CH640639A5

CH640639A5 - Verfahren zur herstellung eines spezifischen immunserums.

Info

Publication number: CH640639A5
Application number: CH373178A
Authority: CH
Inventors: Yoshiji Matsuda; Keiji Tamura; Hiroaki Motoki; Fumio Kitame; Nakao Ishida
Original assignee: Saikin Kagaku Kenkyujo Kk; Kayaku Antibiotic Research Co
Priority date: 1977-06-16
Filing date: 1978-04-06
Publication date: 1984-01-13
Also published as: CA1093964A; GB1565333A; JPS548714A; US4269765A; FR2394805A1; DE2814121A1; JPS6118699B2; DE2814121B2; DE2814121C3; FR2394805B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Immunserums, das wirksam ist für die Diagnose von Krebs.

Bei den üblichen immunologischen oder chemischen Diagnosen von Krebs werden Serumproteine, Serumenzyme oder Hormone geprüft oder quantitativ bestimmt. Das Serum von Patienten, die unter Krebs leiden, weist im allgemeinen einen Gehalt oder eine steigende Menge von ai-Globulin, a2-Globu-lin und ß-Globulin auf. Diese Globuline enthalten immunore-gulatorisches a2-Globulin (IRA), Glycoprotein, arFetopro-tein, carcinoembryonales Antigen (CEA), a2-Macroglobulin und arAntitrypsin. Das Auftreten von arFetoprotein und CEA im Serum ist besonders bemerkenswert. Das erstgenannte tritt in einer Menge von 50 bis 80% im Serum von Patienten auf, die unter idopathischem Leberkrebs leiden, während das letztgenannte in einer Menge von 70 bis 90% im Serum von Patienten auftritt, die unter colorektalen Carcinoma leiden.

Bei der 35. Generalversammlung der japanischen Krebsvereinigung (1976) berichteten MATSUDA et al., dass ein saures Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 2,9 bis 3,3 und einem Molekulargewicht von 59,000, das eine kleine Menge Zucker enthält, im Serum von peritonealen Flüssigkeiten von Patienten vorkommt, die unter Krebs des Magens, des Darms, der Blase und Lymphosarcoma leiden, und dass dieses Protein abgetrennt und gereinigt werden kann durch negative Ionenaustauschchromatographie und Dünnschicht-Gelenkelektrofokussieren. Da dieses Protein die Immunität hemmt, wird es auch «immunosuppressives, saures Protein» genannt und im folgenden bezeichnet als «IAP».

Es wurden daher ausgedehnte Studien und Experimente durchgeführt, um den quantitativen Anstieg von IAP und anderen Mitteln, die bei der Diagnose von Krebs verwendet werden, und die Bedingung des Patienten nach der Operation festzustellen. Hierbei wurde gefunden, dass ein Immunserum oder Antiserum, das hergestellt wird indem IAP nicht menschlichen Lebewesen injiziert wird, mit IAP reagiert und eine antigen-antikörper Reaktion hervorruft. Auf diese Weise wurde eine quantitative Messung des IAP möglich ohne die Verwendung von komplexen chemischen Analysen und aufwendigen Instrumenten und Einrichtungen.

Physikalische und chemische Charakteristika von IAP

Das Ausgangsprodukt oder IAP wird hergestellt, indem ein Serum, eine peritoneale oder thoracale Flüssigkeit, Urin, andere Körperflüssigkeiten von Krebspatienten oder Flüssigkeiten, die von Plazenta von gesunden Menschen gewonnen werden, einer negativen Ionenaustauschchromatographie unterworfen und das Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 2,0 bis 3,3 gewonnen wird. Die auf diese Weise erhaltene Substanz hat die folgenden Eigenschaften:

1. Molekulargewicht: etwa 59000 (gemessen durch Elektrophorese mit 7,5%igem Polyacrylamid Gel enthaltend Na-triumdodecylsulfat)

2. Aussehen: weisses Pulver

3. Löslichkeit: löslich in Wasser, in 0,01 M mit Phosphat gepufferter Salzlösung. Unlöslich in Methanol, Äthanol, Bu-tanol, Aceton, Äthylacetat und Chloroform.

s 4. Isoelektrischer Punkt: pl 2,9 bis 3,3 (durch Dünnschicht Gel-Elektrofokussieren)

5. Aminosäurenzusammensetzung: Hydrolyse von 1 mg der Substanz in 2 ml 6N Salzsäure bei 120 °C während 15 Stunden ergibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin, wo-

10durch die Anwesenheit von Aminosäuren angegeben wird.

6. Farbreaktionen: Positiv gegen die von Euler, Ehrlich, Biuret und Molisch Reaktionen, jedoch negativ gegenüber Ferrichlorid und Lieberman Reaktion.

7. Zersetzungspunkt: 265 °C

8. Infrarotabsorptionsspektrum (mit 0,5%KBr): siehe Figur 1

9. Ultraviolettabsorptionsspektrum (gelöst in destilliertem Wasser auf 0,02%): siehe Figur 2.

10. Stabilität:

20 Bedingungen: 2 mg des sauren Proteins wurden in 10 ml mit Phosphat gepufferter Salzlösung (pH = 7,2) gelöst. 100 °C, 5 Minuten inaktiviert

60 °C, 30 Minuten inaktiviert

4 °C, 24 Stunden stabil

25 18-20 °C, 2 Tage stabil

- 20 °C, 7 T age stabil

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Immunserums, dadurch ge-30 kennzeichnet, dass ein saures Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 2,9 bis 3,3, erhalten durch Ionenaustauschchromatographie von Serum, peritonealer oder thorakaler Flüssigkeit, Urin, anderen Körperflüssigkeiten oder Flüssigkeiten, die von Plazenta des Menschen extrahiert wurden, in 35 nicht menschlichen Lebewesen immunisiert wird und dass dieses immunisierte Serum im normalen menschlichen Serum absorbiert wird.

Beispielsweise Herstellung des spezifischen Immunserums (An-40 ti-IAP-Serum)

Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird das Serum, die peritoneale oder thorakale Flüssigkeit, Urin, oder andere Körperflüssigkeiten von Krebspatienten oder die Flüssigkeit, die aus dem Plazenta von gesunden Patienten ex-45 trahiert wird und die IAP oder gereinigtes IAP enthält, zugegeben zu «Freund's vollständigem Adjuvants» (ein Produkt der Firma Difco Co.), emulgiert und bei Tieren z.B. Kaninchen, Schafen, Pferden oder Kühen subkutan injiziert. Die Injektionen wurden in geeigneten Intervallen wiederholt und wenn die Antikörperkonzentration ein vorbestimmtes Niveau erreicht hat, den Tieren Blut abgezapft. Dieses Immunserum wurde mit normalem menschlichen Serum oder in unlöslichem menschlichen Serum, hergestellt durch Behandlung von normalem menschlichen Serum mit Glutaraldehyd, adsorbiert, d.h. das Immunserum wurde zu dem menschlichen Serum oder zu dem normalen unlöslichen menschlichen Serum zugegeben und 30 Minuten bis 2 Stunden lang bei 37 °C bebrütet. Das gebildete Sediment wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit wurde zu derselben Menge von frischem normalen menschlichen Serum zugegeben und bei 4 °C über Nacht stehen gelassen. Das Sediment wurde wieder abgetrennt durch Zentrifugieren und die überstehende Lösung wurde als das gewünschte spezifische Immunserum gewonnen.

Dieses Immunserum wurde dann der Antigen-Antikör-perreaktion mit IAP, extrahiert von Krebspatienten wie unten im Beispiel 1 beschrieben, unterworfen. Es wurden verschiedene Verfahren angewandt wie doppelte Immunodiffu-

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55

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sion, einfache Immunodiffusion, Immunoelektrophorese, keitsgrad als 50% Ammoniumsulfat, während 100 mg bzw. Antigen-Antikörper Kreuz-Immunoelektrophorese, Antigen- 130 mg IAP erhalten wurden aus den Lösungen mit 60 bis Antikörper gegenläufige Immunoelektrophorese, Rocket- 70% Sättigung an Ammoniumsulfat.

Elektrophorese, sensitivierte Blutzellenagglutination, Radioimmuno Enzym-Immunität-Prüfung usw., um quantitative s Beispiel 4

Messungen des IAP Gehalts im menschlichen Serum, in peri- 10 Plazentas von Menschen wurden fein verteilt und zu ei-

tonealer oder thorakaler Flüssigkeit oder anderen Körper- ner Lösung von 110,1 M Natriumchlorid zugefügt und eine flüssigkeiten bei der Diagnose von Krebs durchzuführen. kurze Zeit gemischt. Das extrahierte plazentale Blut wurde

Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Bei- zentrifugiert und 21 überstehende Lösung erhalten. Nach spiele in Verbindung mit den Zeichnungen im einzelnen be- 10 dem Verfahren von Beispiel 1 wurden 1,6 g IAP mit einem schrieben. isoelektrischen Punkt von 2,9-3,3 erhalten.

Figur 1 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum von IAP,

Figur 2 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Beispiel 5

IAP und 1000 ml Urin, enthaltend IAP von einem Patient, der an

Figur 3 zeigt das Verhältnis zwischen dem Durchmesser 1S Krebs leidet, wurde einer Dialyse mit destilliertem Wasser un-des Rings der Ausfällung und der Menge von IAP, wenn diese terworfen, gefroren und getrocknet. Die gefrorene Substanz Menge IAP mit dem spezifischen Immunserum, hergestellt wurde fein verteilt und in 50 ml einer Phosphat gepufferten nach dem erfindungsgemässen Verfahren, bestimmt wurde. 1/15 M Salzlösung (pH-Wert 7,4) gelöst.

Die Lösung wurde in eine «Sephadex» G-75 (Produkt der Beispiel 1 20 Firma Pharmacia Co.) Kolonne gegeben, mit derselben Puf-

Extraktion und Reinigung von IAP 10 ml peritoneale ferlösung äquilibriert. Durch Dünnschicht Gel-Elektrofokus-Flüssigkeit, enthaltend IAP, extrahiert von einem Patienten, sieren, pH-Wert 2,5-6,0, wurde gefunden, dass das IAP in der der unter Magenkrebs leidet, wurde auf einen pH-Wert von ersten Proteinfraktion eluiert wurde. Diese Fraktion wurde 5,5 mit Essigsäure eingestellt und in Diäthylaminoäthyl an DEAE Cellulose, die mit 0,02 M Acetat-Puffer, pH-Wert

(DEAE) Zellulose (Produkt der Firma Wattmann Co.), das 25 4,0, äquilibriert war, absorbiert und wurde in einer einstufi-mit 0,02 M Acetat Puffer auf ein pH von 5,5 eingestellt war, gen Eluierung mit einem 0,02-0,4 M Acetat-Puffer, pH-Wert absorbiert. Die absorbierte peritoneale Flüssigkeit wurde ge- 4,0, extrahiert. Das IAP wurde konzentriert zwischen 0,2 bis löst in einem 0,02-0,5 Acetat Puffer und in 4 Teilen fraktio- 0,4 M Acetat-Puffer. Diese Fraktionen wurden entsalzt, ein-niert. Es wurde festgestellt, dass das saure Protein in der drit- gefroren und getrocknet, wobei nach isoelektrischer Kolon-ten Fraktion durch Dünnschicht Gel-Elektrofokussieren bei 30 nenelektrophorese, pH-Wert von 2,9-3,3,10 mg gereinigtes einem pH-Wert von 2,5-6,0 eluiert wurde. Da diese Fraktion IAP erhalten wurde.

andere Substanzen enthielt, wurde sie einer Dialyse in einem

0,02 M Acetat Puffer unterworfen und dann wieder in DEAE Beispiel A

Cellulose, eingestellt auf einen pH-Wert von 5,1 mit 0,04 M IAP, erhalten nach dem Verfahren von Beispiel 2, wurde

Acetat Puffer absorbiert. Darauf wurde die absorbierte Sub- 35 mit Salzlösung in 4 mg/ml und 0,5 ml Portionen aufgeteilt, zu stanz mit einem 0,04-0,4 M Acetat Puffer, pH-Wert 5,1 einer einer gleichen Menge von «Freund's vollständigem Adju-Ionengradientchromatographie unterworfen und in drei vants» zugefügt und emulgiert. Die Mischung wurde an ver

Fraktionen getrennt. Das IAP konnte in der zweiten Fraktion schiedenen Stellen des Rückens von Kaninchen mit einem durch Dünnschicht Gel-Elektrofokussieren eluiert werden. Es Gewicht von 2 kg subkutan injiziert. Zwei Wochen später wurde ausgesalzen, gefroren und getrocknet. Es wurden 40 wurde 1 ml derselben emulgierten IAP Mischung injiziert und 27,2 mg eines weissen IAP Pulvers erhalten. 2 Wochen danach wiederum dieselbe Menge. Zehn Tage nach der letzten Injektion wurde dem Kaninchen Blut abgenom-Beispiel 2 men und das Serum abgetrennt und 30 Minuten bei 56 °C in-

Gemäss dem Verfahren von Beispiel 1 wurden 20 mg der aktiviert. Zur Sterilisation der Probe wurde Natriumazid zu-dritten Fraktion, erhalten bei dem ersten chromatographi- 45 gegeben, so dass eine Konzentration von 0,05% erhalten sehen Verfahren, einer isoelektrischen Kolonnenelektropho- wurde. 1 ml des auf diese Weise hergestellten Immunserums rese (pH-Wert 2,5-6,0) unterworfen, wobei IAP bei einem wurde zu normalem menschlichem, unlöslichem Serum zuge-pH-Wert von 2,9-3,3 als einzige Substanz erhalten wurde. geben und zwei Stunden lang bei 37 °C gebrütet. Es wurde Diese Fraktion wurde dann zur Entfernung der Sucrose und dann 30 Minuten lang bei 4 °C und 5000 min zentrifugiert. des Ampholit-Trägers weiterer Dialyse unterworfen. 50 Die überstehende Lösung wurde wieder zu derselben Menge

Es wurde dann gefroren und getrocknet. Es wurden 4 mg des normalen unlöslichen menschlichen Serums zugegeben eines weissen gereinigten IAP Pulvers erhalten. und über Nacht bei 4 °C stehen gelassen. Dieses wurde wieder zentrifugiert, wobei das spezifische Immunserum erhalten Beispiel 3 wurde.

10 ml eines Serums von einem Menschen, der unter Ma- 55 Die spezifische Reaktion der IAP Antikörper in dem her-genkrebs leidet, wurde mit 50% Phosphat gepufferter Salzlö- gestellten Immunserum wurde durch ein Verfahren mit dop-sung und 4 ml der verdünnten Lösung in fünf Behälter gegos- pelter Immunodiffusion (Microouchterlony) und durch Imsen. Es wurde soviel Ammoniumsulfat zugegeben, dass die munoelektrophorese mit einem Antigen, das von einem Se-Lösungen einen Sättigungsgrad von 30,40,50, 60 bzw. 70% rum oder einer peritonealen Flüssigkeit eines Patienten, der aufweisen. Es wurde eine Stunde lang bei 10,000 x g zentrifu- 60 an Krebs leidet, stammt, bestätigt. Ferner reagierte dieses Im-giert. Die Pellets wurden in 5 ml einer 0,14 M phosphatgepuf- munserum nicht mit gesundem menschlichen Serum in dem-ferten Salzlösung gelöst und einer Dialyse und Entsalzung un- selben Test. Hierdurch wurde bestätigt, dass das Immunse-terworfen. Die überstehenden Lösungen wurden ebenfalls mm keine andere Antikörper als IAP Antikörper enthält, dialysiert mit der phosphatgepufferten Salzlösung und entsalzt. Die entsalzten Proben wurden einer Dünnschicht Gel- 65 Beispiel B Elektrofokussierung unterworfen. Es wurde gefunden, dass Agargel (oder gereinigter Agar) wurde zu 1 /15 M phos-das IAP mit einem isoelektrischen Punkt von 2,9-3,3 nicht phatgepufferter Salzlösung (pH = 7,4) in der Weise zugege-ausgefällt wurde aus den Proben mit einem geringeren Sättig- ben, dass die Konzentration 1,2% (1,0%) beträgt. Die Mi-

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schung wurde erhitzt und in einen Behälter gegossen, so dass eine Gelschicht von 1,5 mm Dicke und mit einer glatten Oberfläche gebildet wurde. Hierin wurden Löcher mit einem Durchmesser von 3 mm und 3 mm Abstand voneinander gebildet. Das erfindungsgemäss hergestellte Antiserum, das zu prüfende Serum und das Referenzserum, enthaltend IAP, wurden so eingebracht, dass sie die Löcher vollständig ausfüllten, und dann wurde 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Ausbildung von Fällungslinien zwischen dem Immunserum und dem zu prüfenden Serum wurden kontrolliert und diejenigen, die derartige Linien aufwiesen, wurden als positiv für IAP bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.

Tabelle I Subjekt

Gesunder Mensch Darmkrebspatient Magenkrebspatient Lymphosarcomapatient

Anzahl

Anzahl der getestet positiven

Fälle

20

1

10

Beispiel C

Gereinigter Agar wurde zu 1/15 M phosphatgepufferter Salzlösung (pH=7,4) zur Herstellung eines 1 %igen Gels zugefügt. Die Mischung wurde bei 55 °C geschmolzen und das 5 Immunserum wurde bis zu einer Konzentration von 3% zugefügt. Die Mischung wurde in der Weise in einen Behälter gegossen, dass sich eine Gelschicht mit einer glatten Oberfläche und einer Dicke von 1,0 bis 1,5 mm bildete. Es wurden Löcher hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben und IAP Refe-10renzlösungen verdünnt auf 1/1,1/4 und 1/16 und eine Probe (jeweils genau 5 (il) in die Löcher eingebracht und 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Der Durchmesser der Ringe der Ausfällung wurde wie in Figur 3 angegeben, gemessen. Es wurde bestätigt, dass die Menge des IAP eine 15 Funktion des Durchmessers der Ringe oder der Banden der Ausfallung ist.

C

2 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Immunserums, dadurch gekennzeichnet, dass ein saures Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 2,9 bis 3,3, erhalten durch Ionenaustauschchromatographie von Serum, peritonealer oder thorakaler Flüssigkeit, Urin, anderen Körperflüssigkeiten oder Flüssigkeiten, die von Plazenta des Menschen extrahiert wurden, in nicht menschlichen Lebewesen immunisiert wird und dass dieses immunisierte Serum im normalen, menschlichen Serum absorbiert wird.
2. Spezifisches Immunserum erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.

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