CH639670A5

CH639670A5 - Esuronil esosaminoglicano solfato naturale, procedimento per la sua preparazione.

Info

Publication number: CH639670A5
Application number: CH826978A
Authority: CH
Inventors: Fernando Fussi; Gianfranco Fedeli
Original assignee: Hepar Chimie Sa
Priority date: 1977-08-10
Filing date: 1978-08-03
Publication date: 1983-11-30
Also published as: DE2835096A1; US4230699A; IT7826282A0; DE2835096C2; GB2007693B; JPS5432609A; IT1158896B; US4264733A; JPS6341921B2; GB2007693A

Description

La presente invenzione concerne un eteropolisaccaride naturale, più precisamente un esuronil esosamino-glicano 15 solfato naturale, ottenuto per estrazione da organi1 animali, il quale è dotato di attività anticoagulante, antitrombotica e chiarificante.

La trombosi spesso provoca invalidità permanente, ed è uno dei più frequenti fattori di mortalità, nell'ambito del-20 le malattie cardiovascolari.

Nel termine generico di trombosi si possono comprendere stati di ipercoagulabilità la cui origine può essere ricondotta a:

— «fattori di rischio» che determinano uno stato trom-25 bogenico quale ad esempio il fumo, gli stress, l'uso prolungato di antifecondativi di tipo progestinico, ecc.;

— fattori ereditari quali l'assenza di fattori inibitori della coagulazione (particolarmente l'antitrombina III);

— fattori eziologici di origine varia e talvolta non an-30 cora ben chiarita come modificazioni nella aggregazione piastrinica ecc.;

— fattori correlati ad un temporaneo rallentamento della circolazione sanguigna quale si verifica ad esempio successivamente ad interventi chirurgici sotto narcosi.

35 Le conseguenze patologiche conseguenti ad uno stato «trombogenico» determinato da uno o più dei fattori sopra elencati possono essere le seguenti:

— tromoembolie polmonari, cerebrali, coronariche, e infarto;

4o — tromboflebiti, sindromi varicose;

— disseminazione diffusa di microtrombi intravascolari.

A fronte di una fenomenologia tanto imponente a tut-t'oggi è possibile far ricorso a due tipi di strategia:

45 1) l'impiego di agenti trombolitici

2) la prevenzione degli stati trombogenici e delle loro conseguenze. Data la gravità e la rapidità con cui si può evolvere la trombosi, è chiaro che il secondo tipo di strategia sarebbe di gran lunga la migliore.

so Per affrontare su basi preventive il problema della trombosi sono finora disponibili due categorie di farmaci; gli anticoagulanti orali (cumaruia e derivati) e l'eparina.

Gli anticoagulanti orali (cumarina e derivati) agiscono a livello epatico bloccando i due fattori dell'emocoagula-55 zione: proconvertina e protrombina. Questi anticoagulanti tuttavia mal si prestano ad una prolungata terapia ed inoltre, hanno una scarsa attività antitrombotica perché non agiscono su altri fattori dell'emocoagulazione particolarmente implicati nella genesi della trombosi, primi fra tutti 60 il fattore XA e i fattori piastrinici.

L'eparina si presenta sotto questo aspetto più vantaggiosa in quanto agisce su vari fattori plasmatici dell'emo-coagulazione e particolarmente sulla trombina, sul fattore XA ed anche sui fattori XII, XI e IX oltre che sul fattore 65 piastrinico denominato PF4. Tutte queste azioni vanno ricondotte alla capacità specifica da parte dell'eparina di attivare l'inibitore dei fattori della coagulazione sopra elencati. Questo inibitore che è presente nel plasma si chiama

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antitrombina III e richiede appunto come cofattore per esplicare la propria azione la presenza di eparina.

Purtroppo la terapia con eparina presenta due inconvenienti: anzitutto è attiva soltanto per via parenterale ed il suo effetto non sussiste per più di 8-12 ore, per cui è difficilmente realizzabile una profilassi prolungata nel tempo che prevede 2 iniezioni giornaliere di eparina. Secondariamente l'eparina non ha solo un effetto antitrombotico ma anche un effetto anticoagulante in toto. Ora, se questo secondo effetto è in taluni casi favorevole, in altri casi il rischio di emorragia, se la terapia non è adattata al singolo paziente, può essere un grave inconveniente a fronte dei vantaggi, peraltro indiscutibili, di una profilassi della trombosi.

È stato ora trovato e costituisce l'oggetto principale della presente invenzione che un eteropolisaccaride, più precisamente un esuronil esosaminoglicano solfato, ottenuto per estrazione da organi animali, non soltanto è dotato di attività anticoagulante, antitrombotica e chiarificante, ma è inoltre somministrabile sia per via orale che per via parenterale, è assorbibile attraverso la barriera intestinale e per via cutanea ed è dotato di un- rapporto attività antitrombotica/anticoagulante favorevole rispetto all'eparina.

Per l'identificazione del prodotto secondo la presente invenzione si fa riferimento ai seguenti dati:

Esosamina dopo idrolisi (reazione con p-dimetilammino-benzaldeide): 27 ±3%

S04= organico dopo idrolisi (titolazioni con naftarsone): 27 d= 4%

Gruppi acetilici dopo idrolisi: 7 ± 1 %

Sodio (assorbimento atomico): 10 ± 2%

Rapporto molare acidi uranici : esosammina, solfato : acetile : sodio = 1:1, 2:2:1, 2:3 circa pM (cromatografia per esclusione su gel): 8000-16 000 Potere rotatorio specifico [a]D20 = —15°/ —30° Elettroforesi su acetato di cellulosa (tampone piridina-acido acetico-acqua = 1:10:229; pH 4,5 e sviluppo con blu di toluidina):

Una banda principale con mobilità elettroforetica U = 1,90-1,95 X IO-4 cmV-'sec.-1.

Spettro infrarosso: si riscontrano bande caratteristiche a 1740, 1647, 1555, 1375, 1235 e 1050 cm"1.

Solubilità: l'eteropolisaccaride della presente invenzione è solubile in acqua, in acidi minerali diluiti e in alcali fissati diluiti, però è insolubile in etanolo.

Ai fini dell'identificazione si presta inoltre la prova seguente: ad 1 mi di una soluzione acquosa al 2% del prodotto secondo la presente invenzione si aggiungono 3 mi di una soluzione acquosa al 2% di cloruro di cetilpiridinio riscaldato a 40°C. Si ottiene un voluminoso precipitato bianco che viene separato per centrifugazione. Il precipitato viene ripreso con 3 mi di una soluzione 0,7 M di KCl: si ottiene la completa dissoluzione del precipitato.

Un altro aspetto della presente invenzione risiede nel procedimento estrattivo per l'ottenimento del prodotto sopra identificato. Tale procedimento si caratterizza per le seguenti operazioni:

a) idrolisi di un organo animale, macinato e sospeso in acqua, con un enzima proteolitico;

b) precipitazione del liquido limpido con un solvente miscibile con acqua;

c) solubilizzazione del precipitato in una soluzione di un sale di un acido minerale forte di un catione monovalente oppure bivalente (per es. sodio, ammonio, calcio), detta soluzione salina avendo forza ionica equivalente a quella di NaCl 0,8 M;

d) aggiunta a temperatura non maggiore di 80°C di un eccesso di un alogenuro di ammonio quaternario, scelto fra quelli aventi nella molecola almeno un radicale alifatico con numero di atomi di carbonio maggiore di 12, con formazione di un complesso che rimane in soluzione mentre si forma un precipitato che viene eliminato; 5 e) precipitazione del complesso per diluizione con acqua fino a che si ottiene una forza ionica non superiore a quella di NaCl 0,4 M;

f) isolamento del complesso precipitato e sua solubilizzazione in soluzione salina avente le stesse caratteristiche io di quella dello stadio (c);

g) precipitazione del prodotto desiderato con un solvente miscibile con acqua e suo essiccamento.

Considerato ora in particolare i vari passaggi del procedimento sopra definito, si devono fare le seguenti punis tualizzazioni. L'organo animale che viene sottoposto all'idrolisi è preferibilmente fresco o congelato.

Tra gli organi animali utilizzabili si preferiscono il polmone e il duodeno. L'enzima proteolitico è scelto tra endo-peptidasi vegetali (papaina, bromelina, ficina) o batteriche, 20 e dal tipo di enzima dipendono le condizioni in cui viene effettuata l'idrolisi. In particolare si preferisce operare con calore blando, per tempi non inferiori a 3 ore, e fino a quando il valore dell'azoto a-amminico (come determinato per mezzo del metodo di Soerensen) non subisce ulteriori 23 variazioni.

Per la precipitazione del liquido limpido dopo idrolisi il solvente usato è scelto tra acetone, diossano, metanolo, etanolo e simili.

L'alogenuro d'i ammonio quaternario dello stadio (d) è 30 scelto tra cloruri e bromuri di cetilpiridinio e cetiltrimetilammonio ed il relativo eccesso è di almeno 0,5 g di sale di ammonio quaternario per kg di organo animale di partenza.

Infine per la precipitazione del prodotto finale (stadio g) si preferisce l'impiego di acetone ed il precipitato viene 35 essiccato sotto vuoto o liofilizzato.

Vengono ora forniti due esempi, aventi titolo illustrativo ma non limitativo, del processo di estrazione secondo la presente invenzione.

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Esempio 1

Kg 100 di duodeno porcino sono stati macinati e sospesi in 50 lt di acqua. Dopo riscaldamento a 40°C si sono aggiunti 200 g di papaina sospesa in 25 lt di acqua. Scal-45 data tutta la massa a 60°C si è proceduto nella lisi per 3 h.

Al termine si è scaldata la miscela a 90°C per 15'.

Tutta la massa è stata filtrata per filtro pressa con 4 kg di Standard Supercell, agente coadiuvante della filtrazione a base di diatomee. Il filtrato limpido è stato con-50 centrato a 50 lt, quindi è stato trattato con 150 lt di etanolo e tenuto a riposo per una notte. Allontanato il surnatante idroalcolico, il precipitato è stato essiccato con cura, sospeso in 25 lt di acqua contenente 1200 g di NaCl e filtrato. Al filtrato si sono aggiunti, sotto agitazione, 25 lt di NaCl 55 0,8M contenenti 50 g di cetil-trimetilammonio cloruro e si è scaldato a 40°C. La miscela è stata filtrata per filtro pressa con 2 kg di detto coadiuvante della filtrazione e il filtrato limpido è stato trattato con kg 2 di detto coadiuvante della filtrazione e diluito sotto agitazione con lt 50 di acqua. 60 Scaldato a 40°C si è raccolto il precipitato per filtrazione sotto vuoto. Il pannello di precipitato è stato sospeso in 10 lt di NaCl 0,8M e scaldato a 40°C. Quindi si è filtrato e il liquido limpido è stato trattato sotto agitazione con 1,5 volumi di acetone e tenuto a riposo per una notte. Si 65 allontana il surnatante idroacetonico. Il precipitato è stato lavato due volte con 5 lt per volta di acetone al 70% e quindi disidratato con acetone anidro. Alla fine si è polverizzato e si è essiccato sotto vuoto.

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Resa g 8 di polvere bianca-avorio, leggermente igroscopica con le seguenti caratteristiche:

Solubilità in acqua: completa

[a]DZ0: -18°

Acidi uranici: 28%

Esosamine: 30%

S04= organico: 26,5%

Attività anticoagulante: 25 U/mg (USP)

Rapporto attività antitrombotica/anticoagulante (prova di Yin/prova KCCT) = 2

Attività chiarificante: 125 ULI/mg (unità lipasemiche internazionali).

In relazione all'attività chiarificante, essa viene connessa all'attività lipasemica, ossia al numero minimo di unità lipasemiche internazionali (ULI) che, somministrando per via endovena la sostanza in esame a ratti nella misura di

I mg per kg di peso corporeo, si riscontrano in un litro di plasma. A sua volta per unità lipasemica internazionale, si intende quell'attività eh idrolizza 1 micromole di acido oleico al minuto primo.

Esempio 2

Kg 50 di polmone bovino sono stati macinati e sospesi in 75 lt di acqua. Dopo riscaldamento a 40°C sono stati aggiunti 200 g di papaina sospesa in 25 lt di acqua e si è scaldata la miscela a 65°C per 3 h. Scaduto il tempo si è scaldata la miscela a 90°C per 30'.

Quindi si è separato il liquido per filtrazione, e il filtrato è stato concentrato a 50 lt e filtrato nuovamente. Al filtrato sono stati aggiunti 100 lt di acetone e quindi si è tenuto a riposo per una notte. Separato il surnatante il precipitato è stato ripreso con 50 lt di NaCl 0,8M contenente 50 g di cetilpiridino cloruro. Si è quindi scaldata la miscela a 40°C e si è filtrato con l'aiuto di 2 kg di detto coadiuvante della filtrazione.

Il filtrato è stato diluito con 50 lt di acqua contenente 500 g di Santard Supercell in sospensione. È stato raccolto il panello di precipitato sul filtro. Il precipitato è stato sospeso in 10 lt di NaCl 0,8M e filtrato. Il filtrato limpido è stato lavato per agitazione con 2 lt di cloroformio. Separata la fase cloroformica, la fase acquosa è stata nuovamente filtrata e precipitata con 1,5 volumi di alcool etilico.

II precipitato è stato lavato e disidratato con alcool, quindi sciolto in 100 mi di acqua. La soluzione è stata filtrata per membrana e liofilizzata.

Resa g 6,9 di polvere bianca-avorio con le seguenti caratteristiche:

L'eteropolisaccaride della presente invenzione ottenuto secondo il procedimento sopra descritto è stato sottoposto a saggi per determinare le sue proprietà farmacologiche e le sue attività:

Tossicità acuta

Somministrato a cavie, ratti, topi e conigli fino alla dose di 400 mg/kg non. ha dato luogo ad effetti tossici.

io DL51

DLa

15

l.p.

orale i. v.

i. p. orale i. v.

(topo) (topo) (topo)

(ratto) (ratto) (ratto)

1615 mg/kg

> 6000 mg/kg 1000 mg/kg)

1463 mg/kg

> 6000 mg/kg

150 mg/kg

Prova di attività chiarificante 1) Ediol-test: 100-50 ULI/mg.

20 2) Triton test: i lipidi del siero in ratti trattati con triton vengono diminuiti in modo significativo mediante somministrazione di HP-80.

3) Prova della dieta eterogenica: quando viene aggiunto nella dose di 1% ad una dieta semipurificata addizio-25 nata con colesterolo e acido colico, HP-80 è in grado di abbassare i liquidi del siero in conigli.

Attività anti-coagulante e antitrombotica in vitro Attività anticoagulante (USP): 25-40 U/mg 30 Tempo di coagulazione caolino-cefalina (KCCT): 14-22 U/mg

Prova di Yin/KCCT: 1,8-2,5 (Eparina = 1).

Attività antitrombotica 35 Applicando il Chandler Loop Test si è ottenuto un effetto statisticamente significativo sul movimento del trombo su plasma di ratto.

Alla luce delle attività precedenti si prevede quindi un impiego terapeutico, per via orale e per via parenterale, a 40 dosaggi giornalieri di 100-200 mg, per i casi seguenti:

— Prevenzione di tromboembolie post-operatorie.

— Prevenzione di fatti trombotici susseguenti a uno stato trombogenico quale ad esempio quello che insorge in donne fertili in corso di trattamento prolungato con anticon-

45 cezionali orali.

— Prevenzione delle trombosi venose profonde.

— Prevenzione degli stati di ipercoagulabilità.

Solubilità in acqua: Rotazione [a]D20:

Acidi uranici: Esosammine: S04= organico:

Attività anticoagulante: Attività chiarificante: Attività antitrombotica/ anticoagulante:

completa

-24°

31,2%

33,1%

22,8%

28 U/mg (USP) 115-ULI/mg

2.

50

55

V

Claims

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1. Esuronil esosaminoglicano solfato, caratterizzato dalle seguenti caratteristiche:

Esosamine dopo idrolisi: 29 ±3%

Acidi uranici dopo idrolisi: 27 ± 3 %

S04= organico dopo idrolisi: 27 ± 4%

Gruppi acetilici dopo idrolisi: 7 ± 1 %

Sodio dopo idrolisi: 10 ± 2%, in peso sul secco,

corrispondente ad un rapporto molare acidi uronici :

esosammina : solfato : acetile: sodio 1:1,2:2:1,2:3 pM (cromatografia per esclusione su gel): 8000-16.000 Potere rotatorio specifico [a]D20 = —30°/ —15°.

Elettroforesi su acetato di cellulosa (tampone piridina-acido acetico-acqua = 1:10:229; pH 4,5 e sviluppo con blu di toluidina) : 1 banda principale con mobilità elettroforeti-ca U = 1,90 — 1,95 X lO^cmV^sec-1.

Spettro infrarosso: si osservano bande caratteristiche a 1740, 1647, 1555, 1375, 1235 e 1050 cm"1.

Solubilità: solubile in acqua, in acidi minerali diluiti ed in alcali fissi diluiti; ma insoluble in etanolo.

2 a 5, caratterizzato dal fatto che l'idrolisi con enzima proteolitico viene continuata per almeno 3 ore.

2. Procedimento per l'ottenimento del prodotto secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dalle fasi che comprendono:

b) precipitazione del liquido limpido con un solvente miscibile con acqua;

c) solubilizzazione del precipitato in una soluzione di un sale di un acido minerale forte di un metallo alcalino, alca-lino-terroso o di ammonio', detta soluzione salina avendo forza ionica equivalente a quella di NaCl 0,8M;

d) aggiunta a temperatura non maggiore di 80°C di un eccesso di un alogenuro di ammonio quaternario scelto tra quelli aventi nella molecola almeno un radicale alifatico con numero di atomi di carbonio maggiore di 12, per cui si forma un complesso che rimane in soluzione, mentre si separa il precipitato contemporaneamente formatosi; detto alogenuro essendo aggiunto finché un'ulteriore aggiunta non provoca più precipitazione.

e) precipitazione del complesso per diluizione con acqua fino a che si ottiene una forza ionica non superiore a quella di NaCl 0,4M;

f) isolamento del complesso precipitato e sua solubilizzazione in soluzione salina avente le stesse caratteristiche di quella dello stadio (c), e g) precipitazione del prodotto desiderato con un solvente miscibile in acqua, e suo essiccamento.

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RIVENDICAZIONI

3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che l'idrolisi con enzima proteolitico viene effettuata su tessuto di polmone o di duodeno.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 2 o 3 caratterizzato dal fatto che l'enzima proteolitico è scelto tra pa-paina, bromelina, ficina, alcalasi, e neutrasi.

5. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 2 a 4 caratterizzato dal fatto che l'idrolisi enzimatica viene effettuata a caldo e fino a che il valore dell'azoto a-am-minico non subisce ulteriori variazioni.

6. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da

7. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 2 a 6, caratterizzato dal fatto che detto solvente miscibile con acqua del liquido limpido di idrolisi è scelto ti a acetone, diossano, metanolo et etanolo.

8. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 2 a 7, caratterizzato dal fatto che detto alogenuro di ammonio quaternario è scelto tra cloruri e bromuri di cetil-piri-dino e cetiltrimetilammonio.

9. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 2 a 8, caratterizzato dal fatto che detto solvente miscibile con acqua nella fase di precipitazione finale (fase g) è acetone.

10. Composizione farmaceutica, in particolare adatta 5 per la prevenzione di stati trombotici, caratterizzata dal comprendere quale ingrediente attivo il prodotto della rivendicazione 1 nella dose di 100-200 mg/die.

11. Esuronil esosaminoglicano solfato ottenuto dal procedimento secondo la rivendicazione 2.

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