

149±23*

252±41

165 ±13*

Témoin

—

122±26

195 ±18

99 ±22

D

100

21 ±2*

35±2*

53 ±9

Témoin

—

190±28

295 ±38

93 ±12

E

200

34±3*

182± 18 +

29+12*

Témoin

—

109 ±21

226 ±29

40±4

F

100

11 ±3*

103 ±24*

24±5 +

G

100

29±16 +

218±44

28+ 16

Témoin

—

171 ±29

224 ±20

74±4

H

25

23 ±4*

128 ±11*

56±6 +

Témoin

—

279 ±53

323 ±30

42±6

I

200

57 ±14*

236 ±27+

13±2*

Témoin

—

240+34

211 ±26

42±7

J

100

128 ±24+

263 ±28

45 ±4

*p<0,01; + p<0,05.

Claims

634550

2

REVENDICATIONS

1. Composés chimiques thérapeutiquement actifs, présentant la structure:

SA I

X1-L-Cys-X2-X3-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-

L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

I

SA

dans laquelle A représente l'hydrogène ou bien les deux groupes A forment une liaison directe entre les atomes de soufre; X1 représente H, Gly, L-Ala-Gly, L-Ala-D-Ala, ou Gly-Gly-Gly;

X2 et X3, qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis parmi Gly, D-Leu, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Met, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Asp ou D-Asn, à la condition que X2 et X3 ne représentent pas simultanément le reste Gly, ainsi que les sels d'addition acceptables en pharmacologie des composés ci-dessus.
2. Composés chimiques suivant la revendication 1, caractérisés en ce que X1 représente l'hydrogène.
3. Composés chimiques suivant la revendication 1, caractérisés en ce que X2 et X3 sont choisis parmi D-Arg, D-His, D-Trp et D-Tyr.
4. Composés chimiques suivant la revendication 2, caractérisés en ce que X2 et X3 sont choisis parmi D-Arg, D-His, D-Trp et D-Tyr.
5. Composé chimique suivant la revendication 1, présentant la structure suivante:

H-L-Cys-D-Arg-D-Tyr-L-Phe-L-Phe-D-Trp-

S S

I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH
6. Composé chimique suivant la revendication 1, présentant la structure suivante:

H-L-Cys-D-Tyr-D-Trp-L-Phe-L-Phe-D-Trp-

I

S S

I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH
7. Composé chimique suivant la revendication 1, présentant la structure:

H-L-Cys-D-His-D-Tyr-L-Phe-L-Phe-D-Trp-I

S S

I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH