CH639998A5

CH639998A5 - Verfahren zur isolierung und reindarstellung von enzymen und adsorptionsmittel zur durchfuehrung des verfahrens.

Info

Publication number: CH639998A5
Application number: CH373179A
Authority: CH
Inventors: Ulrich Prof Dr Zimmermann; Guenter Dr Pilwat; Mohammed Prof Dr Saleemuddin
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich
Priority date: 1978-06-28
Filing date: 1979-04-19
Publication date: 1983-12-15
Also published as: GB2024228B; SE7905611L; DE2828235C2; FR2429765A1; FR2429765B1; US4350767A; SE443801B; GB2024228A; DE2828235B1; JPS557099A; JPS6251589B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung und Reindarstellung von Enzymen aus einer aus tierischen Organen oder Geweben gebildeten Roh-Enzym-Lösung, bei dem ein die Bindung eines Enzyms bewirkendes Adsorptionsmittel in die Roh-Enzym-Lösung eingegeben und in dieser so lange belassen wird, bis die Bindung erfolgt ist, wonach das Adsorptionsmittel der Roh-Enzym-Lösung entnommen und das Enzym durch Elution mittels einer Lösung von dem Adsorptionsmittel abgetrennt wird.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Adsorptionsmittel zur Durchführung des Verfahrens.

Enzyme werden in vielen Anwendungsgebieten, beispielsweise in der klinischen Chemie, der Lebensmittelchemie, der Botanik, der Mikrobiologie, der Pharmakologie, ebenso wie in der Agrikulturchemie, eingesetzt. Dabei werden vielfach spezifische Enzyme, und zwar in hochreiner Form, benötigt.

Zwar sind Verfahren der eingangs bezeichneten Art bekannt, bei denen ein Adsorptionsmittel, wie beispielsweise Kieselgur, Aluminiumoxid, Kaolin oder auch Molekularsiebe, eingesetzt wird. Auch ist nach diesen bekannten Verfahren eine Reindarstellung vorbestimmter Enzyme bis zu einem gewissen Reinheitsgrad möglich. Jedoch gelingt es bei Verwendung der vorgenannten Adsorptionsmittel nicht, durch einmalige Adsorption und Elution ein spezifisches Enzym in hochreiner Form zu erhalten. Denn eine bevorzugte Bindung eines vorbestimmten Enzyms an Kieselgel ist praktisch nicht möglich.

Man hat daher auch weitere Verfahren zur Trennung von komplizierten Enzymgemischen entwickelt, die sich der Hochspannungselektrophorese, der Elektrodialyse oder auch der Chromatographie bedienen. Derartige Verfahren sind jedoch relativ aufwendig.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und ein zur Durchführung des Verfahrens einsetzbares Adsorptionsmittel der eingangs bezeichneten Art zu schaffen, nach dem und mittels dessen es möglich ist, ein vorbestimmtes Enzym aus einer Roh-Enzym-Lösung zu isolieren und in hochreiner Form darzustellen.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art gemäss der Erfindung dadurch gelöst, dass als Adsorptionsmittel Membranen von hämolysierten, menschlichen oder tierischen Erythrozyten in die Roh-Enzym-Lösung eingegeben werden, wobei zuvor von den Membranen Enzyme abgelöst werden, die gleiche oder nahezu gleiche Affinität hinsichtlich ihrer Bindung an die Membranen wie die der zu bindenen Enzyme aufweisen.

Das Verfahren gemäss der Erfindung ist einfach in der Durchführung und zudem billig, weil Tierblut oder ausdatiertes menschliches Blut verwendet werden kann und die Membranen mehrmals als Adsorptionsmittel einsetzbar sind. Es hat sich ausserdem gezeigt, dass schon bei einmaliger Adsorption und Elution Enzyme isoliert und in hochreiner Form dargestellt werden können.

Eine zweckmässige Ausführungsvariante des Verfahrens gemäss der Erfindung besteht darin, dass von den Membranen vor deren Eingabe in die Roh-Enzym-Lösung die Enzyme gleicher oder nahezu gleicher Affinität mittels der zur Elution vorgesehenen Lösung abgelöst werden. Bei mehrmaliger Verwendung der Membranen als Adsorptionsmittel ist somit kein besonderer Vorbereitungsschritt vor der Eingabe des Adsorptionsmittels in die Roh-Enzym-Lösung erforderlich.

Das Adsorptionsmittel gemäss der Erfindung besteht aus Membranen, die aus hämolysierten, menschlichen oder tierischen Erythrozyten gebildet worden sind, wobei die an den Membranen gebundene Menge an Enzymen mit einer dem zu bindenen Enzym gleicher oder nahezu gleicher Affinität hinsichtlich der Bindung an die Membranen geringer ist als es den zur Bildung der Membranen herangezogenen Erythrozyten entspricht.

Die bei der Hämolyse gebildeten Membranen sind über viele Tage lager- und einsetzbar. Dennoch kann es zweckmässig sein, die Membranen durch Vernetzungsmittel, wie Glutardialdehyd, zu stabilisieren, um somit - ohne eine Verringerung der Affinität des zu isolierenden Enzyms in Kauf nehmen zu müssen - eine Verlängerung der Lagerzeit um etwa den Faktor 2 für die Membranen zu erzielen. Hierzu können die Membranen mit einer 1 mM/1 Glutardialdehyd enthaltenden Lösung behandelt werden.

Ausführungsbeispiele:

Hämolyse von Erythrozyten zur Bildung von Membranen:

Als Ausgangsmaterial diente frisches menschliches Blut, ausdatiertes menschliches Blut von Blutbanken oder Blut von Ratte, Rind oder Schwein. Die Erythrozyten wurden zweimal mit isotoner NaCl-Lösung gewaschen. Die gewaschenen Erythrozyten wurden im Volumenverhältnis von 1:40 in eine 5 mM/1 Phosphat enthaltende Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 bei 4°C eingegeben. Nach der Hämolyse wurde die Suspension bei 15 OOOfacher Erdbeschleunigung 30 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Die gebildeten Membranen wurden sodann zweimal mit der vorgenannten Pufferlösung im gleichen Mischungsverhältnis gewaschen, um das Hämoglobin zu entfernen.

Herstellung des Adsorptionsmittels zur Isolierung und Reindarstellung des Enzyms Aldolase sowie des Enzyms

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Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase(GAPDH):

Die durch Hämolyse der Erythrozyten hergestellten Membranen wurden im Volumenverhältnis von 1:20 bei 4°C in 2"oiger NaCl-Lösung, die 5 mM/1 Phosphat enthielt, suspendiert und die Suspension eine Stunde lang gerührt. Die Membranen wurden sodann zentrifugiert und zweimal mit der vorgenannten Lösung gewaschen und anschliessend einmal mit einer 5 mM/1 Phosphat enthaltenden Pufferlösung eines pH-Wertes von 8,0 gewaschen.

Herstellung der Roh-Enzym-Lösungen:

Es wurden Roh-Enzym-Lösungen jeweils getrennt aus Muskeln, Leber, Niere und Gehirn von Mäusen sowie von Ratten hergestellt. Hierzu wurden 2 g der jeweiligen Probe mit einem Ultra-Turrax-Homogenisator 30 Sekunden lang zerkleinert und anschliessend 2 Minuten lang in einem Potter-Elvehjem-Glas-Homogenisator, der mit einem Teflon-Pistill ausgestattet war, in einer 5 mM/1 Phosphat enthaltenden Pufferlösung, die 10 mM/1 ß-Mercaptoäthanol enthielt, homogenisiert. Das Volumen des Homogenates wurde auf 40 ml gebracht, das Homogenat bei 4°C 1 Stunde lang gerührt und anschliessend bei etwa 15 OOOfacher Erdbeschleunigung 45 Minuten lang zentrifugiert. Zur Gewinnung der Roh-Enzym-Lösung wurde der Überstand durch ein Membranfilter mit dem Porendurchmesser von 0,4 [im filtriert.

Ausführungsbeispiel I Aus menschlichen Erythrozyten hergestelltes Adsorptionsmittel wurde im Volumenverhältnis 1:3 in aus Muskeln von Mäusen gebildeter Roh-Enzym-Lösung inkubiert und etwa 1 Stunde lang in dieser Lösung belassen. Danach wurden die Membranen zweimal mit einer 5 mM/1 Phosphat enthaltenden Pufferlösung bei 4°C gewaschen. Anschliessend wurden die Membranen zur Isolierung von Aldolase im Volumenverhältnis von 1:20 bei 4°C in eine 5 mM/1 Phosphat, 15 mM/1 NaCl und 2 mM/1 Fructose-1,6-diphosphat enthaltende Pufferlösung eines pH-Wertes von 8,0 inkubiert. Die so gebildete Suspension wurde 30 Minuten lang im Eisbad geschüttelt. Die Membranen wurden sodann abzentri-fugiert.

Die Bestimmung der Aldolase-Aktivität wurde nach der Methode von Sibley und Lehninger durchgeführt (Sibley, J.A. und Lehninger, A.L., J. Biol. Chem. 177, 859-872 (1949)).

Während die spezifische Aktivität der Aldolase in der Roh-Enzym-Lösung 0,01 Einheiten pro mg Protein betrug, betrug sie nach der Eluierung 0,1 Einheiten pro mg Protein.

Ausführungsbeispiel 2 Wie in Ausführungsbeispiel 1 wurde aus menschlichen Erythrozyten hergestelltes Adsorptionsmittel im Volumenverhältnis von 1:3 in aus Muskeln von Mäusen gebildete Roh-Enzym-Lösung inkubiert und etwa 1 Stunde lang in dieser Lösung belassen. Danach wurden die Membranen mit einer 5 mM/1 Phosphat, 15 mM/1 NaCl und 2 mM/1 Fructose-1,6-diphosphat enthaltenden Pufferlösung eines pH-Wertes von 8,0 gewaschen, wobei die so gebildete Suspension etwa 30 Minuten lang im Eisbad geschüttelt wurde. Zur Eluierung des Enzyms GAPDH wurden die Membranen in eine 5 mM/1 Phosphat und 2 mM/1 reduziertes Nikotinamid-Adenin-dinukleotid enthaltende Lösung gegeben und 90 Minuten lang darin belassen. Die Membranen wurden sodann abzentrifugiert.

Die Bestimmung des GAPDH wurde nach der Methode von Tanner und Gray durchgeführt (Tanner, M.J.A. und Gray, W.R., Biochem. J. 125,1109-1117 (1971)).

Während die spezifische Aktivität des GAPDH in der Roh-

Enzym-Lösung 7,4 Einheiten pro mg Protein betrug, betrug die spezifische GAPDH nach der Eluierung 153 Einheiten pro mg Protein.

Zur Kontrolle wurde eine weitere Reinheitsprüfung des Enzyms GAPDH mit einer Probe der mit dem Enzym belegten Membranen durchgeführt. Dabei wurde die Auflösung der Membranen, die Polyacrylamidgel-Elektrophorese in Gegenwart von SDS und das Anfärben nach der Methode von Fairbanks et al durchgeführt (vergleiche hierzu Fair-banks, G., Steck, T.L., and Wallach, F.D.H., Biochemistry 10,2606-2617 ( 1971 )). Bei der Gel-Elektrophorese trat das Enzym GAPDH als einzelne Bande auf, die einem Molekulargewicht von 37 000 zugeordnet werden konnte, was in guter Übereinstimmung anderen Werten aus der Literatur entspricht.

Ausführungsbeispiel 3 Wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, wurde das Enzym Aldolase isoliert und rein dargestellt. Im Unterscheid zu Ausführungsbeispiel 1 wurde eine aus der Leber von Mäusen hergestellte Roh-Enzym-Lösung verwendet. Die spezifische Aktivität des in der Roh-Enzym-Lösung enthaltenen Enzyms Aldolase betrug 0,01 Einheiten pro mg Protein, die spezifische Aktivität des Enzyms nach der Eluierung betrug 0,1 Einheiten pro mg Protein.

Ausführungsbeispiel 4 Wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben, wurde das Enzym GAPDH isoliert und rein dargestellt. Im Unterschied zu Ausführungsbeispiel 2 wurde eine aus der Leber von Mäusen hergestellte Roh-Enzym-Lösung verwendet. Die spezifische Aktivität des in der Roh-Enzym-Lösung enthaltenen Enzyms GAPDH betrug 1,1 Einheiten pro mg Protein, die spezifische Aktivität des Enzyms nach der Eluierung betrug 90 Einheiten pro mg Protein.

Ausführungsbeispiel 5 Wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben, wurde das Enzym GAPDH isoliert und rein dargestellt. Im Unterschied zu Ausführungsbeispiel 2 wurde eine aus der Niere von Mäusen hergestellte Roh-Enzym-Lösung verwendet. Die spezifische Aktivität des in der Roh-Enzym-Lösung enthaltenen Enzyms GAPDH betrug 1,0 Einheiten pro mg Protein, die spezifische Aktivität des Enzyms nach der Eluierung betrug 146 Einheiten pro mg Protein.

Ausführungsbeispiel 6 Wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben, wurde das Enzym GAPDH isoliert und rein dargestellt. Im Unterschied zu Ausführungsbeispiel 2 wurde eine aus dem Gehirn von Mäusen hergestellte Roh-Enzym-Lösung verwendet. Die spezifische Aktivität des in der Roh-Enzym-Lösung enthaltenen Enzyms GAPDH betrug 3,3 Einheiten pro mg Protein, die spezifische Aktivität des Enzyms nach der Eluierung betrug 144 Einheiten pro mg Protein.

Ausführungsbeispiel 7 Wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben, jedoch aus einer aus den Muskeln von Ratten hergestellten Roh-Enzym-Lösung wurde das Enzym GAPDH mit dem gleichen Ergebnis, wie in Ausführungsbeispiel 2 angegeben, rein dargestellt.

Ausführungsbeispiel 8 Es wurde wie in Ausführungsbeispiel 4 beschrieben verfahren. Die für die Isolierung vorbereiteten Membranen wurden jedoch vor ihrer Inkubierung in die Roh-Enzym-Lösung zu ihrer Vernetzung in einer 5 mM/1 Phosphat und

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1 mM/1 Glutardialdehyd enthaltenden Pufferlösung für 10 Minuten inkubiert. Anschliessend wurden die Membranen zentrifugiert und zweimal mit einer 5 mM/1 Phosphat enthaltenden Pufferlösung eines pH-Wertes von 8,0 gewaschen. Es wurden die in Ausführungsbeispiel 4 angegebenen Ergebnisse erhalten.

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Claims

639 998 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Isolierung und Reindarstellung von Enzymen aus einer aus tierischen Organen oder Geweben gebildeten Roh-Enzym-Lösung, bei dem ein die Bindung eines Enzyms bewirkendes Adsorptionsmittel in die Roh-Enzym-Lösung eingegeben und in dieser so lange belassen wird, bis die Bindung erfolgt ist, wonach das Adsorptionsmittel der Roh-Enzym-Lösung entnommen und das Enzym durch Elution mittels einer Lösung von dem Adsorptionsmittel abgetrennt wird, dadurch gekennzeichnet, dass als Adsorptionsmittel Membranen von hämolysierten, menschlichen oder tierischen Erythrozyten in die Roh-Enzym-Lösung eingegeben werden, wobei zuvor von den Membranen Enzyme abgelöst werden, die gleiche oder nahezu gleiche Affinität hinsichtlich ihrer Bindung an die Membran wie die der zu bindenden Enzyme aufweisen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass von den Membranen vor deren Eingabe in die Roh-Enzym-Lösung die Enzyme gleicher oder nahezu gleicher Affinität mittels der zu Elution vorgesehenen Lösung abgelöst werden.

3. Adsorptionsmittel zur Durchführung des Verfahrens gemäss den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es aus durch hämolysierte, menschliche oder tierische Erythrozyten gebildeten Membranen besteht, wobei die an den Membranen gebundene Menge an Enzymen mit einer dem zu bindenden Enzym gleicher oder nahezu gleicher Affinität hinsichtlich der Bindung an die Membranen geringer ist als die den zur Bildung der Membranen herangezogenen Erythrozyten entspricht.

4. Adsorptionsmittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranen durch Vernetzungsmittel, wie Glutardialdehyd, stabilisiert worden sind.