CH637424A5 - Verfahren zum zuechten von zellen. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Züchtung von Zellen und im besonderen auf ein Verfahren

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zur Züchtung von Mikroorganismen, z.B. Bakterien, Hefezellen ierlicher Energiezufuhr, entspricht. Im Diagramm steht in der oder Pilzen. Das Verfahren ist jedoch nicht auf die Züchtung Abszisse die Zykluszeit in logarhythmischem Massstab, von Mikroorganismen beschränkt, sondern kann auch z.B. auf Die Abszisse ist auch das arithmetische Mittel der Zyklus-Gewebskulturen angewandt werden. zeit, wenn diese irregulär ist. Wenn solche irregulären Zyklen Die Ausbeute, die üblicherweise als produzierte Biomasse, 5 nicht allzu breit verteilt sind, ist das gemessene Wirkungsver-bezogen auf aufgewendete Energie definiert wird, war häufig hältnis im wesentlichen übereinstimmend mit dem Diagramm in weit unterhalb dem erreichbaren Maximum und wir identifizier- Fig. 1. Wenn jedoch die Zykluszeit in einem weiten Bereich um ten die diskontinuierliche Natur der Energie wie sie für die Zelle das Mittel verteilt ist, stimmt das Wirkungsverhältnis nicht mit verfügbar ist als Ursache dafür. dem genannten Diagramm überein, sondern mit einem berech-In der vorliegenden Beschreibung wird unter einer Energie- io neten Faktor, der unter Berücksichtigung der gewogenen Mitquelle eine solche verstanden, die als limitierender Faktor für telwerte für die Wirkungsverhältnisse der einzelnen Zyklen er-die Wachstumsrate der betreffenden Kultur wirksam ist. Dem- halten wird. Das Diagramm zeigt die folgenden drei Bereiche, zufolge beziehen wir uns, wenn die Energiequelle eine Kohlen- nämlich:

stoffquelle ist, auf eine Kultur, deren Wachstum durch zuge- Ein erster Bereich bei dem die Zykluszeit tief ist, d.h. die führten Kohlenstoff limitiert wird. i s Pulsrate (Zyklen/Zeiteinheit) hoch ist und die Energieumwand-Unter intermittierender Natur von verfügbarer Energie ver- lung bezogen auf Biomassen-Wirkungsverhältniss praktisch 1 ist stehen wir die Variationen in der Konzentration der Energie- und im wesentlichen konstant ist. In diesem Bereich werden also quelle bei der Kultur, die aus Abweichungen von einem stetigen keine Effekte der Energiezufuhr beobachtet.

Zufluss der Energiequelle im Substrat resultiert. Diese Konzen- Ein zweiter Bereich bei dem die Zykluszeit grösser ist als im trationsänderungen in der Kultur resultieren ihrerseits in Varia- 20 ersten Bereich, d.h. die Pulsrate ist niedriger und das Energie-

tionen der spezifischen Wachstumrate und umgekehrt. Es ist zu Biomassen-Wirkungsverhältnis fällt zuerst auf ein Minimum dieses Auftreten von Perioden mit praktisch keinem Wachstum, und anschliessend mit grösser werdender Zykluszeit nähert es das die totale bioenergitische Wirksamkeit der Organismen be- sich einem konstanten höheren Wert.

einflusst und weniger die Wirkungen der Variabilität der Ener- Eine dritte Region, bei der die Zykluszeit grösser ist als in giequelle auf die Gesamtkultur. 25 der zweiten Region, d.h. die Pulsrate ist niedriger und das Wir-

Mit Hilfe mechanischer Vorrichtungen ist es möglich, die kungsverhältnis ist im wesentlichen konstant. Das Wirkungsver-

Energiequelle pulsförmig auf die mikrobielle Kultur anzu- hältnis in diesem Bereich kann gleich oder niedriger sein als im wenden. ersten Bereich. Dieser dritte Bereich des Diagramms endet,

Wenn eine Energiequelle auf eine Kultur pulsförmig ange- wenn die Pulsrate so niedrig wird, dass die totale Ausbeute der wandt wird, bedeutet dies, dass während einer gegebenen Zeit- 30 Kultur kleiner wird, weil die darin vorhandenen Mikroorganis-

dauer diskrete Anteile dieser Energie eingeführt werden. Jede men beginnen abzusterben.

Periode der Energiezufuhr wird gefolgt von einer Periode, wäh- Das oben beschriebene Diagramm bezieht sich auf den Fall, rend der die vorgängig zugeführte Energie für den Verbrauch bei dem die Zeit während der Kultur ein hohes Wachstum auf-durch die Kultur verfügbar ist. Wenn alle vorgängig zugeführte weist infolge von Verfügbarkeit einer Energiequelle, wesentlich Energie verbraucht ist, folgt eine dritte Periode, während der 35 kleiner ist als die totale Zykluszeit. Für praktische Zwecke kann keine Energie zugeführt wird und keine Energie für die Kultur der Bruchteil dieser Zeit des Wachstums durch eine Annäheverfügbar ist. In der vorliegenden Beschreibung verstehen wir mng durch das Verhältnis von totaler spezifischer Wachstums-unterPulsdauer die Zeitperiode, während der Energie in die rate (|x) zu maximaler spezifischer Wachstumsrate (|xmax) (|xm) Kultur eingeführt wird plus die nachfolgende Periode während das von der genannten Kultur erreicht wird, wenn die Zufuhr der die zugeführte Energie für die Kultur verfügbar ist. Unter 40 VOn Kohlenstoff und Energiequelle nicht limitiert ist. Wir haben dem Ausdruck Zykluszeit verstehen wir die genannte Pulsdauer gefunden, dass die genannte totale spezifische Wachstumsrate plus das nachfolgende Zeitintervall, während dem keine äussere sich nm nähert oder da |Xm reduziert wird, so dass es sich |x Energie für die Kultur zur Verfügung steht, d.h. die totale Zeit- nähert, der Einfluss des Wirkungsverhältnisses auf die Energiedauer zwischen dem Beginn einer Periode der Energiezufuhr ausbeute der Kulturen sich bei irgendeiner konstanten Pulsrate und dem Beginn der nächsten gleichen Periode, wobei diese 45 vergrössert. Es wurde beobachtet, dass Wechsel in der spezifi-genannte Zykluszeit notwendigerweise eine Periode ein- sehen Wachstumsrate der Kultur mit kontinuierlich verfügbarer schliesst, während der keine exogene Energie für die Kultur zur jedoch limitierender Energiequelle ihrerseits Wechsel in der Verfügung steht. energetischen Ausbeute einer Kultur verursachen können. Das Wir haben Experimente durchgeführt, bei denen eine Ener- vorgängig beschriebene Wirkungsverhältnis bezieht sich nur auf giequelle wie eine Kohlenstoffquelle in pulsförmiger Art sowohl 50 zusätzliche Effekte wie sie durch eine intermittierend verfügba-mit regulärer als auch mit irregulärer Frequenz auf eine Kultur re Energiequelle verursacht werden. Andererseits ergeben Ab-von Mikroorganismen angewandt wurde. Unter Pulsen regulä- nahmen im Verhältnis von |x zu [xm in einer Kultur bei der die rer Frequenz verstehen wir Pulse mit gleichen Mengen der Energiequelle intermittierend verfügbar ist ebenfalls abneh-Energiequelle, z.B. der Kohlenstoffquelle, die in gleichen Zeit- mende Energieausbeuten bei irgend einer konstanten Pulsrate, Perioden zugeführt werden und deren dazwischen liegende Pe- 55 verglichen mit der entsprechenden Zellkultur, bei der die Ener-rioden ebenfalls jeweils von gleicher Dauer sind. Unter Pulsen giequelle kontinuierlich verfügbar ist. Die Ergebnisse sind in irregulärer Frequenz verstehen wir Perioden von Energiezu- einem zweiten Diagramm (Fig. 2) mit denselben Koordinaten fuhr, die nicht der oben genannten regulären Art entsprechen, wie in Fig. 1 dargestellt und erscheinen in Form einer Serie von z.B. Perioden, deren Frequenz in zufälligerweise variiert und ,. , u, tti. ,

ebenso Perioden mit variierender Frequenz, bei denen eine be- » Kurven für verschiedene Werte von — , die die Wirkung der stimmte Folge verschiedener Frequenzen sich wiederholt. Aus Veränderung des Zeitanteils vom raschen Wachstum in einem den Ergebnissen unserer Experimente erhielten wir das Dia- Zyklus zeigen.

gramm, das in Fig. 1 wiedergegeben ist. In diesem Diagramm Ein drittes Diagramm, Fig. 3, zeigt die Wirkung, die erhal-steht in der Ordinate das Biomassen-Wirkungsverhältnis (von ten wird, wenn die Zyklen von verfügbarer Energie strikt regel-0-1,0) für die Kultur, das dem Verhältnis der beobachteten 65 massig sind. Eine signifikante Reduktion des Effekts, verursacht Energieumwandlung des biologischen Systems in einer Umge- durch die intermittierende Verfügbarkeit von Energie wird bebung mit pulsförmiger Energiezufuhr bezogen auf die Ener- obachtet. In der vorliegenden Beschreibung wird unter Energieumwandlungsausbeute eines analogen Systems mit kontinu- gieumwandlungs-Wirksamkeit das Verhältnis von zugefügter

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Energie, die in der Bildung neuer Biomasse resultierte und der total zugeführten Energie verstanden; wenn z.B. die einzige Energiequelle eine Kohlenstoff enthaltende Verbindung ist, so beträgt die entsprechende Energieumwandlungs-Wirksamkeit den Wert des Quotienten aus der Masse Kohlenstoff, die in der neu produzierten Biomasse enthalten ist, dividiert durch die totale Masse Kohlenstoff, die eingeführt wurde.

Variabilität oder pulsförmige Zufuhr der in die Kultur eingeführten Energie kann in den oben genannten Zyklen von Energie Verfügbarkeit und NichtVerfügbarkeit resultieren,

wenn die pulsförmige Zufuhr genügend ist, um dem Organismus zu ermöglichen, die Energiereserven im Kulturmedium zu verbrauchen. Die pulsförmige Energiezufuhr, d.h. das Auftreten von definierten Zeitintervallen zwischen zwei aufeinander folgenden Zufuhren von Energie an die Kultur kann auf zwei verschiedene Arten oder durch Kombination dieser zwei verschiedenen Arten erfolgen. In der ersten Art kann die Energie in der Weise der Kultur zugeführt werden, dass z.B. in einen Fermentierungstank die Substratzufuhr in Intervallen erfolgt, wobei die genannten Zeitintervalle gesteuert werden können. Andererseits können nach der zweiten Art eine pulsförmige Energiezufuhr in der Weise erreicht werden, dass die Energie entlang einer physikalisch begrenzten Bahn an verschiedenen Punkten dieser Bahn kontinuierlich zugeführt wird, während die Kultur selbst entlang der genannten Bahn bewegt wird. Diese beiden beschriebenen Arten der Energiezufuhr einerseits in zeitlich voneinander getrennten Pulsen oder von verschiedenen Punkten entlang einer physikalisch begrenzten Bahn können miteinander kombiniert werden. In der zweiten Art ist der Effekt so, dass einzelne Zellen in der Zellkultur bei ihrem Durchfluss durch die genannte Bahn Konzentrationsänderungen ausgesetzt werden, die äquivalent sind einer pulsförmigen Energiezufuhr. Bei der zweiten Art bestimmen die Abstände der Punkte, bei denen Energie zugeführt wird und die Durchflussgeschwindigkeit der Kultur durch die genannte Bahn die Grösse, die bei der ersten Art Zykluszeit genannt wurde. Diese äquivalente Zykluszeit soll im folgenden auch als Zykluszeit bezeichnet werden. Das Verfahren nach der oben beschriebenen zweiten Art kann in den von uns in den GB-PS Nr. 1 353 008,1 417 486 und 1 417 487 und GB-Patentanmeldungen Nr. 35753/74 und 21288/75 Fermentierungsgefässen erfolgen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein erstes Verfahren zum Züchten von Zellen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Zellkultur entlang einer physikalisch begrenzten Bahn bewegt wird, wobei eine Energiequelle von mindestens einer Position aus auf die Kultur einwirkt, wobei einzelne Zellen in der Kultur bei ihrem Durchfluss durch die genannte Bahn Konzentrationsänderungen ausgesetzt werden, die äquivalent sind einer pulsförmigen Energiequelle, in der Weise, dass die Zykluszeit in den ersten Bereich eines Diagramms dieser Zykluszeit als Funktion des Biomassen-Wirkungsverhältnisses unter den auf die Kultur anwendbaren Umgebungsbedingungen, fällt oder in den Teil des zweiten Bereiches des genannten Diagramms, der unmittelbar auf den ersten Bereich folgt und bei dem das Energiewirkungsverhältnis bis zu 15 % des Wertes aus dem ersten Bereich beträgt, fällt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Verfahrens werden einzelne Zellen in der Kultur bei ihrem Durchfluss durch die genannte Bahn Konzentrationsänderungen ausgesetzt, die entweder vernachlässigbar sind oder die äquivalent sind einer pulsförmigen Energiequelle, in der Weise, dass die Zykluszeit entweder 0 ist oder, bei einem gegebenen Wert von il nicht grösser ist als der in nachfolgender Tabelle genannte

JL

Mm grösser als 0,5 0,2

5o,i

0,05

kleiner als 0,02

Zykluszeit (sec)

30 6 4 3

2,5

io

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zi-

kluszeit bei einem gegebenen Wert von — nicht grösser als in

Mm unten stehender Tabelle, wobei die maximale Zykluszeit für Werte von — , die zwischen zwei aufeinander folgenden

15

Werten der unten stehenden Tabelle liegen innerhalb der tabel-lierten Werte für die Zykluszeit linear interpoliert wird:

A

Mm

Zykluszeit (sec)

grösser als 0,5

15

0,2

5

0,1

3,5

0,05

2,5

kleiner als 0,02

2

Mm u.

Wert; die maximalen Zykluszeiten für Werte von — ,die zwischen zwei tabellierten Werten liegen, sollen linear interpoliert werden:

25

Das genannte Verfahren der vorliegenden Erfindung ist geeignet, wenn ein hoher Kohlenstoff-Zelle-Umwandlungsgrad benötigt wird, z.B. in Verfahren zur Herstellung von Einzelzel-30 len-Protein durch Züchten von Mikroorganismen auf einer geeigneten Kohlenstoffquelle, z.B. Methanol. Ein solches Verfahren wird in unterer GB-PS Nr. 1 370 892 beschrieben. Das Verfahren wird in geeigneter Weise in einem Fermentierungsgefäss durchgeführt, wie es in unseren GB-PS Nr. 1 353 008,

35 1 417 486 und 1 417 487 und GB-Patentanmeldungen Nr. 35754/74 und 21288/75 beschrieben wird.

Bei der Durchführung von Verfahren, bei denen ein hoher Kohlenstoff-Zelle-Umwandlungsgrad benötigt wird, in einer Vorrichtung, bei der die Zellkultur entlang einer physikalisch 40 begrenzten Bahn bewegt wird, ist es bevorzugt, die Kohlenstoffquelle kontinuierlich der Kultur zuzuführen, um eine augenblickliche homogene Verteilung der Kohlenstoffquelle zu erreichen. Unter gewissen Umständen kann aus praktischen Gründen dies nicht erreicht werden, z.B. wenn das Substrat eine gut 45 lösliche Flüssigkeit ist und/oder wenn der Organismus eine hohe Affinität für die Energiequelle aufweist. Bei der Durchführung des obgenannten Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt die Energie, z.B. die Kohlenstoffquelle, der Kultur mit einer so kurz wie möglichen Zykluszeit zuzuführen. Vor-50 zugsweise sollte die Zufuhr von einer Mehrzahl von Punkten aus erfolgen. Die Abstände dieser Punkte der Energiezufuhr entlang der genannten Bahn, die eine geeignete Zykluszeit bewirken, sind abhängig von der Durchflussgeschwindigkeit der Kultur durch die genannte Bahn.

55 Schwierigkeiten bei der Zufuhr einer Energiequelle in kontinuierlicher Weise zu einer Kultur können manchmal durch Verwendung von schwerlöslichem Substrat wie einem Alkan, einem langkettigen Alkohol oder einem gasförmigen oder dampfförmigen Kohlenwasserstoff oder durch Modifizieren der 60 Affinität des Organismus für das Substrat, überwunden werden.

Die oben genannten Zykluszeiten sind geeignet für Verfahren für die Herstellung von Einzelzellen-Protein aus Methanol, vorzugsweise unter Verwendung von Stämmen der Species Me-thylophilus methylotrophus (bisher bekannt als Pseudomonas 65 methyltropha), deren Charakteristika in unserer GB-PS 1 370 892 beschrieben werden. Gut geeignete Stämme dieser Species sind die Stämme NCIB Nr. 10508-10515 und 10592— 10596 (äquivalent zu NRRL Nr. B 5352-64 und FERM1215-

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27). Die Durchflussgeschwindigkeit der Zellkultur durch die genannte Bahn und/oder die Zuführungsrate der Energie, z.B. der Kohlenstoffquelle, bei den Zuführungspunkten wird vorzugsweise kontrolliert.

Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein zweites Verfahren zum Züchten von Zellen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Energiequelle kontinuierlich und/oder pulsförmig von einer oder mehreren Positionen aus auf eine Kultur einwirkt, wobei einzelne Zellen in der Kultur einer pulsförmigen Energiequelle oder Konzentrationsänderungen, die äquivalent sind einer pulsförmigen Energiequelle, ausgesetzt werden, wobei die Zykluszeit in den dritten Bereich eines Diagramms dieser Zykluszeit als Funktion des Biomassen-Wirkungsverhältnisses unter den auf die Kultur anwendbaren Umgebungsbedingungen, fällt oder in den Teil des zweiten Bereiches des Diagramms, der unmittelbar vor dem dritten Bereich steht und bei dem das Wirkungsverhältnis bis zu 15 % des Wertes des dritten Bereiches beträgt, fällt.

Eine bevorzugte Ausführungsform des zweiten Verfahrens ist ein Verfahren worin einzelne Zellen in der Kultur einer pulsförmigen Energiequelle oder Konzentrationsänderungen, die äquivalent einer pulsförmigen Energiequelle sind, ausgesetzt werden, wobei die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert von M-

— zwischen dem in unten stehender Tabelle genannten mini-

malen Wert und einem maximalen Wert liegt, bei dem der totale Wirkungsgrad der Kultur abfällt und bei dem einzelne Mikroorganismen in der Kultur abzusterben beginnen, und wobei minimale Werte für die Zykluszeit für Werte von — , die zwischen

H-m zwei benachbarten Tabellenwerten liegen, linear interpoliert werden:

ü

Um grösser als 0,5

0,2

0,1

0,05

0,02

kleiner als 0,01

Zykluszeit (sec)

40 120 230 450 1000 2000

Vorzugsweise liegt die minimale Zykluszeit des zweiten Verfahrens bei einem gegebenen Wert von — bei den nach-

M-m

folgend tabellierten Werten, wobei für Werte von — , die

M-m zwischen zwei benachbarten Tabellenwerten liegen, die minimale Zykluszeit linear interpoliert wird:

ÜL Um grösser als 0,5

0,2

0,1

0,05

0,02

kleiner als 0,01

Zykluszeit (sec)

65 170 350 700 1800 3600

Die genannten Verfahren können zur Herstellung von Ein-zelzellen-Protein verwendet werden, vorzugsweise in Verfahren unter Verwendung von Fermentierungsgefässen wie oben beschrieben in Zusammenhang mit der ersten Darstellung. Die Verfahren sind jedoch besser zur Herstellung von extrazellulären oder intrazellulären Metaboliten, z.B. Zitronensäure, Aminosäuren und antibiotischen Substanzen geeignet.

Im zweiten Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Energie, üblicherweise die Kohlenstoffquelle, vorzugsweise in regulären Perioden zugeführt.

Das zweite Verfahren kann in irgendeinem geeigneten Re-aktionsgefäss wie einem Tank oder in einer Vorrichtung, bei der die Zellkultur entlang eine physikalisch begrenzten Bahn geführt wird, durchgeführt werden. Wenn die Reaktion in einem 5 tankförmigen Gefäss durchgeführt wird, wird die Flüssigkeit oder Energiequelle pulsförmig von einer oder mehreren Positionen aus in die Kultur eingeführt, während bei der Verwendung einer physikalisch begrenzten Bahn, durch die die Zellkultur bewegt wird, die Flüssigkeit oder Energiequelle entlang dieser io genannten Bahn von einer oder mehreren Positionen aus kontinuierlich und/oder pulsförmig zugeführt wird.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist demzufolge in einem weiten Bereich anwendbar und ist überall dort sehr geeignet, wo es um kontinuierliches Züchten von Mikroorganismen geht. Es i5 kann entweder zur Vergrösserung oder zur Verkleinerung des Wirkungsgrades der Zellproduktion, ausgedrückt als Energieverbrauch, je nach Typ des Verfahrens bei dem es zur Anwendung gelangt, verwendet werden. Für die Herstellung von Ein-zelzellen-Protein oder Zellmetaboliten sollte dieser genannte 20 Wirkungsgrad maximiert werden, während bei der Anwendung in der Behandlung von Abwassern und bei der Herstellung von organischen Lösungsmitteln dieser Wirkungsgrad minimalisiert werden soll.

Die genannte Energiequelle ist in geeigneter Weise eine 25 Kohlenstoffquelle. Bei photosynthetischen Reaktionen kann sie jedoch auch eine Lichtquelle sein und bei Kulturen, die Wasserstoff als Energiequelle benötigen, kann sie auch Wasserstoff sein oder sie kann bei anderen chemolithotropen Mikroorganismen irgend eine andere reduzierte anorganische Energiequelle 30 sein.

Die Experimente, die wir durchgeführt haben und die den Diagrammen in Fig. 1-3 zugrunde liegen, waren im wesentlichen von vier verschiedenen Arten:

1. Experimente, bei denen eine Kultur von Mikroorganis-35 men in einem System, bestehend aus einem Paar von verbundenen identischen Fermentationsgefässen zirkulierte. Eine Kohlenstoffquelle wurde auf verschiedene Weise in die Kultur eingeführt:

(a) mit gleicher Zuflussrate bei beiden Fermentationsge-40 fässen.

(b) nur in ein Fermentationsgefäss.

(c) in beide Fermentationsgefässe, jedoch mit unterschiedlicher Zuflussrate.

2. Experimente, bei denen eine Kohlenstoff quelle pulsför-45 mig in einer Serie von verschiedenen Arten in eine Zellkultur,

die sich in einem Standard-Labor-Fermentationsgefäss von 2 Liter Inhalt befand, eingeführt wurde.

3. Experimente, bei denen eine Kohlenstoffquelle kontinuierlich von einer Reihe von Positionen aus in ein zirkuläres Fer-

50 mentationsgefäss von 50 000 Liter Inhalt eingeführt wurde.

4. Experimente, bei denen Abwasser in ein zirkuläres aktiviertes System mit 20 000 Liter Inhalt eingeführt wurde.

Bei einer kontinuierlichen Kultur, bei der ein im Wachstum begriffener Organismus zusammen mit einer Kohlenstoff und/ 55 oder Energiequelle zugeführt wird, so dass Perioden von Energiemangel auftreten, glauben wir, dass wenn die Energie nach einer solchen Periode von Energiemangel zugeführt wird, ein Teil dieser zugeführten Energie in einer Adaptationsphase von den Zellen verbraucht wird und demzufolge nicht für das eigent-60 liehe Wachstum zur Verfügung steht. Dies resultiert in einem Absinken des totalen Wirkungsgrads der Produktion von Biomasse, ausgedrückt als konsumierte Energie über eine längere Zeitdauer.

Wir vermuten, dass Zellen, die einer kontinuierlichen Ener-65 giezufuhr wie z.B. in Form einer Kohlenstoffquelle ausgesetzt sind, sich bezüglich ihres Wachstums in einem Gleichgewichtszustand befinden, bei dem die Metabolitenkonzentrationen und Enzymaktivitäten sich entsprechend der wirksamen Biomassen-

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bildung auf einem konstanten Niveau befinden. Kulturen von dieser Art können dadurch in ihrem Wachstum gebremst werden, dass die Energiezufuhr pulsförmig erfolgt, d.h. dass zwischen zwei Energiezufuhren Perioden auftreten, während denen keine Energie zugeführt wird. Das der Beschreibung von Kulturen dieser Art dienende Wirkungsverhältnis kann in der folgenden vereinfachten Gleichung ausgedrückt werden:

X/(X+fY jim/jxt)

worin X abhängig ist von der Energie, die für Biosynthese unter Gleichgewichtswachstumsbedingungen mit einer Rate von |xm notwendig ist, worin Y abhängig ist von der Energie, die benötigt wird, um den metabolischen Apparat nach einer Periode ohne verfügbare Energie zu reorganisieren, worin t die wie oben definierte Zykluszeit bedeutet und worin f einen Faktor zwischen 0 und 1,0 darstellt, der aussagt, welcher Anteü von Reorganisations-Energie nötig ist als Funktion der Zeit, während der keine exogene Energie verfügbar war.

Wenn der Quotient

klein ist, nähert sich das Wirkungsverhältnis dem Wert 1. Dies kann erreicht werden durch: Vergrössern von [X bei konstantem |xm; Verkleinern von (im bei konstantem ix oder durch den Wert der Funktion f, die abhängig ist von der Zykluszeit. Diese Funktion f ist eine komplexe Funktion, die den Anteil der Metaboliten beschreibt, der während einer Periode ohne verfügbare exogene Energie abgebaut wird und enthält: Geschwindigkeitskonstanten (k) für den Metabolismus, eine Ansprechzeit (tr) zwischen total verbrauchter Energie und Einsetzen des metaboliten Abbaus, die totale Zykluszeit (t) und den proportionalen Wachstumsfaktion n/iv

Unter der Voraussetzung, dass nach Beendigung der Energiezufuhr der Organismus während der Ansprechszeit (tr) unverändert bleibt und dass anschliessend die Metaboliten mit einer Rate, entsprechend ihrer Konzentration abgebaut werden, kann gezeigt werden, dass:

f=l-exp (ktr-kt (1—fx/[xm))

(vorausgesetzt, dass f=0 substituiert wird, wenn Werte kleiner 0 erhalten würden).

Diese Funktion stellt nur eine Approximation dar, gibt jedoch den tatsächlichen Verlauf gut wieder, mit Ausnahme des Endes der Ansprechzeit, wo ein augenblicklicher Wechsel von 0 auf einen endlichen Wert für die Rate des Metabolitverbrauchs vorausgesagt wird. Dies steht nicht in Übereinstimmung mit unseren Vorstellungen von mikrobiologischen Systemen, so dass eine Korrektur für die oben genannte Funktion in diesem Bereich nötig war.

Wenn der Wert von f in die folgende Gleichung eingeführt wird:

Wirkungs Verhältnis = X/(X+fY[xm/[Xt)

beschreibt die Funktion eine Reihe von Kurven, die in Fig. 2 dargestellt sind. Alle unsere Daten waren in Übereinstimmung mit diesen Kurven.

In Fig. 1 wird der erste Bereich des oben beschriebenen Diagramms wie folgt interpretiert. Bei diesen sehr kurzen Zykluszeiten ist der Einfluss der Ansprechszeiten des Organismus so, dass der Wert von f gegen 0 geht und das Wirkungsverhältnis bei einem Maximum liegt. Im zweiten Bereich des Diagramms ist f grösser, weil die Zykluszeit hier grösser wird als die Ansprechzeit des Organismus und demzufolge das Wirkungsverhältnis abnimmt. Wenn jedoch t weiter zunimmt, nimmt der Einfluss von f auf die Gleichung ab und t erhält dominierenden Einfluss mit dem Ergebnis, dass das Wirkungsverhältnis grösser wird. In diesem Bereich ist das typische Diagramm für reguläre Pulse verschieden von demjenigen für irreguläre Pulse wie in Fig. 3. Für reguläre Pulse wird der Punkt des Wiedererreichens eines konstanten Wertes in Richtung auf kürzere Zykluszeiten 5 verschoben. Die Ursache dafür liegt wahrscheinlich darin, dass die natürlichen Oszillationen von regulärer Frequenz die Zellen für die Regulierung der metabolischen Aktivität benützen,

durch die pulsförmige Substratzufuhr mit konstanter Frequenz simuliert werden können. Wenn irreguläre Pulse für die Sub-îostratzufuhr verwendet werden, wird die natürliche konstante Frequenz von metabolischen Oszillationen zerstört und zufällige Variationen in der Aktivität treten auf. Experimente mit Kulturen, mit Wachstum auf der Basis einer einzelnen Energiequelle (Proteinorganismen) auf Methanol und gemischte Kulturen 15 (Prokaryoten und Eukaryoten) mit Wachstum, basierend auf einer gemischten Energiequelle, zeigen, dass Theorie und Praxis mit dem obenstehend hergeleiteten mathematischen Modell in Übereinstimmung waren. Wir glauben, dass diese Theorie auf die meisten Systeme anwendbar ist, in denen Mikroorganismen 20 unter Energie limitierenden Bedingungen wachsen, und wir nannten das Modell deshalb «Reorganisation Energy Loss Theory».

Beispiel 1

Eine Kultur von Methylophilus methylotrophus wurde in 25 einem kleinen zyklischen Druck-Fermentierungsgefäss (wie in GB-PS Nr. 1 353 008 beschrieben) mit 165 1 Flüssigkeitsvolumen bei 40 °C und D=0,25h"1 gezüchtet. Das Medium war dasselbe wie das, als Medium I bezeichnete in GB-PS 1 370 892. Die Zirkulationsrate im Fermentationsgefäss betrug 30 30 m3h-1, was in einer mittleren Zirkulationszeit von 20 sec resultierte. Das Trockengewicht der Zellen war abhängig von der Zuflussrate von Methanol, so dass 14 g/1 der Gleichgewichtskonzentration von trockenen Zellen entsprach. Rund um das Fermentationsgefäss waren 5 Punkte mit Methanolzufuhr 35 angeordnet, wobei die Zuflussrate von Methanol proportional war zum Volumen von Flüssigkeit in entsprechenden Teil des Fermentationsgefässes.

Die physikalische Verteilung der Methanolzugabe war so, dass die zirkulierenden Zellen einem ständigen Wechsel von 40 Substratgegenwart und -abwesenheit mit der Frequenz von 3 sec oder der Frequenz von 20 sec ausgesetzt waren, wenn alles Methanol von einem einzelnen Punkt ins Fermentationsgefäss zugeführt wurde.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 genannt.

45

Tabelle 1

Methanolzugabe, C zu Zykluszeit Zellen1

C zu CO,2 C zu S/N3

50

20 sec 3 sec

57,8 65,1

38,6 30,9

4,3 3,2

1. C zu Zellen bedeutet den Anteü von Methanol-Kohlen-55 stoff, der in die Zellen eingebaut wurde.

2. C zu C02 bedeutet den Anteil von Methanol-Kohlenstoff, der in C02 eingebaut wurde.

3. C zu S/N bedeutet den Anteil von Methanol-Kohlenstoff, der in überstehenden Kohlenstoff umgewandelt wurde.

60 Beispiel 2

In einem Laborfermentationsgefäss (Flüssigkeitsvolumen von 1,5 1 und Gleichgewichtszustand Trockengewicht von 10 g/ 1) wurde kontinuierlich eine Kultur von Methylophilus methyl-trophus bei verschiedenen Verdünnungsraten und bei konstan-65 ter Durchflussrate des Mediums gezüchtet. Ein separates Zuführungssystem für Methanol wurde verwendet, so dass genügend Methanol z.B. für 3 sec Wachstum bei (x=0,2h_1 in einem Puls von 0,3 sec Dauer zugeführt werden konnte. Dieses Ver-

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hältnis von Zuführungszeit über totaler Zykluszeit wurde für alle verschiedenen Zykluszeiten auf 1:10 gehalten. Die Zusammensetzung des Mediums und die Bedingungen für das Wachstum waren identisch wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

0,20

Tabelle 2

Verdünnungsrate (h"1)

0,07

Zykluszeit (sec) *C in Zellen (%)

2,75 5,5 11,0 22,0

56.2

49.3 47,5 42,3

1,0

64,4

2,0

62,4

2,5

61,0

3,0

59,5

4,0

54,5

8,0

53,0

11,0

47,1

20,0

46,2

33,0

48,8

2,75

62,1

5,5

61,5

io 0,4

*Gew.-% Methanol-Kohlenstoff, der in Zellen eingebaut wurde.

Der Kohlenstoffgehalt der Zellen bleibt während dem ganzen Experiment konstant.

C

1 Blatt Zeichnungen

Claims (15)

1. 637 424

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zum Züchten von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zellkultur über eine physikalisch begrenzte Bahn geleitet wird, wobei eine Energiequelle an mindestens einer Position auf die Kultur einwirkt, und wobei einzelne Zellen in der Kultur bei ihrem Durchfluss durch die genannte Bahn Konzentrationsänderungen ausgesetzt werden, die äquivalent sind zu einer pulsförmigen Energiequelle in der Weise, dass die Zykluszeit in den ersten Bereich eines Diagramms der Zykluszeit als Funktion des Biomassen-Wirkungsverhältnisses unter den Umgebungsbedingungen die anwendbar auf die Kultur sind, fällt oder in den Teil des zweiten Bereiches des genannten Diagramms, der unmittelbar auf den ersten Bereich folgt und bei dem das Energiewirkungsverhältnis innerhalb 15% des Wertes für den ersten Bereich beträgt, fällt.
2. 2. Verfahren zum Züchten von Zellen gemäss Anspruch 1, wobei einzelne Zellen in der Kultur bei ihrem Durchfluss durch die genannte Bahn Konzentrationsänderungen ausgesetzt werden, die äquivalent sind zu einer pulsförmigen Energiequelle in der Weise, dass die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert von

   ^ nicht grösser als der in nachfolgender Tabelle gegebe-Mm ne Wert ist; wobei die maximalen Zykluszeiten für Werte von —-— , die zwischen zwei der nachfolgend genannten Tabellenwerte fallen, linear interpoliert werden zwischen den entsprechenden benachbarten Zykluszeiten:

   —-— Zykluszeit (sec)

   Mm grösser als 0,5 30 0,2 6 0,1 4 0,05 3 kleiner als 0,02 2,5
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert von — nicht grösser ist als der in un-

   Mm ten stehender Tabelle genannte und wobei die maximale Zy-

   kluszeit für Werte von — zwischen zwei benachbarte Tabel-Mm lenwerte fallen, bei den entsprechenden benachbarten Tabellenwerten für die Zykluszeit linear interpoliert werden:

   —— Zykluszeit (sec)

   Um grösser als 0,5 15

   0,2 5

   0,1 3,5

   0,05 2,5

   kleiner als 0,02 2
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, zur Herstellung eines Einzelzellen-Proteins, durch Züchtung von Mikroorganismen auf einer Kohlenstoffquelle.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die genannte Kohlen-stoffquelle Methanol ist.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, worin die genannte Energiequelle von einer Mehrzahl von Punkten rund um die Bahn auf die Kultur einwirkt.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen zu der Art Methylophilus methylotrophus, die früher als Pseudomonas methylotropha bekannt waren, gehören.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die genannten Zellen zu einem der Stämme NCIB Nr. 10508-10515 und 10592-10596 gehören.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Energiequelle eine Kohlenstoffquelle ist.
10. 10. Verfahren zur Züchtung von Zellen, dadurch gekenn-

    5 zeichnet, dass eine Energiequelle kontinuierlich und/oder puls-förmig von mindestens einer Position aus auf eine Zellkultur einwirkt, wobei einzelne Zellen in der Kultur einer pulsförmigen Energiequelle oder Konzentrationsänderungen, die äquivalent zu einer pulsförmigen Energiequelle ausgesetzt werden, io wobei dièse Energiequelle von der Art ist, dass ihre Zykluszeit in den dritten Bereich eines Diagramms der Zykluszeit als Funktion des Biomassen-Wirkungsverhältnisses unter den auf die Kultur anwendbaren Umgebungsbedingungen fällt oder in den Teil des zweiten Bereiches des Diagramms, der unmittelbar 15 vor dem dritten Bereich liegt und bei dem das Wirkungsverhält-nis bis zu 15 % des Wertes des dritten Bereiches beträgt, fällt.
11. 11. Verfahren zur Züchtung von Zellen gemäss Anspruch 10, worin die einzelnen Zellen in der Kultur einer pulsförmigen Energiequelle oder Konzentrationsänderungen, die äquivalent

    20 zu einer pulsförmigen Energiequelle sind, ausgesetzt werden,
12. u.

    wobei die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert von — in

    Mm den Bereich zwischen dem in nachfolgender Tabelle genannten Minimum und einem maximalen Wert fällt, bei dem die Total-25 ausbeute der Zellkultur abnimmt und einzelne Mikroorganismen absterben, und wobei entsprechende minimale Werte für

    IX

    die Zykluszeit von Werte von — , die zwischen zwei benach-

    Mm harten Tabellenwerten liegen aus den entsprechenden benach-30 barten Tabellenwerten für die Zykluszeit linear interpoliert werden:

    — Zykluszeit (sec)

    35 grösser als 0,5 40

    0,2 120

    0,1 230

    0,05 450

    0,02 1000

    40 kleiner als 0,01 2000.
13. 12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die minimale Zy-
14. N.

    kluszeit bei einem gegebenen Wert von — dem nachfolgend

    Mm

    45 tabellierten Wert entspricht und wobei die minimale Zykluszeit für Werte von — ,die zwischen zwei benachbarte Werte der Mm unten stehenden Tabelle fallen, entsprechend linear interpoliert werden:

    50

    — Zykluszeit (sec)

    Mm grösser als 0,5 65

    0,2 170

    55 0,1 350

    0,05 700

    0,02 1800

    kleiner als 0,01 3600.

    60 13. Verfahren nach Ansprüchen 10-12 zur Herstellung von extrazellulären oder intrazellulären Metaboliten.
15. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-13, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Energiequelle eine Kohlenstoffquelle ist.

    65