CH637629A5 - Verfahren zur herstellung von polypeptiden. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden durch schrittweise Kondensation von gegebenenfalls Schutzgruppen tragenden Aminosäuren in der gewünschten Sequenz an einem festen, phenylgruppenhaltigen Trägermaterial und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung des antiinflammatorisch wirkenden, Mastzellen degranulierenden Peptids MCD.

Es ist seit langem bekannt, Peptide durch schrittweises Zusammenfügen von Aminosäuren in der Lösung zu bilden. Als wesentlich erfolgreicher hat sich jedoch die 1962 von Merrifield angegebene Festphasen-Peptidsynthese [Fed. Proc., Fed. Amer. Soc. Exp. Biol. 21 (1962) 412] erwiesen, gemäss der die Kondensation der einzelnen Aminosäuren an einem festen Trägermaterial (vorzugsweise schwach ver-netztem Polystyrol) durchgeführt wird, bis zum Schluss das fertige Polypeptid vom Träger abgespalten wird. Der Vorteil der Merrifield-Synthese ist in dem Arbeiten in heterogener Phase zu sehen, wodurch es ohne weiteres möglich wird, die bei der Peptidsynthese eingesetzten Reagenzien sehr einfach von dem an das Trägermaterial gebundenen eigentlichen Syntheseprodukt abzutrennen. Der Nachteil dieser Merri-field-Synthese ist darin zu sehen, dass naturgemäss die für die sequentielle Peptidsynthese angewandten chemischen Reaktionen nicht quantitativ ablaufen, so dass die Umsetzung zum Teil nicht in dem gewünschten Sinne verläuft, wodurch gleichzeitig verunreinigende Peptide synthetisiert werden, die sich nur ausserordentlich schlecht abtrennen lassen. Insbesondere bei längeren Aminosäuresequenzen von 50 und mehr Aminosäuren ergeben sich selbst bei 99%iger Wirksamkeit der Einzelschritte wegen der Vielzahl der Reaktionen neben dem angestrebten Peptid eine immense Zahl von Nebenprodukten, die entweder kürzere Aminosäureketten aufweisen oder Fehler in der Aminosäuresequenz besitzen können.

Es besteht daher ein erhebliches Bedürfnis dafür, die an sich verfahrenstechnisch einfache Merrifield-Synthese derart zu verbessern, dass es ohne weiteres möglich wird, auch höhermolekulare Peptide mit einer Vielzahl von Aminosäuren in der Kette zu bilden, die keine oder nur geringe Mengen von unerwünschten Nebenprodukten enthalten.

Es wurde nunmehr gefunden, dass es gelingt, Polypeptide durch schrittweise Kondensation von Aminosäuren nach der Merrifield-Festphasentechnik in einfacher Weise mit hoher Reinheit und geringer Bildung von Nebenprodukten herzustellen, in dem man ein in bestimmter Weise aktiviertes Trägermaterial einsetzt, mit einer bestimmten Schutzgruppe N-terminal geschützte Aminosäuren bzw. Peptidfragmente verwendet und zunächst Unterfragmente des letztendlich zu bildenden Endpeptids an dem Trägermaterial aufbaut, abspaltet, reinigt, wieder an das Trägermaterial bindet und mit einem oder mehreren weiteren Teilfragmenten des Endpeptids vereinigt.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird daher durch ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden durch schrittweise Kondensation von gegebenenfalls Schutzgruppen tragenden Aminosäuren in der gewünschten Sequenz an einem festen, phenylgruppenhaltigen Trägermaterial gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein mit Bromacetylbromid'unter Bildung von Bromacetylphenylgruppen aktiviertes, schwach vernetztes Trägermaterial verwendet, Aminosäuren mit N-terminaler a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonylgruppe oder entsprechend N-terminal geschützte Peptidfragmente einsetzt, die gebildeten Peptidfragmente im Verlaufe der Synthese von dem Trägermaterial abspaltet, von verunreinigenden Nebenprodukten abtrennt und zur weiteren Synthese erneut an das Trägermaterial bindet.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren werden die Aminosäuren bzw. die Peptidfragmente über die an dem Trägermaterial vorliegenden Bromacetylgruppen an das Trägermaterial gebunden, wodurch eine relativ leicht lösbare Bindung erreicht wird, die unter der Einwirkung von sauren und insbesondere basischen Reagenzien gespalten werden kann, beispielsweise unter Verwendung von Trifluoressigsäure und Bromwasserstoff in organischen Lösungsmitteln, von flüssigem Fluorwasserstoff, oder durch basenkatalysierte Umesterung, durch basische Hydrolyse, durch Hydrazino-lyse oder insbesondere und bevorzugt durch Ammonolyse.

Mit Hilfe dieser leicht spaltbaren Bindung an das Trägermaterial wird es möglich, die gebildeten Peptidfragmente unter Erhalt der sonst vorhandenen Schutzgruppen wieder abzuspalten, Verunreinigungen zu entfernen, Analysen durchzuführen und die einzelnen Peptidfragmente wieder an das Trägermaterial zu binden und weiter aufzubauen bzw. zu dem gewünschten Peptid zu vereinigen. Dabei hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, als N-terminale Schutzgruppe für die Aminosäuren bzw. Peptidfragmente die

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a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxy-benzyloxycarbonylgruppe einzuführen, die als solche und auch in Form ihrer Spaltprodukte ohne weiteres mit Hilfe von optischen Methoden bestimmt werden kann, so dass es in dieser Weise gelingt, den Ablauf der Peptidsynthese in einfacher Weise photometrisch zu überwachen und zu steuern.

Da bei der Bindung der ersten Aminosäuren an das aktivierte, Bromacetylphenylgruppen aufweisende Trägermaterial unerwünschte Nebenreaktionen, wie eine cyclolartige Umwandlung des C-terminalen Rests oder eine Diketopipe-razinabspaltung, werden einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens zufolge entweder Peptidfragmente aus wenigstens drei Aminosäuren oder als erste Aminosäure Isoleucin, Leucin, Valin bzw. die an der Mercaptogruppe bzw. der Aminogruppe geschützten Aminosäuren Cystein und Lysin, bei denen diese Nebenreaktionen nicht auftreten können, an das aktivierte Trägermaterial gebunden.

Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden mehrere verschiedene Peptidfragmente des gewünschten Polypeptids unabhängig voneinander her-5 gestellt, vom Trägermaterial abgespalten, worauf nach der Abtrennung von verunreinigenden Nebenprodukten und Reagenzien jeweils zwei in der angestrebten Sequenz benachbarte Peptidfragmente miteinander kondensiert werden, wozu man mindestens eines dieser Fragmente in der oben io angegebenen Weise wieder an das Trägermaterial bindet, bevor man die Kondensation unter Bildung des gewünschten Endpeptids durchführt.

Einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zufolge ist das Verfahren auf die Herstellung des phar-15 makologisch äusserst interessanten, weil antirheumatischen und entzündungshemmenden, Mastzellen degranulierenden Peptids MCD der folgenden Formel

Ile-Lys-Cys-Asn-Cys-Lys-Arg-His-Val-Ile-Lys-Pro-His-Ile-Cys-Arg-Lys-Ile-Cys— l 1 1 I

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■Gly-Lys-Asn-NH2

gerichtet, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man zunächst getrennt die Peptidfragmente I [Ddz-Ile-Lys(Z)-Cys(Acm)-Asn-Cys(StBu)-Lys(Z)-Arg(Tos)], II [Ddz-His(Boc)-Val-Ile-Lys(Z)], III [Ddz-Pro-His-Ile-Cys(Acm)] und IV [Ddz-Arg(Tos)-Lys(Z)-Ile-Cys(StBu)-Gly-Lys(Z)-Asp(OBzl)] bildet, die Fragmente I und II bzw. III und IV zu den Fragmenten V [Ddz-Ile-Lys(Z)-Cys(Acm)-Asn-Cys(StBu)-Lys(Z)-Ars(Tos)-His(Boc)-Val-Ile-Lys(Z)] und VI [Ddz-Pro-His-Ile-Cys(Acm)-Ars(Tos)-Lys(Z)-Ile-Cys(StBu)-GIy-Lys(Z)-Asp(OBzl)] vereinigt und schliesslich die Fragmente V und VI zu dem geschützten, an das Trägermaterial gebundenen Peptid VII [Ddz-Ile-Lys(Z)-Cys(Acm)-Asn-Cys(StBu)-Lys(Z)-Arg(Tos)-His(Boc)-Val-Ile-Lys(Z)-Pro-His-Ile-Cys(Acm)-Arg(Tos)-Lys(Z)-Ile-Cys(StBu)-Gly-Lys(Z)-Asp(OBzl)] vereinigt, das Peptid VII von dem Träger abspaltet und in an sich bekannter Weise die Schutzgruppen abspaltet und die Cys5Cys19- und Cys3-Cysl5-Disulfidbrücken ausbildet.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird als Trägermaterial ein schwach vernetztes und damit quellfähiges phe-nylgruppenhaltiges Trägermaterial eingesetzt, wozu man insbesondere ein Polystyrolgel verwendet, das mit weniger als 0,5% Divinylbenzol vernetzt worden ist. Dieses Trägermaterial wird durch Umsetzen mit Bromacetylbromid aktiviert, wodurch Bromacetylgruppen in das Polystyrolgel eingeführt werden. Diese funktionellen Gruppen ermöglichen das leichte Binden der für den Peptidaufbau benötigten Aminosäuren bzw. Peptidfragmente über das entsprechende C-ter-minale Ende. Hierbei reagiert die Carboxylatgruppe der Aminosäure bzw. des Peptidfragments unter Bromid-Abspaltung und bildet eine Estergruppe an der Acetophenylgruppe des polymeren Trägers aus, die ohne weiteres insbesondere unter basischen Bedingungen wieder gespalten werden kann. Dabei können je nach der gewünschten Gruppe an dem abgespaltenen Peptidfragment verschiedene basische Methoden, die an sich aus der Peptidchemie bekannt sind, angewandt werden, beispielsweise die Hydrolyse, wenn Carboxyl-gruppen gebildet werden sollen, die Hydrazinolyse, wenn Hydrazingruppen, die sich in Azidgruppen umwandeln lassen, gebildet werden sollen und die Spaltung mit Ammoniak unter Bildung von Amidgruppen. Die Ammonolyse führt man vorzugsweise in der Weise durch, dass man ein mit Ammoniak gesättigtes organisches Lösungsmittel, insbesondere Dioxan, als Abspaltungsreagens verwendet. Man kann jedoch auch mit Vorteil eine mit Ammoniak bei 0°C gesättigte Dimethylformamid/Methanol-Mischung (4/1, Volumen/Volumen) oder eine 10%ige Lösung von Ammoniak in einer Dioxan/Methanol-Mischung (9/1, Volumen/ Volumen) einsetzen.

Das erfindungsgemäss verwendete Trägermaterial besitzt die für die angestrebte Festphasensynthese notwendigen Eigenschaften, nämlich die notwendige Unlöslichkeit in den verwendeten Lösungsmitteln, eine mechanische Stabilität und eine ausreichende chemische Inertheit gegenüber den eingesetzten Reagenzien. Dabei liegt das Trägermaterial vorzugsweise in Form von kleinen Kügelchen mit einem Durchmesser von vorzugsweise 0,1 bis 0,2 mm vor.

Wegen der mechanischen Empfindlichkeit dieser Träger^ materialgelkügelchen arbeitet man vorzugsweise in einem Zentrifugalreaktor, in dem die Gelkügelchen an einer porösen Rotorwandung unter der Einwirkung der sich durch die Rotation ergebenden Zentrifugalkräfte festliegen und dabei von den flüssigen Reagenzien durchströmt werden, wodurch eine weitgehend quantitative Umsetzung bei den Einzelschritten erreicht werden kann.

Die bei dem erfindungsgemässen Verfahen eingesetzten Aminosäuren bzw. Peptidfragmente sind N-terminal mit der a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxy-benzyloxycarbonylgruppe (Ddz-Schutzgruppe) geschützt, die wesentlich säurelabiler ist als die bislang häufig in der Peptidchemie verwendete tert.-Butyloxycarbonylgruppe (Boc-Schutzgruppe). Diese Schutzgruppe und damit versehene Aminosäuren sind bereits in Peptides (1972) Seiten 72 bis 77 beschrieben worden. Mit dieser Schutzgruppe geschützte Aminosäuren sind in fester Form und auch in Form von Lösungen gegen Autoacidolyse stabil und werden dadurch hergestellt, dass man die Aminosäuren mit dem Hydrazid- bzw. Azid-Derivat der Schutzgruppenverbindung umsetzt.

Der grosse Vorzug dieser erfindungsgemäss verwendeten Schutzgruppe ist darin zu sehen, dass sie relativ einfach unter sauren Bedingungen abgespalten werden kann, beispielsweise unter Verwendung von Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoffsäure in organischen Lösungsmitteln, wie Dichlor-methan, Chloroform, Dimethylsulfoxid und Mischungen davon. Vorzugsweise verwendet man eine 0,5- bis 10%ige Lösung von Trifluoressigsäure in trockenem Dichlormethan. Bei Anwendung dieses Spaltungsreagens wird die Schutzgruppe in Abhängigkeit von der gewählten Verdünnung der Trifluoressigsäure im Verlaufe von 5 bis 30 Minuten bei 20°C vollständig abgespalten. Mit vorzugsweise 5%iger Trifluores-

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sigsäure wird die Ddz-Schutzgruppe von trägergebundenen Ddz-Peptiden im Verlaufe von 15 Minuten und vorzugsweise im Verlaufe von etwa 8 Minuten von Ddz-Peptiden in Lösung abgespalten.

Ein weiterer Vorzug ist darin zu sehen, dass die Schutzgruppe als auch die aus ihr gebildeten Spaltprodukte 3,5-Dimethoxy-a-methylstyrol und 3,5-Dimethoxyphenyldi-methylcarbinol bei 230 und bei 280 nm charakteristische UV-Banden zeigen, die es ermöglichen, den Syntheseablauf photometrisch zu überwachen und zu steuern, indem man die Reaktionslösungen im Kreislauf durch den oben erwähnten Zentrifugalreaktor und ein UV-Spektrophotometer führt, der es ermöglicht, über die angegebenen UV-Banden der Schutzgruppen bzw. ihrer Spaltprodukte den Reaktionsablauf ständig zu verfolgen und zu überwachen. Hierdurch kann ohne weiteres festgestellt werden, wann die Reaktion der zuletzt angefügten Aminosäure bzw. des zuletzt eingeführten Peptidfragments im wesentlichen vollständig abgelaufen ist.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird ein vorzugsweise mit weniger als 0,5% Divinylbenzol vernetztes Polystyrol als Trägermaterial verwendet, das durch Umsetzen mit Bromacetylbromid in Nitrobenzol mit Bromacetylphenylgruppen versehen und damit aktiviert worden ist. Diese Bromacetylierung kann durch Aluminiumchlorid katalysiert und bei Raumtemperatur durch Umsetzen während 20 Stunden durchgeführt werden, wobei man ein Trägermaterial mit 0,05 bis 5 und vorzugsweise 0,5-1,1 Milliäquivalenten reaktiver Bromacetylphenylgruppen pro Gramm erhält.

Dann werden die N-terminal mit der a,a-DimethyI-3,5-dimethoxy-benzyloxycarbonylgruppe geschützten Aminosäuren bzw. Peptidfragmente an das in dieser Weise aktivierte Trägermaterial gebunden, was vorzugsweise dadurch erreicht wird, dass man die geschützten Aminosäuren bzw. Peptidfragmente über die entsprechenden Cäsiumsalze der Carboxylgruppen einführt. Dabei verwendet man die lipo-philen Cäsiumsalze der Aminosäuren bzw. Peptidfragmente in Dimethylformamid in einem geringfügigen Überschuss, um basenkatalysierte Racemisierungen und Nebenreaktionen zu vermeiden. Bereits bei einem Überschuss der Cäsiumsalze von lediglich 50% ergibt sich eine vollständige Umsetzung nicht nur von N-terminal geschützten Aminosäuren, sondern auch von Di- und Tripeptiden unter identischen Bedingungen mit den an dem Trägermaterial vorliegenden Bromacetylgruppen. Zur Einführung der Aminosäuren bzw. Peptidfragmente in das Trägermaterial kann man auch anstelle der Cäsiumsalze Tetraalkylammonium-salze verwenden, da diese quartären Kationen ebenfalls einen lipophilen Charakter besitzen. Insbesondere verwendet man die entsprechenden Triäthylammoniumsalze. In jedem Fall lässt sich in dieser Weise eine vollständige Umwandlung der Bromacetylphenylgruppen des Trägermaterials erreichen.

Nach dem üblichen Auswaschen der Reaktionsteilnehmer und der Verunreinigungen werden die N-terminalen a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxy-benzyloxycarbonyl-Schutz-gruppen durch Acidolyse abgespalten, vorzugsweise durch Umsetzen mit einer 5%igen Lösung von Trifluoressigsäure in Dichlormethan. Nach dem Waschen des Trägermaterials wird eine Deprotonierung der durch Protonen blockierten N-terminalen Aminogruppen bewirkt durch Umsetzen mit tertiären Aminen, wie Triäthylamin, Diisopropyläthylamin oder N-Methylmorpholin, in organischen Lösungsmitteln,

wie Dichlormethan, Chloroform oder Dimethylformamid. Nach dem erforderlichen Waschen wird dann die nächste N-terminal geschützte Aminosäure bzw. das nächste N-ter-minal geschützte Peptidfragment unter Ausbildung einer 5 Peptidbindung angekoppelt. Diese Peptidbindung wird in an sich bekannter Weise erreicht, beispielsweise unter Aktivierung mit Dicyclohexylcarbodiimid, unter Einsatz symmetrischer oder gemischter Aminosäureanhydride, unter Verwendung aktiver Ester, durch Redoxkondensation oder der-io gleichen. Anschliessend wird nach dem Freiwaschen des Trägermaterials von Reagenzien die weitere Anfügung der nächsten Aminosäure der gewünschten Sequenz oder eines weiteren Peptidfragments in der angegebenen Weise durchgeführt, bis schliesslich ein Peptidfragment ausreichender 15 Grösse an dem Trägermaterial vorliegt.

Erfindungsgemäss werden die gebildeten Peptidfragmente im Verlaufe der Synthese von dem Trägermaterial abgespalten, was mit Hilfe der oben angegebenen Spaltungsreagenzien und insbesondere durch basische Hydrolyse, vor-20 zugsweise durch Ammonolyse erreicht wird. Nach dem Entfernen von Verunreinigungen, wie Nebenprodukten und Reagenzien, werden die erhaltenen reinen Peptidfragmente erneut, vorzugsweise in Form der Cäsiumsalze, an ein frisches, Bromacetylphenylgruppen aufweisendes Trägermate-25 rial gebunden, wonach weitere N-terminal mit a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxy-benzyloxycarbonyl-Schutzgruppen geschützte Aminosäuren bzw. Peptidfragmente ankondensiert werden, bis das gewünschte Endpeptid an dem Trägermaterial vorliegt, von dem es in üblicher Weise abgespalten, 30 dann isoliert und gereinigt wird.

In dieser Weise gelingt es insbesondere durch zwischenzeitliches Abspalten der Peptidfragmente, Reinigen dieser Peptidfragmente und Vereinigen der gewünschten Peptidfragmente in der angestrebten Sequenz, die gewünschten End-35 peptide weitgehend frei von Nebenprodukten, wie kürzerket-tigen Peptiden oder Peptiden mit Sequenzfehlern, zu synthetisieren. Dies gelingt mit dem erfindungsgemässen Verfahren dadurch, dass die gebildeten Peptidfragmente ohne weiteres und insbesondere ohne Abspaltung der vorhandenen Schutz-40 gruppen von dem Trägermaterial abgespalten und auf den Zwischenstufen der Synthese bereits von gebildeten Verunreinigungen befreit werden können und weil schliesslich wegen der erfindungsgemäss eingesetzten besonderen Schutzgruppe, nämlich der a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxyben-45 zyloxycarbonyl-Schutzgruppe eine ständige photometrische Überwachung des Reaktionsablaufes sichergestellt ist, so dass eine praktisch quantitative Umsetzung in den einzelnen Kondensationsstufen erreicht werden kann.

Im folgenden sei die Erfindung näher anhand der bevor-50 zugten Verfahrensweise zur Herstellung des Mastzellen degranulierenden Peptids MCD erläutert, das als Bestandteil des Bienengifts bekannt ist und bereits in üblicher Weise in der Lösung synthetisiert worden ist. Dieser stark basische Bienengiftbestandteil ist von besonderem Interesse, da er 55 pharmakologisch zur Bekämpfung von rheumatischen Erkrankungen verwendet werden kann, so dass seine synthetische Herstellung in starkem Masse erwünscht ist.

Diese Synthese des MCD-Peptids sei im folgenden anhand der beigefügten Zeichnung näher erläutert, die in der ein-60 zigen Figur eine schematische Wiedergabe der Zusammenfügung des MCD-Peptids aus einzelnen Peptidfragmenten verdeutlicht.

Das MCD-Peptid entspricht der folgenden Formel

He-Lys-Oys-Asn-Cys-Lys-Arg-His-Val-Ile-Lys-Pro-His-Ile-Cys-Arg-Lys-Ile-Cys-

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und wird dadurch erhalten, dass man mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens zunächst die oben angegebenen Peptidfragmente I, II, III und IV synthetisiert, dann die Fragmente I und II zu V sowie III und IVzu VI vereinigt, anschliessend die gebildeten Fragmente V und VI in der erfindungsgemässen Weise zu VII zusammenfügt, das gebildete geschützte MCD-Peptid (VII) von dem Träger abspaltet, seine Schutzgruppen in an sich bekannter Weise entfernt und die beiden Disulfidbrücken in üblicher Weise ausbildet.

Hierzu bringt man die als Ausgangsmaterialien eingesetzten N-terminal mit cc,a-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzylo-xycarbonyl-gruppen (Ddz-Gruppen) geschützten Aminosäuren in Form der Cäsiumsalze auf das 0,5 bis 1,1 Milliäqui-valente Bromacetylphenyl-gruppen pro Gramm aufweisende, mit weniger als 0,5% Divinylbenzol vernetzte Polystyrol auf. Dabei setzt man die Cäsiumsalze der Aminosäuren bzw. der geschützten Peptidfragmente, vorzugsweise geschützte Tripeptide, in Dimethylformamid ein und erreicht eine völlige Reaktion der Bromacetylphenylgruppen im Verlaufe von drei Tagen bei 40°C. Diese Cäsiumsalze wendet man vorzugsweise in einem 1,5-fachen Überschuss an.

Die Kondensation der Peptidbindung erfolgt unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid, das zusammen mit der zu bindenden, N-terminal geschützten Aminosäure in drei- bis fünffachem Überschuss eingesetzt wird. Werden stattdessen N-terminal geschützte Peptidfragmente ankondensiert, so muss ausserdem ein sechs- bis zehnfacher Überschuss an 1 -Hydroxybenzotriazol (HOBt) zugesetzt werden zwecks Unterdrückung von Racemisierung. Die erhaltenen Derivate werden mit Dichlormethan und einer Dichlorme-than/Methanol-Mischung (4/1) gewaschen. Die gesamten Reaktionen, einschliesslich der Abspaltung der geschützten Peptidfragmente bzw. Peptide von dem Trägermaterial, die neben den auf Seite 9, Zeile 15 genannten Verfahren auch mit Benzyltrimethylammoniumhydroxid in einer Methanol/ Dioxan-Mischung (1/3) durchgeführt werden kann, erfolgen in einem Zentrifugalreaktor unter ständiger photometrischer Überwachung der Reaktionsflüssigkeiten auf der Grundlage der oben angegebenen UV-Banden der Schutzgruppe bzw. ihrer Spaltprodukte.

Zunächst wird das Peptidfragment I [Ddz-Ile-Lys(Z)-Cys(Acm)-Asn-Cys(StBu)-Lys(Z)-Arg(Tos)], das die Aminosäuren 1 bis 7 enthält, mit einer Ausbeute von 82% gebildet. Nach dem Abspalten dieses Peptidfragments von dem Trägermaterial wird es gelchromatographisch gereinigt (Sephadex LH 20 mit einer Dioxan/Methanol-Mischung [1 /1] und auf Kieselgel mit einem Trichlormethan/Metha-nol-Gradienten. Man erhält das Material mit einer Ausbeute von 34%, bezogen auf die anfänglich auf das Trägermaterial aufgebrachten Aminosäuren. Die Aminosäureanalyse des Heptapeptids steht in Einklang mit der Theorie.

Dann wird das Peptidfragment II [Ddz-His(Boc)-Val-Ile-Lys(Z)], das die Aminosäuren 8 bis 11 umfasst, mit einer Ausbeute von 77% auf dem Trägermaterial gebildet und wird dort unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid in tert.-Butanol mit dem überschüssig eingesetzten Peptidfragment I verknüpft. Nach drei Tagen lässt sich die vollständige Kondensation des Peptidfragments I durch die photometrische Überwachung der Reagenslösung feststellen. Dann wird das gebildete Peptidfragment V mit Benzyltrimethylammonium-hydroxid in einer Methanol/Dioxan-Mischung (1/3) abgespalten und über Kieselgel mit Hilfe eines Trichlormethan/ Methanol-Gradienten gereinigt. Man erhält das Peptidfragment mit einer Ausbeute von 53% (126 mg). Rf-Wert = 0,45 (Trichlormethan/Methanol/Essigsäure-Mischung, 85/10/5). Die Aminosäureanalyse zeigt die gewünschten Verhältnisse.

Dann bildet man das die Aminosäuren 12 bis 15 enthal-

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tende Peptidfragment III [Ddz-Pro-His-Ile-Cys(Acm)]. Es wird in der oben angegebenen Weise von dem Trägermaterial abgespalten, das Material wird über Kieselgel unter Anwendung eines Trichlormethan/Methanol-Gradienten gereinigt und aus Methanol kristallisiert. F = 170°C. Die Reinausbeute beträgt 20%, die Aminosäureanalyse steht im Einklang mit der Theorie.

Anschliessend bildet man das Peptidfragment IV [Ddz-Arg(Tos)-Lys(Z)-Ile-Cys(StBu)-Gly-Lys(Z).-Asp(OBzl)], das die Aminosäuren 16 bis 22 umfasst, mit einer Ausbeute von 84%. Anschliessend bindet man an das auf dem Trägermaterial vorliegende homogene Peptidfragment IV (4,5 g, 0,21 Milliäquivalente pro Gramm) 0,9 Milliäquivalente des reinen Peptidfragments III, wozu man nach der Dicyclohexylcarbodiimid/l-Hydroxybenzotriazol-(HOBt)-Methode in Dimethylformamid arbeitet. Nach drei Tagen ist eine 73%ige Einfügung des Peptidfragments III anhand der photometrischen Überwachung der Reaktionslösung festzustellen. Die verbleibenden freien Aminogruppen des Peptidfragments IV werden mit 3-Nitrophthalsäureanhydrid (0,1 Mol/1 in Pyridin, Einwirkungszeit 10 Minuten) blockiert, um die Bildung falscher Sequenzen zu unterdrücken. Man erhält in dieser Weise das Peptidfragment VI [Ddz-Pro-His-Ile-Cys(Acm)-Arg(Tos)-Lys(Z)-Ile-Cys(StBu)-Gly-Lys(Z)-Asp(Obzl)] das die Aminosäuren 16 bis 22 enthält, auf dem Trägermaterial mit einer Ausbeute von 24%.

Man bewirkt schliesslich die abschliessende Kondensation von 126 mg des Peptidfragments V, das die Aminosäuren 1 bis 11 umfasst, an das auf dem Trägermaterial vorliegende Peptidfragment VI mit Hilfe des Dicyclohexylcarbodiimid/ l-Hydroxybenzotriazol(HOBt)-Verfahrens in Dimethylformamid, wobei man einen dreifachen Überschuss des in Lösung vorliegenden Peptidfragments anwendet. Nach 5 Tagen lässt sich die vollständige Reaktion des Peptidfragments V feststellen, wobei man das völlig geschützte MCD-Peptid mit einer Ausbeute von 32% erhält.

Man bewirkt anschliessend die Abspaltung des völlig geschützten MCD-Peptids von dem Trägermaterial durch Ammonolyse unter Verwendung einer gesättigten Ammoniaklösung in Dioxan als Abspaltungsreagens. Man führt die Abspaltung während 4,5 Tagen bei Raumtemperatur unter photometrischer Überwachung der Umsetzung durch. Dann wird die erhaltene Ab'spaltungslösung in üblicher Weise aufgearbeitet, um das voll geschützte MCD-Peptid zu reinigen. Das gereinigte Material zeigt bei der Dünnschichtchromatographie einen Hauptfleck beim Rf-Wert von 0,4 (Chloroform/Methanol/Essigsäure-Mischung, 85/10/5) bzw. von 0,45 (sek.-Butanol/Essigsäure/Wasser-Mischung, 4/1/1).

In der nächsten Stufe werden die Schutzgruppen mit Tri-fluormethansulfonsäure abgespalten. Hierzu gibt man die Trifluormethansulfonsäure zu dem gut getrockneten Peptid, verwendet Dimethylsulfoxid als Kationenfänger und rührt unter Feuchtigkeitsausschluss während 1 Stunde bei Raumtemperatur, wonach man das Peptid mit Äther ausfällt, in die Acetatform überführt und reinigt. Bei dieser Behandlung werden die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Z) und die Tosyl-Schutzgruppe (Tos) abgespalten, während die tert.-Butylmercapto-Schutzgruppe (StBu) und die Acetamido-methyl-Schutzgruppe (Acm), die die Schutzgruppen der Schwefelgruppen darstellen, nicht angegriffen werden.

Zur Ausbildung der Disulfidbrücken Cys5-Cys'9 bzw. Cys3-Cys15 geht man nach der Verfahrensweise vor, die von J. van Rietschoten et al [Europ. J. Biochem. 56 (1975) 34 bis 40], P. Hartter, U. Weber, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 356 (1975) 693 und P. Sieber et al, Helv. Chim. Acta 60,4 (1977) 36 beschriebenen Weise vor. Das Material wird in üblicher Weise gereinigt und zeigt bei verschiedenen Analysen ein

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gleiches, bei einem pharmakologischen Test ein ähnliches Verhalten wie das entsprechende Naturprodukt. So zeigt das Material bei der Dünnschichtchromatographie auf Cellulose-platten, bei der Papierelektrophorese, bei der Disk-Elektro-phorese auf Platten und auf SDS-Gelen sowie bei der Hochdruckflüssigkeitschromatographie das gleiche Laufverhalten wie das entsprechende MCD-Naturprodukt. Auch die Aminosäurenanalyse entspricht der des Naturprodukts.

Die pharmakologischen Untersuchungen lassen erkennen, dass das erfindungsgemäss synthetisch hergestellte MCD-Peptid 26% der Wirksamkeit des Naturprodukts bezüglich der Freisetzung von Histamin besitzt. Durch Reinigen des s erhaltenen MCD-Peptids durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie lässt sich ein gereinigtes Syntheseprodukt gewinnen, das 35% der pharmakologischen Wirksamkeit des Naturprodukts aufweist.

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1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

637 629 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden durch schrittweise Kondensation von gegebenenfalls Schutzgruppen tragenden Aminosäuren in der gewünschten Sequenz an einem festen, phenylgruppenhaltigen Trägermaterial, dadurch gekennzeichnet, dass man ein mit Bromacetyl-bromid unter Bildung von Bromacetylphenylgruppen aktiviertes, schwach vernetztes Trägermaterial verwendet, Aminosäuren mit N-terminaler a,a-dimethyl-3,5-dimethoxyben-zyloxycarbonylgruppe oder entsprechend N-terminal geschützte Peptidfragmente einsetzt, die gebildeten Peptidfragmente im Verlaufe der Synthese von dem Trägermaterial abspaltet, von verunreinigenden Nebenprodukten abtrennt und zur weiteren Synthese erneut an das Trägermaterial bindet.

2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Peptidfragment aus wenigstens drei Aminosäuren oder Isoleucin, Leucin oder Valin oder die Schutzgruppen tragenden Aminosäuren Cystein oder Lysin mit dem aktivierten Trägermaterial umsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man mehrere verschiedene Peptidfragmente des gewünschten Polypeptids unabhängig voneinander herstellt, vom Trägermaterial abspaltet und dann jeweils zwei in der gewünschten Sequenz benachbarte Peptidfragmente, von denen eines an das Trägermaterial gebunden ist, miteinander kondensiert.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung des Mastzellen degranulierenden Peptids MCD zunächst getrennt die Peptidfragmente I [Ddz-Ile-Lys(Z)-Cys(Acm)-Asn-Cys(StBu)-Lys(Z)-Arg(Tos)], II [Ddz-His(Boc)-Val-Ile-Lys(Z)], III [Ddz-Pro-His-Ile-Cys(Acm)] und IV[Ddz-Arg(Tos)-Lys(Z)-Ile-Cys(StBu)-Gly-Lys(Z)-Asp(Obzl)] bildet, die Fragmente I und II bzw. III und IV zu den Fragmenten V [Ddz-Ile-Lys(Z)-Cys(Acm)-Asn-Cys(StBu)-Lys(Z)-Ars(Tos)-His(Boc)-Val-Ile-Lys(Z)] und VI [Ddz-Pro-His-Ile-Cys(Acm)-Ars(Tos)-Lys(Z)-Ile-Cys(StBu)-Gly-Lys(Z)-Asp(Obzl)] vereinigt und schliesslich die Fragmente V und VI zu dem geschützten, an das Trägermaterial gebundenen Peptid VII [Ddz-Ile-Lys(Z)-Cys(Acm)-Asn-Cys(StBu)-Lys(Z)-Arg(Tos)-His(Boc)-Val-Ile-Lys(Z)-Pro-His-Ile-Cys(Acm)-Arg(Tos)-Lys(Z)-Ile-Cys(StBu)-Gly-Lys(Z)-Asp(OBzl)] vereinigt, das Peptid VII von dem Träger abspaltet, die Schutzgruppen abspaltet und die Cys5-Cys19-und Cys3-Cys15-Disulfidbrücken ausbildet.