CH640948A5 - Verfahren zur bestimmung von weissen blutkoerperchen und von blutplaettchen neben anderen blutteilchen mittels herstellung einer zellsuspension aus einer blutprobe. - Google Patents
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Description
Aufgabe der Erfindung ist es daher, die Unterscheidung der Blutplättchen von den Hüllen der roten Blutkörperchen 15 und den Leukocyten sowie Informationen über die Grösse der Blutplättchen zu gewinnen und die Unterscheidung der meisten Klassen der ungefärbten Leukocyten aufgrund ihrer Grösse und Granulareigenschaften zu ermöglichen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestim-20 mung von weissen Blutkörperchen und von Blutplättchen neben anderen Blutteilchen mittels Herstellung einer Zellsuspension aus einer Blutprobe, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man
(a) eine am Koagulieren gehinderte Blutprobe mit einem 25 Detergens versetzt, das die roten Blutkörperchen für die anschliessende Auflösung vorbehandelt, ohne die Morphologie der weissen Blutkörperchen zu beeinträchtigen;
(b) ein Fixiermittel unter Aufrechterhaltung des neutralen pH-Wertes des Gemisches zumischt,
so (c) das erhaltene Gemisch bei einer Temperatur von 55 bis 62 °C mindestens 2 min bebrütet und
(d) die Zahl der weissen Blutkörperchen und/oder der Blutplättchen bestimmt.
In einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungs-35 gemässen Verfahrens wird als Detergens Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonolaurat verwendet und die Bebrütung 2 min bei etwa 58 °C durchgeführt.
In einer automatisierten Apparatur für kontinuierlichen Durchflussbetrieb, wie dem Hemalog D (Eingetragenes Wa-40 renzeichen der Technicon Instruments Corporation), die der Erleichterung der differentiellen Zählung der weissen Blutkörperchen dient, und bei dem automatisierten Verfahren gemäss US-PS 3 741 875 werden die einzelnen Zellarten mit Hilfe von cytochemischen Verfahren speziell identifiziert und 45 markiert. Der Strom aus gefärbten und ungefärbten Zellen fliesst durch eine optische Sichtkammer, in der ein fotoelektrisches Messverfahren die Amplituden des absorbierten Lichtes und getrennt davon das von jeder Zelle gestreute Licht misst. Elektronische Signale werden aufgrund ihrer Amplitude ein-50 geteilt und zu Kategorien klassifiziert, die den unterschiedlichen Zellarten entsprechen. Für die fünf hauptsächlichen Arten von weissen Blutkörperchen von Gesamtblut werden die entsprechenden Daten für eine Probe/min ausgedruckt. Mit dem spezifischen Verfahren zur chemischen Identifizie-55 rung werden die weissen Blutkörperchen angefärbt. Das gestreute Licht misst die durch das Verfahren beeinflusste Grösse der Zellen grob.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Erzielung einer differentiellen Zählung der weissen Blutkörperchen lässt sich so-60 wohl der manuellen als auch der automatisierten Durchführungsform anpassen. In jedem der beiden Fälle ermöglicht das Verfahren eine wirksame Unterscheidung der meisten normalen Klassen ungefärbter Leukocyten durch Lichtstreuung allein, da die Morphologie der weissen Blutkörperchen 65 nicht beeinträchtigt worden ist. Die Zählung ist genau, weil die vorbereiteten Zellen frei von Klumpen aus weissen Blutkörperchen, Hüllen roter Blutkörperchen oder Blutplättchen sind.
3 640 948
Eine weit verbreitete Methode zur Zählung von Blutplätt- Die Konzentration des Detergens in dem erhaltenen Ge-
chen beruht auf der Verwendung einer konzentrierten Harn- misch liegt zwischen etwa 0,03 und 2,0% (Volumen/Volu-
stofflösung zur Auflösung der roten Blutkörperchen. Bei die- men) und beträgt vorzugsweise etwa 0,4 bis etwa 6,0% (Volu-
sem Verfahren wird auch etwas Material von Blutplättchen men/Volumen).
extrahiert, und es werden einige weisse Blutkörperchen zer- s Während des erwähnten Vorbehandlungsschrittes wird teilt, wodurch Teilchen erzeugt werden, die sich in den dabei das erhaltene Gemisch bei Raumtemperatur oder Umge-
verwendeten Instrumenten nicht von Blutplättchen unter- bungstemperatur, beispielsweise bei etwa 25 °C, etwa 1 min scheiden lassen, wodurch die Zählung der Blutplättchen lang bebrütet. Dadurch wird ermöglicht, dass das Detergens falsch wird, und bei einigen abnormen Blutproben wird die seine Aufgabe zufriedenstellend erfüllt.
Bildung von sehr feinen Proteinniederschlägen verursacht, die io Das bebrütete Gemisch wird unter Rühren und Halten sich ebenfalls in den verwendeten Instrumenten von Blut- des pH-Wertes im neutralen Bereich mit einem Fixierungs-
plättchen nicht unterscheiden lassen und wodurch ebenfalls in mittel versetzt. Vorzugsweise ist das Fixierungsmittel eine mit derartigen Blutproben die Zählung der Blutplättchen beein- Phosphat gepufferte Formaldehydlösung, und der pH-Wert trächtigt wird. liegt im Bereich von 6 bis 8.
Die Extraktion von Blu'tplättchenmaterial durch den 15 Das Gemisch wird anschliessend bei einer Temperatur
Harnstoff erniedrigt das Lichtbrechungsvermögen der Blut- von 55 bis 62 °C mindestens 2 min lang und vorzugsweise bei plättchen, wodurch die Grösse des Signals des gestreuten 58 °C 2 min lang bebrütet.
Lichtes erniedrigt wird, das durch sie in den verwendeten In- Anschliessend wird das Gemisch nötigenfalls verdünnt strumenten erzeugt wird. Demzufolge verschmelzen die klein- und optisch gemessen. Zur Bestimmung der Blutplättchen-sten Signale, die von den Blutplättchen ausgehen, mit den 20 zahl wird die Verdünnung mit einer angesäuerten isotoni-grössten Rauschsignalen des Systems, die durch das elektro- sehen Salzlösung vorgenommen, wonach das erhaltene Ge-nische Rauschen in den Detektoren und Verstärkern sowie misch einen pH-Wert von 2 bis 4 besitzt. Eine Suspension un-von den gleichzeitig durch den fotometrischen Lichtstreu- ter Verwendung von mit 0,5% Essigsäure angesäuerter Salzungsdetektor erfolgenden Durchtritt einer grossen Anzahl lösung ergibt eine hinreichende Verdünnung, ein verbessertes von Zellhüllen von roten Blutkörperchen, d.h. Membranen 25 Verhältnis von Blutplättchensignal zu Rauschen, eine saubere von roten Blutkörperchen, die von ihrem Inhalt durch die Abtrennung der Blutplättchen von den Hüllen der roten Blut-Auflösung befreit worden sind, erzeugt werden. Es ist daher körperchen und Leukocyten, und die ursprünglichen einzel-nicht möglich, eine Schwelle zwischen dem Rauschen und der nen Volumina der Blutplättchen bleiben erhalten. Es ist auch durch die Blutplättchen hervorgerufenen Anzeige mit grosser möglich und in manchen Fällen bevorzugt, die Probe durch Zuverlässigkeit genau festzusetzen. 30 Zugabe einer isotonischen Salzlösung vor der Behandlung mit dem Detergens teilweise zu verdünnen.
Durch das erfindungsgemässe Verfahren wird eine Me- . . ,
thode geschaffen, bei der die roteh Blutkörperchen aufgelöst ?ur Bestimmung der weissen Blutkörperchen wird die werden, ohne dass Material von den Blutplättchen extrahiert Probe durch Zusatz einer isotonischen Salzlosung mindestens wird, ohne dass die weissen Blutkörperchen zerteilt werden 35 te^weise nach der Bebrütungsstufe verdünnt. Alternativ kann und ohne dass sich aus den Proteinen abnormer Blutproben die Probe mindestens teilweise vor der Behandlung mit dem Niederschläge bilden. Das erfindungsgemässe Verfahren lie- Detergens verdünnt werden.
fert eine Hochpuls Verteilung von Signalen mit einem grossen, ^ie Suspension von weissen Blutkörperchen, die auf die wohl definierten Minimum zwischen Rauschen und Blut- angegebene Weise mit einer isotonischen Salzlösung verdünnt plättchen sowie einem weiteren grossen, wohldefinierten Mi- 40 worden ist, erhält die Morphologie der weissen Blutkörper-nimum zwischen Blutplättchen und weissen Blutkörperchen. chen> glaubt eine Unterscheidung der ungefärbten weissen
Ausserdem bleiben bei dem erfindungsgemässen Verfah- Blutkörperchen durch Lichtstreuung mit niedrigem und gros-ren die Unterschiede in der Morphologie der weissen Blutkör- sem Winkel sowie die Unterscheidung von Lymphocyten, perchen erhalten, wodurch die Unterscheidbarkeit der mei- Monocyten, Neutrophilen und Eosinophilen ohne An-sten Klassen an weissen Blutkörperchen voneinander ohne 45 färbung.
Anfärbung ermöglicht wird. Das Verfahren erhält ausserdem die Peroxidaseaktivität
Gleichgültig, ob das erfindungsgemässe Verfahren zur Er- der weissen Blutkörperchen, was die weitere Unterscheidung zielung einer differentiellen Zählung der weissen Blutkörper- der beiden sonst schwierig zu unterscheidenden Gruppen von chen oder einer Zählung der Blutplättchen eingesetzt wird, Leukocyten ermöglicht, nämlich die der peroxydaseaktiven wird zunächst eine am Koagulieren gehinderte Blutprobe mit so und -inaktiven Agranulocyten.
einem Detergens versetzt, das die roten Blutkörperchen für Die hergestellte Suspension kann sofort (on line) für die die anschliessende Auflösung vorbehandelt. klinisch-hämatologische Analyse durch Lichtstreuung ver-
Der Zusatz des Detergens zu diesem Zeitpunkt ist ein wendet werden, und sie kann aufbewahrt werden, um als Be wichtiger Schritt des erfindungsgemässen Verfahrens. Das zugssuspension für ein derartiges System zu dienen.
Detergens wirkt als Vorbehandlungsmittel oder Vorkonditio- 55 Zwei Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nach-nierungsmittel derart, dass es bei den Konzentrationen, in de- folgend ausführlich erläutert.
nen es zugesetzt wird, die Morphologie der weissen Blutkörperchen oder der Blutplättchen nicht beeinträchtigt und auch Beispiel 1 die roten Blutkörperchen nicht auflöst, indessen die roten Macro-Methode
Blutkörperchen für die anschliessende Auflösung vorbereitet. 60 0,1 ml einer am Koagulieren gehinderten Gesamtblut-
Für das erfindungsgemässe Verfahren wird als Detergens probe werden mit 0,32 ml einer 1 %igen Lösung von Poyloxy-vorzugsweise Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonolaurat ver- ethylen-20-Sorbitanmonolaurat in isotonischer Salzlösung wendet, wenngleich andere Detergentien, wie beispielsweise versetzt und das erhaltene Gemisch bei Raumtemperatur Polyoxyethylen-23-monolaurylether oder Polyoxyethylen-20- etwa 1 min lang bebrütet.
Sorbitanmonooleat, ebenfalls in der Lage sind, die roten « Danach wird das Gemisch unter Rühren mit 0,42 ml Blutkörperchen vorzubehandeln, ohne dass die roten Blut- phosphatgepufferter Formaldehydlösung mit einem Gehalt körperchen aufgelöst werden, und daher in gleicher Weise von 8 Vol.-% Formaldehyd versetzt und das erhaltene Geverwendbar sind. misch 2 min bei 57 °C bebrütet.
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A. Bestimmung der weissen Blutkörperchen
Das obige bebrütete Gemisch wurde mit 1,2 ml isotonischer Salzlösung versetzt, und die différentielle Zählung der weissen Blutkörperchen wurde durch Lichtstreuung durchgeführt.
B. Bestimmung der Blutplättchen
Das oben erwähnte bebrütete Gemisch wurde mit 1,2 ml isotonischer Salzlösung versetzt. 0,1 ml des erhaltenen Gemisches wurde zu 4,0 ml einer mit 0,5% Essigsäure angesäuerten isotonischen Salzlösung hinzugefügt. Die Zählung der Blutplättchen und die Messung der Grösse wurden mit Hilfe der Lichtstreuung durchgeführt.
Beispiel 2
Micro-Bestimmung
0,01 ml vor dem Koagulieren geschütztes Gesamtkapillarblut wurden im Verhältnis von 1:10 mit einer isotonischen Salzlösung verdünnt, und 0,1 ml des erhaltenen Gemisches wurden zu 0,32 ml einer 0,125%igen Lösung von Polyoxyet-hylen-20-Sorbitanmonolaurat in isotomischer Salzlösung hinzugegeben und das erhaltene Gemisch etwa 1 min bei Raumtemperatur bebrütet.
5 Das Gemisch wurde danach unter Rühren mit 0,42 ml einer phosphatgepufferten Formaldehydlösung mit einem Gehalt von 8 Vol.-% Formaldehyd versetzt und das erhaltene Gemisch bei 57 °C 2 min lang bebrütet.
A. Bestimmung der weissen Blutkörperchen io Die différentielle Zählung der weissen Blutkörperchen der obigen Suspension wurde durch Lichtstreuung gemessen.
B. Bestimmung der Blutplättchen
Das obige bebrütete Gemisch wurde mit 1,2 ml isotoni-15 scher Salzlösung versetzt. 0,1 ml des erhaltenen Gemisches wurden zu 1,0 ml einer mit 0,5% Essigsäure angesäuerter isotonischer Salzlösung hinzugefügt. Die Zählung der Blutplättchen und die Bestimmung der Grösse erfolgten durch Lichtstreuung.
C
Claims (5)
1. Verfahren zur Bestimmung von weissen Blutkörperchen und von Blutplättchen neben anderen Blutteilchen mittels Herstellung einer Zellsuspension aus einer Blutprobe, dadurch gekennzeichnet, dass man
(a) eine am Koagulieren gehinderte Blutprobe mit einem Detergens versetzt, das die roten Blutkörperchen für die anschliessende Auflösung vorbehandelt, ohne die Morphologie der weissen Blutkörperchen zu beeinträchtigen;
(b) ein Fixiermittel unter Aufrechterhaltung des neutralen pH-Wertes des Gemisches zumischt;
(c) das erhaltene Gemisch bei einer Temperatur von 55 bis 62 °C mindestens 2 min bebrütet und
(d) die Zahl der weissen Blutkörperchen und/oder der Blutplättchen bestimmt.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Detergens Polyoxyethylen-20-Sorbitanmo-nolaurat in einer Menge verwendet, dass eine Konzentration in dem Gemisch von 0,3 bis 2,0 Volumenprozent erhalten wird.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Stufe (a) die mit dem Detergens versetzte Blutprobe etwa 1 min bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Gemisch in Stufe (b) nach dem Zusatz des Fixiermittels bei einem pH-Wert von 6 bis 8 hält.
5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Fixiermittel eine phosphatgepufferte Formaldehydlösung verwendet.
6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Temperatur in Stufe (c) bei etwa 58 °C und die Inkubationszeit bei 2 min hält.
7. Verfahren gemäss Anspruch 1 zur Bestimmung von weissen Blutkörperchen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verdünnung der gesamten Probe durchführt, die mindestens zum Teil erst nach der Bebrütungsstufe (c) unter Verwendung einer isotonischen Salzlösung erfolgt, wobei man für das erhaltene Gemisch einen pH-Wert von 6 bis 8,5 wählt.
8. Verfahren gemäss Anspruch 1 zur Bestimmung von weissen Blutkörperchen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verdünnung der gesamten Probe durchführt, die mindestens zum Teil bereits vor der Behandlung mit dem Detergens in Stufe (a) erfolgt.
9. Verfahren gemäss Anspruch 1 zur Bestimmung von Blutplättchen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verdünnung der Probe nach der Bebrütungsstufe (c) unter Verwendung einer angesäuerten isotonischen Salzlösung durchführt und für das erhaltene Gemisch einen pH-Wert von 2 bis 4 wählt.
10. Verfahren gemäss Anspruch 1 zur Bestimmung von Blutplättchen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verdünnung der Probe teilweise durch Zusatz der isotonischen Salzlösung vor der Behandlung mit dem Detergens in Stufe (a) durchführt.
Die bestehenden Verfahren zum Auszählen von Blutplättchen haben sich als nicht ganz verlässlich erwiesen. Automatisierte Ausführungen dieser Verfahren haben sich bisher auf Chemismen gestützt, die zu falsch bestimmten Blutplättchenzählungen geführt haben.
Bei typischen Verfahren zur Zählung von Blutplättchen wird ein Material zu einer Gesamtblutprobe hinzugegeben, um die roten Blutkörperchen aufzulösen. Die Verfahren zum Auflösen der roten Blutkörperchen, die bisher angewandt wurden, besitzen jedoch schädliche Nebenwirkungen: Material von den Blutplättchen selbst wird extrahiert, einige weisse
Blutkörperchen werden zerteilt, und in einigen Fällen bilden sich Niederschläge aus Proteinen. Wenn von diesen Vorgängen einer oder mehrere stattfinden, wird die angezeigte Plättchenzählung falsch berechnet.
5 Was die Differentialzählungen für weisse Blutkörperchen, die gegenwärtig verfügbar sind, angeht, so ist es bisher nicht möglich, weisse Blutkörperchen zu erhalten, die durch Auflösung frei von roten Blutkörperchen sind, ohne dass die weissen Blutkörperchen gleichzeitig geschädigt werden. Daher ist io eine angemessene Differenzierung der Leukocyten, wie sie in der US-PS 3 741 875 beschrieben ist, nur möglich, wenn die Zellen durch cytochemische Umsetzung angefärbt werden.
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