CH634589A5

CH634589A5 - Process for the preparation of an aqueous dispersion or solution of a protein bonded to a urethane polymer

Info

Publication number: CH634589A5
Application number: CH1515877A
Authority: CH
Inventors: Frank Joseph Hartdegen; Wayne Elliott Swann
Original assignee: Grace W R & Co
Priority date: 1976-12-10
Filing date: 1977-12-09
Publication date: 1983-02-15
Also published as: BE861602A; JPH0233356B2; GB1574508A; DE2755053C2; FR2393005B1; FR2393005A1; DE2755053A1; AT356620B; ATA883577A; MX4534E; JPS5379094A; NL187585B; NL7713584A; NL187585C

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Dispersion oder Lösung eines an ein Urethanpolyme-

O

II

2) P-NH-C -NH—Pol-NH-C -NH-P

3

634 589

O O

Il II

3 ) HUN-PoI-NH-C -NH-P-NH-C -NH-Pol-NH2

Es ist auch nicht unwahrscheinlich, insbesondere wenn ein Überschuss an Polymerem vorliegt, dass das Protein als Zentrum für eine Verzweigung dient, die zu der folgenden idealisierten Struktur führen kann:

O

4) H2N-PoI-NH-C-NH-P

/

o

NH-C-NH-Pol-NH2

o

10

\

NH-C -NH-Pol-NH,

Die obigen Strukturen können unter Bildung eines ausgedehnten Netzwerkes, das sich schwer in Wasser dispergieren lässt, weitergeführt werden. Ferner kann die Gegenwart einer grossen Anzahl von Polymerketten, zum Beispiel in einem Enzym, zu sterischen Behinderungen führen. Diese könnte man reduzieren, wenn das Substrat klein ist, wie im Fall der Peroxi-dase-Enzyme. Man weiss, dass diese Enzyme verhältnismässig unbeständig sind, und nimmt daher an, dass die Umsetzung von Peroxidase-Enzymen mit Polyurethanvorpolymerem günstig ist.

Beim Dispergieren in Wasser werden alle nicht-umgesetzten -NCO-Gruppen durch Reaktion mit Wasser unter Hydrolyse in -NH2-Gruppen umgewandelt, so dass Kohlendioxid entwickelt wird und am Polyurethanmolekül Amingruppen entstehen. Diese Amingruppen können mit den freien Isocyanatgruppen an benachbarten Polyurethanmolekülen reagieren, und diese unter Bildung von Harnstoffbindungen vor sich gehende Reaktion kann die Bildung und das Wachstum sowie die Vernetzung zu einem Poly-(harnstoffurethan)-polymeren bewirken, dessen Moleküle nicht mehr dispergierbar sind, wenn die Umsetzungen weit genug fortgeschritten sind.

In der ersten Vermischungsstufe des Proteins mit dem Vorpolymeren ist die relative Menge der -NCO-Gruppen in Beziehung zu den -NH2-Gruppen des Proteins nicht kritisch. Ein Überschuss von -NCO-Gruppen kann angewandt werden, das heisst es wird ausreichend Isocyanat verwendet, so dass nach dem Lösen des Proteins im Vorpolymeren mehr als eine Stunde nachdem die Lösung gebildet ist, freie nicht umgesetzte -NCO-Gruppen vorhanden sind, unter der Annahme, dass die Komponenten vermischt wurden, und dass man sie bei Raumtemperatur, zum Beispiel 21 °C lösen Hess. Wenn der Überschuss an -NCO-Gruppen zu gross ist, wird die Wahrscheinlichkeit einer Kettenverlängerung beim Dispergieren in Wasser erhöht,

ebenso die Wahrscheinlichkeit der Bildung unlöslicher Reaktionsprodukte. Vorzugsweise liegen die Proteinamingruppen im Überschuss vor, um die Anzahl der an jedes Proteinmolekül gebundenen Polymerketten zu reduzieren. Man nimmt jedoch an, dass die Vorteile, zum Beispiel die Stabilisierung und die verringerte Antigenwirkung der mit Polymeren modifizierten Proteine erreicht werden können, ob nun eine oder eine grosse Anzahl von Polymerketten an das Protein gebunden ist.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform, der Ausführungsform A, gemäss der Erfindung umfasst das Verfahren:

(a) die Bildung eines ersten Produktes durch Vermischen in Abwesenheit von Wasser, das heisst unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen des Proteins mit einem flüssigen Polyiso-cyanat und

(b) die Bildung eines zweiten Produktes aus einem flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen und in ihm gelösten Protein durch Vermischen und Umsetzen des ersten Produktes und einer entsprechenden Menge eines sPolyols in Abwesenheit von Wasser.

Alternativ umfasst das Verfahren:

(a) Die Bildung eines ersten Produktes durch Vermischen des Proteins mit einem flüssigen Polyol in Abwesenheit von Wasser und

(b) die Bildung eines zweiten Produktes aus einem flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen und in ihm gelöstem Protein durch Umsetzung des ersten Produktes und einer entsprechenden Menge Polyisocyanat in Ab-

j 5 Wesenheit von Wasser.

Bei diesen Ausführungsformen bevorzugt man im allgemeinen die Verwendung von 2 bis 500 und insbesondere von 50 bis 100 mg Protein je g Polyol.Die Menge verwendetes Protein in 20Bezug auf das Isocyanat ist nicht kritisch.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren:

(a) das Vermischen des flüssigen Polyurethanvorpolymeren 25 und eines mit dem Enzym umsetzbaren Substrats in Abwesenheit von Wasser und

(b) das Vermischen der erhaltenen Mischung mit dem Enzym in Abwesenheit von Wasser. In diesem Falle bevorzugt man im allgemeinen die Verwendung von 5 bis 100 Molen und insbe-

30 sondere von 8 bis 12 Molen Substrat je Mol Enzym.

Im erfindungsgemässen Verfahren wirkt das flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen als (a) Lösungsmittel für die Lösung des zu bindenden Proteins und (b) als Reaktionsteilnehmer für die Umsetzung mit dem an es zu

35

bindenden Protein.

Die Verfestigungstemperatur des flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen hängt vom Mo-40 lekulargewicht des Vorpolymeren und dem Gerüst des Vorpolymeren ab.

Die Bildung der Protein/Vorpolymer-Lösung wird in Abwesenheit von Wasser durchgeführt und in Gegenwart oder Abwesenheit eines Verdünnungsmittels oder einer Mischung von 45 Verdünnungsmitteln. Selbstverständlich kann ein Verdünnungsmittel, das das Protein denaturieren oder die Dispergier-barkeit verhindern oder wesentlich reduzieren würde, nicht verwendet werden: Brauchbare Verdünnungsmittel sind in der US-Patentschrift 3 672 955 beschrieben. Die Verdünnungsmittel 50 können in Wasser stark löslich sein, wie Aceton ; mässig löslich, wie Methylacetat oder Methylethylketon oder in Wasser unlöslich sein, wie Benzol und andere derartige Verdünnungsmittel, wie sie in der US-Patentschrift 3 672 955 beschrieben sind.

55

60

Die Verdünnungsmittel dienen zur Verringerung der Viskosität (a) des flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen und (b) der entstehenden Lösung.

Wenn das Verdünnungsmittel in Wasser unlöslich oder im wesentlichen unlöslich ist, kann ein Emulgiermittel verwendet werden.

Man nimmt an, dass die Bindung des Proteins durch Umsetzung mit dem Vorpolymeren eine generell auf alle Proteine anwendbare Reaktion ist, die Enzyme, Antikörper und Antigene 65 einschliesst.

Solche Enzyme umfassen Oxido-Reduktasen, Lyasen, Transferasen, Isomerasen, Hydrolasen und Ligasen.

634 589

Spezifische Enzyme sind:

Urease Trypsin Lactase

Glucose-Oxidase

Chymotrypsin

Ribonuclease

Peroxidase

Pepsin

Rennin

Invertase

Papain

Asparaginase

Pectinase

Pectin-Esterase

Penicillin-Amidase

Glucose-Isomerase

Lysozym

Aminosäure-Acylase Pronase

Alkohol-Dehydrogenase a-Amylase

ß-Amylase Subtilisin

Aminosäure-Oxidase

Katalase

Tannase

Cellulase Ficin

Bromelain Pankreatin Isoamylase Lipase

Äpfelsäure-Dehydrogenase

Hexokinase

Lactat-Dehydrogenase

Adenosin-Desaminase

Uricase

Galactose-Oxidase Diaphorase Cholinesterase Aldolase

Pyruvat-Carboxylase

Phospharylase

Cephalosporin-Amidase

Isozitronensäure-Dehydrogenase cc-Glycerinphosphat-Dehydrogenase

Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase Äpfelsäureenzym

Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

Phenol-Oxidase

Glucoamylase

Pullulanase

Hefe-Cytochrom-c-Reduktase

Luciferase

Nitrit-Reduktase

Glutamyl-Transferase

Glutathion-Synthetase

Glycocyamin-Phosphokinase

Hippursäure-Synthetase

Aldehyd-Oxidase

Bernsteinsäure-Dehydrogenase sowie menschliches Immunoglobulin G. Die Reinheit des Proteins ist wahrscheinlich nicht kritisch. Ob rein oder nicht rein, wenn es nur die erforderlichen Amingruppen aufweist. Die Bindung kann so mit (a) reinem kristallinem Protein, (b) partiell gereinigtem nicht-kristallinem Protein, (c) unreinen, Enzyme, Antikörper oder Antigene enthaltenden getrockneten Extrakten oder (d) nicht gereinigten getrockneten Extrakten aus Fermentationsbrühen, zum Beispiel einem aus einer Brühe mit Aceton erhaltenen Fällungsprodukt bewirkt werden.

Nach der Bildung der Protein/Vorpolymer-Lösung verursachen bestimmte Proteine die Verfestigung des Vorpolymeren, wenn das Protein in ausreichend grossen Mengen vorhanden ist. Ein Beispiel für dieses Phänomen ist Penicillin-Amidase. Wenn die Amidase-Werte etwa 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Vorpolymeren, überschreiten, besitzt die Vorpolymerlösung eine erhöhte Viskosität und kann nach etwa 60 Minuten nicht mehr gerührt werden. Bei Konzentrationen von unter etwa 5 Gew.-% lässt sich die Lösung noch rühren und in Wasser dispergieren.

Der Beginn der Verfestigung kann einfach dadurch festgestellt werden, dass man das Protein in zunehmend grösseren Mengen in verschiedenen Ansätzen des Vorpolymeren löst.

Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen sind bekannt, vgl. zum Beispiel Kirk-Othmer «Encyclope-

5 -Dehydroshikimin-Reduktase

Glutathion-Reduktase

Glycolsäure-Oxidase

Nitrat-Reduktase

Xanthin-Oxidase

Lipoyl-Dehydrogenase

Flavin-Peroxidase

Glycin-Oxidase

Carboxylase a-Ketosäure-Dehydrogenase Transketolase dia of Chemical Technology», John Wiley and Sons, Inc., New 45 York, 2. Auflage, Band 9, und «The Encyclopedia of Chemi-stry», George L. Clark, Reinhold Publishing Corporation, New York, 2. Auflage. Die erfindungsgemäss verwendeten sind in Wasser dispergierbar oder in Wasser löslich.

Unter dieser Voraussetzung kann jedes flüssige Polyure-50 thanvorpolymere, einschliesslich der in den US-Patentschriften 3 672 955 und 3 929 574 genannten, die mindestens eine freie Isocyanatgruppe je Molekül des Vorpolymeren enthalten, verwendet werden. Vorzugsweise enthält das Vorpolymere durchschnittlich 1 bis 2 Isocyanatgruppen je Molekül, obgleich auch 55 solche mit zum Beispiel 2 bis 8 oder mehr Isocyanatgruppen je Polyurethanmolekül verwendet werden können.

Das erfindungsgemäss eingesetzte flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen kann mindestens zwei reaktionsfähige Isocyanatgruppen je Molekül des Vorpoly-60 meren enthalten. Ein Polyurethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen ist ein «flüssiges Polyurethanvorpolymeres», das bei der erfindungsgemässen Verwendung die folgenden Bedingungen erfüllt: Es ist bei 40 bis 70 °C eine freifliessen-de Flüssigkeit oder lässt sich in einem inerten Lösungsmittel, 65 zum Beispiel den oben angegebenen, unter Bildung einer Lösung lösen, die etwa 1 bis 50% und insbesondere 10 bis 25 Gew.-% an Polyurethanvorpolymerem mit endständigen Isocyanatgruppen enthält.

Der vorliegend verwendete Ausdruck «flüssiges Polyure-thanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen» bezeichnet beispielsweise ein flüssiges Polyurethan- oder Poly-harnstoffmolekül mit mindestens etwa zwei freien Isocyanatgruppen je Molekül.

Repräsentative Beispiele für Polyisocyanate, die mit einer aktive Wasserstoffatome enthaltenden Verbindung, zum Beispiel einem Glykol, Polyol, Polyglykol, Polyesterpolyol oder Po-lyätherpolyol zu einem Polyurethan mit endständigen Isocyanatgruppen umgesetzt werden können, sind:

Toluol-2,4-diisocyanat, Toluol-2,6-düsocyanat, handelsübliche Gemische aus Toluol-2,4- und -2,6-diisocyanat, Ethylen-diisocyanat, Ethylidendiisocyanat, Propylen-l,2-diisocyanat, Cyclohexylen-l,2-diisocyanat, Cyclohexylen-l,4-diisocyanat, m-Phenylendiisocyanat, 3,3 ' -Diphenyl-4,4' -biphenylendiisocy-anat, 4,4'-Biphenylendiisocyanat, 3,3'-Dichlor-4,4'-bipheny-lendiisocyanat, 1,6-Hexamethylen-düsocyanat, 1,4-Tetrame-thylendiisocyanat, 1,10-Decamethylen-diisocyanat, 1,5-Naph-thalin-diisocyanat, Cumol-2,4-düsocyanat, 4-Methoxy-l,3-phe-nylendiisocyanat, 4-Chlor-l,3-phenylendiisocyanat, 4-Brom-1,3-phenylendiisocyanat, 4-Ethoxy-l,3-phenylen-diisocyanat,

5 634 589

2,4'-Diisocyanatodiphenyläther, 5,6-Dimethyl-l,3-phenylen-diisocyanat, 2,4-Dimethyl-l,3-phenylendiisocyanat, 4,4'-Diiso-cyanatodiphenyläther, Benzidin-diisocyanat, 4,6-Dimethyl-l,3-phenylendiisocyanat, 9,10-Anthracen-diisocyanat, 4,4'-Diiso-5cyanatodibenzyl, 3,3'-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenylme-than, 2,6-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenyl, 2,4-Diisocyana-tostilben, 3,3'-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenyl, 3,3'-Di-methoxy-4,4' -düsocyanatodiphenyl, 1,4-Anthracendiisocyanat, 2,5-Fluorendiisocyanat, 1,8-Naphthalindiisocyanat, 2,6-Diiso-xocyanatobenzfuran, 2,4,6-Toluoltriisocyanat und p,p',p"-Tri-phenylmethan-triisocyanat.

Eine brauchbare Klasse flüssiger Polyurethanvorpolymerer mit endständigen Isocyanatgruppen sind die von Polyätherpo-islyolen und Polyesterpolyolen abgeleiteten.Diese Verbindungen können in bekannter Weise durch Umsetzung eines Polyäther (oder Polyester)-polyols mit einem Polyisocyanat hergestellt werden, wobei man einen Überschuss des letzteren verwendet, um freie Isocyanatgruppen im Produkt zu gewährleisten. Ein 20 typisches Beispiel hierfür ist nachstehend in Form einer idealisierten Gleichung wiedergegeben:

CH,

HO-(-CH2-CH2-0-)m-HPolyätherpolyol CH3

NCO

NGO Polyisocyanat

CH3

OCN-

O

o

-NH-C -0-(-CH2-CH2-0-) fjj—C-NH-

V

-NCO

\y flüssiges Polyurethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen m bezeichnet die Anzahl der sich wiederholenden Oxyethylen- 45 methylj-propan, Triethanolamin, Triisopropanolamin, Resor-

einheiten. Diese können 5 bis 50 betragen. ein, Pyrogallol, Phloroglucin, Hydrochinon, 4,6-di-tert.-Butyl-

Das Vorpolymere kann aus einer Vielzahl von Polyolen, wie sie catechin, Catechin, Orcin, Methylphloroglucin, Hexylresorcin,

in der US-Patentschrift 3 672 955 angegeben sind, einschliess- 3-Hydroxy-2-naphthol, 2-Hydroxy-l-naphthol, 2,5-Dihydr-

lich einfacher Polyole und Polyätherpolyole sowie Polyesterpo- oxy-l-naphthol, Bisphenole, wie 2,2-Bis-(p-hydroxyphenyI)-

lyole hergestellt werden. 50 propan und Bis-(p-hydroxyphenyl)-methan, l,l,2-Tris-(hydr-

Typische einfache Polyole sind: Propylenglykol, Trimethy- oxyphenyl)-ethan un<? l,l,3-Tris-(hydroxyphenyl)-propan.

lenglykol, 1,2-Butylenglykol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, Typische Polyätl^ oolyole sind solche, die durch Umset-

1,5-Pentandiol, 1,2-Hexylenglykol, 1,10-Decandiol, 1,2-Cy- zung eines Alkylenoxids mit einem Initiator erhalten werden,

clohexandiol, 2-Buten-l,4-diol, 3-Cyclohexen-l,l-dimethanol, der aktive Wasserstoffatome enthält, zum Beispiel einem mehr-

4-Methyl-3-cyclohexen-l,l-dimethanol, 3-Methylen-1,5-pen- 55 wertigen Alkohol, wie Ethylenglykol, einem Polyamin, wie tandiol, Diethylenglykol, (2-Hydroxyethoxy)-l-propanol, 4-(2- Ethylendiamin oder Phosphorsäure. Die Umsetzung wird ge-

Hydroxyethoxy)-l-butanol, 5-(2-Hydroxypropoxy)-l-penta- wohnlich in Gegenwart eines sauren oder basischen Katalysa-

nol, l-(2-Hydroxymethoxy)-2-hexanol, l-(2-Hydroxyprop- tors durchgeführt. Beispiele für geeignete Alkylenoxide sind oxy)-2-octanol, 3-AIlyloxy-l,5-pentandiol, 2-AlIyloxymethyl- Ethylenoxid, Propylenoxid, die isomeren Butylenoxide sowie

2-methyl-l,3-propandiol, [(4-Pentyloxy)-methyl]-l,3-propan- 60 Gemische aus zwei oder mehr Alkylenoxiden, zum Beispiel Ge-

diol, 3-(o-Propenylphenoxy)-l,2-propandiol, Thiodiglykol, mische aus Ethylen- und Propylenoxid. Die erhaltenen Poly-

2,2'-[Thiobis-(ethylenoxy)]-diethanol, Polyethylenätherglykol ätherpolyole enthalten ein Polyäthergerüst und endständige Hy-

mit einem Molekulargewicht von etwa 200,2,2'-Isopropyliden- droxylgruppen. Die Anzahl der Hydroxylgruppen im Polymer-

bis-(p-phenylenoxy)-diethanol, 1,2,6-Hexantriol, 1,1,1-Trime- molekül wird durch die Funktionalität des Initiators mit aktiven thylolpropan, 3-(2-Hydroxyethoxy)-l ,2-propandiol, Ethylen- 65 Wasserstoffatomen bestimmt. Zum Beispiel führt ein bifunktio-glykol, 3-(2-Hydroxypropoxy)-l,2-propandiol, 2,4-Dimethyl-2- neiler Alkohol, wie Ethylenglykol, zu Polyätherketten, in denen

(2-hydroxyethoxy)-methylpentandiol-l,5 ; l,l,l-Tris-[(2-hydr- zwei Hydroxylgruppen im Polymermolekül enthalten sind.

oxyethoxy)-methyl]-ethan, 1,1,1 -Tris-[(2-hydroxypropoxy)- Wenn die Polymerisation des Oxids in Gegewnart von Glycerin,

634 589 6

einem trifunktionellen Alkohol, durchgeführt wird, enthalten rial entsteht, das durch Filtrieren abgetrennt werden kann. Zur die gebildeten Polyäthermoleküle durchschnittlich drei Hydr- Erhöhung der Ausbeute an löslichen Verbindungen sollten ent-

oxylgruppen im Molekül. Eine noch höhere Funktionalität wird sprechende Dispergierungsbedingungen eingehalten werden,

erreicht, wenn man das Oxid in Gegenwart von Polyolen, wie Um die Bildung unlöslichen Materials zu verhindern, bevorzugt

Pentaerythrit, Sorbit, Saccharose und Dipentaerythrit polymeri- 5 man die Verwendung wasserlöslicher hydrophiler Polyurethane siert. Andere mehrwertige Alkohole, die mit Alkylenoxiden zu mit mindestens 50 Mol.- % Oxyäthyleneinheiten im Gerüst. Das brauchbaren Polyätherpolyolen umgesetzt werden können, sind Verhältnis Wasser zu Protein plus flüssigem Polyurethanvorpo-

in der bereits aufgeführten Liste einfacher Polyole enthalten. lymerem mit endständigen Isocyanatgruppen ist nicht kritisch.

Eine besonders brauchbare Klasse von Polyätherpolyolen Um die Dispergierung weiter zu erleichtern, kann ein obersind die Polyoxyethylenpolyole H0-(CH2CH2-0)x-H, in de- io flächenaktives Mittel verwendet werden. Die Verwendung nen x eine solche Durchschnittszahl darstellt, dass das Polyol ein oberflächenaktiver Mittel ist üblich. Die einzige Forderung bedurchschnittliches Molekulargewicht von bis zu etwa 1000 oder steht darin, dass das oberflächenaktive Mittel natürlich nicht mit etwa 2000 oder noch etwas höher besitzt. dem Protein reagieren und dadurch dessen biologische Wirkung

Die verwendbaren Polyesterpolyole werden am einfachsten verringern sollte. Geeignete oberflächenaktive Mittel sind durch Kondensationspolymersation eines Polyols mit einer is nichtonische Materialien, zum Beispiel die komplexen Gemi-

mehrbasischen Säure hergestellt. Das Polyol und die sauren Re- sehe aus Polyoxyethylenderivaten, die unter dem Handelsna-

aktionsteilnehmer werden in solchen Anteilen verwendet, dass men «Tween» auf dem Markt sind. Brauchbar sind auch die im wesentlichen alle Säuregruppen verestert werden und die Blockcopolymeren aus Oxyäthylen/Oxypropylen, die unter dem gebildete Kette aus Estereinheiten endständige Hydroxylgrup- Handelsnamen «Pluronic» vertrieben werden. Das oberflächen-

pen aufweist. Repräsentative Beispiele für solche mehrbasi- 20 aktive Mittel kann entweder dem Wasser, oder der Protein/

sehen Säuren sind Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glu- Vorpolymer-Lösung zugefügt werden.

tarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Korksäure, Azelainsäure, Bei der Dispergierung der Protein/Polymer-Lösung in Was-

Sebacinsäure, Brassylsäure, Thapsisäure, Maleinsäure, Fumar- ser beobachtet man häufig, dass das Protein/Polymer-Reak-

säure, Glutaconsäure, cc-Hydromuconsäure, ß-Hydromucon- tionsprodukt in Wasser löslich ist. Dies ist besonders dann der säure, a-Butyl-a-ethylglutarsäure, a,ß-Diethylbernsteinsäu- 25 Fall, wenn das Polyurethangerüst eine merkliche Anzahl Oxy-

re, o-Phthalsäure, Isophthalsäure, Terephthalsäure, Hemimel- ethyleneinheiten, zum Beispiel 50% oder mehr auf Gewichtsba-

lithsäure, Trimellithsäure, Trimesinsäure, Mellophansäure, sis enthält.

Prehnitinsäure, Pyromellithsäure, Zitronensäure, Benzolpenta- Der vorliegend verwendete Ausdruck «Dispersionen» um-

carbonsäure, 1,4-Cyclohexan-dicarbonsäure, Diglykolsäure, fasst wässrige «Lösungen» des Protein/Polymer-Reaktionspro-

Thiodiglykolsäure, dimerisierte Ölsäure und dimerisierte Linol- 30 duktes.

säure, Repräsentative Beispiele für Polyole für die Herstellung Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält die pro-dieser Polymeren sind Ethylenglykol, 1,3-Propylenglykol, 1,2- teinhaltige wässrige Dispersion etwa 0,1 bis 50 Gew.-% eines Propylenglykol, 1,4-Butylenglykol, 1,3-Butylenglykol, 1,2-Bu- aktiven Proteinpräparates auf wasserfreier Basis, das kovalent tylenglykol, Buten-l,4-diol, 1,6-Hexandiol, Hexen-l,6-diol, über Ureid-Bindungen an ein in Wasser dispergierbares hydro-1,7-Heptandiol, Diethylenglykol, Glycerin, Trimethylolpropan, 35 philes Poly-(harnstoff-urethan)-polymeres mit einem Oxyalky-1,3,6-Hexantriol, Trimethanolamin, Pentaerythrit, Sorbit und lengerüst, das mindestens 50 Mol.-% Oxyethylen enthält, gebeliebige andere oben angegebene Polyole. bunden ist. Das Protein kann ein Enzym, ein Antikörper oder

Typische, für das erfindungsgemässe Verfahren bevorzugte ein Antigen sein.

Vorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen sind Für den Fachmann liegen zahlreiche Anwendungszwecke

(a) Das Vorpolymere aus Toluoldiisocyanat und einem Po- 40 für die wässrige Proteindispersionen oder -lösungen gemäss der lyethylenglykol. Erfindung, die beständiger sind und eine geringere Antigenwir-

(b) Das Vorpolymere aus Toluoldiisocyanat und einem Po- kung aufweisen, auf der Hand. Unter anderem können sie als lyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht Standards oder Kontrollen in Testverfahren angewandt werden, von 800 bis 1200 und vorzugsweise von etwa 1000. zum Beispiel stabilisierte Glucose-Qxidase für die Bestimmung

(c) Das Vorpolymere aus Toluoldiisocyanat und Ethylengly- « von Serumglucose, oder stabilisierte Kreatin-Phosphokinase kol, Diethylenglykol, einem Polyoxyethylenpolyolpolymeren, (KPK) als Standard für die Bestimmung von Serum KPK. Pentaerythrit, Glycerin, Trimethylolpropan und einem Polyoxy- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In diesen propylenpolyolpolymeren, vorausgesetzt, dass mindestens wurde das Urethanvorpolymere durch Vermischen von Poly-50 Mol.-% des Gerüstes aus Polyoxyethylen bestehen. ethylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 1000

(d) Das Vorpolymere aus Toluoldiisocyanat und einer Mi- 50 (PEG) mit Trimethylolpropan (TMOP) und Umsetzen der Mischung aus einem Polyethylenglykol mit einem durchschnittli- schung mit Toluoldiisocyanat (TDI), das die endständigen Isochen Molekulargewicht von etwa 800 bis 1200, vorzugsweise eyanatgruppen zur Verfügung stellt, erhalten. Das Molverhält-etwa 1000, und Trimethylolpropan, wobei das Trimethylolpro- nis PEG/TMOP/TDI betrug etwa 2/0,66/6,3.

pan und das Polyethylenglykol in einem Molverhältnis von etwa

1:1 bis 4 und das Toluoldiisocyanat in einer Menge von etwa 55 Beispiel

0,85 bis 1,25 und vorzugsweise von 0,95 bis 1,1 Mol je Äquiva- An Polyurethan gebundenes Lysozym lent (17 g) der vom Polyethylenglykol und dem Trimethylolpro- Ein in Wasser dispergierbares Lysozym/Polyurethan-Reak-

pan zur Verfügung gestellten -OH-Gruppen eingesetzt wird. tionsprodukt wurde durch Vermischen von 0,1 g Lysozym und

(e) Das Vorpolymere aus Toluoldiisocyanat und Ethylen- 1,0 g des Vorpolymeren hergestellt. Diese Materialien liess man glykol nach Beispiel 1 der US-Patentschrift 3 929 574. 60 eine Stunde in einem Exsikkator bei Raumtemperatur (etwa

Die Protein/Vorpolymer-Lösung wird dann in Wasser di- 21 °C) reagieren.

spergiert. Vorteilhaft wird sie in genügend Wasser dispergiert Die Enzym/Polyurethan-Zusammensetzung wurde langsam und in einer ausreichend geringen Geschwindigkeit, dass die zu 500 ml entionisiertem Wasser gegeben, das drei Tropfen ei-

Kettenverlängerung so gering wie möglich gehalten wird. Sonst nes Poly-(oxyethylen/oxypropylen) oberflächenaktiven Mittels ist die Dispergierung nicht kritisch, ausser, dass gerührt werden 65 (Pluronic L-61) enthielt. Während der Zugabe des Wassers sollte, um die Kettenverlängerung bei der Dispergierung so ge- wurde heftig gerührt. Nachdem alles zugesetzt war, wurde noch ring wie möglich zu halten. Man hat festgestellt, dass gewöhnlich 35 Minuten gerührt. Das gerührte Material trennte sich in zwei eine gewisse Kettenverlängerung eintritt und unlösliches Mate- Phasen.

7

634 589

Die lösliche Phase wurde durch ein Whatman Nr. 40-Filter filtriert und dann durch ein 0,22 um-Filter. Aus der Aktivität gegen Micrococcus lysodeikticus stellte man 50% der Enzymwirksamkeit in der löslichen Phase fest.

Eine Kontrollprobe wurde dadurch hergestellt, dass man 1,0 g Vorpolymeres ohne Enzym wie oben härtete und filtrierte.

Feines Sephadex G-50 Hess man in 0,05 molarem Ammo-niumacetatpuffer (pH 7,0) aufquellen und füllte damit eine 2,5 X 45 cm Glas-Chromatographiersäule auf 2,5 X 41 cm. Proben wurden mit 0,05 molarem Ammoniumacetatpuffer (pH 7,0) bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 1,35 ml Min.-1 eluiert und in 4,5 ml Fraktionen gesammelt. Für jede Fraktion wurde die Absorbens bei X=280 nm bestimmt. Die Absorbens jeder Probe wurde in Reihe von 60 aus der Säule eluierten Fraktionen gemessen. Die Proben wurden in folgender Weise auf die Säule aufgebracht.

Eine 2,0 ml Probe des löslichen an Polymeres gebundenen Lysozyms wurde auf die Säule aufgebracht und wie oben beschrieben eluiert. Für das lösliche an das Polymere gebundene Lysozym stellte man bei der Fraktion 37 ein Maximum mit der Absorbens 0,1 fest. Das als Kontrolle verwendete freie Polyurethan wies bei der Fraktion 41 ein Maximum mit einer Absorbens von 0,12 auf.

Die Form der Absorbenskurven für das an das Polymere gebundene Enzym und das freie Polymere waren ähnlich und zeigten keine scharfen Maxima wie Dextran und das freie Enzym. Die verhältnismässig breite Verteilung und das Fehlen eines scharfen Maximums zeigen wahrscheinlich eine breite Verteilung der Polymerkettenlängen im gebundenen Enzym und den freien Polymerproben an.

Eine 2,0 ml-Probe mit einem Gehalt von 1,5 mg freiem Dextran vom Molekulargewicht etwa 2000 und 4 mg freies Lysozym wurden auf die Säule aufgebracht und mit Puffer eluiert. Das Dextran hatte bei der Fraktion 13 ein Maximum mit der Absorbens 0,71 und freies Lysozym bei der Fraktion 30 mit der Absorbens 0,32.

Beispiel 2

An Polyurethan gebundenes Trypsin

Trypsin wurde unter Bildung eines in Wasser dispergierba-ren Produktes an Polyurethan gebunden, indem man 0,1 g Trypsin und 0,9 g des Vorpolymeren mischte und wie im vorhergehenden Beispiel die Mischung langsam zu 500 ml entionisiertem Wasser gab.

Nach dem Filtrieren und Trocknen des unlöslichen Materials in einem Ofen von 45 °C wurden 32% des anfänglichen Materials als unlöslich gewonnen.

Wie im vorhergehenden Beispiel wurde eine Kontrollprobe ohne Enzym hergestellt.

Sephadex G-50 (fein) Hess man in entionisiertem Wasser aufquellen und füllte damit zwei 0,9 X 60 cm Chromatogra-phiersäulen, die über ein kurzes dünnes Rohr in Reihe zu einer Gesamtkolonnenhöhe von 0,9 X120 cm verbunden wurden. Mit entionisiertem Wasser wurden bei 0,3 ml • Min.-1 bei Raumtemperatur Proben eluiert und in 2,7 ml Fraktionen gesammelt. Für jede Fraktion wurde die Absorbens bei X.=280 nm festgestellt.

Eine 1,0 ml-Probe des löslichen gebundenen Trypsins wurde auf die Säule aufgebracht und mit entionisiertem Wasser eluiert.

Man stellte zwei Maxima bei 280 nm fest, das kleinere mit der Fraktion 20 und das grössere mit der Fraktion 23.

Eine 1,0 ml-Probe der Kontrolle wurde auf die Säule aufgebracht und mit entionisiertem Wasser eluiert, wobei man das kleinere Maximum bei der Fraktion 18 und das grössere Maximum bei der Fraktion 21 feststellte.

Eine 1,0 ml Probe, die 2 mg freies Trypsin enthielt, wurde auf die Säule aufgebracht. Sie führte bei der Fraktion 20 zu einem einzigen Maximum.

Für das lösliche gebundene Trypsin wurde ein grösseres Ab-sorbensmaximum bei etwa 190 nm und ein kleineres Maximum bei 173 nm festgestellt. Beim freies Trypsin war die Absorbens bei etwa 213 nm. Die Absorbens der Polyurethankontrolle war 5 bei etwa 90 nm (kleineres Maximum) und bei etwa 205 nm (grösseres Maximum).

Beispiel 3

Lösliches Reaktionsprodukt aus Rinderserum, Albumin und io Polyurethan

An Polyurethan gebundenes Rinderserumalbumin (RSA) wurde durch Vermischen von 0,1g RSA mit 0,9 g des Vorpolymeren und Reaktion in einem Exsikkator (um es trocken zu halten) während einer Stunde hergestellt. Dieses Material wur-15 de dann langsam zu 200 ml entionisiertem Wasser gegeben. Das Wasser wurde während der Zugabe rasch gerührt. Nach beendeter Zugabe wurde die wässrige Dispersion weitere 35 Minuten gerührt.

Die lösliche Fraktion wurde durch Filtrieren durch ein 20 Whatman Nr. 40-Filter und dann durch ein 0,22 [im Millipo-renfilter abgetrennt. Die Menge an unlöslichen Stoffen (40%, bezogen auf das vereinigte Gewicht an Enzym und Vorpolyme-rem) wurde durch Trocknen des Rückstandes nach dem Filtrieren festgestellt.

25 Proben des löslichen Materials und äquivalente Mengen an freiem RSA in entionisiertem Wasser wurden auf eine Ampho-line PAG-Platte (pH-Bereich 3,5 bis 9,5) auf einer den isoelektrischen Punkt einstellenden LKB-Multiphor-Einheit aufgebracht.

30 Man führte den Verasch bei 10 °C durch, bis der pH-Gradient festgestellt war. Die Gelplatte mit den Proben wurde dann zur Sichtbarmachung der Proteine angefärbt.

Freies RSA, das nach den Angaben in der Literatur einen ■ pl=4,9 hat, führte zu vier feststellbaren Proteinbanden im pH-35 Bereich 4,8 bis 5,3. Die das RSA/Vorpolymer-Reaktionspro-dukt enthaltende Probe ergab eine homogene Bande im pH-Bereich 4,8 bis 5,0.

Beispiel 4

40 An Polyurethan gebundene Invertase

250 mg Invertase wurden in 4 g Vorpolymerem gelöst. Die Lösung wurde langsam zu 300 ml Wasser gegeben, die mit 1000 U/Min. gerührt wurden. Die erhaltene Dispersion wurde filtriert. Sowohl die wässrige Phase als auch die feste Phase 45 hatten enzymatische Wirksamkeit.

Freie Invertase wurde in Wasser dispergiert, bis der gleiche Wert an Enzymwirksamkeit erreicht war, wie bei der wässrigen Dispersion. Die beiden wässrigen Dispersionen (mit freiem und mit gebundenem Enzym) wurden 14 Tage bei 10 °C aufbe-50 wahrt, innerhalb denen die Wirksamkeit beider Dispersionen um etwa 10% abfiel. Gleichzeitig wurde ein ähnlicher Versuch durchgeführt, wobei man jedoch die Dispersionen bei 40 °C aufbewahrte. Nach 14 Tagen hatte das an das Polymere gebundene Enzym noch etwa 45 % seiner ursprünglichen Wirksam-55 keit, während beim freien Enzym nur Spuren an Wirksamkeit von weniger als 5 % der anfänglichen Wirksamkeit ermittelt werden konnten.

Die wässrige Dispersion des an das Polymere gebundenen Enzyms war bei 40 °C thermisch beständiger als das freie En-60 zym.

Beispiel 5 An Polyurethan gebundenes Trypsin Fällung mit Trichloressigsäure 65 Herstellung von löslichem gebundenen Protein

400 mg Trypsin wurden in 3600 mg Vorpolymerem gelöst, worauf man bei Raumtemperatur in einem Exsikkator eine Stunde reagieren Hess.

634 589

8

Das Reaktionsprodukt wurde dadurch in 200 ml Wasser dispergiert, dass man kleine Anteile unter raschem Rühren innerhalb von 30 Minuten in das Wasser gab.

Unlösliches Produkt wurde durch Filtrieren durch ein Whatman Nr. 40-Filter und anschliessend durch ein 0,22 (im Milli-porenfilter entfernt.

Die vereinigten Fällungen aus beiden Filtrationen wurden getrocknet und gewogen. Die Differenz (Gewicht des Reaktionsproduktes abzüglich der Fällungen) ist die Menge an löslichem Material in den erhaltenen 200 ml klarer Lösung.

Das obige Verfahren wurde mit der Abweichung wiederholt, dass kein Enzym verwendet wurde, das heisst es wurden 3600 mg Vorpolymeres mit 200 ml Wasser umgesetzt. Die erhaltene Polymerlösung diente nach dem Filtrieren als Kontrolle.

Zwei weitere Kontrollproben wurden wie folgt hergestellt: Die Kontrolle 1 enthielt 6 mg Trypsin gelöst in 10 ml Wasser, während die Kontrolle 2 6 mg Trypsin gelöst in 10 ml der freien Lösung enthielt.

Zu 10 ml jeder der obigen Lösungen wurden 30 ml einer 5 %igen Trichloressigsäurelösung gegeben. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die gebildeten Produkte 30 Minuten mit 17.000 U/Min. zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden abdekantiert und die erhaltenen Fällungen in einem Vakuumofen getrocknet.

Die Gewichte der erhaltenen Fällungen sowie die Menge Material in jeder 10 ml-Lösung vor der Fällung waren wie folgt:

^Berechnet aus der bekannten Menge in Lösung (erhalten aus dem Reaktionsprodukt abzüglich der anfänglichen Fällungen) unter Verwendung des Verhältnisses Vorpolymeres Enzym im Reaktionsgemisch.

5

Trichloressigsäure ist ein bekanntes Reagenz für die Fällung von Proteinen, während die obigen Werte zeigen, dass es kein lösliches Polyurethan fällt. Wenn Trichloressigsäure zu löslichen gebundenen Proteinen gegeben wird, fallen die Proteine aus, 10 wobei auch der Teil des löslichen Polyurethans ausgefällt wird, an den die Proteine gebunden sind.

Ähnliche Versuche wurden mit Rinderserumalbumin und Penicillin-Amidase durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.

15

Rinderserumalbumin/Trichloressigsäurefällung

20

insgesamt

Protein

Polymères

Fällung ohne

62

0

62

2

Kontrolle 1

8

0

11

Kontrolle 2

70

8

62

16

löslich

gebunden

80

(8)a

(72)*

23

Probe

Menge

Protein

Polymeres

Fällung

Penicillin-Amidase/Trichloressigsäurefällung

Material in der in der

in der

Lösung

30

Lösung

insgesamt

Protein

Polymeres

Fällung ohne

72

0

72

2

ohne 62

0

62

0

Xon

Kontrolle 1 8

8

0

8

trolle 1

6

0

8

35 Kontrolle 2 70

8

62

12

Kon

löslich

trolle 2

78

6

72

9

gebunden 77

(7)a

(70)*

20

löslich

gebunden

59

(6)*

(53)*

25

(a)berechnet wie oben für Trypsin beschrieben

C

Claims

634 589

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Dispersion oder Lösung eines an ein Urethanpolymeres gebundenen Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass man ein in Wasser lösliches oder dispergierbares biologisch wirksames Protein und ein in Wasser lösliches oder dispergierbares flüssiges Polyurethanvor-polymeres mit endständigen Isocyanatgruppen unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen vermischt und diese Mischung dann in Wasser löst, bzw. dispergiert.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Dispersion zur Entfernung nicht dispergierten Protein/Polymer-Materials filtriert.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein/Polymer-Material wasserlöslich ist.
4. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorpolymere ein Oxyalkylengerüst aufweist.
5. Verfahren gemäss Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Poylmergerüst aus Oxyäthylen-, Oxypropy-len- oder Oxybutyleneinheiten und vorzugsweise aus Oxyäthy-leneinheiten besteht.
6. Verfahren gemäss Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Vorpolymere von Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 800 bis 1200 ableitet.
7. Verfahren gemäss Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorpolymere im Gerüst mindestens 50 Mol.-% Oxyäthyleneinheiten aufweist.
8. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorpolymere ein lineares Polyestergerüst aufweist.
9. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man das Vorpolymere in Gegenwart des Proteins bildet.
10. Verfahren gemäss Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man das Protein unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen entweder mit einem flüssigen Polyol oder mit einem flüssigen Isocyanat vermischt und dann die erhaltene Mischung mit einem flüssigen Isocyanat bzw. einem flüssigen Polyol versetzt, wobei man vorzugsweise 50 bis 100 mg Protein je g Polyol verwendet.
11. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erleichterung der Dispergierung ein grenzflächenaktives Mittel zusetzt.
12. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als Protein ein Enzym verwendet.
13. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein in Wasser dispergierbares, biologisch wirksames Protein und ein in Wasser dispergierbares, flüssiges Poly-urethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen zu einer Lösung umgesetzt werden.
14. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine in Wasser lösliche oder dispergierbare Proteinzusammensetzung, im wesentlichen bestehend aus einem Polyurethan mit einem im wesentlichen linearen Polyoxyalky-lengerüst bzw. einem im wesentlichen linearen Polyestergerüst, an das über Ureid-Bindungen ein in Wasser dispergierbares biologisch wirksames Protein gebunden ist, in Wasser löst, bzw. dispergiert.
15. Wässrige Dispersion oder Lösung von an ein Urethanpolymeres gebundenem Protein, erhalten nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.

res gebundenen Proteins sowie die derart erhaltene wässrige Dispersion oder Lösung.

Der Ausdruck «lösliche gebundene Enzyme» bezeichnet in der Technik das Reaktionsprodukt aus einem Protein und ei-snem polymeren natürlichen oder synthetischen Material. Dieses Reaktionsprodukt ist in flüssigen Medien, wie Wasser, löslich oder dispergierbar. Bei der Bindung des Proteins an das Polymere handelt es sich im allgemeinen um eine kovalente Bindung, obgleich auch schon Adsorptionsverfahren angewandt îowurden. Die löslichen, gebundenen Proteine zeigen häufig eine biologische Reaktionsfähigkeit, die der des freien Proteins ähnlich ist. Andere besitzen im Vergleich zu den freien nichtmodifi-zierten Proteinen verbesserte Löslichkeit und/oder verringerte Antigenwirkung sowie andere Verbesserungen.

i5 Die Enzyme wurden schon auf verschiedenen Wegen an verschiedene Polymere gebunden. Insbesondere hat man sie an Polyurethane, zum Beispiel Polyurethanschaum gebunden. Zum Beispiel ist in der US-Patentschrift 3 929 574 die Herstellung eines gebundenen (immobilisierten) Proteins, nämlich ei-zones Enzyms, beschrieben. Sie erfolgt dadurch, dass man ein flüssiges Polyurethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen unter schaumbildenden Bedingungen mit einer wässrigen Dispersion des Enzyms in Berührung bringt. Hierdurch schäumt das Polyurethan auf und bindet die Enzyme in dem 25 gebildeten Polyurethanschaum.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Dispersion oder Lösung eines an ein Urethanpolymeres gebundenen Proteins ist im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert.

3° Das Verfahren wird bei einer Temperatur durchgeführt, bei der das Polyurethanvorpolymere mit den endständigen Isocyanatgruppen in flüssigen Zustand vorliegt. Natürlich sollte die Temperatur unter der Denaturierungstemperatur des zu bindenden Proteins liegen. Die Denaturierungstemperatur von 35 Proteinen liegt im allgemeinen über etwa 35 °C. Jedoch sind einige Proteine verhältnismässig kurze Zeit, zum Beispiel 5 bis 30 Minuten oder länger bei höheren Temperaturen von zum Beispiel bis zu etwa 70 °C oder etwas höher beständig.

Ohne an diese Theorie gebunden zu sein, nimmt man an, 40 dass das Protein in den erhaltenen Verbindungen über mindestens eine Ureid-Bindung an das Polyurethanpolymere gebunden ist. Aus den nachstehenden Beispielen geht hervor, dass ein Protein/Polyurethan-Produkt mit anderen Eigenschaften gebildet wird. Zum Beispiel unterscheiden sich die Wanderung durch 45 eine chromatografische Säule, die Wanderung in einem elektrischen Feld und die Löslichkeitseigenschaften von denen des freien Proteins wie auch des freien Polymeren.

Es ist natürlich bekannt, dass die Umsetzungsgeschwindigkeiten von Aminen mit Isocyanatgruppen viel grösser sind als 50 die Umsetzungsgeschwindigkeiten von Aminen mit Wasser oder Hydroxylgruppen. Es ist auchbekannt, dass Proteine, wie Enzyme, Antigene, Antikörper und einfache Proteine, zum Beispiel Serumalbumine, im wesentlichen Polymere von Aminosäuren darstellen, die verfügbare -NH2-Gruppen aufweisen. Es ist 55 daher wahrscheinlich, dass sich in der Protein/Vorpolymer-Lö-sung Ureid-Bindungen zwischen dem Protein und dem Vorpolymeren bilden.

Man nimmt daher an, dass Protein/Polymer-Reaktionsprodukte in der Protein/Vorpolymer-Lösung vorliegen, die die fol-60 genden idealisierten Arten einschliessen, in denen «P» das Protein und «Pol» das Polymere darstellen:

O

65

1) P-NH-C-NH-Pol-NH2