CH638563A5 - Process for the preparation of a mixture of androsta-1,4-diene-3,17-dione and androst-4-ene-3,17-dione - Google Patents

Process for the preparation of a mixture of androsta-1,4-diene-3,17-dione and androst-4-ene-3,17-dione Download PDF

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CH638563A5
CH638563A5 CH718582A CH718582A CH638563A5 CH 638563 A5 CH638563 A5 CH 638563A5 CH 718582 A CH718582 A CH 718582A CH 718582 A CH718582 A CH 718582A CH 638563 A5 CH638563 A5 CH 638563A5
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steroid
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CH718582A
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Merle Gene Wovcha
Candice Brenda Biggs
Thomas Richard Pyke
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Upjohn Co
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    • C07J1/0003—Androstane derivatives
    • C07J1/0011—Androstane derivatives substituted in position 17 by a keto group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

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2
PATENTANSPRUCH Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden insbeson-
Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aus Androsta- dere neue Mikroorganismenmutanten, nämlich Mycobacte-l,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion, dadurch rium fortuitum NRRL B-8153 und Mycobacterium phlei gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismusmutanten NRRL B-8154 zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Cory- 5 Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffato-nebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, men zu ADD und AD benutzt. Beispiele für geeignete Steroid-Serratia und Streptomyces, der sich durch seine Fähigkeit zum substrate sind Sitosterine, Cholesterine, Stigmasterine, Camselektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 pesterin und ähnliche Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen. Diese Steroidsub bzw. Ansammlung von Androsta-l,4-dien-3,17-dion und io strate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Androst-4-en-3,17-dion in der Gärbrühe auszeichnet, in einem Einsatz gelangen.
wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegen- Wie bereits erwähnt, erhält man durch ihre Fähigkeit zum wart eines Steroids mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffato- selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 men in der 17-Alkylseitenkette züchtet. bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnete und
15 in der Nährbrühe ADD und AD anhäufende Mutanten durch Mutation von Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.
Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen 20 Zur Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung wurde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur wurden in der später beschriebenen Weise die Arten Myco-veröffentlicht. Die früheste einschlägige Arbeit stammt offen- bacterium fortuitum ATCC 6842 und Mycobacterium phlei sichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937, UC 3533 zu neuen Labormikroorganismusmutanten mutiert.
«Berichte» 70,470 und «Berichte» 70,2079. AaO wird über Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17ß-Hydroxysteroiden 25 von ATCC 6842 folgendes: «J.C. Cruz 2. Cold abscess. Acta mit Hilfe von Gärhefe berichtet. Im Jahre 1952 (vgl. US-PS Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Medium 90 37C». M. fortui-2602769) berichten Peterson und Murray über die 1 la-Hydro- tum ATCC 6842 baut Sterine nicht selektiv zu niedrigmoleku-xylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigri- laren Verbindungen, beispielsweise CO2 + H2O, ab. Somit cans. 1972 (vgl. US-PS 3684657) berichten Kraychy und Mit- eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Ste-arbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von ste- 30 roidabbau.
roidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 und M.
mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette phlei UC 3533 (UC steht für «Kultursammlung der Firma The mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Upjohn Company») mittels Nitrosoguanidin erhält man neue
Androst-4-en-3,17-dion, Androst-l,4-dien-3,17-dion und 20a- Mutanten, die selektiv Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 Hydroxymethyl-pregna-l,4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS 35 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen zu ADD und AD
3759791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selek- abzubauen vermögen. Diesen Mikroorganismusmutanten wur-tive mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3,l 7-dion den durch das Northern Regional Research Laboratory, U.S. durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigma- Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA (die stanreihe mit mindetens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkyl- Mikroorganismusmutanten wurden an dieser Hinterlegungsseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805. 40 stelle in der Dauersammlung am 12. Februar 1976 hinterlegt)
Mutanten, die durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau die Nummern NRRL B-8153 und NRRL B-8154 zugeteilt, von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliess- Eine Subkultur dieser Mikroorganismen ist auf Anfrage von lieh 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnet sind und in der dieser Hinterlegungsstelle frei erhältlich. Es sei jedoch darauf Gärbrühe (fermentation beer) Androsta-l,4-dien-3,17-dion (im hingewiesen, dass die Verfügbarkeit bzw. Aushändigung der folgenden ADD bezeichnet) und Androst-4-en-3,l 7-dion (im 45 Kulturen keine Lizenz an einem etwa auf die vorliegende folgenden als AD bezeichnet) anhäufen, erhält man nach den Erfindung erteilten Patent begründet.
im folgenden näher erläuterten Mutationsmassnahmen oder Die im Rahmen des Verfahrens gemäss der Erfindung ver anderen Mutationsmassnahmen aus Mikroorganismen der wendeten Mikroorganismen unterscheiden sich von der aus Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebac- der genannten US-PS 3759791 bekannten Art Mycobacterium terium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protami- 50 NRRL B-3805. Die Mycobacterium-Art NRRL B-3805 zeigt nobacter, Serratia und Streptomyces, vorzugsweise Mycobac- die allgemeinen Eigenschaften von Mycobacterium vaccae. terium. Beispiele für Arten dieser Gattungen sind M. phlei, M. Bei letzterer Art handelt es sich um eine von den verwendeten smegmatis, M. rhodochrous, M. mueosum, M. fortuitum und Mycobacterium-Arten M. fortuitum und M. phlei deutlich ver-M. butyricum. schiedene Art. Bezüglich eines Vergleichs dieser Mikroorga-
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines 55 nismen siehe «Bergey's Manual of Determinative Bacterio-Gemisches aus Androsta-l,4-dien-3,l7-dion und Androst- l0gy», 8. Ausgabe, The Williams und Wilkins Company, 1974,
4-en-3,l 7-dion ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen Seiten 695 und 696.
Mikroorganismusmutanten aus der Gruppe Arthrobacter, Die Morphologie und die Chemikalien bzw. Drogenemp-
Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, findlichkeit von M. fortuitum NRRL B-8153 und M. phlei Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, der eo NRRL B-8154 sind von den entsprechenden Eigenschaften sich durch seine Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroi- der Ausgangsarten M. fortuitum ATCC 6842 und M. phlei UC den mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Koh- 3533 nicht zu unterscheiden. Beide M.-fortuitum- und M. lenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von phlei-Kulturen stellen säurefeste, unbewegliche, nicht sporen-
Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,l 7-dion in bildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ord-der Gärbrühe auszeichnet, in einem wässrigen Nährmedium es nung Actinomycetales dar. Nach der Runyons-Klassifizierung unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 (vgl. E.H. Runyon «Med. Clin. North America», 43,273 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylsei- [1959]) handelt es sich bei M. fortuitum um ein nichtchromo-tenkette züchtet. genes, der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium, d.h. es
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wächst rasch bei niedriger Temperatur unter Bildung nichtpig-mentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien. M. phlei stellt ebenfalls ein der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium dar, das jedoch bei Züchtung auf einfach zusammengesetzten Medien tief gelbe bis orange Kolonien bildet.
M. fortuitum ATCC 6842 und M. fortuitum NRRL B-8153 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nichtselektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum NRRL B-8153 erfolgt dagegen ein selektiver Ste-roidabbau. Diese Eigenschaft von M. fortuitum NRRL B-8153 stellt eine in hohem Masse wertvolle Eigenschaft dar. Auch M. phlei UC 3533 und M. phlei NRRL B-8154 unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle. M. phlei UC 3533 bewirkt einen nichtselektiven Steroidabbau, während M. phlei NRRL B-8154 einen selektiven Abbau von Steroiden bewirkt.
Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 und M. phlei UC 3533 zu M. fortuitum NRRL B-8153 und M. phlei NRRL B-8154 erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmassnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Mutationsmassnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutations- und Umwandlungs- bzw. Transformationsmassnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder equivalente Massnahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden.
Die selektive Umwandlung lässt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum NRRL B-8153 oder M. phlei NRRL B-8154 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/1. Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweissartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glukose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Kasein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt zu werden, da vor der Sterilisation des Mediums normalerweise Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.
Das Umwandlungsverfahren dauert im allgemeinen etwa 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur reicht gewöhnlich von etwa 25° bis etwa 37 °C, für M. fortuitum NRRL B-8153 vorzugsweise 30 °C und für M. phlei NRRL B-8154 vorzugsweise 35 °C. Der Inhalt des Umwandlungsgefässes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des jeweiligen Mikroorganismus vorzugsweise bewegt. Auf diese Weise lässt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.
Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus zwei Volumina Äthylacetat und drei Volumina Cyclohexan, kann das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert werden. So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentationsoder Umwandlungsgemisch einschliesslich der Gärbrühe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind vorzugsweise Dichlorme-than, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat, Benzol und dergleichen.
Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, voneinander getrennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gär- oder Fermentationsbrühe lässt sich mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.
Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der die gewünschten umgewandelten Steroide enthaltende Destillationsrückstand lässt sich in einer Mindestmenge eines 20:80-Äthylacetat/Cyclohexan-Gemischs lösen. Die erhaltene Lösung kann dann auf trockenem Silikagel unter Verwendung eines 20:80-Äthylacetat/Benzol-Gemischs als Entwickler chromatographiert werden. ADD und AD lassen sich aus dem Silikagel durch Eluieren mit einem 15:85-Äthylacetat/Chloroform-Gemisch abtrennen. Die Einzelverbindungen lassen sich aus dem Gemisch durch Verdampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren aus Hexan isolieren.
Die bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens als gewünschte Endprodukte anfallenden Verbindungen ADD und AD stellen bekannte Steroidzwischenprodukte dar. So eignen sich diese Verbindungen als Zwischenprodukte bei der Synthese geeigneter Steroidhormone. Aus ADD lässt sich beispielsweise nach dem aus der US-PS 3274183 bekannten Verfahren Östron herstellen. Aus AD kann man gemäss den Lehren der US-PS 2 143453, 2253798, 2264888 und 2356154 Testosteron gewinnen.
Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäss der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben «Gewichtsprozente». Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nicht anders angegeben, Volumenangaben.
Beispiel 1
Herstellung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8153 aus M. fortuitum ATCC 6842:
(a) Nitrosoguanidin-Mutagenese:
Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur von 28 °C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen :
Nährbrühe (Difco) 8 g/1
Hefeextrakt 1 g/1
Glyzerin 5 g/1
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
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Der pH-Wert des Mediums wird mit ln-NaOH vor einer 20minütigen Sterilisation bei 121 °C auf 7,0 eingestellt.
Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa 5 x 108/ml wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1m-Natriumcitrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d.h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schliesslich wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 p. g/ml zugesetzt. Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 37 °C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen O,lm-Kaliumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schliesslich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung :
NH4NO3 1,0 g/1
K2HPO4 0,25 g/1
MgS04-7H20 0,25 g/1
NaCl 0,005 g/1
FeS04-7H20 0,001 g/1
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
durchgemischt und schliesslich in sterile Petri-Schalen gegossen. Bei diesen Massnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch durch Durchmischen des heissen Gemischs und durch Abflammen 5 der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleichmässige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird.
10 Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden Testplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt. Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 28 °C werden mit Hilfe 15 steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet. Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen Phenotypus aufweisen, werden dann in Schüttelflaschen 20 ausgewertet.
(c) Schüttelflaschenauswertung:
Es werden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammenset-25 zung verwendet:
resuspendiert. Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20minütigen Sterilisieren bei 121 °C mit ln-HCl auf 7,0 eingestellt. Endlich werden die Zellen zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet.
(b) Auswahl und Isolierung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8153:
Die in der geschilderten Weise mutagenisierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fraser und Jerrel, 1963 «J. Biol. Chem.», 205,291 bis 295):
NH4CI 3,0 g/1
Harnstoff 0,5 g/1
Cerelose 10,0 g/1
30 KH2PO4 0,5 g/1
MgS04-7H20 0,5 g/1
FeCl3-6H20 0,5 g/1
CaCOa 3,0 g/1
Tween 80* 0,5 g/1
35 mit Wasser aus dem Hahn aufgefüllt auf 1 Liter
* Atlas Refinery, Inc., Newark, New Jersey
Glyzerin 10,0 g/1
K2HPO4 0,5 g/1 40
NH4CI 1,0 g/1
MgS04-7H20 0,5 g/1
FeCl3-6H20 0,05 g/1
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
45
Nach Zugabe von 15 g/1 Agar wird das Medium 20 min lang in einem Autoklaven auf eine Temperatur von 121 °C erhitzt und dann in sterile Petri-Schalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutageneseverfahren gebildeten Nährauxotro- 50 phe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 28 °C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete 55 Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollplatten repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G.E. Peter-son, H.L. Lewis und J.R. Davis «Préparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sour- 60 ces in agar media», J. Lipid Research 3,275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter (a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/1 Agar und 1,0 g/1 eines geeigneten Kohlenstofflieferanten werden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, 65 worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 121 °C im Autoklaven erhitzt wird. Das sterile, heisse Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäss gegossen, mehrere min lang
Hierauf werden in das Medium 1 g/1 Sojamehl und dann 30 g/1 Sitosterin eingemischt. Nach 30minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklaven auf 121 °C werden sie auf 28 °C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts geimpft:
Die gereinigten Isolate aus Stufe (b) werden bei einer Temperatur von 28 °C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatguts der folgenden Zusammensetzung:
Nährbrühe (Difco)
Hefeextrakt
Glyzerin mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf
8 g/1 lg/1 5 g/1 11
wird eine von einem geneigten Agar entnommene Öse voll Zellen verwendet. Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 30minütigen Erhitzen der Flasche auf 121 °C in einem Autoklaven mit ln-NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28 °C inkubiert.
Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500-ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 30 °C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit drei Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d.h.
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zwei Volumina Äthylacetat und drei Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/Fliissig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit von ADD und AD bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch den neuen Mutanten aus dem Muttermycobacterium M. fortuitum ATCC 6842. 5
Beispiel 2
Umwandlung von Sitosterin in ADD und AD:
Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel 1 (c). Dieses Medium wird durch 30minütiges Erhitzen io im Autoklaven auf 121 °C sterilisiert, dann auf 30 °C abgekühlt und schliesslich mit 10 Teilen einer Saatkultur des Mutanten Mycobacterium M. fortuitum NRRL B-8153, die entsprechend Beispiel 1 (c) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegung 336 h lang bei ei-15 ner Temperatur von 30 °C zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Dichlormethan extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann durch Vakuumdestillation vom Lösungsmittel befreit. Hierauf wird der 20 erhaltene Destillationsrückstand in einer Mindestmenge eines 20:80-Äthylacetat/Cyclohexan-Gemischs gelöst, worauf die Lösung auf trockenem Silikagel unter Verwendung eines 20: 80-Äthylacetat/Benzol-Lösungsmittelsystems chromatogra-phiert wird. Die Anwesenheit von Androst-4-en-3,l7-dion und 25 Androsta-l,4-dien-3,17-dion ergibt sich aus einem Dünn-schichtchromatogramm. Die erhaltenen Verbindungen werden aus dem Silikagel durch Eluieren mit einem 15:85-Äthylacetat/Chloroform-Lösungsmittelsystems abgetrennt, worauf die Einzelverbindungen durch Verdampfen des 30 Lösungsmittels und Umkristallisieren des Verdampfungsrückstands aus Hexan isoliert werden.
Beispiel 3
Durch Ersatz von M. fortuitum NRRL B-8153 durch M. 35 phlei NRRL B-8154 in Beispiel 2 und Ändern der Inkubationstemperatur von 30 °C auf 35 °C erhält man ebenfalls ein Gemisch aus ADD undAD.
Beispiel 4
Durch Ersatz des Sitosterins durch Cholesterin in den Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADD und AD.
Beispiel 5
Durch Ersatz des Sitosterins durch Stigmasterin in den Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADD und AD.
Beispiel 6
Durch Ersatz des Sitosterins durch Campesterin in den Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADD und AD.
Beispiel 7
Durch Zugabe einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 6 zu dem Sitosterin im Beispiel 2 und 3 oder durch Ersatz des Sitosterins in den Beispielen 2 und 3 durch eine Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 6 erhält man ebenfalls ein Gemisch aus ADD und AD.
Beispiel 8
Durch Ersatz von Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 bzw. Mycobacterium phlei UC 3533 im Beispiel 1 durch einen Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia oder Streptomyces erhält man Mikroorganismusmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und zur Anhäufung von ADD und AD in der Gärbrühe auszeichnen.
Beispiel 9
Durch Ersatz des M. fortuitum NRRL B-8153 bzw. M. phlei NRRL B-8154 in den Beispielen 2 bis 7 durch die gemäss Beispiel 8 erhaltenen Mutanten erhält man ebenfalls ein Gemisch aus ADD und AD.
G
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