CH638401A5 - Process for the preparation of haemoglobin preparations having an increased oxygen delivery - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von für die intravenöse Injektion geeigneten Hämoglobinpräparaten mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten und Hämoglobinlösungen.
Der Sauerstoff-Halbsättigungsdruck des Hämoglobins (Hb), P50-Wert genannt, beträgt im intakten Erythrozyten bekanntlich 36 mbar. Neben dem intraerythrozytären pH-Wert von 7,25 ist für jenes Mass der Sauerstoff-Abgabebe-reitschaft vor allem der Gehalt an 2,3-Diphosphoglycerat (DPG) verantwortlich. Für alle Infusionspräparate auf der Basis von frei gelöstem Hämoglobin, beziehungsweise Derivaten davon, ist der pH-Wert des Blutplasmas von etwa 7,4 massgebend, da sie zwangsläufig unter diesen Bedingungen den Sauerstoff transportieren müssen. Bereits diese Tatsache führt zu einer Linksverschiebung der Sauerstoffverbindungskurve entsprechend einer Erniedrigung des P50-Wertes auf günstigenfalls etwa 32 mbar. Ist eine solche Hämoglobinlösung aber erst infundiert, dann wird sofort im Dissoziationsgleichgewicht ungebundenes 2,3-Diphosphoglycerat aufgrund seiner geringen Molekülgrösse durch die Nieren ausgeschieden. Das DPG ist am Hb salzartig gebunden und dissoziiert entsprechend rasch nach, so dass in kurzer Zeit alles in der Blutbahn frei gelöste Hb von DPG entblösst ist. Infolgedessen sinkt der P50-Wert auf 20-22 mbar ab. Ein höherer P50-Wert weist auf eine erhöhte Sauerstoffabgabebereitschaft eines Präparates hin.
Bisher wurde noch kein Hämoglobinpräparat gefunden, das leicht Sauerstoff für eine Sauerstoffversorgung des Gewebes abgibt. Es ist bekannt, dass Pyridoxal-5-phosphat (Fig. 1) bevorzugt auch an der gleichen Stelle der Hb-Mole-kel gebunden wird wie DPG, überraschenderweise ist es jedoch erheblich fester als Diphosphoglycerat an das Hämoglobin gebunden. Das von R.E. Benesch, R. Benesch, A. 40 Benk, R. Renthal und B. A. Bray in Proc. I. Interamer. Symp. Haemoglobins, Caracas (1969), «Genetical, func-tional and physical studies of hemoglobins», pgs. 134-142 (Karger, Basel 1971) beschriebene Modellpräparat aus Hämoglobin und Pyridoxal-phosphat lässt sich nicht als In-45 fusionslösung verwenden, da es pyrogene Reaktionen auslöst.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass es möglich ist, ein für die intravenöse Injektion geeignetes Hämoglobinpräparat mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber so Erythrozyten herzustellen, das aus einem Kondensationsprodukt von Hämoglobin und Pyridoxalphosphat besteht und keine pyrogene Reaktion bewirkt. Ein'solches Präparat kann wegen seiner günstigen Sauerstoff-Affinität therapeutisch intravenös verwendet werden. In diesem Kondensa-55 tionsprodukt liegt ein Hämoglobintetrameres mit einer statistischen Verteilung von Pyridoxalphosphat am Hämoglobin vor. Das Präparat hat selbst bei einem pH-Wert von 7,4 einen PSo-Wert von 42 mbar. Die Verweilzeit eines solchen Präparates in der Blutbahn beträgt etwa 2 Stunden.
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- Derartige pyrogenfreie und im Blutkreislauf als hervorragende Sauerstoffdonatoren wirksame, als Infusionslösungen (Hb/PP) verwendbare Hämoglobinpräparate gewinnt man, wenn man von dem Verfahren der Hämoglobingewin-65 nung von R.E. Benesch und R. Benesch [Proc. of the National Academy of Science USA 59, 526-532 (1968)] abweicht und dabei erfindungsgemäss vorgeht, wie im Patentanspruch 1 definiert.
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Durch das im Patentanspruch 2 definierte Verfahren sind Präparate mit einer Verweilzeit im Blut von 4 bis zu 9 h erhältlich.
In der Sterilfiltration können direkt Infusionseinheiten von 300 ml oder 500 ml hergestellt werden.
Durch den Zusatz von IN Natronlauge und von Gluco-semonohydrat werden in den erfindungsgemässen Verfahren chemische Vorgänge bewirkt, durch welche die Sauerstoffverbindungseigenschaften von Hämoglobin verändert und reduktive Enzyme unwirksam gemacht werden.
Das Säulen-Chromatogramm solcher Präparate («Se-phadex» G-150,90 x 1,5 cm, 0,3 ml Auftragsvolumen) zeigt Fig. 2 der Zeichnungen.
Die P5 „-Werte des erfmdungsgemäss hergestellten Präparates bei einem pH-Wert von 7,45 liegen zwischen 40 und 53,3 mbar und übertreffen damit den p50-Wert des Hämoglobins in den Erythrozyten beträchtlich.
Es wurde weiter gefunden, dass man durch weitere Modifizierung solcher, durch Bindung von Pyridoxalphosphat an Hämoglobin zur verbesserten Sauerstoffabgabe an das Gewebe befähigte Moleküle, deren Verweilzeit im Blut etwa 2 Stunden beträgt, erreicht, dass diese bei Erhaltung ihrer therapeutischen Funktion mindestens doppelt so lange in der Blutbahn voll wirksam bleiben. Dafür wird das Verfahren zweckmässig wie folgt durchgeführt:
Menschliche Erythrozyten werden mit schwach alkalischer Waschlösung wenigstens 4mal behandelt, dann hämolysiert und mit einem Kationenaustauscher in H+-Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0-5,5 abgesunken ist, dann vom Harz und ausgefällter Stromamasse durch Kühlzentrifugation befreit, auf eine gewünschte Hämoglobinkonzentration von 5-9% mit Wasser verdünnt, ein pH-Wert von 7-9 mit IN Natronlauge eingestellt, dann unter einem Vakuum von 26,6 mbar 10 Minuten lang, danach unter Einleitung von Stickstoff, gerührt, bis der Sauerstoff im Gefäss durch reinen Stickstoff verdrängt ist, 0,25-1,25 g Pyridoxal-5-phosphat pro Liter 5-9%ige Hämoglobinlösung zugegeben und unter Stickstoff 15 Minuten bis 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur weitergerührt und anschliessend mit der 5- bis lOfachen molaren Menge Natriumborhydrid gegenüber dem Pyridoxalphosphat weitere 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur verrührt, danach wieder evakuiert, ein Dialdehyd der Formel OCH-(CH2)n-CHO, worin n 1-6 bedeutet, in 9facher molarer Menge zum Hämoglobin zugegeben, 45 Minuten lang unter Stickstoff gerührt, unvernetztes Hämoglobin dann durch Aussalzen oder Ultrafiltration abgetrennt, das angereicherte vernetzte Präparat mit IN Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,6 bei 20 °C eingestellt, durch entsprechende Salzzusätze auf Blutplasma analoge Konzentrationen ergänzt, 22 g Glucosemonohydrat pro Liter zugefügt und sterilfiltriert.
Für die Abreicherung an unvernetztem Hämoglobin gibt es dabei z.B. zwei Möglichkeiten:
1. Man rührt allmählich das 0,8- bis l,0fache Volumen der Hämoglobinbereitung an 4molarer Ammoniumsulfatlösung zur Aussalzung des vernetzten Hämoglobins ein. Der abzentrifugierte Niederschlag wird in Wasser gelöst und gegen eine 0,5%ige Kochsalzlösung dialysiert zur Entfernung des Ammoniumsulfats und aller überschüssigen Hilfschemikalien. Die letzten Spuren werden durch einen Mischbettaustauscher entfernt.
2. Man durchströmt eine Hohlfaser-Patrone Hl P 100 (Hersteller: Firma Amicon Corporation, 21 Hostwell Avenue. Lexington, Massachusetts, USA) mit der Hämoglobin-Bereitung. Durch Ultrafiltration wird unvernetztes Hämoglobin bevorzugt abgepresst und dabei im Unfiltrat abgereichert.
Bei diesem Verfahren lässt man Pyridoxalphosphat zunächst auf Hämoglobin einwirken und reduziert anschliessend durch naszierenden Wasserstoff aus Natriumborhydrid die gebildeten Azomethin-(Schiff-Basen-) zu sekundären Amin-Bindungen.
NaBH
(Hb)-N = CH-(Pyr) % (Hb)-NH-CH2-(Pyr)
Anschliessend lässt man einen Dialdehyd der Formel
O=CH-(CH2)n-CH=O, n = 1-6
auf die Moleküle einwirken. Dadurch erreicht man eine Aneinanderkopplung der modifizierten Hämoglobin-Moleküle zu grösseren Gebilden.
Geeignet für diese Behandlung sind Dialdehyde mit insbesondere geraden Kohlenstoffketten von 3-8 C-Atomen wie Malondialdehyd, Succindialdehyd, Glutardialdehyd, Adipindialdehyd, Suberaldehyd, die der Formel OCH-(CH2)n-CHO entsprechen, in der n einen Wert von 1-6 bedeutet.
Dieses Verfahrensprodukt (Hb/PP)m gemäss Fig. 3 der Zeichnung besteht aus
A = hochvernetztem pyridoxaliertem Hämoglobin (m >3) B = oligomervernetztem pyridoxaliertem Hämoglobin (m = 2-3)
C = unvernetztem pyridoxaliertem Hämoglobin (m = 1)
Als Ausgangsmaterial können auch bereits abgelaufene Blutbank-Erythrozyten für beide Verfahrensmodifikationen verwendet werden.
Ausser in einem einwandfreien Pyrogentest wurde das erfmdungsgemäss hergestellte Infusionspräparat aus Hb/PP an Ratten und Mäusen auf akute Toxizität geprüft. Dabei wurden noch 50 ml einer 8%igen Lösung pro kg Körpergewicht ohne abnormales Verhalten und ohne auffällige Symptome von den Ratten intravenös vertragen. Nachdem Mäuse eine intravenöse Dosis von 100 ml pro kg Körpergewicht noch überlebten, wurde gemäss Thaer: «Grundlagen der experimentellen Arzneimittelforschung» (1965) bestimmt, dass die
LD50 mehr als 50 ml/kg Körpergewicht beträgt,
und die Substanz mit dem Prädikat «relativ harmlos» einzustufen ist.
Im Gegensatz zu dem Produkt von R. E. und R. Benesch konnte bei dem erfmdungsgemäss hergestellten Präparat aufgrund eines konstanten PS0-Wertes nachgewiesen werden, dass die Schiffsche-Basen-Bindung des Pyridoxal-phosphats an die Aminogruppe des N-terminalen Valins der ß-Kette des Hämoglobins gegen Dialysebehandlung in vitro resistent ist. Es wurde eine erschöpfende Dialyse gegen 0,9% Kochsalzlösung bei 10 °C durchgeführt.
Ergebnis
Präparat P50 (mbar)
vor Dialyse nach Dialyse
Hb/PP 731017 42,6 44
Hb/PP 731013 52 49,3
Vergleiche dazu Literatur-Zitat R.E. Benesch et al. 1971
Die überlegene Wirksamkeit unter den physiologischen Bedingungen des Blutkreislaufes zeigt das Präparat Hb/PP auch im Tierversuch. Das Präparat gibt auch unter einem normalen venösen Sauerstoff-Partialdruck von 53,3 mbar bereits Sauerstoffmengen an das Gewebe ab, die frei gelöstes normales Hämoglobin erst unter pathologischen Verhältnis-
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sen, d.h. wenn der venöse P02 auf etwa 26,6 mbar abgesunken ist (K. Messmer et al. in Vorbereitung), erreicht.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert. In den Zeichnungen zeigt Fig. 1 die Strukturformel von Pyridoxal-5-phosphat, und Fig. 2-6 sind Chromatogramme von erfiridungsgemäss hergestellten Präparaten.
Beispiel 1
Das Erythrozytensediment einer 4 Wochen gelagerten Blutkonserve (etwa 270 ml) wird 10 Minuten lang mit 1/3 seines Volumens einer l,6%igen Kochsalzlösung mit 1,2% ß-Propiolactongehalt verrührt. Die Erythrozyten werden bei 0 C abzentrifugiert und nach Absaugen des Uberstandes und der gebildeten Thrombozytenhaut noch 4mal mit dem 1- bis 2fachen Volumen folgender Lösungen auf der Kühlzentrifuge gewaschen:
1. 3,8% Natriumbicarbonat/Wasser
2. 3,8% Natriumbicarbonat/Wasser
3. 1:1-Mischung l,6%ige Kochsalz-/3,8%ige Bi-carbonatlösung
4. l,6%ige Kochsalzlösung
Zur Hämolyse werden die gewaschenen Erythrozyten in die Menge aqua pro injectione eingerührt, die dem Erythro-zytenausgangsvolumen entspricht, und mit Kationenaustauschersuspension in der H+-Form - zum Beispiel «DOWEX» 50 WX 8 - versetzt, bis der pH-Wert auf 5 absinkt. Es folgt Abstumpfung auf einen pH-Wert von 5,5-5,7 mit IN Natronlauge und Abtrennung von Stroma und Harz durch Kühlzentrifugierung und Abgiessen. Mit aqua pro injectione wird der Überstand auf 8,6% Hämoglobin verdünnt, mit IN Natronlauge auf pH-Wert 7,5 eingestellt und pro Liter Lösung mit 3,6 g Natriumchlorid, 22 g Glukosemonohydrat, 0,29 g Kaliumchlorid, 0,23 g Calciumchlorid-dihydrat und 0,25 g Magnesiumsulfat-heptahydrat versetzt.
Nach erneuter Kühlzentrifugation wird dekantiert und in geschlossenem Gefäss 10 Minuten lang unter einem Vakuum von 26,6 mbar gerührt.
Durchleiten von Reinstickstoffgas vertreibt den letzten Sauerstoff, so dass anschliessend das Hämoglobin überwiegend in der Desoxyform vorliegt. Diese wird mit 1,1g Pyridoxal-5-phosphat-monohydrat pro Liter Lösung (entspricht etwa 3,5 mol Pyridoxalphosphat pro 1 Mol Hb-Te-tramer) umgesetzt, indem 1 Stunde lang bei 20 °C unter Stickstoff gerührt wird, nach vorheriger Zugabe von 2,12 g Natriumbicarbonat pro Liter.
Es folgt eine Endeinstellung mit IN Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,6 (bei 20 °C) und Sterilfiltration. Ausbeute: Etwa 400 ml Lösung 8%ig an Hb.
Pso-Wert bei pH-Wert 7,45:42,6 mbar
Beispiel 2
Die vereinigten Erythrozytensedimente sechs frischer Blutkonserven (etwa 1,51) werden gemäss Beispiel 1, jedoch 5 Minuten lang mit 2,0% ß-Propiolacton/1,6% Natriumchloridlösung behandelt. Die Hämolyse erfolgt mit dem doppelten Erythrozytenvolumen von etwa 3 Litern aqua pro injectione.
Die pH-Einstellung mit IN Natronlauge vor dem Zusatz von - der Verdünnung angepasst - 0,82 g Pyridoxal-phos-phat-monohydrat pro Liter Lösung erfolgt in Abweichung von Beispiel 1 auf 9,0, und die Rührdauer unter Stickstoff beträgt 2 Stunden.
Nach wiederum analoger Aufarbeitung resultieren
4 Liter einer Hb/PP-Lösung, 6%ig an Hb
Ps0-Wert: 42,6 mbar
Beispiel 3
Das Erythrozytensediment einer 10 Tage alten Blutkonserve wird ohne ß-Propiolacton-Vorbehandlung den 4 Waschvorgängen analog Beispiel 1 unterworfen. Die gewaschenen Erythrozyten werden aber in 450 ml aqua pro injectione hämolysiert (stärkere Verdünnung). Zur Reaktion mit 1,1g Pyridoxal-5-phosphat-monohydrat pro Liter Lösung (entsprechend 5 mol Pyridoxal-phosphat pro 1 mol Hb-Te-tramer) wird aber auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt und anschüessend 2 Stunden lang unter Stickstoff bei Zimmertemperatur gerührt.
Nach der üblichen Elektrolyt-Endeinstellung erhält man etwa 700 ml Hb/PP-Lösung mit einem Gehalt von 5,5% Hb.
Pso-Wert: 52 mbar
Beispiel 4
Vereinigte Erythrozytensedimente von 25 abgelaufenen Blutkonserven (etwa 61) werden gemäss Beispiel 1, aber nur 5 Minuten lang mit der angegebenen ß-Propiolacton-/Koch-salzlösung gerührt. Abweichend von Beispiel 1 erfolgt ausserdem die pH-Einstellung auf einen Wert von 7,0 vor Zusatz des Pyridoxalphosphates.
Am Ende der analog Beispiel 1 durchgeführten Weiterverarbeitung werden 10,5 Liter eines Hb/PP-Präparates mit einem Hb-Gehalt von 8% gewonnen, das einen P50-Wert von 45,3 mbar hat.
Beispiel 5
100 ml 6%ige Hämoglobinlösung wurden durch Evakuieren auf 26,6 mbar und anschliessendes Spülen mit Stickstoff in die Desoxyform überführt. 47 mg Pyridoxalphosphat wurden unter Rühren zugegeben, und es wird 15 Minuten lang weitergerührt. Dann wurden 56 mg Natriumborhydrid zugegeben und weitere 20 Minuten lang gerührt (Zimmertemperatur). Nach dem erneuten Evakuieren wurden 0,8 ml 10% Glutardialdehyd zugegeben und 45 Minuten lang unter Stickstoff gerührt. Um das unvernetzte Hämoglobin abzutrennen, wurden 90 ml 4molare Ammoniumsulfatlösung innert 7 Minuten zugegeben und noch 10 Minuten lang gerührt. Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert, der Überstand verworfen. Der Niederschlag wurde in 20 ml Wasser aufgelöst. Es folgte eine 3stündige Dialyse mit «Visking»-Dialysierschlauch Typ 10/32 gegen das 50fache Volumen einer 0,5%igen Kochsalzlösung, wobei die Aussenlösung 3mal ausgewechselt wurde. Die dialysierte Hämoglobinlösung wurde zur restlosen Entfernung des Ammoniumsulfats über einen Mischbettaustauscher geschickt, bestehend aus stark saurem Kationenaustauscher, zum Beispiel «Dowex» WX 8 Kationenaustauscher in der Na+-Form bzw. «Dowex» 21 K Anionenaustauscher in der Cl~-Form (Lieferant: Firma DOW Chemical Company, Midland, Michigan, USA).
Nach der Einstellung auf pH-Wert 7,5 mit n-NaOH und auf eine isotonische Elektrolyt- beziehungsweise Glukosekonzentration (Zusatz von 2 g Glukose und 0,21 g Natriumbicarbonat) wurde das Präparat sterilfiltriert und im Kühlschrank (5 °C) aufbewahrt.
Das Präparat entsprach einem P50-Wert von 21,3 mbar und zeigte das Säulen-Elutions-Diagramm über «Sepharo-se» 6 B (Produkt der Firma Pharmacia Fine Chemicals AB) gemäss Fig. 4.
Beispiel 6
Es wurde wie in Beispiel 5, jedoch mit der 3fachen An-satzgrösse bis zur Zugabe des Glutardialdehyds gearbeitet. Nach dem Rühren wurde das Präparat durch eine mit 0,9%-NaCl-Lösung vorgefüllte Hohlfaser-Ultrafiltrationspatrone HIP 100 mit einem Eingangsdruck von 666 mbar umge-
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pumpt. Das durch die Ultrafiltration abgepresste Volumen Beispiel 7 wurde kontinuierlich durch steriles Wasser ersetzt. Die Um- Es wurde wie in Beispiel 5, jedoch mit Zusatz von 71 mg pumpdauer betrug etwa 5 Stunden. In dieser Zeit fand Pyridoxalphosphat, gearbeitet. Das entsprechend hergestellgleichzeitig eine Vollentsalzung statt. Das Präparat wurde te Endprodukt wies einen P50-Wert von 24 mbar auf und wie in Beispiel 5 eingestellt, hatte einen P50-Wert von 25,3 5 zeigte das Gelchromatogramm von Fig. 6.
mbar und zeigte das Gelchromatogramm von Fig. 5.
s
1 Blatt Zeichnungen
Claims (3)
- 6384012PATENTANSPRÜCHE1. Verfahren zur Herstellung von für die intravenöse Injektion geeigneten Hämoglobinpräparaten mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten und/oder Hämoglobinlösung, dadurch gekennzeichnet, dass man menschliche Erythrozyten mit schwach alkalischer Waschlösung mindestens 4mal behandelt, dann hämolysiert und mit einem Kationenaustauscher in H+-Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0-5,5 abgesunken ist, dann von Harz und ausgefällter Stromamasse durch Kühlzentrifugation befreit, mit Wasser auf eine gewünschte Hämoglobinkonzentration von 5-9% verdünnt, mit IN Natronlauge einen pH-Wert von 7-9 einstellt, die Elektrolyte durch Salzzusätze auf dem Blutplasma analoge Konzentrationen ergänzt, 22 g Glucosemo-nohydrat/1 zugibt, dann unter einem Vakuum von 26,6 mbar 10 min lang rührt, Stickstoffgas darüberleitet, bis der Sauerstoff im Gefäss durch reinen Stickstoff verdrängt ist, das Hämoglobin mit 0,25 bis 1,25 g Pyridoxal-5-phosphat pro Liter 5-9%ige Hämoglobinlösung reagieren lässt und unter Stickstoff 15 min bis 2 h lang bei Zimmertemperatur weiterrührt, und schliesslich mit IN Natronlauge auf einen ph-Wert von 7,6 bei 20 °C einstellt und sterilfiltriert.
- 2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man die Erythrozyten zunächst bei 10-15 °C 5-15 min lang mit verdünnter Lösung von ß-PropioIacton in einem Verhältnis von 4-12 g ß-PropioIacton je Liter Erythrozyten-sediment behandelt und anschliessend das Behandlungsmittel und seine Reaktionsprodukte mit schwach alkalischen Lösungen auswäscht.
- 3. Verfahren zur Herstellung von Hämoglobinpräparaten mit einer Verweilzeit von 4 bis zu 9 h im Blut, dadurch gekennzeichnet, dass man menschliche Erythrozyten mit schwach alkalischer Waschlösung mindestens 4mal behandelt, dann hämolysiert und mit einem Kationenaustauscher in H+-Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0-5,5 abgesunken ist, dann von Harz und ausgefällter Stromamasse s durch Kühlzentrifugation befreit, mit Wasser auf eine gewünschte Hämoglobinkonzentration von 5-9% verdünnt, mit IN Natronlauge einen pH-Wert von 7-9 einstellt, dann unter einem Vakuum von 26,6 mbar 10 min lang rührt, Stickstoffgas darüberleitet, bis der Sauerstoff im Gefäss io durch reinen Stickstoff verdrängt ist, 0,25-1,25 g Pyridoxal-5-phosphat pro Liter 5-9%ige Hämoglobinlösung zugibt und unter Stickstoff 1 h lang bei Zimmertemperatur weiterrührt, und anschliessend mit der 5- bis lOfachen molaren Menge Natriumborhydrid gegenüber dem Pyridoxal-15 phosphat weitere 20 min lang bei Zimmertemperatur verrührt, danach wieder evakuiert, einen Dialdehyd der Formel OCH-(CH2)n-CHO, worin n 1-6 bedeutet, in 9facher molarer Menge zum Hämoglobin zugibt, 45 min lang unter Stickstoff rührt, unvernetztes Hämoglobin dann durch Aussalzen 2o oder Ultrafiltration abtrennt, mit IN Natronlauge auf einen ph-Wert von 7,5 bei 20 CC einstellt, Elektrolyte durch Salzzusätze auf dem Blutplasma analoge Konzentrationen ergänzt, 22 g Glukosemonohydrat pro Liter zugibt und sterilfiltriert.25 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Erythrozyten zunächst bei 10-15 °C 5-15 min lang mit verdünnter Lösung von ß-Propiolacton in einem Verhältnis von 4-12 g ß-Propiolacton je Liter Erythrozyten-sediment behandelt und anschliessend das Behandlungsmit-30 tel und seine Reaktionsprodukte mit schwach alkalischen Lösungen auswäscht.
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