CH634853A5 - Schwefelhaltige metabolite, ihre herstellung und verwendung in arznei- und futtermitteln. - Google Patents

Schwefelhaltige metabolite, ihre herstellung und verwendung in arznei- und futtermitteln. Download PDF

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CH634853A5 CH628278A CH628278A CH634853A5 CH 634853 A5 CH634853 A5 CH 634853A5 CH 628278 A CH628278 A CH 628278A CH 628278 A CH628278 A CH 628278A CH 634853 A5 CH634853 A5 CH 634853A5
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV.
Erfindungsgemäss gelangt man zu S 54832/A-I, S 54832/ A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV, indem man einen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV produzierenden Stamm von Micromonospora globosa in Gegenwart eines Nährmediums züchtet.
Die Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/ A-III und S 54832/A-IV besitzen folgende Charakteristika:
S 54832/A-I Hellgelbes amorphes Pulver Smp. >310°
[aß0 = + 118,7° (c = 1,140 in Pyridin)
Analyse: Gef. C 50,2 H 4,2 N 13,1 O 21,7 S 11,3%
UV-Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 1.
Xmax219nm loge' = 1,86 287 nmloge' = 1,41 364 nmloge' = 1,13
IR-Spektrum in KBr, vgl. Fig. 2.
'H-NMR-Spektrum in DMSO, 90 MHz mit Tetramethyl-silan als interner Standard, vgl. Fig. 3.
I3C-NMR-Spektrum in DMSO auf einem BRUKER HX-90E Spektrometer bei 22,63 MHz aufgenommen (interner Standard TMS = 0 ppm), vgl.Tabelle, Seite 3.
l3C-NMR-Spektrum von S 54832/A-I 100 mg in 1,2 ml DMSO + TMS
171.18
112.23
168.25
111.06
167.73
103.78
167.21
95.53
167.02
79.67
165.07
74.93
163.77
73.56
160.91
69.40
160.07
67.39
159.94
65.25
159.42
63.10
158.31
62.52
153.89
57.45
150.97
55.95
149.67
49.52
149.41
25.80
148.56
17.80
147.39
13.58
142.65
134.91
134.39
129.78
129.20
128.16
127.25
126.47
125.36
124.19
123.09
119.97
119.38
Löslichkeit: S 54832/A-I ist leicht löslich in Dimethyl-formamid, Acetonitril, Dioxan, Dimethylsulfoxid, massig löslich in Chloroform, schwer löslich in Methanol, Äthanol und unlöslich in Wasser und Hexan.
Aminosäureanalyse Bei der Aminosäureanalyse wurde, neben nicht identifizierten Aminosäuren, eine Aminosäure gefunden, die die gleiche Retentionszeit wie Threonin aufweist.
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3
634 853
S 54832/A-II Hellgelbes amorphes Pulver Smp!>310°
Analyse: Gef. C 48,5 H 3,8 N 12,4%
UV-Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 4.
À max 218 nm log e' = 1,90 293 nm log e' = 1,40 362 nm log e' = 1,16 IR-Spektrum in KBr, vgl. Fig. 5.
S 54832/A-III Hellgelbes amorphes Pulver Smp. >310°
Analyse: Gef. C 48,1 H 4,1 N 12,3% UV-Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 6.
/.max 218 nmloge' = 1,86 292 nm loge' = 1,36 362 nm loge' = 1,14 IR-Spektrum in KBr, vgl. Fig. 7.
S 54832/A-IV Hellgelbes amorphes Pulver Smp. >310°
Analyse: Gef. C 49,0 H 4,0 N 12,7%
UV-Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 8.
/. max 218 nm log e' = 1,88 292 nm loge' = 1,41 360 nm log e' = 1,15 I R-Spektrum in K Br, vgl. Fig. 9.
In der folgenden Tabelle sind die Ri-Werte von S 54832/ A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV im Dünnschichtchromatogramm angegeben (Kieselgel Merck 60-PIatten, Schichtdicke 0,25 mm, Laufstrecke 14,7 cm).
Ri-Werte
Fliessmittel A-I A-II A-III A-IV
Methylenchlorid-Methanol- 0,56 0,50 0,53 0,49
Wasser
(80:17,5:2)
Methylenchlorid-Methanol- 0,39 0,30 0,34 0,28
Wasser
(88: 11 : 1)
Als Nachweisreagenz kann Jod verwendet werden. Beim Ansprühen mit einer 0,2%-igen Ce(SO.i)2-Lösung in 50%-iger Schwefelsäure und Erwärmen auf 130° geben alle vier Verbindungen eine graubraune Anfärbung.
Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich nach bekannten Methoden ausführen. Eine Probe der Kultur des S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV produzierenden Stammes wurde am 26. April 1978 beim United States Department of Agriculture (Northern Utiliza-tion Research and Development Division), Peoria, III., USA, deponiert und steht der Öffentlichkeit unter der Bezeichnung NRRL 11299 zur Verfügung.
Doch können auch S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/ A-III und S 54832/A-IV produzierende Stämme verwendet werden, die aus dem Ausgangsstamm von Micromonospora globosa durch Mutation unter Einwirkung von Strahlen oder Behandlung mit mutagenen Substanzen oder durch Selektion gewonnen werden können.
Charakteristikum des Stammes NRRL11299 Der neue erfindungsgemäss verwendete Stamm NRRL 11299 wurde 1976 in Cullerà, Spanien, aus einerfrischen
Erdprobe aus einem Reisfeld isoliert. Die Kultur bildet kein Luftmycel, und wächst als Substrat- oder als vegetative Mycelmasse in einzelnen, jedoch hohen orangefarbigen Kolonien von unregelmässiger Form. Die Myzelien mit einem Durchmesser zwischen 0,5 um und 0,7 (im sind gerade bis leicht gewellt und tragen seitliche und endständige Sporen. Die Seitensporen treten oft einzeln auf, es gibt aber auch doppelte Sporen, die übereinander angeordnet sind, wobei die unteren grösser sind. Manchmal befinden sich auch gleichzeitig zwei Sporen am Ende eines Sporenträgers. Die Sporen sind elliptisch bis oval oder rund mit einem Durchmesser von 1,0 bis 1,3 (im. In den meisten Agarmedien sind die vegetativen Myzelien mittelmässig gelb-rosa oder hell-aprikosenfarbig und weich, mit der Tendenz zum Fragmentieren, jedoch nicht wie im Falle der Spezies Nocardia. Man beobachtet in einigen Medien unregelmässige Schwellungen, zwiebelähnliche Strukturen, die 2 bis 3 Mal die Grösse der Sporen erreichen können, von denen man annimmt, sie seien ungewöhnliche Formen, wie man sie bei anderen Actinomyceten-Spezies sieht. Auf einem Saccharosemedium erscheinen die Sporen in traubenähnlichen Büscheln, während auf allen anderen Medien die Sporen entweder einfach oder doppelt vorkommen und von relativ langen Sporenträgern (2-3 |im) getragen werden. Der Stamm NRRL 11299 wächst nur spärlich auf synthetischen Medien, baut lediglich drei der geprüften Zucker ab und gedeiht sehr gut auf Medien mit komplexen proteinhaltigen Substanzen.
Die Wachstumseigenschaften des Stammes NRRL 11299 auf normalen biologischen Medien und seine Kohlenstoffassimilation sind in den folgenden Tabellen aufgeführt:
Wachstumseigenschaften Kulturmedium Kultur-Charakteristiken Mycelform
Malz-Hefe-Extrakt-Agar
W:
ausgezeichnet,
orange
R:
orange (R3ea)*
LM:
keines
LP:
keine
Hafermehl-Agar
W:
mittelmässig,
orange
R:
hellorange
(R3ea)*
LM:
keines
LP:
keine
Stärke- anorganische
W:
schwach,
Salze-Agar
hellorange
R:
beige (R3ea)*
LM:
keines
LP: '
keine
Glycerin-Asparagin-Agar W:
schwach,
hellorange
R:
beige (R3ea)*
LM:
keines
LP:
keine
W: Wachstum R: Rückseite LM: Luftmycel LP: Lösliches Pigment
*: Referenz mit Bezug auf das «Color-wheels System» (Tresner and Bachus, 1963)
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634853
4
Assimilation von Kohlenstoffverbindungen Wachstum Kohlenstoffquelle
+ D-Cellobiose, Cellulose, D-Saccharose
— D- & L-Arabinose, Dextrin, Dulcitol,
D-Fructose, D-Glucose, D-Galactose, Glycerin, m-Inositol, Inulin, D-Lactose, D-Maltose, D-Mannitol, D-Mannose, D-Melibiose, D-Melezitose, D-Raffinose, D-Ribose, L-Rhamnose, D-Salicin, D-Sorbitol, D-Xylose, Stärke
+: Schwache Kohlenstoffverwertung Keine Kohlenstoffverwertung
Der neue Stamm NRRL 11299 besitzt folgende physiologische Eigenschaften:
Nitrat-Reduktion negativ
Stärkehydrolyse positiv (schwach)
Cellulose-Abbau positiv (schwach)
Tyrosin-Reaktion negativ (rosa lösl. Pigment)
Milch-Koagulation positiv
Miich-Peptonisierung positiv (langsam)
Gelatine-Verflüssigung negativ
Melaninbildung negativ (wächst auf Medium)
Der Stamm NRRL 11299 stimmt mit der Beschreibung einer Micromonospora globosa-ähnlichen Micromono-spora-Sepzies überein, wie in Bergey's Manual, 8. Auflage, S. 852-853, beschrieben.
Der neue Stamm NRRL 11299 lässt sich auf verschiedenen Nährmedien mit den üblichen Nährstoffen züchten, z.B. wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
Die Züchtung des Stammes NRRL 11299 kann nach aerober Oberflächenzüchtung oder Immersionszüchtung erfolgen.
Sobald bei der Züchtung eine maximale Menge der neuen Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV produziert worden ist, was z.B. durch die Aktivität gegen Staphylococcus aureus festgestellt werden kann, wird das Mycel aus der Kulturbrühe abgetrennt und extrahiert. Die im Kulturfiltrat vorhandene Menge der Verbindungen kann durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. Äthyl-acetat, Butylacetat, n-Butanol, gewonnen werden. Eine andere Ausführungsform besteht darin, dass man den Mycel-anteil in der Kulturbrühe homogenisiert, z.B. mit einem Ultraturrax, und die Verbindungen durch Extraktion mit den erwähnten Lösungsmitteln gewinnt.
Eine bevorzugte Ausführungsform besteht darin, dass die Brühe durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren in Mycel und Kulturfiltrat getrennt wird. Das Mycel wird danach mit Methanol oder mit Aceton unter Homogenisieren mit einem Turrax extrahiert, das Zellmaterial abzentrifugiert und die organische Phase unter Wasserzugabe auf Wasser konzentriert.
Danach wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. n-Butanol, oder Äthylacetat, extrahiert und die Extrakte bei niederer Temperatur, vorzugsweise 40-50°, im Vakuum eingedampft. Der im Kulturfiltrat verbleibende Anteil an aktiven Verbindungen kann mit den oben erwähnten Lösungsmitteln extrahiert werden. Aus den so erhaltenen Rohextrakten können die Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV
durch an sich bekannte chromatographische Methoden isoliert und rein dargestellt werden. Vorteilhaft hat sich als erste Operation eine Fällung der Rohextrakte mit Petroläther erwiesen, wobei lipophile Begleitstoffe entfernt werden können.
Aus dem Fällungsprodukt können anschliessend zuerst durch Gelfiltration an Sephadex LH20 und nachfolgende wiederholte Chromatographie an Kieselgel die reinen Verbindungen S 54832/A-I bis A-IV erhalten werden. Die Verbindungen fallen als hellgelbes amorphes Pulver an; nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum bei 20° zeigen sie einen Smp. >310° (Zers.).
Die Erfindung umfasst auch Fermentationsbrühen, die bei der Züchtung eines S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/ A-III und S 54832/A-IV produzierenden Stammes von Micromonospora globosa gewonnen werden.
Die Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/ A-III und S 54832/A-IV sind als Heilmittel geeignet. Sie zeigen eine Hemmwirkung gegenüber Mikroorganismen wie gram-positive Bakterien, Mycoplasmen und Neisserien, aber keine Aktivität gegen Hefen und Pilze.
Die sehr breite Aktivität gegen gram-positive Bakterien erstreckt sich auf deren pathogene Vertreter, wie Staphylokokken, Streptokokken, Corynebakterien und Mycobakte-rien. In der folgenden Tabelle sind die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC-Werte) von S 54832/A-I gegen einige Mikroorganismen angegeben. Die MIC-Werte werden auf bekannte Weise in Verdünnungsreihen bestimmt. Die Bestimmung erfolgte durch Inkubation in Trypticase Soy Broth bei 37° während 24 Stunden. Inoculumdichte: 105 Keime/ml.
Organismus
MIC/ug/ml
Staphylococcus aureus
0,03
Staphylococcus aureus res. Penicillin
0,03
Staphylococcus aureus res. Tetracyclin
<0,01
Staphylococcus aureus res. Rifamycin
0,03
Staphylococcus aureus 6538P
0,03
Staphylococcus aureus
<0,01
Streptococcus aronson
0,03
Streptococcus faecalis
0,1
Streptococcus faecalis
0,03
Streptococcus pyogenes
0,1
Streptococcus faecalis
0,03
Streptococcus haemolyticus
0,1
Diplococcus pneumoniae
0,1
Corynebacterium equi
0,03
Sarcina lutea res. Erythromycin
<0,01
Bacillus subtilis
<0,01
Clostridium sphenoides
0,3
Clostridium pasteurianum
<0,01
Mycobacterium thamnophesos
<0,01
Mycobacterium smegmatis
<0,01
Mycoplasma laidlawii
0,03
Neisseria catharalis
0,1
Neisseria pharyngis
<0,01
Ein sehr ähnliches antimikrobielles Wirkungsspektrum zeigen die Verbindungen S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV.
Die neuen Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV können als Heilmittel allein, und zwar in reiner Form oder in den entsprechenden Heilmittelformen für topicale, enterale oder parenterale Verabreichung oder bei Tieren als Futtermittelzusatz verwendet wefden.
s
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Die Dosierung hängt naturgemäss von der Verabreichungsform sowie von der gewünschten Behandlung ab. Für grössere Säugetiere beträgt die totale, täglich verabreichte Dosis 10-500 mg. Üblicherweise erfolgt die Verabreichung in geteilten Dosen 2- bis 4-mal täglich.
Geeignete Dosierungsformen für die orale Verabreichung enthalten von 2 bis 250 mg der Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV vermischt mit einem festen oder flüssigen pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel. Für die parenterale Verabreichung geeignete Dosierungsformen könne von 2 bis 20 mg der Verbindungen, vermischt mit einem flüssigen pharmazeutischen Träger, enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel
Züchtung des Stammes NRRL 11299 in einer Schüttelkultur a) Agar-Ausgangskultur
Die als Ausgangsmaterial verwendete Agarkultur des Stammes NRRL 11299 erhält man, indem man ein Kulturmedium ( I) folgender Zusammensetzung:
g/Liter
Glucose
10,0
Stärke löslich
20,0
N-Z-AmineTyp A
5,0
CaCOî
1,0
Hefe-Extrakt
5,0
Agar(Bacto)
15,0
destilliertes Wasser
1 Liter mit einer auf an sich bekannte Weise hergestellten Sporensuspension des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 11299 beimpft. Das Medium wird vor der Sterilisation mit NaOH auf PH 7,0 eingestellt und beträgt nach der Sterilisation (20 Minuten bei 120°) 6,8 bis 7,0.
b) Sporensuspension
Eine gut gewachsene Agar-Ausgangskultur des Stammes NRRL 11299 wird mit 5 ml steriler, 0,9%-iger Kochsalzlösung versetzt, was eine dichte Sporensuspension ergibt.
c) Vorkultur und Zwischenkultur
Von dieser Sporensuspension werden 5 ml zur Beimpfung eines 200 ml Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 50 ml des folgenden Vorkulturmediums (II) enthält:
g/Liter
Dextrin 10,0
Glucose 10,0
Pepton 5,0
Hefeextrakt 5,0
CaCOi 1,0
destilliertes Wasser 1 Liter
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 eingestellt. Das Vorkulturmedium wird in einem Autoklaven bei 120° während 20 Minuten sterilisiert, worauf der pH-Wert 7,0 bis 7,2 beträgt.
Die so angesetzte Vorkultur wird während 4 Tagen bei 27° auf einer Rundschüttelmaschine (100 U/Min.) aerob inkubiert und zur Beimpfung einer Zwischenkultur verwendet, indem 5 ml der Vorkultur in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml des folgenden Mediums (III) überimpft werden:
g/Li ter
Fleischextrakt 3,0
Trypton 5,0
Glucose 1,0
Stärke löslich 24,0
Hefeextrakt 5,0
CaCOj 2,0
destilliertes Wasser 1 Liter
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 eingestellt und das Medium in einem Autoklaven bei 120° während 20 Minuten sterilisiert, worauf der pH-Wert 7,0 bis 7,2 beträgt.
d) Hauptkultur
Die Zwischenkultur wird während 3 Tagen bei 21° auf einer Rundschüttelmaschine (220 U/Min.) aerob inkubiert und wird dann direkt zur Beimpfung einer Hauptkultur verwendet, indem 5 ml der Zwischenkultur in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml des folgenden Mediums (IV) überimpft werden:
g/Liter
Stärke löslich 20,0
Hefeextrakt 10,0
Glucose 10,0
Casein-Hydrolysat 5,0
Calciumchlorid-2-Hydrat 4,0
Kobalt (Il)-chlorid 0,00013
destilliertes Wasser 1 Liter
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 eingestellt und das Medium in einem Autoklaven bei 120° während 20 Minuten sterilisiert, worauf der pH-Wert 6,8 bis 7,0 beträgt. Die so angesetzte Hauptkultur wird während 5 Tagen bei 21° auf einer Rundschüttelmaschine (220 U/Min.) inkubiert.
Beispiel 2
Züchtung des Stammes NRRL 11299 in einer Fermentationskultur
Die zur Beimpfung der Vorkultur verwendete Sporen- und Mycelsuspension wird aus einer Kultur des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 11299 hergestellt, welche 21 Tage bei 21° auf einem Agarmedium folgender Zusammensetzung:
g/Liter
Lösliche Stärke 20
Agar 15
Glucose 10
Hefeextrakt 5
N-Z-AmineTyp A 5
CaCOj 1
Entmineralisiertes Wasser 1 Liter
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
634853
6
gezüchtet wird. Sporen und Mycel dieser Kultur werden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.
Mit je 50 ml dieser Suspension werden fünf 2-Liter-Erlen-meyerkolben mit je 1 Liter Medium folgender Zusammensetzung:
g/Liter
Dextrin 10
Glucose 10
Pepton 5
Hefeextrakt 5
CaCCh 1
Entmineralisiertes Wasser 1 Liter angeimpft und auf einer Rundschüttelmaschine (180 UPM, r = 5 cm) 4 Tage bei 27° inkubiert. Der pH-Wert der Nährlösung wird vor der Sterilisation mit NaOH auf 7,2 eingestellt.
Mit 5 Liter dieser Vorkultur werden 50 Liter Medium fol-gender-Zusammensetzung:
g/Liter
Lösliche Stärke . 24
Trypton 5
Hefeextrakt 5
Fleischextrakt 3
CaCOj 2
Glucose 1
Entmineralisiertes Wasser 1 Liter in einem 75-Liter-Stahlfermenter angeimpft. Die Zwischenkultur wird 3 Tage bei 21° unter Rühren (200 UPM, Blat-trührer) und Belüftung (1 Liter Luft/Liter Medium/Min.) und bei einem Überdruck von 0,5 bar inkubiert. Die Hauptkultur im 750-Liter-Fermenter mit 500 Liter Nährlösung folgender Zusammensetzung:
g/Liter
Lösliche Stärke
20
Hefeextrakt
10
Glucose
10
Casein-Hydrolysat
5
C alciumchlorid-2-Hydrat
4
Kobalt (II)-chlorid
0,00013
Entmineralisiertes Wasser
1 Liter wird unter Rühren (110 UPM, Blattrührer) und Belüftung (1 Liter Luft/Liter Medium/Min.) 4 Tage bei 21° und 0,5 bar Überdruck fermentiert. Der pH-Wert wird auch auf dieser Stufe mit NaOH vor der Sterilisation auf 7,2 eingestellt.
Beispiel 3
Isolierung der Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV
470 Liter Fermentationsbrühe (nach Beispiel 2 gewonnen) werden mit 2N Natronlauge auf pH 7,0 gestellt und mit einem Westfalia-Klärseparator aufgetrennt, wobei 450 Liter Kulturfiltrat und 22 kg Mycel anfallen. Das Kulturfiltrat wird dreimal mit je 500 Liter Äthylacetat extrahiert. Nach dem Waschen der Extrakte mit 50 Liter Wasser wird die organische Phase bei 20-50° Konzentrattemperatur zur Trockne eingedampft, wobei 117 g öliger Rohextrakt anfallen.
Das Mycel wird einmal mit 70 Liter Methanol und danach einmal mit 70 Liter 90%-igem Methanol je 1 Stunde mit einem Ultra-Turrax-Gerät homogenisiert. Die methanolischen Extrakte, die man durch Abnutschen des Feststoffes erhielt, werden vereinigt und unter Wässerzugabe auf ca. 150 Liter konzentriert. Diese wässrige Phase wird danach dreimal mit je 200 Liter Äthylacetat extrahiert und die Extrakte mit 100 Liter Wasser gewaschen. Die vereinigten Extrakte werden wie oben zur Trockne eingedampft und liefern 66 g Rohextrakt.
Die 183 g vereinigten öligen Extrakte werden unter Rühren zu 1 Liter Petroläther gegeben. Die überstehende Lösung wird abdekantiert und der ölige Rückstand im Vakuum bei 50° vom Lösungsmittel befreit. Danach wird das Fällungsprodukt in Methylenchlorid-Methanol (1:1) gelöst und die Lösung auf eine mit Methylenchlorid-Methanol (1:1) bereitete Säule von 1,5 kg Sephadex LH20 gebracht. Die Elution . mit Methylenchlorid-Methanol (1:1) liefert 11,5 g Fraktionen mit Aktivität gegen Staphylococcus aureus. Dieses Material wird in Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88:11:1) gelöst und die Lösung auf eine mit Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88:1 1:1) bereitete Säule von 1 kg Kieselgel Merck (ICorngrösse 0,063-0,2 mm) gebracht. Die Elution mit Methylen chlorid-Methanol-Wasser (88:11:1) liefert zuerst 984 kg stark angereicherte Fraktionen von S 54832/A-I. Die späteren Eluate ergeben nach Eindampfen im Vakuum eine Mischfraktion von S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV mit inaktiven Begleitstoffen.
Die Fraktion von S 54832/A-I (984 mg) wird in 50 ml Me-thylenchlorid-Methanol (1:1) gelöst und bei Raumtemperatur auf ca. 20 ml eingeengt, wobei S 54832/A-I ausfällt. Die Substanz wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Man erhält S 54832/A-I als amorphes, hellgelbes Pulver. Smp. >310° (nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum bei Raumtemperatur).
Zur Reinisolierung von S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV wird die Mischfraktion der drei Verbindungen (594 mg) in Methylenchlorid-Methanol-Wasser (92:7,5:0,5) gelöst und die Lösung auf eine mit Methylenchlorid-Me-thanol-Wasser (92:7,5:0,5) bereitete Säule von 500 g Kieselgel Merck (Korngrösse 0,04-0,063 mm) gebracht, wobei zuerst S 54832/A-II, dann S 54832/A-III und zuletzt S 54832/A-IV eluiert werden.
Die letzte Reinigung der Verbindungen erfolgt jeweils durch eine Ausfällung aus Methanol, analog wie für S 54832/A-I beschrieben.
Die Reinstoffe S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/ A-IV fallen als amorphes hellgelbes Pulver an und zeigen alle einen Smp. > 310° (nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum bei Raumtemperatur).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
B
4 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

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1. Die Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV mit folgenden Charakteristika:
S 54832/A-I Hellgelbes amorphes Pulver Smp. >310°
[aß'= +118,7° (c = 1,140 in Pyridin)
Analyse: Gef. C 50,2 H 4,2 N 13,1 O 21,7 S 11,3% /.max 219 nm loge' = 1,86 287 nm loge' = 1,41 364 nm log e' = 1,13 Löslichkeit: S 54832/A-I ist leicht löslich in Dimethylform-amid, Acetonitril, Dioxan, Dimethylsulfoxid, massig löslich in Chloroform, schwer löslich in Methanol, Äthanol und unlöslich in Wasser und Hexan.
Aminosäureanalyse
Bei der Aminosäureanalyse wurde, neben nicht identifizierten Aminosäuren, eine Aminosäure gefunden, die die gleiche Retentionszeit wie Threonin aufweist.
S 54832/A-II Hellgelbes amorphes Pulver Smp. >310°
Analyse: Gef. C 48,5, H 3,8 N 12,4%
>„max 218 nm loge' = 1,90 293 nmloge' = 1,40 362nm loge' = 1,16
S 54832/A-III Hellgelbes amorphes Pulver Smp. >310°
Analyse: Gef. C 48,1 H 4,1 N 12,3%
À max 218 nmloge' = 1,86 292 nmloge' = 1,36 362 nmloge' = 1,14
S 54832/A-IV Hellgelbes amorphes Pulver Smp. >310°
Analyse: Gef. C 49,0 H 4,0 N 12,7%
Ä.max218nm loge' = 1,88 292 nmloge' = 1,41 360 nmloge' = 1,15
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen S 54832/ A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III and S 54832/A-IV produzierenden Stamm von Micromonospora globosa in Gegenwart eines Nährmediums züchtet.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Heilmittel oder Futtermittelzusatz, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verbindung S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III oder S 54832/A-IV enthält.
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