CH637657A5 - Process for the production of ergosine - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Ergosin.
Anwendungsgebiet der Erfindung:
Von den über 50 bisher natürlich bekannten Mutterkornal-kaloiden besitzen die Vertreter der Peptidgruppe eine grosse Bedeutung in der Medizin, so z.B. Ergotamin, Ergocornin, Ergokryptin und Ergocristin. Das Ergosin steht dem Ergotamin sehr nahe und unterscheidet sich vom letzteren nur durch Austausch der Aminosäure Phenylalanin gegen die Aminosäure Leucin in der Cyclolseitenkette.
Ergosin wirkt wie andere Mutterkornalkaloide vom Pep-tidtyp utretonisch sowie vasokonstriktorisch und ist deshalb für die Medizin von Bedeutung. Auch ist das Ergosin eine Schlüsselverbindung für Partialsynthesen. (Zu den Strukturen der genannten Peptidalkaloide vergleiche Abb. 1.)
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:
Bisher sind kaum Verfahren bekannt geworden, nach denen saprophytisch Ergosin gewonnen werden kann.
In einem Britischen Patent ist beschrieben, dass neben Ergokryptin, Ergocornin und Ergometrin als Hauptalkaloide (30%, 28% bzw. 22%) auch Ergosin in Mengen von 5%
gebildet wird (Brit. Pat. 1401406 vom 20.7.1973).
In anderen Patenten wird die gleichzeitige Gewinnung von Ergocornin und Ergosin, zwei Peptidalkaloiden, nebeneinander geschützt. Der geschützte Stamm bildet beide Alka-loide bzw. ihre Isomeren Ergocorninin und Ergosinin in etwa gleichen Mengen bei einem Gesamtalkaloidgehalt von etwa 900-1100 [ig/ml Nährlösung (Brit. Patent 1 184039 vom 21.2.1969).
Ein grosser Nachteil der genannten Verfahren ist einmal der geringe Anteil an Ergosin bzw. das Vorliegen von eng verwandten Peptidalkaloiden nebeneinander, die erst auf kompliziertem Wege voneinander getrennt werden müssen.
Ziel der Erfindung:
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Gewinnung von Ergosin zu entwickeln, bei dem die ökonomisch aufwendige Abtrennung verwandter Peptidalkaloide nicht erforderlich ist.
Darlegung des Wesens der Erfindung:
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Stämme zu isolieren, die 1. in der Lage sind, saprophytisch Ergosin zu bilden, das nahezu frei ist von Nebenalkoloiden, und 2. sich durch Stabilität und gute Fermentationseigenschaften auszeichnen.
Es wurde von Wildstämmen (PUR 13, PUR 50) der Art Claviceps purpurea (Fr) Tul., isoliert im Raum Halle (DDR),
von auf Roggen gewachsenen Sklerotien, die Ergotamin bildeten, ausgegangen. Diese Wildstämme waren in von Alka-loiden. Durch Mutation dieser Linien mit UV-Licht konnten Stämme isoliert werden, die saprophytisch frei von Alka-loiden waren, die aber deutliche morphologische Veränderungen (plektenchymatische Strukturen) aufwiesen. Bei einigen Stämmen waren die Aktivitäten von Enzymen der Aromatenbiosynthese, verglichen mit der Ausgangsform deutlich erhöht. Nach Zweitmutation der morphologisch veränderten Selektanten konnte aus etwa 2000 Linien ein Stamm isoliert werden, der fähig ist, Ergosin zu bilden. Im Verlaufe dieser Arbeiten war es möglich, saprophytisch alkaloidfreies Pilzmaterial in eine produzierende Linie umzuwandeln und gleichzeitig das Alkaloidspektrum - bezogen auf das Sklero-tium - umzusteuern. Der isolierte Stamm hat die Bezeichnung CI. purpurea (Fr) Tul.Mut 168 und ist am 28. Januar 1977 beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, Beuthenbergstr. 11, DDR-6900 Jena, unter der Bezeichnung IMET PA 134 hinterlegt worden; der Stamm ist der Öffentlichkeit zugängig. Er zeichnet sich vor allem dadurch aus, dass er Ergosin und dessen Isomeres Ergosinin in Mengen bis zu etwa 90% neben etwa 10% eines leicht abtrennbaren Clavingemisches bildet. Der neue Stamm besitzt die folgenden makroskopischen und mikroskopischen Eigenschaften.
Die Kultivation zur Charakteristik von Cl. pupurea MUT 168 erfolgte auf den in Tab. 1 zusammengestellten Agarme-dien.
Mikroskopisches Aussehen:
Auf den in der Tabelle 1 genannten Agarmedien bestehen die Kolonien aus mehr oder weniger stark verzweigtem Mycel, das eine Dicke von durchschnittlich 4-5 u besitzt. An den Verzweigungen wurden 7-8 gemessen. Konidien wurden nicht beobachtet, auf üblichen Sporulationsmedien (z.B. MIO) zerfiel dagegen das Mycel in z.T. sehr kleine Bruchstücke (auch in flüssiger M10-Kultur). Fetttröpfchen in relativ geringer Anzahl konnten nur auf Medium 846 und 829 beobachtet werden.
Das Mycel der submersen Kulturen (ca. 14 Tage alt, Produktionsmedium) besteht aus langen verzweigten Hyphen mit einer Dicke von ca. 5 ji. Die Hyphen haben z.T. kugelförmig abgerundete Anschwellungen und enthalten viele Fetttröpfchen, Konidien wurden nicht beobachtet.
Makroskopisches Aussehen:
Das makroskopische Aussehen wurde bei Kulturen festgestellt, die bei 24 ± 1°C auf Agarschalen (0 10 cm) während 14-16 Tagen gewachsen waren. Die Zusammensetzung der Medien ist Tab. 1 zu entnehmen.
Medium M10: sehr gutes Wachstum mit gefalteter, sich teilweise abhebender Oberfläche, braune Pigmentierung, Rückseite teilweise mit dunklen Flecken, keine Konidien. Medium 846: gutes Wachstum, Kolonien mit gefalteter, gekröseartiger Oberfläche, braun, Rückseite hellbraun, keine Konidien-Medium 829: gutes Wachstum. Die hellbraunen bis braunen Kolonien besitzen eine gefaltete, krause Oberfläche und einen unregelmässigen Rand. Die Rückseite ist hellbraun. Medium 784: gutes Wachstum. Die Kolonien haben eine braune Oberseite und eine farblose Unterseite. Sie sind gefaltet, kraus und besitzen einen unregelmässigen Rand. Keine Konidien.
2
s
10
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20
25
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637 657
Die Kultivation des Pilzes zur Produktion erfolgt in flüssigen Nährmedien in emerser oder submerser Kultur. Die Nährmedien enthalten eine assimilierbare C-Quelle, wie beispielsweise Saccharose, Mannit, Sorbit, Glycerin, Zitronenoder Bernsteinsäure; eine assimilierbare N-Quelle, wie beispielsweise Ammoniak, Asparagin, Pepton, Caseinhydro-Iysat oder ein Ammoniumsalz, sowie Mineralsalze. Die Fermentation kann beispielsweise in Fernbach-, Erlenmeyer-oder Schüttelkolben oder im Fermenter erfolgen. Die Alka-loide sind grösstenteils (>80%) im Nährmedium enthalten und können auf üblichem Wege erhalten werden. Insgesamt wird während 10 bis 35 Tagen kultiviert.
Die Kultivation erfolgt zweckmässigerweise ein- bis dreistufig. Es ist vorteilhaft, wenn die Vorkultur 5-12 Tage alt ist und das Impfverhältnis Vor- : Hauptkultur 1:5 bis 1:20 beträgt. Der pH-Wert liegt zwischen 4,0 und 6,2, die Temperatur beträgt 20 bis 30°C. Die Stammerhaltung kann über Röhrchen oder durch Tiefkühllagerung unter Verwendung von Schutzkolloiden, wie z.B 60% Saccharoselösung + Magermilch = 2:1, auf üblicher Weise erfolgen.
Ausführungsbeispiele:
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern:
Beispiel 1
Ausgehend von Schrägröhrchen des Stammes MUT 168 wurden durch Zermörsern des Mycels Vorkulturen von 100 ml Medium 821 in 500 ml Schüttelkolben beimpft. Das Medium hat folgende Zusammensetzung:
Saccharose 200 g
Ammoniumeitrat 15 g
Ca(NÛ3)2 1 g
KH2PO4 0,25 g
MgS04-7H20 0,3 g
FeS04-7H20 10 mg
ZnSCWHîO 30,8 mg
KCl 0,1 g
Hefeextrakt 3,0 g
Wasser ad 1000.0
pH (vor dem Sterilisieren) 5,8 - 6,0 Sterilisation 30 Min. bei 110°C.
Die Kolben wurden 7 Tage bei 24 ± 1°C bei 200 Upm bebrütet. 10% der erhaltenen Kulturen dienten dazu, 500 ml Kolben mit je 100 ml Medium 720 der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:
Saccharose 200 g
Ammoniumeitrat 15 g
Ca(NCh)2 1 g
KH2PO4 0,25 g
MgS04-7H20 0,3 g
FeS04-7H20 10 mg
ZnS04 • 7H2O 30,8 mg
KCl 0,1 g
Wasser ad 1000.0
pH (vor dem Sterilisieren) 5,8 - 6,0 Sterilisation 30 Min. bei 110°C.
Nach 12—21 tägiger Bebrütung unter den für Vorkulturen beschriebenen Bedingungen enthielten die Kulturen 180-280 ji.g/ml Gesamtalkaloid, bestehend aus 90% eines Gemisches von Ergosin und Ergosinin und 10% eines Clavi-nalkaloidgemisches. Die Alkaloide können nach an sich bekannten Verfahren isoliert und gereinigt werden.
Beispiel 2
10% der in Beispiel 1 beschriebenen Vorkultur wurden in 400 ml Fernbachkolben mit 100 ml des Mediums 720 überführt. Bei 24 ± 1 °C wurden die Kolben bebrütet und nach 20 Tagen Kultivation das emerse Mycel vom Medium abgetrennt. Die Kolben enthielten 250-350 (ig Gesamtalkaloid pro ml Nährmedium, das die gleiche Zusammensetzung besass, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Identifizierung der Alkaloide erfolgte in der folgend beschriebenen Weise:
Nach 20tägiger Fermentation der Oberflächenkultur enthalten die Kulturen 300 jxg/ml Alkaloidgemisch. 10 ml werden alkalisiert und erschöpfend mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird auf 5 ml eingeengt und davon 2 ml durch präparierte Schichtchromatographie an Kieselgel mit Fluorescenzindikator (Lösungsmittelsystem Chloroform: Äthanol (8:2)) getrennt. Die Alkaloidflecke werden abgeschabt und mit einer Mischung von Wasser: Methanol: Eisessig (45:45:10) aufgenommen und anschliessend mit van UrkTs Reagenz im Verhältnis (1:2) versetzt. Die blau gefärbten Lösungen werden zentrifugiert, der Überstand mit einer Quarzlampe 5 Min. bestrahlt und die Extinktion im Photometer bestimmt. Die Alkaloidmengen können unter gleichen Bedingungen aufgestellten Eichkurven entnommen werden. Das Alkaloidgemisch dieses Stammes hat folgende Zusammensetzung: Ergosin 65%; Ergosinin 25%, Clavine 10%.
Die präparative Gewinnung der Peptidalkaloide kann auf folgende Weise durchgeführt werden: 2,5 Liter Nährlösung werden alkalisch gestellt (pH 9) und erschöpfend mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte dampft man im Vakuum ein. Daraus resultieren 690 mg Rohalkaloidgemisch. Dieses Material wird in wenig Chloroform gelöst und an einer Kieselgel-Säule chromatographiert. Als Elutionsmittel dient Chloroform, dem steigende Mengen Äthanol (bis 15%) zugesetzt werden. Es bilden sich zwei getrennte, im UV-Licht blau fluorescierende Zonen. Die rascher wandernde Zone ergab Ergosinin. Nach Umkristallisieren aus Methanol werden 150 mg Ergosinin (C30H37O5N5) erhalten, Fp 225°C. Md = +394° (c = 1% Chloroform). Hochaufgelöstes Massenspektrum m/e: 547 (M+); Gef. 547,2807, Ber. 547,2794 für C30H37O5N5. Weitere prominente Fragmente m/e: 280; 267; 224; 221 ; 210; 167; 154. Das Eluat der langsamer wandernden Zone enthielt 350 mg Ergosin (C30H37O5N5). Massenspektrum m/E: 547 (M+). Weitere prominente Fragmente m/e: 280; 267; 224; 221; 210; 167; 154.
In beiden Fällen ist die Keller'sche und van Urk'sche Reaktion positiv, und das Absorptionsspektrum im UV zeigt bei X = 312 m/(i ein Maximum.
Bei der sauren Hydrolyse entstehen jeweils Leucin und Prolin. Die alkalische Hydrolyse liefert Lysergsäure (Ergosin) bzw. Isolysergsäure (Ergosinin).
Auch das chromatographische Verhalten der beiden isolierten Peptilalkaloide stimmt mit authentischem Ergosin bzw. Ergosinin überein. Eine Umwandlung der Alkaloide ineinander nach bekannten Methoden ist möglich.
Beispiel 3
Ausgehend von Schrägröhrchen werden nach dem in Beispiel 1 genannten Verfahren Vorkulturen in 500 ml Schüttelkolben mit 100 ml des Mediums 815, dessen Zusammensetzung nachfolgend angegeben ist, angesetzt.
Saccharose 300 g
KH2PO4 0,5 g
NaN03 2,0 g
Hefeextrakt 0,1 g
MgS04-7H20 0,6 g
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
637 657
4
KCl
FeS04-7H20 Wasser ad pH (vor dem Sterilisieren) 5,5-5,8 Sterilisation 30 Min. bei 110°C.
0,5 g 10 mg 1000.0 ml
Nach der Inkubation unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen wurden 10% der Vorkultur in 500 ml Schüttelkolben mit 100 ml Medium 833 übertragen, das die folgende Zusammensetzung hat:
Saccharose Ammoniumeitrat
300 g 20 g
Ca(N03>
KH2PO4
MgS04-7H20
FeS04-7H20
ZnS04-7H20
Wasser ad pH (vor dem Sterilisieren) 5,4-5,7 Sterilistion 30 Min. bei 110°C.
lg 0,25 g 0,3 g 10 mg 30,8 mg 1000.0 ml
10 Nach 14tägiger Inkubation unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen enthielten die Kolben 180-220 [ig/ml Gesamtalkaloid der gleichen Zusammensetzung, die in Beispiel 1 genannt wurde.
Tabelle I
Zur Kultivation auf Agar verwendete Medien
Komponenten
MIO
Medien
NL846 NL829
NL784
Bierwürze
(ungehopfte Vorderwürze, 15%) 330 ml
Hefeextrakt 3 g
Saccharose Glucose
Ammoniumeitrat
L-Asparagin
Neo-Pepton
Ca(NCb)2
KH2PO4
FeS04-7H20
ZnS04-7H20
MgS04-7H20
KCl
Agar-Agar
Wasser ad pH
Sterilisation
25-30 g 1000.0 5.5
30 Min., 110°C
ad
100,0 g 15,0g
1,0 g 0,25 g 10,0 mg 4,4 mg 0,3 g 0,2 g 30 g 1000.0 5.6-5.8
30 Min., 110°C
ad
0,5 g 100,0 g
10,0g
1,0 g 0,25 g 20 mg 20 mg 0,25 g
25-30 g
1000.0
5.4-5.6
30 Min., 110°C
ad
3,0 g 50,0 g
3,0 g
0,5 g 20 mg 17,6 mg 0,3 g
25-30 g 1000.0 5.5
30 Min., 110°C
Risj-I/Rj?
«C Û
H .CO-MH-^ . >-CH5 , h 'Rj
(1) R3— — CHz
: Ergotamin
-ch5 .
(2) R1.R2-HJ R3= CM2-C>I' - : Ergosin
CH5
(3) Ri, ß2= ch5; R3- -cfH* : Ergocornin
CHj
(4) Ri,R2=CHj; r3—ch2-ch 5 : oc-Ergokryptin
CH^
Abb. 1. Strukturformeln einiger Cyclolalkaloide des Mutterkorns
Claims (2)
1. Verfahren zur Darstellung von Ergosin, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Claviceps purpurea (Fr) Tul. IMET PA 134 in aerober submerser oder emerser Fermentation in einem flüssigen Nährmedium, welches eine Kohlenstoff-, eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 20 bis 30°C und einem pH-Wert von 4,0 bis 6,2 während eines Zeitraums von 10 bis 35 Tagen kultiviert und das gebildete Alkaloidgemisch aus etwa 90% Ergosin/Ergosinin und etwa 10% leicht abtrennbarer Clavi-nalkaloide isoliert und getrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation bei 22 bis 25°C und pH 5,2 bis 5,9 durchgeführt wird.
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