CH636127A5 - Process for the preparation of the novel antibiotic MSD890A9 - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums MSD 890A9, das sowohl gegenüber gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien aktiv ist. Das Antibiotikum wird durch Züchten bzw. Wachsen von Species von Streptomyces auf geeigneten Fermentationsmedien hergestellt.

Die Entdeckung der bemerkenswerten antibiotischen Eigenschaften von Penicillin hat auf diesem Gebiet ein grosses Interesse stimuliert. Dadurch wurden viele andere, wertvolle antibiotische Substanzen gefunden. Im allgemeinen umfasst die antibakterielle Aktivität von jedem dieser Antibiotika nicht bestimmte, klinisch wichtige pathogene Bakterien. Beispielsweise sind einige hauptsächlich nur gegen gram-positive Arten von Bakterien aktiv. Die aufgetretene Resistenz bei der weitverbreiteten Verwendung vorhandener Antibiotika bei der Behandlung bakterieller Infektionen hat bewirkt, dass ein ernstes Resistenzproblem entstanden ist.

Die Nachteile der bekannten Antibiotika haben somit eine weitere Forschung nach anderen Antibiotika stimuliert, die gegenüber einem grossen Bereich von Pathogenen wie auch gegenüber resistenten Stämmen besonderer Mikroorganismen aktiv sind.

Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums MSD 890A9 insbesondere in verdünnter Form, als rohes Konzentrat oder in reiner Form.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines neuen und nützlichen Antibiotikums zu schaffen, das bei der Inhibierung des Wachstums verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen hochwirksam ist.

Es soll ein Verfahren zur Herstellung der neuen antibiotischen Verbindung durch Fermentation eines Nährmediums mit Species von Streptomyces geschaffen werden.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte neue antibiotische Verbindung wird durch Wachstum bei kontrollierten Bedingungen eines neuen Stamms von Streptomyces flavogriseus erzeugt.

Auf Grundlage ausgedehnter taxonomischer Untersuchungen wurde der Stamm des bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismus als zu den Species Streptomyces flavogriseus gehörig'identifiziert und wurde in der Hinterlegungsstelle von Merck & Co., Inc. Rahway, N.J., als MA-4638 15 bezeichnet. Seine Kultur wurde am 15. September 1976 permanent ohne Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit bei der Culture Collection of the Northern Regional Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 20. Peoria, III., hinterlegt. Sie ist unter der Hinterlegungsnummer 11 020 verfügbar.

Streptomyces flavogriseus MA-4638 bildet das Antibiotikum 890As, das in im wesentlichen reiner Form aus der Fermentationsbrühe isoliert wird.

25 Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Streptomyces flavogriseus MA-4638 werden in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Morphologie - Sporenträger verzweigt, gerade bis gekrümmte Sporenketten, die Büschel bilden. Die Ketten sind • 30 nicht länger als 10 Sporen. Die Sporen sind sphärisch bis oval -0,9 p-x 1,2 [i(970x).

Kultureigenschaften Hafermehlagar (ISP Medium 3)

35 Vegetatives Wachstum - umgekehrt-gelb-dunkelgelb gesäumt mit Braun, gekräuselt;

Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Mittelgrau;

lösliches Pigment - keines ;

Czapek Dox Agar (Saccharose-Nitratagar)

40 vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun gesäumt mit Dunkelbraun;

Luftmycelium - mittelgrau, samtartig;

lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums; Eialbuminagar 45 vegetatives Wachstum - umgekehrt-gelb-dunkelgelb gesäumt mit Braun ;

Luftmycelium - mittelgrau, vermischt mit gelblichem Grau (2dc) und grauem Gelb (2db) ;

lösliches Pigment - hellgelblich Dunkelgelb ; so Glycerin-Asparaginagar vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun ;

Luftmycelium - samtartig, hellgrau mit gelblichem Ton (2dc);

lösliches Pigment - helles Dunkelgelb;

55 Anorganisches Salze-Stärke-Agar (ISP Medium 4)

vegetatives Wachstum - umgekehrt-grünlich-gelblich-dun-kelgelb;

Luftmycelium - samtartig, mittelgrau mit gelbem Ton (3fe) ; lösliches Pigment - sehr helles Dunkelgelb ; 60 Hefeextrakt-Dextrose + Salze-Agar vegetatives Wachstum - umgekehrt-dunkelbraun; Luftmycelium - dunkelgrau, vermischt mit hellerem Grau; lösliches Pigment - keines ;

Hefeextrakt-Malzextraktagar (ISP Medium 2)

65 vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun ;

Luftmycelium - samtartig, dunkelgrau gesäumt mit hellerem Grau;

lösliches Pigment - keines;

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Magermilchagar vegetatives Wachstum - dunkelgelb;

Luftmycelium - spärlich, weisslich;

lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums ; Hydrolyse von Casein - gut;

Lackmusmilch vegetatives Wachstum - mässiges Ringwachstum, dunkelgelb;

Luftmycelium - keines;

Farbe-purpur;

Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Pepto-nisierung ; Alkalischwerden ;

Magermilch vegetatives Wachstum - mässiges Ringwachstum, dunkelgelb;

Luftmycelium - keines ;

lösliches Pigment - hellbraun;

Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung ; Alkalisch werden ;

Nährtyrosinagar vegetatives Wachstum - umgekehrt-dunkelbraun; Luftmycelium - dunkelgrau gesäumt mit gräulichem Weiss ; lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums ; Zersetzung von Tyrosin - positiv ; Pepton-Eisen-Hefeextraktagar vegetatives Wachstum - dunkelgelb;

Luftmycelium - weisslich, mässig;

lösliches Pigment - keines ;

Melanin - keines;

HzS-Bildung - negativ ;

Nähragar vegetatives Wachstum - umgekehrt-helles gräuliches Braun;

Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Dunkelgrau;

lösliches Pigment - keines ;

Nährstärkeagar vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau ; Luftmycelium - mittelgrau;

lösliches Pigment - keines;

Stärkehydrolyse ~ gut;

Nährgelatineagar vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau; Luftmycelium - gräulich-weiss ;

lösliches Pigment - keines ;

Verflüssigung von Gelatine - gut;

Kartoffelstück vegetatives Wachstum - dunkelgelb;

Luftmycelium - mittel- bis dunkelgrau;

lösliches Pigment - keines;

Loeffler's Blutserum vegetatives Wachstum - creme-gefärbt;

Luftmycelium - keines;

lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung - keine;

Gelatinestich vegetatives Wachstum - dunkelgelb;

Luftmycelium - keines ;

lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung von Gelatine - vollständig.

Alle obigen Bestimmungen erfolgten nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 °C, sofern nicht anders angegeben. Der pH-Wert der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien ist etwa neutral, nämlich pH 6,8 bis 7,2. Die in der Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen entsprechen den Definitionen von Color Harmony Manual, 4. Edition (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Streptomyces flavogriseus MA-4638 wird weiterhin auf seine Fähigkeit untersucht, verschiedene Kohlenhydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck werden die Mikroorganismen auf synthetischem Grundmedium (Pridham und Gottlieb), das 1% Kohlenhydrat enthält, bei 28 °C drei Wochen gezüchtet. Der pH-Wert der bei diesen Untersuchun-5 gen verwendeten Medien ist etwa neutral (6,8 bis 7,2). In Tabelle I ist die Verwertbarkeit dieser Kohlenhydratquellen durch Streptomyces flavogriseus MA-4638 aufgeführt; + bedeutet Wachstum; ± bedeutet schlechtes oder fragliches Wachstum; und — bedeutet kein Wachstum im Vergleich mit io einer negativen Kontrolle (keine Kohlenstoffquelle).

Tabelle I

Glucose

+

Maltose

+

Arabinose

+

Mannit

+

Cellulose

-

Mannose

-L

Fructose

+

Raffinose

-

Inosit

-

Rhamnose

+

Lactose

+

Saccharose

±

Xylose

+

Die Stärke des Wachstums bei Änderungen der Temperatur 25 und der Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus sind wie folgt: Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salzeagar) 28 °C - gutes vegetatives Wachstum und Luftwachstum; 37 °C - gutes vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen; 50 °C - kein Wachstum.

30 Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Hefeextrakt-Dextrose + Salzeagar)

aerob.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist nicht auf die Verwendung des Organismus Streptomyces flavogriseus oder auf Orga-35 nismen beschränkt, die das obige Wachstum und die mikroskopischen Eigenschaften vollständig erfüllen. Diese sind nur zur Erläuterung aufgeführt. Die Verwendung von Mutanten, die aus den beschriebenen Organismen durch verschiedene Mittel bzw. Verfahren, wie Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrah-40 lung, Stickstofflost, Bakteriophageneinwirkung u.ä., erhalten werden, ist gewünscht und beabsichtigt.

890As wird während der aeroben Fermentation bei kontrollierten Bedingungen von geeigneten, wässrigen Nährmedien gebildet, die mit einem Stamm des Organismus Streptomyces 45 flavogriseus inokuliert sind. Wässrige Medien, wie solche, die für die Herstellung anderer Antibiotika verwendet werden,

sind für die Herstellung von 890As geeignet. Solche Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, die von den Mikroorganismen assimilierbar sind, so Im allgemeinen können Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Dextrose, Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit u.ä., und Stärken, wie Dextrin oder Körner bzw. Granulat, z.B. von Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl u.ä., verwendet werden, entweder allein oder zusammen mit einer 55 Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff in dem Nährmedium. Die Menge an Kohlenhydrat variiert normalerweise zwischen etwa 1 und 6 Gew.%, bezogen auf das Medium. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden oder mehrere solcher Kohlenstoffquellen können in dem Medium vereinigt 60 werden. Im allgemeinen können viele proteinhaltige Materialien als Stickstoffquellen bei dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen umfassen beispielsweise Hefehydrolysate, primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maiseinweich-65 flüssigkeit, lösliche Stoffe, die bei der Branntweinherstellung anfallen, bzw. Schlempen o.ä. Die bevorzugte Quelle sind lösliche Stoffe von der Branntweinbrennerei bzw. Schlempen. Die Stickstoffquellen werden entweder allein oder im Gemisch vor

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4

zugsweise in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.%, bezogen auf das wässrige Medium, verwendet.

Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien zugegeben werden, gehören die üblicherweise verwendeten Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen ergeben. Weiterhin umfasst werden insbesondere ebenfalls Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan und Eisen.

Die in den Beispielen beschriebenen Medien sind nur Beispiele für eine grosse Vielzahl von Medien, die verwendet werden können.

Die Fermentation wird zweckmässig bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 37 °C durchgeführt. Für optimale Ergebnisse ist es jedoch bevorzugt, die Fermentation bei einer Temperatur von 23 bis 28 °C durchzuführen. Der Anfangs-pH-Wert des für das Züchten der Stämme von Streptomyces flavogriseus-Kulturen und die Erzeugung von Antibiotikum 890As verwendeten Nährmediums kann von etwa 6,0 bis 8,0 variieren.

Eine Fermentation in kleinem Massstab des Antibiotikums wird zweckdienlich durchgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit einer Kultur, die das Antibiotikum bildet, inokuliert und nach dem Übertragen in das Produktionsmedium die Fermentation bei konstanter Temperatur von etwa 24 °C auf einer Schüttelvorrichtung während mehrerer Tage ablaufen lässt.

Die Fermentation kann in einem sterilisierten Kolben des Nährmediums über eine oder mehrere Stufen der Impfmaterialentwicklung initiiert werden. Das für die Impfstufe verwendete Nährmedium kann irgendein geeignetes Gemisch aus Kohlen-Stoff- und Stickstoffquellen sein. Der Impfkolben wird in einer Kammer mit konstanter Temperatur bei etwa 28 °C während eines Tages oder bis das Wachstum ausreicht geschüttelt, und ein Teil des entstehenden Wachstums wird zur Inokulierung entweder eines Impfmaterials der zweiten Stufe oder des Produktionsmediums verwendet. Impfkolben für das Zwischenstadium werden, wenn sie verwendet werden, in im wesentlichen der gleichen Art entwickelt, d.h. ein Teil des Kolbeninhalts von der letzten Impfstufe wird zur Inokulierung des Produktionsmediums verwendet. Die inokulierten Kolben werden bei konstanter Temperatur mehrere Tage geschüttelt und gegen Ende der Inkubationszeit wird der Inhalt des Kolbens zentrifugiert oder filtriert.

Für die Arbeit in grossem Massstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einer Rührvorrichtung und einer Einrichtung zum Belüften des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Nach diesem Verfahren wird das Nährmedium in dem Tank zubereitet und durch Erhitzen bei einer Temperatur bis zu etwa 120 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit einem zuvor gezüchteten Impfmaterial der produzierenden Kultur inokuliert, und die Fermentation kann während einer Zeit von beispielsweise 1 bis 6 Tagen ablaufen, während man das Nährmedium bewegt bzw. rührt und/oder belüftet und die Temperatur bei etwa 22 bis 26 °C hält. Dieses Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 890A9 ist besonders zur Herstellung grosser Mengen an Antibiotikum geeignet.

Physikalische und chemische Eigenschaften des Antibiotikums 890As

Antibiotikum 890A9 ist eine saure Verbindung, die in RichCH3-CH

tung auf den positiven Pol bei der Elektrophorese bei neutralem pH-Wert wandert. Bei einem Gradienten von 50 V/cm in 0,03 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,1, wandert das Antibiotikum in 30 min 8,0 cm, verglichen mit einer Wanderung von 4,0 5 cm für 890Ai. Das Dinatriumsalz ist ein weisses oder leicht gelbes Pulver, lyophilisiert aus einer wässrigen Lösung. Bei sauren Bedingungen in wässriger Lösung ist das Antibiotikum in freier Säureform instabil. Das Antibiotikum wird daher normalerweise in gebundener Form als Salz oder anderes Derivat, das io stabiler ist, festgestellt.

Das Dinatriumsalz des Antibiotikums 890As besitzt ein Absorptionsmaximum bei 308 und 228 nm und ein Minimum bei 262 nm bei neutralem pH-Wert in Wasser. Für die am stärksten gereinigte Zubereitung beträgt das A3os/A26o-Verhältnis is 2,05 ; das A308/A220-Verhältnis 1,17; und das A3os/A228-Verhält-nis 1,05. Mehr als 93% der Absorption bei 308 nm werden durch Umsetzung mit Hydroxylamin bei neutralem pH-Wert ausgelöscht. Nach der Umsetzung mit Hydroxylamin nimmt die Absorption bei 260 nm zu, und das Verhältnis der Zunahme bei 20 260 nm zu der Abnahme bei 308 nm beträgt etwa 0,30. Die Umsetzung mit Hydroxylamin, die von der A3os-Abnahme bei den in der Sektion «Hydroxylamine Reaction» beschriebenen Bedingungen folgt, ist offensichtlich erster Ordnung mit einer Halbwertszeit bei Zimmertemperatur von 25 bis 50 s. 25 Bestimmt gegenüber einem Standard von Antibiotikum 890Ai, besitzt das Antibiotikum 890A9 82 Einheiten/HAEA3os-Einheit. HAEA308 wird unter der Sektion « Hydroxylamin-reaktion» beschrieben.

In Tabelle II sind die 100 MHz Signale des kernmagneti-30 sehen Resonanzspektrums von 890A9 in D2O bei 10 °C aufgeführt. Chemische Verschiebungen werden in ppm, bezogen auf HOD, bei 4,70 5 und 32 °C gegeben, und die Kupplungskonstanten werden in Hertz aufgeführt.

35

Tabelle II

CHsCH l,55(3H,D,6Hz)

CH3CO 2,12 (3H,S)

Ce-H 3,91 (1H, D,D; J6-5=5,5 Hz; J6.s=9 Hz)

40 Cs-H 4,36 (1H,M)

C8-H ~5 (teilweise überlagert von der HOD-Linie)

C(1)-H2 3,14 (1H,D,D; 18,2 + 9,8 Hz)

-S-CH=CH-N 6,10 (1H,D, 13,9 Hz) und 7,19 (1H,D, 13,9 Hz)

45

Das Massenspektrum von TMSÌ-890A9 zeichnet sich durch die in Tabelle III aufgeführten Fragmente aus.

Tabelle III

m/e

55

84 227 298/9

339

340 366 456

60 Antibiotikum 890A9 besitzt die folgende Molekülstruktur

5

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Antibiotikum 890As zeichnet sich weiter durch die folgenden antibiotischen Spektrumprofile aus.

Der Versuch zur Bestimmung der antibiotischen Spektrumprofile des Antibiotikums 890A? wird durch Anwendung eines 0,015 ml Tröpfchens aus einer 20 (ig/ml wässrigen Lösung des Antibiotikums auf die Oberfläche einer lOOx 15 mm Petrischale, die 5 ml geimpftes Nähragar plus 0,2% Hefeextrakt enthält und die bei 25 °C inkubiert wird, durchgeführt. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Durchmesser in mm der Inhibierungs-zone bzw. Hemmzone, werden in Tabelle IV aufgeführt.

Organismus Hemmzone

Durchmesser, mm

Bacillus sp. MB Nr. 633 38

Proteus vulgaris MB Nr. 1012 26

Pseudomonas aeruginosa MB Nr. 979 0

Serratia marcescens ATCC 890 21

Staphylococcus aureus ATCC 6538 P 30

Bacillus subtilis ATCC 6633 38

Sarcina lutea ATCC 9341 30

Staphylococcus aureus MB Nr. 698 20

Streptococcus faecalis MB Nr. 753 0

Alcaligenes faecalis ATCC 213 29

Brucella bronchiseptica ATCC 4617 16

Salmonella gallinarum MB Nr. 1287 34

Vibrio percolans ACC 8461 32

Xanthomonas vesicatoria MB Nr. 815 28

Proteus vulgaris ATCC 21100 35

Escherichia coli MB Nr. 1418 30

Pseudomonas stutzeri AT CC 11607 10

Klebsiella pneumoniae MB Nr. 1264 24

Aerobacter aerogenes MB Nr. 835 25

Erwinia atroseptica ATCC 4446 30

Pseudomonas aeruginosa MB Nr. 2824 0

Corynebacterium pseudodiph. ATCC 9742 19

Escherichia coli ATCC 9637 26

Streptococcus faecium MB Nr. 2820 10

Streptococcus agalactiae MB Nr. 2875 29

Vibrio percolans MB Nr. 2566 (res. ceph C) 21

Proteus vulgaris MB Nr. 2112 (Episom) 34

Proteus mirabilis MB Nr. 3126 27

Vibrio percolans ATCC 8461 + 2x 105 |i/ml 19 Penicillinase

Vibrio percolans ATCC 6461 + ß-Lactamase 32 von Enterobacter clacae MB 2646

Antibiotikum 890As ist gegenüber verschiedenen grampositiven und gram-negativen Bakterien wirksam und ist ein potenter Inhibitor von bakteriellen ß-Lactamasen und kann in der Human- und Veterinärmedizin Verwendung finden. 890A9 kann allein oder zusammen mit anderen antibakteriellen Arzneimitteln für die Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive oder gram-negative Bakterien, z.B. Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Salmonella schottmuelleri, verursacht werden.

Die beschriebene Verbindung kann ebenfalls zusammen mit ß-Lactam-Antibiotika, die gegenüber ß-Lactamasen empfindlich sind, zur Potenzierung der Wirkung solcher ß-Lactam-Antibiotika durch Inhibierung der Lactamase-Aktivität verwendet werden und ermöglicht somit eine verlängerte Lebensdauer der Antibiotika.

Ein Gemisch aus Antibiotikum 890Ai mit einem lactamase-empfindlichen ß-Lactam-Antibiotikum wird wirksamer bei der Behandlung von Infektionen mit ß-Lactamase erzeugenden

Bakterien sein als die gleiche Menge an ß-lactamase-empfindli-chen Antibiotika allein.

Antibiotikum 890Aç kann als Zusatzstoff zu Tierfutter, zur Konservierung von Futter- und Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Es kann in wässrigen Zubereitungen in Mengen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung oder bevorzugt in Konzentrationen im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung zur Zerstörung und Inhibierung des Wachstums schädlicher Bakterien auf medizinischen und zahnmedizinischen Gegenständen bzw. Einrichtungen und als Bakterizid bei industriellen Anwendungen verwendet werden.

Antibiotikum 890A9 kann in pharmazeutischen Zubereitungen als einziger aktiver Bestandteil oder zusammen mit einem oder mehreren Antibiotika oder mit einer oder mehreren pharmakologisch aktiven Substanzen verwendet werden.

Das Antibiotikum kann oral, topisch, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Die für die Verabreichung verwendeten Verfahren können irgendwelche Verfahren sein, die dem Fachmann geläufig sind oder die dem beschriebenen Antibiotikum angepasst werden können.

Die beschriebenen Zusammensetzungen können zusätzlich zu einem Träger andere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxydantien, Konservierungsmittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Mittel zur Regulierung der Viskosität oder Geschmacksmittel, enthalten, Mittel, die gut bekannt sind und üblicherweise verwendet werden.

In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Geflügel, Kühen bzw. Rindern, Schafen, Schweinen u.ä., können die Zubereitungen z.B. als intramammare Zubereitung entweder in langwirkenden oder schnell abgebenden Grundstoffen verwendet werden.

Die zu verabreichende Dosis hängt in grossem Ausmass von dem Zustand des zu behandelnden Subjekts, dem Gewicht des Wirts und der Art der Infektion, dem Weg und der Frequenz der Verabreichung ab. Der parenterale Weg ist für generalisierte Infektionen bevorzugt. Der orale Weg ist für intestinale Infektionen bevorzugt.

Bei der Behandlung bakterieller Infektionen bei Menschen bzw. Lebewesen können die beschriebenen Verbindungen zusammen mit einem ß-lactamase-empfindlichen Antibiotikum oral oder parenteral nach an sich bekannten Verfahren für die Antibiotikumverabreichung verabreicht werden. Das Antibiotikum 890A9 kann in einer Menge von etwa 2 bis 600 mg/ kg/Tag verabreicht werden. Bevorzugt wird es in Mengen von etwa 5 bis 100 mg/kg/Tag, bevorzugt in unterteilten Dosiseinheiten, z.B. drei bis vier Mal täglich, verabreicht. Es kann in Dosiseinheiten verabreicht werden, die z.B. 100,330,400 oder 1000 mg aktiven Bestandteil mit geeigneten physiologisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten werden in Form flüssiger Präparationen, wie Lösungen öder Suspensionen, oder als Feststoffe in Tabletten oder Kapseln vorliegen. Die optimale Dosis wird bei einem gegebenen Fall von der Art und der Stärke der zu behandelnden Infektion abhängen. Kleinere Dosen werden bei der Kinderheilkunde verwendet werden; alle diese Einstellungen sind dem Fachmann geläufig.

Das erfindungsgemässe Verfahren umfasst auch die Herstellung der nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Salze von 890As, z.B. die pharmakologisch annehmbaren Salze, die mit anorganischen und organischen Basen gebildet werden, beispielsweise die Metallsalze, die sich von Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxiden ableiten, Carbonate oder Bicarbonate, wie solche, die sich von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium ableiten, und Salze, die sich von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie Monoalkylamine, Dialkyl-amine, Trialkylamine, niedrig-Alkanolamine, Di-niedrig-alka-

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nolamine, niedrig-Alkylendiamine, N,N-Diaralkyl-niedrig-alkylendiamine, Aralkylamine, Amino-subst.-niedrig-Alka-nole, N,N-Di-niedrig-alkylamino-subst.-niedrig-alkanole, Amino-polyamino- und Guanidino-subst.-niedrig-alkansäuren und Stickstoff enthaltende heterocyclische Amine, ableiten. Beispiele sind Salze, die sich von Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kalium-carbonat, Kaliumhydroxid, Calciumcarbonat, Trimethylamin, Triäthylamin, Piperidin, N-Äthylpiperidin, Morpholin,

Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, N,N'-Dibenzyläthylendi-amin, Diäthanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-l-propanol, Theophyllin, N-Methylgluca-min u.ä. ableiten.

Die Salze der beschriebenen Verbindung können direkt aus dem Fermentationsmedium unter Verwendung geeigneter Eluierungsmittel während der Ionenaustauschchromatogra-phie isoliert werden oder sie können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können die Disalze, wie das Dinatriumsalz, durch Behandlung von 2 Äquiv. Natriumhydroxid mit 1 Mol des Produktes (I) in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt werden. Gemischte Salze mit einwertigen Kationen können durch Vermischen von 1 Mol einer einwertigen Base mit I Mol des Produktes (I) plus I Äquiv. einer anderen Base hergestellt werden. Alternativ können monobasische Salze durch Behandlung von 1 Äquiv. einer Base mit einem einwertigen Kation mit 1 Mol des Produktes (I) hergestellt werden. Salze können ebenfalls durch Behandlung von 1 Mol des Produktes mit 1 Mol einer Base mit einem zweiwertigen Kation hergestellt werden. Die nach dem erfin-dungsgemässen Verfahren hergestellten Salze sind pharmakologisch annehmbare, nichttoxische Derivate, die als aktiver Bestandteil in einer geeigneten pharmazeutischen Dosiseinheitsform verwendet werden können. Sie können ebenfalls mit anderen Arzneimitteln unter Erzeugung von Zubereitungen mit einem breiten Aktivitätsspektrum kombiniert werden.

Die Fermentationsbrühen, die das erfindungsgemäss hergestellte Antibiotikum 890A9 enthalten, besitzen im allgemeinen Aktivitäten im Bereich von etwa 2 bis 170 Einheiten/ml bei der Analyse entsprechend dem Scheiben-Diffusions-Assay unter Verwendung von Vibrio percolans (ATCC 8461). Das in diesen Fermentationsbrühen enthaltene Antibiotikum 890A? kann nach einer Reihe von Verfahren gewonnen und gereinigt werden. Bei einem dieser Verfahren kann das Antibiotikum 890As an einem stark basischen Anionenaustauschharz adsorbiert werden. Beispiele solcher stark basischen Anionenaustausch-harze sind solche, die eine Styrol-Divinylbenzol-Matrix enthalten, z.B. das Polystyrolharz «Dowex» 1 x2 mit quaternären Ammoniumgruppen am Kern (hergestellt von Dow Chemical Co., Midland, Michigan), im Chloridzyklus. Andere Beispiele dieser Klassen sind stark basische Austauschharze einschliesslich der folgenden: «Duolite» A-40, A-42, A-101, A-102 und A-l 14(hergestellt von Chemical Process Co., Redwood City, California); «Amberlite» IRA-400, IRA-401 und IRA-410. Alternativ kann ein schwach basisches Anionenaustauschharz, wie «Amberlite» IRA-68, verwendet werden. («Amberlite»-Harze werden von Rohm and Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania, hergestellt).

Das adsorbierte Antibiotikum kann leicht von dem Anionenaustauschharz mit Salzlösungen in 80%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol eluiert werden. Das so erhaltene Eluat kann weiter nach anderen Reinigungsverfahren gereinigt werden. Das Eluat kann gereinigt werden, indem man es konzentriert und durch eine Säule leitet, die mit einem Polystyrol, nichtpolares, hydrophobes, vernetztes Divinylbenzolpolymer, wie XAD-1, 2 und 4, oder Polyacrylamidharzen, wie XAD-7 und 8, gefüllt ist. XAD-2 ist bevorzugt. (XAD-1,2,4,7 und 8

werden von Rohm and Haas, Washington Square, Philadelphia, Pennsylvania, hergestellt).

Ein Verfahren zur Herstellung von weiter gereinigtem Antibiotikum 890A9 kann beispielsweise durch Gelfiltration mit 5 Polyacrylamidgel mit einer Porengrösse, die Moleküle mit einem Molekulargewicht über 1800 ausschliesst, wie «Bio-Gel» P-2 (hergestellt von Bio - Rd, Richmond, California) durchgeführt werden. Andere Gele, wie «Sephadex» G-10, können ebenfalls für die Entsalzung verwendet werden.

io Das bevorzugte Verfahren, gemäss dem das Antibiotikum 890A9 in hoher Reinheit aus einer Brühe erhalten werden kann, besteht darin, dass man die Brühe zur Entfernung der Feststoffe zentrifugiert oder filtriert, das Filtrat an einem Anionenaustauschharz, wie «Dowex»-l x2 im Chloridzyklus mit 15 3%igem NaCl in 80%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol adsorbiert und eluiert. Dadurch werden die Antibiotika sowohl konzentriert als auch teilweise gereinigt. Anschliessend wird über eine Säule mit geeignet präpariertem XAD-2 geleitet, das die Antibiotika verzögert und dadurch das «Dowex»-1 x2-Eluat 20 reinigt und entsalzt. Die mit 890A9 angereicherten Fraktionen werden gesammelt und weiter gereinigt. Die Chromatographie an einem «Dowex»-l x2, Teilchengrösse max.. 0,037 mm, mit der Elution durch NaCl und/oder NH4CI in 80%igem wässrigem Methanol ergibt ein Produkt, das von den meisten UV 25 absorbierenden Verunreinigungen frei ist (das NH4CI wird verwendet, um in dem Eluierungsmittel eine gewisse Pufferkapazität zu erhalten). Das 890A9 wird von anderen Antibiotika bei diesem Verfahren abgetrennt. Durch eine Entsalzung an «Bio-Gel» P-2 oder «Sephadex» G-10 in 50%igem Methanol wird die 30 Hauptmenge des Salzes, das bei der «Dowex»-1 x2-Chromato-graphie eingeführt wurde, entfernt.

Die restlichen Verunreinigungen können durch einen weiteren Chromatographiezyklus an «Dowex»-1 x2 der angegebenen Teilchengrösse und Eluierung mit einer Lösung, die Natri-35 umchlorid und 50%iges Methanol enthält, und anschliessende Entsalzung verringert werden.

Bei der Reinigung durch Säulenchromatographie werden im allgemeinen nur solche Fraktionen eluierten Volumens, die Antibiotikum in einer Menge enthalten, das mindestens 30% 40 rein ist, als reinste Fraktionen für die weitere Reinigung vereinigt. Die Kriterien für die Reinigung sind die Verhältnisse Bioaktivität/A220 oder A308/A260 und HAEA308/A220 und bei Entsalzungsverfahren die Leitfähigkeit. Bei jeder Chromatographiestufe werden A220, A260, A308 und die Bioaktivität geeig-45 neter Fraktionen gemessen. Sofern möglich, wird HAEA308 ebenfalls gemessen und beim Entsalzen werden die Leitfähigkeiten gemessen. Die Kriterien für die Entscheidung, welche Fraktionen für die nachfolgenden Verfahren vereinigt werden, können etwas eingestellt werden, so dass man eine höhere Aus-50 beute auf Kosten der Reinheit erhält oder umgekehrt, so dass man eine höhere Reinheit auf Kosten der Ausbeute erhält.

Beim Arbeiten im Labormassstab (weniger als 201 Probenvolumen) können alle Chromatographiestufen, mit Ausnahme der XAD-2-Chromatographie, in einem Kühlraum bei 2 bis 55 5 °C durchgeführt werden. Die XAD-2-Chromatographie wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Der pH-Wert der zu lagernden Antibiotika-Lösungen wird auf 7 bis 8 durch sorgfältige Zugabe verdünnter NaOH- oder NCl-Lösungen eingestellt. Wässrige Lösungen werden in einem Kühlschrank oder, bevor-60 zugt, in Eis-Wasser aufbewahrt, und 50- bis 80%ige Methanollösungen werden bei —20 bis -60 °C aufbewahrt.

Bei Reinigungsstufen vor der XAD-2-Chromatographie werden die Lösungen im allgemeinen auf 25 uM in EDTA durch Zugabe von '/«costei Volumen einer Lösung aus 0,1M Na2 65 EDTA eingestellt, die durch Zugabe von Natriumhydroxid (0,1 M «neutrales EDTA») auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt wurde.

7

636 127

Ein Fliessschema für das Reinigungsverfahren zur Herstellung des Antibiotikums 890A9 ist nachstehend dargestellt.

des Reinigungsverfahrens für

Antibiotikum 890An v

.1 .Kühlen

2.Zentrifugieren

3.Zugabe v.EDTA

Zentrifu-gierte Brühe

I n

1.Adsorbierten an Dowex-1x2

(Cl-) 0,297-0,149 mm

2.Waschen mit 0,15M NaCl + 0,01M tris-HCl+25/UM EDTA in 50% MeOH '

3.Waschen mit Wasser

4.Eluieren mit 3% NaCl+0,01M tris-HCl,pH 7,+0,25/uM neutr.

, EDTA in 80% Methanol

"Dowex-1x2

1.Konzentrieren

2.Adsorbieren an XAD-2 ^ 3.Eluieren mit Wasser

XAD-2 !

Eluat

1.Konzentrierten der 890An enthaltenden Fraktionen

2.Verdünnen mit MeOH

3. Adsorb. an "Dowex-1 x4 ( Cl~ ) (-0,037 mm)

4.Eluieren mit 0,26M NaCl+ 0,005M NHaCI+O,00005M NH*

! r | In 80# Methanol

)DowexMx4

Eluat 890A^

1.Verdünnen mit Wasser

2.Adsorb.an 'Dowex-1x2(Cl~) (-0,037 mm)

3.Eluieren mit 0,30M NaCl + 0,005M NHaCI + 0,001 M NH*

H_ ^ 1 ig-. 5090 Methanol

"DowexMx2 Eluat

1.Konzentrieren

2.Zugabe von 1 Vol MeOH

3. Adsorb. an "Bio-Gel8 P-2( in 50% MeOH)

4.Eluieren mit 0,2mM NH, in 50% MeOH D

890 Ag

'Sio-Gel* P-2

Eluat

1. Konzentrieren

2. Lyophilisieren

636 127

8

Konzentration (|j.g/ml)

Zonendurchmesser (mm)

3,12

16,8

6,25

22,3

12,5

25,0

25

29,6

Assay-Verfahren für Antibiotikum 890A9 II. Analysen- bzw. Assayverfahren für die Bestimmung der

I. Bioassay «890 Assay-Einheiten»

Ein Agarplattenscheiben-Diffusionsverfahren wird unter Ein an sich bekanntes Agarplattenscheiben-Diffusionsver-

Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganis- fahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC

mus verwendet. Eine gereinigte Probe des Antibiotikums 890Ai 5 8461 als Testorganismus verwendet. Cephaloridin wird als wird als Standard verwendet. Antibiotikum 890Ai wird entspre- Standard verwendet. Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende chend dem nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt. Platten werden folgendermassen hergestellt. Eine Kultur von

Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende Platten werden Vibrio percolans ATCC 8461 wird in einem Nährbrühe-

folgendermassen hergestellt. Hefeextrakt über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrich-

Eine lyophilisierte Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 io tung bei 28 °C inkubiert und dann wird auf eine Dichte von wird in 15 ml sterilisiertem Medium, das 8 g/1 «Difco» Nähr- 60% Durchlässigkeit bei 660 nm verdünnt. Ein 33,2 ml Teil die-

brühe und 2 g/1 Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthält, ser verdünnten Kultur wird zu 1 1 Medium zugegeben, das ein

«Nährbrühe-Hefeextrakt» (im folgenden als NB YE bezeich- Nähragar plus 0,2% Hefeextrakt enthält und bei 46 °C gehalten net), suspendiert. Die Kultur wird über Nacht auf einer Rota- wird. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird auf tionsschüttelvorrichtung bei 28 °C inkubiert. Diese Kultur wird is lOOx 15 mm Kunststoff-Petrischalen, 10 ml pro Schale, gegos-

zur Inokulation der Oberfläche von Schrägkulturen, die 1,5% sen, gekühlt und bei 2 bis 4 °C bis zu 5 Tagen vor der Verwen-

Agar in NBYE enthalten, verwendet. Die inokulierten Schräg- dung gehalten.

kulturen werden über Nacht bei 28 °C inkubiert und dann in Die Konzentration an Cephaloridin, die äquivalent zu 1

einem Eisschrank gelagert. Einheit/ml 890Ai ist, wird durch Analyse an Platten, die wie

Die gekühlten Schrägkulturen, die aus einer einzigen, lyo- 20 oben beschrieben hergestellt wurden, die jedoch 5 ml inoku-

philisierten Kultur hergestellt werden, werden bis zu 4 Wochen liertes Medium/Platte enthalten, folgendermassen bestimmt,

von ihrer Herstellung an folgendermassen verwendet: Eine Öse Vier Konzentrationen an Cephaloridin werden als Standard von Inokulum aus der Schrägkultur wird in 50 ml NBYE, das in verwendet - 3,12, 6,25, 12,5 und 25 |ig/ml mit 12,5 (ig/ml als einem 250 ml Erlenmeyerkolben enthalten ist, dispergiert. Die Vergleichslösung. Die Zonendurchmesser auf einer 5 ml Platte Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung 25 für den Standard sind wie folgt:

bei 28 °C inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die 50%

Durchlässigkeit bei 660 nm ergibt. Ein 33,2 ml Teil dieser verdünnten Kultur wird zu 11 NBYE, das 15 g Agar enthält und bei 46 °C gehalten wird, zugegeben. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in lOOx 15 mm Kunststoff-Petrischalen,

5 ml pro Schale, gegossen, gekühlt und bei 2 bis 4 °C bis zu 5 Tagen vor der Verwendung gehalten.

Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 1,27 cm werden in die zu untersuchende Lösung eingetaucht und auf Eine Einheit wird als die Menge an Antibiotikum/ml defi-

den Agar gelegt. Alternativ können die Scheiben durch Aufpi- 35 niert, die eine 25 mm Hemmzone auf einer 5 ml Platte, wie in pettieren von V10 ml Lösung auf die trockene Scheibe beladen Teil I oben beschrieben, ergibt. Daher wird bei diesem Versuch werden, und dann kann die Scheibe auf den Agar gelegt wer- eine Konzentration von 12,5 (ig/ml Cephaloridin äquivalent zu den. Der Durchmesser der Hemmzone wird nach einer geeigne- 1 Einheit 890Ai/ml angenommen. Da die Neigung der Linie ten Inkubation ( 12 bis 24 h bei 25 °C) gemessen. Gegebenen- für Cephaloridin 4,0 beträgt, werden die Berechnungen der falls erfolgen Verdünnungen der Lösungen, die untersucht wer- 40 Potenz der Probe unter Verwendung einer Neigung von 4,0

den sollen, mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 «Kali- durchgeführt.

umphosphatpuffer» (im folgenden als KPB bezeichnet) oder mit entionisiertem Wasser. III. Hydroxylamin-Reaktion

Die Wirksamkeiten bzw. Potenzen werden folgendermas- Antibiotikum 890A9 reagiert mit Hydroxylamin und ergibt sen berechnet. Eine Neigung wird bestimmt, indem man die 45 eine Substanz, bei der die Absorption bei 308 nm im wesentli-

Zonendurchmesser einer Lösung des Antibiotikums 890A9 und chen verschwunden ist. Man erhält somit eine Grundlage für einer vierfachen Verdünnung (in KPB) dieser Lösung misst. eine quantitative Analyse des Antibiotikums 890A9.

Zwei Scheiben mit jeder Konzentration werden auf einer einzi- Die zu analysierende Lösung wird auf 0,05 M in Kaliumgen Platte analysiert, und die durchschnittliche Zonengrösse phosphat, pH 7,4 durch Zugabe von V20 Vol. einer Lösung, die bei jeder Konzentration wird bestimmt. Die Neigung ist gleich 50 0,8 M K2HPO4 und 0,2 M KH2PO4 enthält, gebracht. !/ioo Vol. der Hälfte des Unterschieds der durchschnittlichen Zonengrös- von 1 M hydroxylamin-hydrochlorid wird zugegeben und die sen. Die Wirksamkeiten bzw. Potenzen werden nach der For- Absorption bei 308 nm wird in Intervallen von Vi bis 2 min mei berechnet : gemessen. Die Umsetzung wird bei Zimmertemperatur durch-

. \ geführt. Kinetische Werte erster Ordnung werden angenom-

Potenz (Einheiten/ml) = ( ^ ) 55 men und die Halbwertszeit wird aus der Absorptionsabnahme

Neigung ) während der ersten 10 min bestimmt. Aus dieser Halbwertszeit

(Potenz des Standards) x Verdünnung x 10 wird die Zeit geschätzt, bei der keine weitere Absorptionsab-

worin D der durchschnittliche Durchmesser der von der Unbe- nähme beobachtet werden sollte, und die Beobachtungen wer-

kannten gebildeten Zonen, Ds der durchschnittliche Durch- den über diesen Zeitpunkt hinweg durchgeführt. Wenn man messer der Standardzonen und «Verdünnung» der Grad, mit 6o keine weitere Abnahme über diese Zeit beobachtet, wird die der die Unbekannte vor der Analyse verdünnt wurde, bedeu- gesamte Absorptionsabnahme als «Hydroxylamin-verschwind-ten. Wird kein Standard verwendet, nimmt man an, dass Ds bare Absorption bei 308 nm(HAEA3os)» genommen (wobei für 0,25 mm beträgt und die (Potenz des Standards) wird als 1 Ein- die Verdünnungswirkung und die Absorption des Hydroxyla-heit/ml angenommen, bestimmt an Vibrio percolans ATCC mins korrigiert wird). Wenn man eine Absorptionsabnahme 8461. Reines 890 Ai wird so definiert, dass es eine Wirksamkeit 65 über diese Zeit beobachtet, wird die Rate der Hintergrundsab-von 250 Einheiten pro Hydroxylamin-verschwindbare Absorp- sorptionsabnahme berechnet, und die beobachtete Abnahme zu tionseinheit bei 300 nm ergibt, wenn es als Standard verwendet diesem Zeitpunkt wird für die Hintergrundsabnahme korri-

wird. giert, wobei man annimmt, dass die Hintergrundsabnahme mit

9

636 127

der Zeit linear verläuft. Der korrigierte Wert wird dann als HAEA308 aufgezeichnet.

Die Anzahl der HAEAsos-Einheiten ist gleich dem HAEA308, multipliziert mit dem Volumen in ml.

In den folgenden Beispielen werden die Verfahren, gemäss denen die beschriebenen Produkte hergestellt werden, erläutert. Die Herstellung des Antibiotikums 890Ai wird in der US-Anmeldung mit der Ser.-Nr. 634 300 beschrieben. Auf diese Veröffentlichung wird expressis verbis Bezug genommen.

Beispiel 1

Eine MA-4638 enthaltende Schrägkultur wird zur Inokulierung eines 250 ml Erlenmeyerkolbens, der mit Ablenkorganen versehen ist und 50 ml Medium A enthält, verwendet.

Medium A

Dextrose 10,0g

Hefeautolysat («Ardamine»*) 10,0 g

MgS04-7H20 0,05 g

Phosphatpuffer** 2,0 ml destilliertes Wasser 1000 ml pH 6,5

* «Ardamine» : Yeast Products, Inc. ** Phosphatpufferlösung:

KH2PO4 91,0g

NazHPOt 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Dieser Kolben wird bei 28 °C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung mit einer Schwingungsamplitude von 5,08 cm 2 Tage lang geschüttelt, bis das Wachstum zufriedenstellend ist. Nach 2 Tagen wird dieses Impfgut zur Inokulierung von drei 250 ml Erlenmeyerkolben, die 40 ml Medium B enthalten,

unter Verwendung von 2 ml/Kolben (5%) verwendet.

Medium B

Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g

Gesamtweizen (gemahlen) 20,0 g destilliertes Wasser 1000 ml pH : unter Verwendung von NaOH auf 7,0 eingestellt.

Diese Produktionskolben werden ebenfalls bei 28 °C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung bis zu 4 Tage lang geschüttelt, wobei während der Fermentation Analysenversuche durchgeführt wurden. Nach einem Alter von 3 Tagen wird ein aliquoter Teil der überstehenden Lösung aus der zen-trifugierten Brühe für die Klassifizierung und Identifizierungsuntersuchung verwendet. Unter Verwendung von 0,63 cm Analysenscheiben auf Standardanalysenplatten ergibt diese Brühe eine 22 mm Hemmzone gegenüber Proteus vulgaris und eine 15 mm Hemmzone gegenüber Salmonella gallinarum. Die Bioau-tographie eines Elektrophoretogramms der zentrifugierten Brühe zeigt zwei Komponenten. Der sich schneller bewegende kleinere Flecken enthält 890As.

Beispiel 2

Fünfzehn gefrorene Ampullen, die 1 ml MA-4638-Kultur-brühe enthalten, werden langsam aufgetaut und der Inhalt wird aseptisch in fünfzehn 250 ml Erlenmeyerkolben mit dreifachen Umlenkelementen, die 50 ml C-Impfmedium enthalten, überführt. Die Kolben werden mit Baumwolle verschlossen.

C-Medium autolysierte Hefe («Ardamine»*) 10,0 g

Glucose 10,0g

MgSÛ4*7H20 0,05 g

Phosphatpuffer** 2,0 ml destilliertes Wasser 1000 ml der pH-Wert wird mit NaOH vor der Behandlung im Autoklaven auf 6,5 eingestellt

*«Ardamine»: Yeast Products, Inc.

**Phosphatpufferlösung:

KH2PO4 91,0g

Na2HP04 95,0 g destill. Wasser 1000 ml

Die Impfkolben werden 20 bis 24 h lang bei 28 °C ± 1 °C an einem 210 U/min Gyrotationsschüttler, 5,08 cm (2 inch) Schwingungsamplitude, geschüttelt. Die Brühe von den Impfkolben wird zur Inokulierung von Produktionskolben verwendet.

Die folgenden unterschiedlichen Produktionskolben, die D-Produktionsmedium enthalten, werden verwendet: sechs 21 Schüttelkolben ohne Ablenkelemente, die 150 ml Medium/ Kolben enthalten, mit Baumwolle verschlossen; acht 21 Schüttelkolben mit drei Umlenkelementen, die 350 ml Medium/Kolben enthalten, mit Mullverschluss ; und zweihundertfünfzig 250 ml Schüttelkolben ohne Ablenkelemente, die 40 ml Medium/Kolben enthalten, mit Baumwolle verschlossen. Die Gehalte an verwendetem Inokulum sind: 5 ml/150 ml Medium; 10 ml/350 ml Medium; und 1,5 ml/40 ml Medium.

D-Medium

Dextrin CPC-modifizierte Stärke) 40,0 g Schlempe 7,0 g Hefeextrakt 5,0 g

CoC12-6H20 50,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml der pH-Wert wird mit NaOH vor der Behandlung im Autoklaven auf 7,3 eingestellt

Nach der Inokulation werden die Produktionskolben bei 25° ± 1 °C unter Schütteln auf einer 220 U/min Gyrotations-schüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, während 3 Tagen geschüttelt. Die Kolben werden geerntet und der Inhalt wird vereinigt.

Die Brühe wird in 200 ml Teilen bei 11 000 U/min während 15 min zentrifugiert. Zu den vereinigten überstehenden Lösungen, insgesamt 91, gibt man 2 ml 0,1 M EDTA, und die überstehende Lösung wird auf eine Säule (8,2 x 20 cm) von Dowex-1 x 2 (Cl~), 0,297 bis 0,149 mm aufgebracht, die zuvor mit 510,1 M HCl + 30 g/1 NaCl in 80%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol und anschliessend mit 51 entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Geschwindigkeit der Anwendung beträgt 10 bis 50 ml/min. Nach der Anwendung der Probe wird die Säule mit 11 entionisiertem Wasser und anschliessend mit 9 10,15 M NaCl + 0,01 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25 |iM neutral. EDTA in 50%igem wässrigem Methanol gewaschen. Das Antibiotikum 890A9 wird dann mit 91 eines 30 g/1 NaCl ± 0,01 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25 |iM neutr. EDTA in 80%igem wässrigem Methanol in einer Strömungsrate von 40 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 200 bis 900 ml werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität nach der ATCC 8461 Analyse scheint in allen Fraktionen, 1 bis 19, aufzutreten, mit einem breiten Maximum bei den Fraktionen 6 bis 11, die sich von 1290 bis 3550 ml eluiertem Volumen erstrecken. Die Fraktionen 6 bis 14 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 190 ml konzentriert, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,4 ml 12M HCl von 7,6 auf 6,5 gebracht.

Das Konzentrat wird auf eine Säule (4,95 x 36 cm) aus XAD-2, die zuvor mit 41 von je 60%igem wässrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 50 g/1 NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde, angewendet. Nach der Anwendung der Probe wird die Säule dreimal mit 101 entionisiertem Wasser gewaschen und dann mit entionisiertem Wasser bei 15 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 100 bis 500 ml werden gesammelt. Diese Säule wird gewaschen und die Chromatographie wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Die verdünnten Fraktionen werden unmittelbar mit Eis-Wasser gekühlt.

Die antibiotische Aktivität nach der ATCC 8461-Analyse

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

636 127

10

tritt in den Fraktionen 4 bis 12 auf, die sich von 450 bis 2345 ml eluiertem Volumen erstrecken. Die Fraktionen 5 bis 8, die sich von 600 bis 1245 ml eluiertem Volumen erstrecken, besitzen die höchsten Verhältnisse an HAEA304/A220 und werden dementsprechend für die weitere Reinigung vereinigt. Die gesammel- 5 ten Fraktionen besitzen insgesamt 607 HAEA304-Einheiten.

Die vereinigten Fraktionen 5 bis 8 werden bei vermindertem Druck auf 40 ml konzentriert, und das Konzentrat wird mit 160 ml Methanol verdünnt. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit 1 M NaOH auf 7,5 eingestellt, und die Lösung wird dann auf eine Säule, 2,2 x 40 cm, aus «Dowex»-l x4 (Cl~), (-0,037 mm), die zuvor mit 210,1 M HCl + 30 g/1 NaCl in 80°/oigem (Vol/ Vol) wässrigem Methanol und dann mit 1180%igem Methanol gewaschen wurde, aufgebracht. Die Rate der Anwendung der Probe beträgt 2 ml/min. Nach der Anwendung wird die Säule 15 mit 50 ml 80%igem Methanol gewaschen und mit 0,26 M NaCl + 0,01 M NH4CI + 0,0002 M NH3 in 80%igem Methanol bei 1 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Die Bioaktivität nach der ATCC 8461-Analyse tritt in den Fraktionen 87 bis 280 auf. Der Hauptpeak des Antibiotikums 20 890A? tritt in den Fraktionen 231 bis 275 auf, die maximale Aktivität tritt in der Fraktion 250 auf. Die Fraktionen 231 bis 275 werden vereinigt und ergeben die 890As-«Dowex»-Charge.

Die 890A<>-«Dowex»-Charge (vereinigte Fraktionen 231 bis 275) wird mit 1600 ml entionisiertem Wasser verdünnt und auf 25 eine Säule (2,2 x 42 cm) aus «Dowex»-l x2(Cl~) (-0,037 mm), bei 2 ml/min aufgebracht. Nach der Anwendung wird die Säule mit 50 ml 50%igem (Vol/Vol) Methanol gewaschen und mit 3,4 10,30 M NaCl + 0,010 M NH4CI + 0,0002 M NHs in 50%igem Methanol und anschliessend mit 210,30 M NaCl + 0,01 M 30 NH4CI ± 0,0002 M NH3 in 60%igem Methanol bei 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 9,5 ml werden gesammelt.

Der Hauptabsorptionspeak bei 305 nm tritt in den Fraktionen 385 bis 440 mit einem Maximum bei der Fraktion 410 auf. Die Fraktionen 400 bis 425 besitzen die höchsten A3os/A26o-Ver- 35 hältnisse und werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen enthalten 160 A305 Einheiten, von denen 147 durch Hydroxylamin auslöschbar sind.

Die vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 5,5 ml konzentriert. Der pH-Wert wird durch 40

Zugabe von 30 jxl 1M NaOH auf 7,1 eingestellt, und 5,5 ml Methanol werden zugegeben. Die Probe wird dann auf eine Säule (2,2 x 69 cm) aus «Sephadex» G-10 angewendet, die zuvor mit 210,05 mM NH3 in 50%igem (Vol/Vol) Methanol gewaschen wurde. Nach der Anwendung der Probe wird die Säule mit 0,05 45 mM NH3 in 50%igem Methanol, bei 1 ml/min, eluiert. Fraktionen von 2,95 ml werden gesammelt.

Der Hauptabsorptionspeak bei 307 nm tritt bei den Fraktionen 69 bis 85 mit einem Maximum bei den Fraktionen 77 bis 78 auf. Leitfähigkeitsmessungen einzelner Fraktionen zeigen, dass 50 der Hauptabsorptionspeak bei 307 nm etwas nach dem Salz-peak eluiert. Die Fraktionen 74 bis 82, die 68 A307-Einheiten mit einem Verhältnis von A307/A260 von 1,80 enthalten, werden vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem 55 Druck auf 3 ml konzentriert, und das Konzentrat wird auf eine Säule (3,4 x 45 cm) aus «Dowex»-50x2 (Na+) (0,074 bis 0,037 mm), angewandt, die zuvor mit 2110~5 M NaOH in entionisiertem Wasser und anschliessend mit 100 ml entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Nach Anwendung der Probe wird die 60 Säule zweimal mit 2 ml entionisiertem Wasser gespült und dann mit entionisiertem Wasser bei 4 ml/min eluiert. Fraktionen von 3,95 ml werden gesammelt.

Der Hauptabsorptionspeak bei 307 nm tritt bei den Fraktionen 38 bis 48 mit einem Maximum bei den Fraktionen 42 und 65 43 auf. Die Fraktionen 42,43 und 44 haben die höchsten A307/ A22o-Verhältnisse und werden für die Lyophilisierung gesammelt. Der pH-Wert der vereinigten Fraktionen wird durch

Zugabe von 2,2 jo.10,1 M NaOH von 5,8 auf 7,0 eingestellt und 2,5 ml werden entfernt. Die restlichen 9,4 ml werden bei vermindertem Druck auf 1 ml konzentriert und 10 ml D2O werden zugegeben. Die Konzentration auf 1 ml und die Zugabe von 10 ml D2O werden wiederholt und die Endkonzentration wird erreicht. 1 ml des Konzentrats wird gefroren und lyophilisiert. Man erhält 20 mg Feststoffe, wovon etwa 18 mg NaCl sind, geschätzt durch die Leitfähigkeit.

Beispiel 3

Zwei gefrorene Ampullen, die je 1 ml MA-4638-Kultur-brühe enthalten, werden langsam aufgetaut, und der Inhalt wird aseptisch in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben mit drei Ablenkelementen, die je 50 ml C-Impfmedium enthalten, gegeben. Die Kolben werden mit Baumwolle verschlossen.

C-Medium autolysierte Hefe («Ardamine»*)

Glucose

MgS04-7H20

Phosphatpuffer**

destilliertes Wasser

10,0 g 10,0 g 0,05 g 2,0 ml 1000 ml der pH-Wert wird durch Zugabe von NaOH vor der Behandlung im Autoklaven auf 6,5 eingestellt.

*«Ardamine» : Yeast Products, Inc.

**Phosphatpufferlösung:

KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destill. Wasser 1000 ml

Die Impfkolben werden 20 bis 24 h lang bei 28° ± 1 °C auf einer 210 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude geschüttelt. Der Inhalt wird gesammelt und zur Inokulierung der Produktionskolben verwendet.

Zehn 21 Schüttelkolben mit Ablenkelementen, die je 300 ml D-Produktionsmedium enthalten, werden mit 10 ml/Kolben der Brühe von dem Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit einem Mullverschluss bedeckt.

D-Medium

Dextrin (CPC modifizierte Stärke)

Schlempe

Hefeextrakt

CoCh-óHìO

destilliertes Wasser

40,0 g 7,0 g 5,0 g 50,0 mg 1000 ml der pH-Wert wird mit NaOH vor der Behandlung im Autoklaven auf 7,3 eingestellt

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei 24°+1 °C unter Schütteln auf einer 210 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, 3 Tage lang inkubiert. Die Kolben werden geerntet, der Inhalt wird vereinigt und die Brühe wird auf ihre Aktivität geprüft.

Erntealter (h) 72

pH-Wert 6,5

890 Assay (Einheiten/ml) 30,45

21 der gesamten Brühe aus den obigen KR-Produktionskol-ben werden in 200 ml Teilen bei 9000 U/min zentrifugiert; man erhält 1,71 überstehende Lösung mit einem pH-Wert von 6,8.

Die überstehende Lösung wird auf eine «Dowex» 1x2-(Cl-)-Säule, 50 bis 100 mesh (0,297 bis 0,149 mm), Schichtdimension 3,9 cm x 25 cm, bei einer Strömungsrate von 5 bis 10 ml/min angewendet. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser und anschliessend mit 210,15 M NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 0,25 uM neutr. EDTA in 50%igem (Vol/ Vol) wässrigem Methanol gewaschen.

Das Produkt wird dann mit 30 g/1 NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25 uM EDTA in 80%igem (Vol/Vol) wässri-

11

636 127

gern Methanol bei einer Strömungsrate von 5 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Die Bioaktivität tritt in den Fraktionen 5 bis 180 mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 70 auf. Die Fraktionen 12 bis 105 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 15 5 ml konzentriert. Der pH-Wert wird mit 1 M HCl auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat wird auf eine Säule (3,4 x 55 cm) aus XAD-2 angewendet, die mit 2,51 von je 60%igem (Vol/Vol) wässrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 5% NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Säule wird mit 3 io x 5 ml Teilen entionisiertem Wasser gespült und mit entionisiertem Wasser bei 10 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Die Bioaktivität tritt in den Fraktionen 32 bis 270 mit einem Maximum bei den Fraktionen 42 bis 62 auf. Die gesamte Bioak-is tivität, die eluiert wird, beträgt 25% der Aktivität der ursprünglichen Brühe. Die Fraktionen 40 bis 240 werden vereinigt und die gelagerten vereinigten Fraktionen 12 bis 34 aus der XAD-2-Säule von Beispiel 1 zugegeben. Die gesamten vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 50 ml konzentriert :2o sie enthalten 120 HAEA304-Einheiten.

Das Konzentrat wird mit 200 ml Methanol verdünnt und bei 2 ml/min auf eine Säule (2,15 x 40 cm) aus «Dowex»-l x4, (-0,037 mm), aufgebracht, die zuvor mit 21 von 30 g/1 NaCl in 80%igem wässrigem Methanol und 1180%igem wässrigem Me- 25 thanol gewaschen wurde. Nach Anwendung der Probe wird die Säule mit 100 ml 80%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol gewaschen und mit 2,510,22 M NaCl + 0,01 M NH4CI + 0,0002 M NH3 in 80%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol und anschliessend mit 310,31 M NaCl + 0,01 M NH4CI + 0,0002 M 30 NH3 in 80%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol eluiert. Die Strömungsrate beträgt 2 ml/min. Fraktionen von je 10 ml werden gesammelt.

Das Antibiotikum 890As wird an der «Dowex»-1 x4-Säule abgetrennt und in den Fraktionen 280 bis 350 eluiert, bestimmt 35 durch Analyse an ATCC 8461.

Die «Dowex»-l x4-Fraktionen 307 bis 338 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 7,6 ml konzentriert. 30 |il 1 M NaOH werden zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 bis 7,5 zu gegeben. Das Konzentrat wird mit 7,6 ml Methanol ver- 10 dünnt, und die Lösung wird zur Entfernung des Salzniederschlags zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird bei vermindertem Druck auf 4 ml konzentriert, und zu diesem Konzentrat gibt man 6 ml Methanol. Der Salzniederschlag kann sich absetzen und die überstehende Lösung wird auf eine Säule 45 (2,2 x 70 cm) aus «Sephadex» G-10 pipettiert, die zuvor mit 10 ml 1 M NH3 in wässrigem Methanol und anschliessend mit 11 0,0001 M NH3 in 80%igem Methanol gewaschen wurde. Nach Anwendung der Probe wird die Säule dreimal mit 1 ml 0,0001 M NH3 in 80%igem Methanol gespült und mit 400 ml des glei- so chen Lösungsmittels mit einer Strömungsrate von 1 ml/min gewaschen. Die Säule wird dann mit 0,00005 M NH3 in 50%igem wässrigem Methanol bei einer Strömungsrate von 1 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt,

wobei man vom Beginn der ersten Anwendung des 50%igen 55 Methanoleluats zählt.

Ein Absorptionspeak bei 305 nm tritt bei den Fraktionen 9 bis 22 mit einem Maximum bei der Fraktion 12 auf. Die Fraktionen 11 bis 17 werden vereinigt; sie enthalten 17 A305-Einhei-ten, von denen 9,1 durch Hydroxylamin auslöschbar sind. eo

Die vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 2 ml konzentriert, mit 99,7% D2O auf 10 ml verdünnt und dann bei vermindertem Druck auf 1,5 ml konzentriert, gefroren und lyophilisiert. Das entstehende, weisse Pulver, das das Produkt 890A9 und mehr als 5 mg Natriumchlorid 65 enthält, wird NMR-spektroskopisch analysiert.

Antibiotikum 890Ai

Ein Rohr bzw. eine Ampulle aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces glavogriseus MA-4600 NRRL 8140 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium E der folgenden Zusammensetzung enthält.

Medium E

Hefeextrakt 10,0g

Glucose 10,0g

MgS04-7H20 0,05 g

Phosphatpuffer** 2 ml destilliertes Wasser 1000 ml

**Phosphatpuffer:

KH2PO4 91,0g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird zur Inokulierung eines 250 ml Erlen-meyerkolbens mit drei Ablenkelementen, der 54 ml Impfmedium C der folgenden Zusammensetzung enthält, verwendet.

10,0 g 10,0 g 0,05 g 2 ml 1000 ml

Medium C

autolysierte Hefe («Ardamine»*)

Glucose MgS04-7H20 Phosphatpuffer**

destilliertes Wasser der pH-Wert wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt *«Ardamine» :

Yeast Products, Corp.

**Phosphatpufferlösung :

KH2PO4 91,0g

Na2HP04 95,0 g destill. Wasser 1000 ml

Der Impfkolben wird mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen und 30 h bei 28° ± 1 °C auf einer 220 U/min Gyrotations-schüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, geschüttelt.

Fünfzig 250 ml Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkelemente, die je 40 ml Produktionsmedium F enthalten, werden mit 1 ml/Kolben der Brühe von dem Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit Watte bzw. Baumwolle verschlossen.

Medium F

Tomatenpaste bzw. -mark primäre Hefe Dextrin («Amidex») C0CI2.6H2O destilliertes Wasser

20,0 g 10,0 g 20,0 g 5,0 mg 1000 ml der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei 28°± 1 °C unter Schütteln auf einer 220 U/min Gyrotations-schüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, 3 Tage lang geschüttelt. Die Kolben werden auf ihre Aktivität gegenüber Vibrio percolans ATCC 8461-Standardassayplatten unter Verwendung von 1,27 cm Analysenscheiben, die in zen-trifugierte Fermentationsbrühenproben eingetaucht wurden, untersucht. Die Proben werden mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, verdünnt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

Stunden nach der Entnahme 72

pH-Wert 6,4

Vibrio percolans

('/ioo Verdünnung) Assay 23 mm

890 Assay, Einheiten/ml 103

Die gesamte Brühe wird in 200 ml Teilen in Polycarbonat-flaschen 15 min bei 9000 U/min zentrifugiert; man erhält 1600

636 127

12

ml vereinigte überstehende Lösung mit einer Potenz von 104 Einheiten/ml. Dazu gibt man 0,5 ml 0,1 M neutr. EDTA.

Die zentrifugierte Brühe wird an einer «Dowex»-1 x2 (Cl~), (0,297 bis 0,149 mm)-Säule, Schichtdimensionen 3,8 x 22 cm, in einer Strömungsrate von 6 bis 20 ml/min adsorbiert. Die Säule wird mit 100 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 11 entionisiertem Wasser, enthaltend 50 g Natriumchlorid, 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 n.M neutr. EDTA bei einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt. Antibiotikum 890Ai tritt in den Fraktionen 13 bis 81 mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 33 auf, wenn man vom Beginn der ersten Anwendung des Salzeluats an zählt. Die Fraktionen 24 bis 41, die die höchsten Biopotenz/ A22o-Verhältnisse besitzen, werden für die weitere Behandlung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 29 000 Einheiten oder 17% der angewendeten Bioaktivität.

Das «Dowex»-Eluat wird auf 10 ml konzentriert, und der pH-Wert wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 6,5 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus XAD-2, Schichtdimensionen 3,3 x 36 cm, aufgebracht, die zuvor mit je 2 160%igem Aceton, entionisiertem Wasser und 5%igem (Gew./Vol.) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Probe wird damit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 40 bis 260 ml werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität tritt in den Fraktionen 6 bis 14 auf, die sich von 220 bis 2560 ml des eluierten Volumens erstrecken. Der Peak tritt bei den Fraktionen 9 und 10 auf, die sich von 370 bis 590 ml eluiertem Volumen erstrecken. Die Fraktionen 9 bis 12, die 370 bis 1060 ml des eluierten Volumens entsprechen, besitzen die höchsten HAEA3oo/A22o-Verhältnisse und werden für die weitere Behandlung vereinigt. Diese Fraktionen enthalten 36 600 Einheiten; dies entspricht 126% der offensichtlich angewandten Aktivität.

Die vereinigten Fraktionen 9 bis 12 werden auf 100 ml konzentriert und das Konzentrat wird auf eine Säule aus «Dowex»-l x4 (Cl~) (—0,037 mm), Schichtdimension 2,2x41 cm, in einer Strömungsrate von 2 ml/min aufgebracht. Die s Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 31 0,07 M NaCl + 0,005 M NHiCl + 0,0001 M NHs in entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 10,8 ml werden gesammelt, beginnend bei der ersten Anwendung des Eluierungsmittels.

io Der Hauptpeak des Antibiotikums 890Ai tritt in den Fraktionen 181 bis 217 mit einem Maximum bei der Fraktion 198 auf. Die Fraktionen 186 bis 210, die insgesamt 114 Absorptionseinheiten bei 300 nm enthalten, werden vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen werden auf 4,0 ml konzentriert, 15 und der pH-Wert wird durch Zugabe von 16 ^.11 M NaOH auf 7,3 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus «Bio-Gel» P-2 (0,074 bis 0,037 mm), Schichtdimension 2,15 x 70 cm, aufgebracht, mit 3 x 1 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit entionisiertem Wasser bei 0,96 ml/min eluiert. Fraktionen von 3,85 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890Ai tritt bei den Fraktionen 24 bis 44 mit einem Maximum bei den Fraktionen 33 und 34 auf. Die Fraktionen 27 bis 38, die die höchsten A300/ A245-Verhältnisse besitzen, werden für die Lyophilisierung vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen haben insgesamt 72 A300-Einheiten.

Zur Durchführung der Lyophilisierung werden die vereinigten Fraktionen auf 3,0 ml konzentriert, und der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zugabe von 10 (il 0,1 M NaOH auf 30 7,5 eingestellt. Die Probe wird in zwei Teile von je 1,50 ml geteilt, und die Teile werden getrennt schnell gefroren und aus 14 ml Ampullen mit Glasschraubverschluss lyophilisiert. Jede Probe enthält 1,73 mg 890Ai ; dies entspricht 35,8 A3oo-Einhei-ten.

20

25

g

Claims (2)

1. 636 127

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums MSD 890A9 in Form der Verbindung der Formel

   OSO..H

   I 3

   CH -CH

   Ì

   S-CH=CH-NH-C-CH.

   CO OH

   oder von deren pharmazeutisch annehmbaren Salzen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen 890A9 liefernden Stamm von Streptomyces flavogriseus in wässrigem Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen kultiviert und das Antibiotikum gewinnt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der kultivierte Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus NRRL11 020 ist.