CH641479A5

CH641479A5 - Verfahren zur herstellung eines zur kovalenten bindung mit biologisch aktivem material befaehigten traegermaterials.

Info

Publication number: CH641479A5
Application number: CH615077A
Authority: CH
Inventors: Christof Biebricher; Ruediger Luce
Original assignee: Max Planck Gesellschaft
Priority date: 1976-05-18
Filing date: 1977-05-17
Publication date: 1984-02-29
Also published as: SE7705543L; JPS52140588A; US4177038A; IL52119A0; GB1569446A; FR2351990A1; IL52119A; FR2351990B1; DE2621974A1; JPS6317841B2

Description

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Trägermaterial zu synthetisieren, das es erlaubt, biologisch aktiven Stoff an einen unlöslichen Träger in einer solchen Weise anzubinden,

dass die Befähigung dieses biologisch aktiven Stoffs mit anderen biologischen Substanzen in Wechselwirkung zu treten, nicht beeinträchtigt wird. Insbesondere geht es darum, ein Mittel aufzuzeigen, welches Enzyme in guter Ausbeute ko valent gebunden trägt und folgende Eigenschaften besitzt:

a) resistent gegen Temperaturen bis zu 100° C

b) mechanisch stabil, druckstabil c) einen geringen Strömungswiderstand besitzend d) keine Ladungsträger aufweisend e) hydrophil

Die Bindung des biologisch aktiven Stoffs, beispielsweise des Enzyms, an den Träger soll f) sehr stabil gegen Hydrolyse im pH-Bereich von 3-11 sein g) die Eigenschaften des Trägers möglichst wenig verändern h) unter möglichst schonenden Bedingungen (wässrige Lösung, neutraler pH-Bereich) geschlossen werden i) spezifisch geschlossen werden k) durch die Kupplung an den Träger die enzymatische Wirkung nicht beeinträchtigen und

1) die Reaktion von Enzymen mit hochmolekularen Substraten nicht sterisch behindern.

Es wird ausdrücklich daraufhingewiesen, dass für manche Anwendungsfälle nicht unbedingt die Summe sämtlicher aufgezählter Eigenschaften erreicht werden muss. Jedoch für fast alle empfindlichen Enzyme und für die Enzyme, die hochmolekulare Reaktionspartner haben, müssen die Eigenschaften a) bis 1) gleichzeitig vorliegen.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines geformten Trägermaterials kennzeichnet sich dadurch, dass der

Träger mit einem gegebenenfalls verkappten Diisocyanat derart umgesetzt wird, dass noch freie, zur kovalenten Bindung befähigte Isocyanatgruppen am so erhaltenen Trägermaterial verbleiben. Die Erfindung geht damit von dem Grundgedanken aus, das 5 Verfahren abschnittsweise zu gestalten, d.h. zunächst einmal ein Trägermaterial herzustellen und dieses ggf. zu isolieren. Auch innerhalb der Herstellung des Trägermaterials wird abschnittsweise gearbeitet. Nach jedem Schritt muss das Zwischenprodukt, beispielsweise durch Filtration, isoliert werden .Findet nur ein io Bindungsmittel Verwendung, dann ergibt sich nur ein Verfahrensschritt. Mehrere Verfahrensschritte ergeben sich dann, wenn mit einem Kupplungsmittel und einem Brückenglied gearbeitet wird. Bei all den gegebenen Arbeitsmöglichkeiten unter Verwendung eines Bindungsmittels, eines Kupplungsmittels, eines 15 Brückengliedes sowie in den verschiedenen Kombinationen dieser Mittel ergibt sich die Möglichkeit, die gewünschten Eigenschaften in ihrer Zusammensetzung für den jeweiligen Anwendungsfall zu wählen und schrittweise das Trägermaterial nach diesen Gesichtspunkten aufzubauen. So ist der Träger im wesent-20 liehen für die geforderten Eigenschaften b) und c) bestimmend. Das Bindungsmittel und das Kupplungsmittel sind im wesentlichen verantwortlich für die Eigenschaften f), g), h) und k). Das Brückenglied bestimmt im wesentlichen die Eigenschaften von 1). Die übrigen nicht gesondert angeführten Eigenschaften wer-25 den von der Kombination des Trägers, des Bindungsmittels, des Kupplungsmittels usw. beeinflusst. Somit besteht die Möglichkeit, den biologisch aktiven Stoff direkt über das Bindungsmittel an den Träger zu binden. Es ist aber auch möglich, dass das Bindungsmittel über das Brückenglied und das Kupplungsmittel 30 mit dem Träger verbunden wird, um auf diese Weise einer sterischen Hinderung entgegenzuwirken und die Wirksamkeit des biologisch aktiven Stoffs, wenn er an das Trägermaterial gebunden ist, zu erhöhen.

Als Träger können verwendet werden: Organische Naturstof-35 fe, wie Zellulose, Agarose, Dextrane od. dgl. Weiterhin sind synthetische polymere Träger ausprobiert worden, beispielsweise derivatisierte Acrylamide. Auch anorganische Träger kommen in Betracht, z. B. Glas. Bei der Auswahl der Träger müssen auch die folgenden Parameter in Betracht gezogen werden. 40 Wichtig ist die makroskopische Gestalt des Trägers, der beispielsweise in Kugelform, Perlform, in Fiberform, z. B. als Watte od. dgl., als Granulat od. dgl., eingesetzt werden kann. Bei der Perlform kommt es weiterhin auf die Parameter Korngrösse und Porosität an. Es besteht dabei, je nach den genannten Parame-45 tern, die Möglichkeit, mehr an der äusseren Oberfläche zu binden oder aber auch eine Bindung zusätzlich im Innern des Materials zu verwirklichen. Bei grosser Korngrösse ist die Belegungsdichte allgemein klein. Unter Belegungsdichte wird allgemein ein Mass dafür verstanden, wie viel biologisch aktiver Stoff 50 an ein Trägermaterial pro Volumeneinheit gebunden werden kann. Die Porosität beeinflusst wesentlich die mechanische Stabilität und die Druckstabilität. Wird auf diese Eigenschaften besonderer Wert gelegt, dann empfiehlt es sich, kleinporöses oder unporöses Material als Träger einzusetzen. Der Strömungs-55 widerstand des Trägermaterials ist abhängig von der makroskopischen Gestalt des Trägers und der Korngrösse.

Bei der Auswahl des Bindungs- und auch des Kupplungsmittels geht es im wesentlichen darum, die Eigenschaften des Trägers möglichst wenig zu verändern. Man muss also die 60 Auswahl so treffen, dass möglichst wenig Nebenreaktionen stattfinden, die das Trägermaterial unvorteilhaft verändern könnten. Bei dem Arbeiten mit Isocyanat versteht es sich, darauf zu achten, dass der Träger einerseits wasserfrei ist und dass andererseits auch wasserfrei gearbeitet wird. Zum Einsatz kom-65 men also organische Lösungsmittel. Besonders bewährt haben sich bei den durchgeführten Versuchen aprotische polare Lösungsmittel, z. B. zyklische Äther, z. B. THF (Tetrahydrofuran), Dioxan. Sehr geeignet als aprotische Lösungsmittel sind auch

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Acetonitril, Dimethylformamid, Formamid. Für die Entfernung des Lösungsmittels, d.h. zum abgesetzten Arbeiten, ist es von Vorteil, wenn der Siedepunkt möglichst niedrig liegt, also etwa unter 100° C.

Als Kupplungsmittel werden vorzugsweise aromatische oder aliphatische Diisocyanate eingesetzt. Die Kupplungsmittel sollen möglichst wenig hydrophob sein. Dies bedeutet für die aliphatischen Diisocyanate möglichst kurzkettige Diisocyanate auszuwählen, die gesättigt oder ungesättigt sein können. Die aromatischen Diisocyanate sollen möglichst wenig hydrophobe Gruppen aufweisen. Besonders geeignete Diisocyanate sind:

Toluol-2,4-diisocyanat, Toluol-2,6-diisocyanat, handelsübliche Gemische aus Toluol-2,4- und 2,6-diisocyanat, Äthylendiiso-cyanat, Äthylidendiisocyanat, Propylen-l,2-diisocyanat, Cyclo-hexylen-l,2-diisocyanat, Cyclohexylen-l,4-diisocyanat, m-Phe-nylendiisocyanat.

Da die reaktiohsfähigen Gruppen vieler Träger reaktionsträge sind, werden Katalysatoren eingesetzt. Dies können starke Basen sein, insbesondere Natriumimidazolid. Auch die metallorganischen Katalysatoren der Polyurethanchemie kommen in Frage. Über die Katalysatormenge wird die Belegungsdichte gesteuert. Es wird immer mit einem Überschuss von Kupplungs- oder Bindungsmittel gearbeitet. Es wird häufig die fünf- bis zehnfache Überschussmenge eingesetzt. Die Reaktion findet bei Temperaturen zwischen der Raumtemperatur und der Siedetemperatur des jeweiligen Lösungsmittels statt. Bei Verwendung von beispielsweise mikroporösen Perlen als Träger mit einer Korngrösse von etwa 10 bis 50 [im werden gute Ergebnisse erzielt, wenn die Reaktion so gesteuert wird, dass Belegungsdichten von 25 bis 200 uMol pro ml Schüttvolumen erreicht werden. Die Reaktion wird beendet durch Auswaschen überschüssiger Reagentien mit wasserfreiem Lösungsmittel, vorzugsweise dem Lösungsmittel, in dem die Folgereaktion stattfinden soll.

Als Brückenglied findet eine Substanz mit mindestens zwei reaktionsfähigen Gruppen Verwendung. Bei der Verwendung von zwei reaktionsfähigen Gruppen entsteht eine lineare Kette. Bei Verwendung einer Substanz mit mehr als zwei reaktionsfähigen Gruppen entsteht eine Verzweigung. Besonders geeignet hierfür sind aromatische oder aliphatische gesättigte oder ungesättigte Diamine, Aminoalkohole oder Diole. Es versteht sich, dass die als Brückenglied eingesetzten Substanzen möglichst keine hydrophoben Gruppen aufweisen dürfen. Kurzkettige gesättigte Aliphaten mit zwei reaktionsfähigen Gruppen ergeben gute Ergebnisse.

Soll die Kette verlängert werden, dann ist es erforderlich, Polyäthylenglykole von niedrigem Molekulargewicht einzusetzen. Damit wird die hydrophobe Wirkung von langen aliphatischen Ketten vermieden. Ungesättigte aliphatische oder aromatische Diole oder Diamine bieten den besonderen Vorteil, dass das mit ihnen realisierte Brückenglied starr bzw. wenig flexibel ist, so dass der an ihm später anzulagernde biologisch aktive Stoff freistehend gehalten wird und sich nicht eng an das Trägermaterial anlegen kann. Rückfaltungen des Materials werden damit vermieden. Analoges gilt für die Verzweigungen, mit denen die Belegungsdichte erhöht werden kann.

Substanzen, die als Brückenglied oder Schwingarm besonders geeignet sind, wurden in grosser Vielzahl ausprobiert. Es werden hier nur einige bevorzugte Beispiele genannt:

Diamine: Äthylendiamin, Tetramethylendiamin, 1,5-Diami-no-3-Azapentan, m-Phenylendiamin usw.

Aminoalkohole: Äthyanolamin, l-Aminobuten-2,3-ol-4; 3-Aminocyclohexynol, p-Aminophenol usw.

Diole: Äthylenglycol, Glycerin, Butandio-1,4; Buten-2,3-diol-1,4, Hydrochinon, Resorcin, Phloroglucinusw. Polyäthylengly-colfraktionen niedrigeren Molekulargewichtes.

Um sicherzustellen, dass nur eine reaktionsfähige Gruppe des Schwingarms mit dem Kupplungsmittel reagiert, wird die Substanz des Schwingarms in grossem Überschuss, vorzugsweise 10-

fach, eingesetzt. Auf einen Katalysator kann im allgemeinen verzichtet werden. Es kann jedoch eine schwache Base, wie Triäthylamin, Verwendung finden. Für das Lösungsmittel, die Temperatur und die Reinigung des Umsatzproduktes gelten analog die vorher gemachten Ausführungen.

Bei Verwendung eines Brückengliedes oder Schwingarmes ist zwischen diesen und dem biologisch aktiven Stoff wiederum ein Bindungsmittel eingesetzt. Hinsichtlich des Bindungsmittels gilt auch hier, dass es zwei reaktive Gruppen aufweist. Als Bindungsmittel können die gleichen Substanzen eingesetzt werden, die zuvor als Beispiele für die Kupplungsmittel aufgeführt wurden. Hinsichtlich der Auswahl der Kupplungsmittel gelten analoge Kriterien. Da jedoch für die Brückenglieder reaktionsfähige Gruppen benutzt wurden, die weniger reaktionsträge sind als die reaktionsfähigen Gruppen des Trägers, kann durch die Wahl des Katalysators bewirkt werden, dass das Bindungsmittel ausschliesslich mit dem Brückenglied in Reaktion tritt. Als solche Katalysatoren werden aprotische schwache Basen verwendet, z.B. Triäthylamin. Auch hier wird mit hohem Überschuss gearbeitet. Es gelten auch hier die zuvor gemachten Aussagen bezüglich des Lösungsmittels, der Temperatur und der Isolierung. Nach dem Auswaschen der überschüssigen Substanzen wird das Lösungsmittel verdampft, so dass das Trägermaterial anfällt, welches beispielsweise in pulvriger Form lagerfähig ist. Dieses Trägermaterial weist also in der Regel an seinem Ende die Isocyanatgruppe auf. Dies muss jedoch nicht sein. Es ist auch möglich, dass hier durch ein Desaktivierungsmittel ein Abschluss gebildet wird, der sich bei der Anlagerung des biologisch aktiven Stoffs wieder löst. Eine solche Verbindung wird als «verkapptes Isocyanat» bezeichnet. Das Desaktivierungsmittel wird dabei in einem organischen Lösungsmittel eingesetzt. Das erhältliche Produkt kann in gleicher Weise isoliert bzw. gelagert werden.

Bei der Kupplung mit biologisch aktivem Stoff wird das Desaktivierungsmittel gegen den biologisch aktiven Stoff ausgetauscht. Als Desaktivierungsmittel kommen in Frage Thiophe-nole, Phenolderivate, z. B. 2,4-Dinitrophenol, Hydroxylaminde-rivate, z. B. N-Hydroxysuccinimid, zyklische Amine, z. B. Benzimidazol, oder ähnliche Substanzen.

Der am Beispiel des Isocyanats und Diisocyanats aufgezeigte Wirkmechanismus lässt sich selbstverständlich auch auf andere Kupplungsmittel und Bindungsmittel ausdehnen. Als weitere reaktive Gruppen des Bindungsmittels oder des Kupplungsmittels kommen Acylhalogenide, aktivierte Ester, Isothiocyanate, Sulfochloride, Chlorkarbonate und dgl. in Frage.

Die Kupplung von biologisch aktivem Stoff gestaltet sich denkbar einfach. Das Trägermaterial wird in die Lösung des biologisch aktiven Stoffes in einem geeigneten Lösungsmittel eingerührt. Besonders hohe Belegungsdichten können erzielt werden, wenn der biologisch aktive Stoff in apro tischen organischen Lösungmitteln löslich ist. Es treten hierbei keine Seitenreaktionen auf. Dies trifft vor allem für Stoffklassen, wie z. B. Antibiotika, zu. Enzym und andere Proteine sind im allgemeinen nur in wässriger Lösung anwendbar. Dabei tritt als Seitenreaktion die Hydrolyse des Isocyanats auf. Die Aminogruppen des biologisch aktiven Stoffs reagieren jedoch wesentlich rascher als das Wasser mit dem Isocyanat, so dass trotzdem hohe Belegungsdichten erreicht werden. Die Lösung von Enzymen und anderen Proteinen in Wasser muss gepuffert werden. Als Puffer eignen sich alle Puffersubstanzen, die keine reaktionsfähigen Gruppen enthalten. Gute Ergebnisse wurden erzielt mit Phosphatpuffer, mit Imidacolpuffer und mit Good-schen Pufferlösungen. Der pH-Bereich soll neutral bis leicht alkalisch sein. Im pH-Bereich von 6 bis 10 wurden gute Ergebnisse erzielt. Die Bindereaktion wird bei Raumtemperatur oder in der Kälte durchgeführt. Die geschlossene Bindung ist sehr fest. Bei allen geprüften Enzymen war kein Leakage festzustellen. Das erhaltene Mittel, also das Trägermaterial mit dem angelagerten biologisch aktiven Stoff, enthält keine zusätzlichen Ladungsträger.

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Es wurden etwa 20 Enzyme an ein Trägermaterial gebunden. biologisch aktiven Stoffs mit dem Trägermaterial zu einem

Darunter waren auch solche, deren Immobilisierung wegen ihrer substituierten Urethan verbunden ist. Aich bei dem Mittel grossen Empfindlichkeit bisher nicht möglich war. kennzeichnet sich das Trägermaterial durch ein oder mehrere

Alle geprüften Enzyme wurden in aktiver Form an das Träger- Merkmale, wie sie bereits beschrieben sind.

material gebunden. Damit ergibt sich eine grosse Wahrschein- 5 Die Tragweite der Erfindung wird anhand von verschiedenen lichkeit, dass das Verfahren allgemein anwendbar ist. Beispielen für Trägermaterialien und Mittel aufgezeigt:

Als Kupplungsmittel kann ebenfalls ein Bindungsmittel mit la) Beispiele für die Synthese von Trägermaterialien, die zwei reaktiven Gruppen Verwendung finden, wobei Isocyanat biologische Stoffe binden können und die Isocyanatgruppe beeine oder vorzugsweise beide reaktive Gruppen des Kupplungs- nutzen:

mittels bildet. Es ist auch möglich, dass als Bindungsmittel und io a) Die Bindung zum Träger wird mit Hilfe der Isocyanat-

als Kupplungsmittel Diisocyanat Verwendung findet und das gruppe hergestellt: Ein Träger, z.B. Zellulose, wird mit Cyan-

Brückenglied aus einer Substanz mit mindestens zwei reaktions- bromid aktiviert und mit Phenylendiamin umgesetzt. Die entste-

fähigen Gruppen, insbesondere Amino- und/oder Hydroxyl- hende Verbindung reagiert mit Phosgen zu einem Isocyanat, das gruppen, gebildet wird. Damit entstehen auf jeden Fall stabile mit dem biologischen Stoff reagiert (siehe Fig. 1).

Bindungen. 15 lb) Die Bindung von Träger zu dem biologischen Stoff wird

Zur Erhöhung der Belegungsdichte können auch zwei oder mit Hilfe der Isocyanatgruppe bewerkstelligt:

mehr als Bindungsmittel eingesetzte Diisocyanate durch eine Agarose als Träger wird mit einem Bindungsmittel umgesetzt,

Substanz mit mindestens drei reaktionsfähigen Gruppen, insbe- das sowohl eine Isocyanatgruppe als auch einen aktivierten Ester sondere Amino- und/oder Hydroxylgruppen, an das Kupplungs- enthält. Die Isocyanatgruppe addiert an den Träger, die aktivier-

mittel gebunden werden. 20 te Estergruppe vermag mit dem biologischen Stoff zu kondensie-

Für bestimmte Anwendungsfälle ist es sinnvoll, wenn die ren (siehe Fig. 2).

Reaktivität der Isocyanatgruppe des Trägermaterials zur Erzie- lc) Beide reaktiven Gruppen des Bindungsmittels sind Isocy-

lung einer spezifischen Bindung durch Verwendung eines Desak- anatgruppen, d. h. das Bindemittel ist ein Diisocyanat (siehe Fig.

tivierungsmittels vermindert wird. Dies ist insbesondere vorteil- 3).

haft, wenn Proteine oder Enzyme in wässriger Lösung an Träger- 25 2a) Beispiel für ein Trägermaterial, das aus Träger, Kuppmaterial gebunden werden sollen, weil die Hydrolysegeschwin- lungsmittel, Schwingarm und Bindungsmittel besteht:

digkeit des Isocyanats dadurch wesentlich herabgesetzt wird. In dem gewählten Beispiel sind alle reaktiven Gruppen sowohl

Das vorgeschlagene Verfahren erlaubt die Herstellung von des Bindungsmittels als auch des Kupplungsmittels Isocyanat-aktivierten Trägermaterialien in grossen Ansätzen unter Ver- gruppen. Als Brückenglied ist eine hydrophile langkettige Verwendung von grosstechnisch erzeugten billigen Chemikalien. 30 bindung gezeigt. Zellulose als Träger wird in Gegenwart der Die aktivierten Trägermaterialien sind im wasserfreien Zustand starken Base Natriumimidazolid mit Toluoldiisocyanat umge-haltbar und binden biologisch aktiven Stoff, welcher freie -NH2 setzt, die entstehende Verbindung addiert als Brückenglied oder -OH-Gruppen enthält, in Wasser oder in organischen Polyäthylenglycol. Bei einer weiteren Umsetzungmit Toluoldii-Lösungsmitteln kovalent. Die biologische Aktivität des Stoffes socyanat in Gegenwart der schwachen Base Triäthylamin rea-bleibt bei dem Kupplungsverfahren erhalten; eine sterische 35 giert das Bindungsmittel nur mit den primären OH-Gruppen des Hinderung der biologischen Aktivität durch den Träger wird Brückenglieds, während restliche sekundäre Hydroxylgruppen durch das Zwischenkuppeln von Schwingarmen weitgehend ver- des Trägers nicht mehr reagieren ; es entsteht folgendes Material: mieden. Die kovalente Bindung ist chemisch stabil. Die Eigen- (Fig. 4).

Schäften des Trägers, insbesondere die Porosität, die Flussrate 2b) Beispiel für eine Verzweigung, die in diesem Fall durch und die Schmelztemperatur, werden durch das Aktivierungsver- 40 eine Polyaminoverbindung erzeugt wird:

fahren nicht geändert. Das Verfahren kann speziell zur Herstel- Reaktion wie bei 2a), jedoch wird als Schwingarm ein Poly-

lung von immobilisierten Enzymen herangezogen werden und äthylenimin verwendet (Fig. 5).

liefert Mittel, die zur Verwendung in Flussreaktoren hervorra- 3a) Beispiel für eine Harnstoffbindung zwischen einem Trägergend geeignet sind. material, das Isocyanatgruppen trägt und einem biologischen

Das mindestens eine reaktive Gruppe aufweisende geformte 45 Stoff mit Aminogruppen:

Trägermaterial zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stof- Ein Trägermaterial, z.B. das Material, das bei Beispiel 2a)

fen, insbesondere Enzyme, kennzeichnet sich dadurch, dass die entstanden ist, reagiert mit Lysin in wässriger Lösung unter reaktive Gruppe eine Isocyanatgruppe oder eine verkappte Bildung eines substituierten Harnstoffs (Fig. 6). In gleicher

Isocyanatgruppe ist, die an einer am Träger hângendèn Bin- Weise reagieren Enzyme, die Lysin enthalten.

dungsgruppe gebunden ist. Besonders gute Voraussetzungen für 50 3b) Beispiele für eine Urethanbindung zwischen einem Tfäger-

die optimale Wirksamkeit des später anzulagernden biologisch material mit freien Isocyanatgruppen und einem biologischen aktiven Stoffs sind dann gegeben, wenn die reaktive Isocyanat- Stoff mit freien Hydroxylgruppen:

gruppe über ein Brückenglied mit dem Träger verbunden ist. Material, wie in Beispiel 2a) oder 2b) beschrieben, wird mit

Zwischen dem Brückenglied und dem Träger ist ein Kupplungs- Chloramphenicol in Dioxan umgesetzt, es entsteht folgende mittel vorgesehen. Das Kupplungsmittel kann ein Bindungsmit- 55 Verbindung: (siehe Fig. 7).

tel mit zwei reaktiven Gruppen sein, wobei vorzugsweise Isocy- 4) Beispiel für eine Desaktivierung:

anat eine oder möglichst beide reaktive Gruppen bildet. Bei der Ein Trägermaterial, das freie Isocyanatgruppen enthält, wird

Reaktion von Isocyanaten mit reaktionsfähigen Gruppen entste- in organischen Lösungsmitteln mit Thiophenol umgesetzt (siehe hen ausschliesslich substituierte Urethane oder substituierte Fig. 8).

Harnstoffe. 60 5a) Herstellung von Trägermaterial aus Dextrangel:

Das erfindungsgemässe Mittel, welches biologisch aktiven 5 g getrocknetes Sephadex G 50 superfine (Pharmacia, mikroStoff enthält, der durch ein Trägermaterial immobilisiert ist, poröse vernetzte Dextrangele) wird in 100 ml wasserfreiem kennzeichnet sich dadurch, dass sich eine reaktive Gruppe des Tetrahydrofuran (THF) suspendiert. Unter Rühren werden 1 ml biologisch aktiven Stoffs mit einer Isocyanatgruppe des Träger- Toluoldiisocyanat (handelsübliche Mischung des 2,4 und 2,6 materials verbunden hat. So ist es möglich, dass eine Aminogrup- 65 Isomeren) und 0,5 ml Katalysatorsuspension zugesetzt und die pe des biologisch aktiven Stoffs mit dem Trägermaterial zu einem Lösung unter heftigem Rühren für 30 min zum Rückfluss erhitzt, substituierten Harnstoff verbunden ist. Die Isocyanatgruppe Die Suspension wird abfiltriert und durch W aschen mit wasserkann aber auch so umgesetzt sein, dass eine Hydroxylgruppe des freiem THF von überschüssigen Reagentien befreit.

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Die Perlen werden in einer Lösung von 2 g Butin (2)-diol-(l ,4) in 100 ml trockenem THF suspendiert und für 30 min zum Rückfluss erhitzt. Das Material wird abgesaugt, mit THF gewaschen und in einer Lösung von 2,5 ml Toluoldiisocyanat und 0,25 ml Triäthylamin in 150 ml wasserfreiem THF aufgeschwemmt. Nach 30 min Rühren bei Raumtemperatur wird das Material abgesaugt, sorgfältig mit wasserfreiem THF gewaschen, im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und in Ampullen eingeschmolzen. Nach monatelanger Lagerung lässt sich keine Abnahme der Bindungskapazität beobachten.

Die gelblichen Perlen schwellen in Wasser wie das Ausgangsmaterial; auch Aussehen und Strömungswiderstand sind nicht verändert

Isocyanatgehalt: 250 [iMole/g

Lysinbindungskapazität in wässriger Lösung 4 [tMole/g

Die verwendeten Abkürzungen sind von der IUB/IUPAC vorgeschrieben und übliche Abkürzungen. Sie sind im allgemeinen Sprachgebrauch verständlicher als die ausführlichen Namen.

Es handelt sich um folgende Substanzen:

poly(U)

Polyuridylsäure

UDP

Uridin-5'-diphosphat poly(AU)

Polyadenyluridylsäure poIy(dAT)

Polydeoxyadenylthymidylsäure

GDP

Guanosin-5'-diphosphat

GTP

Guanosin-5'-triphosphat

IDP

Inosin-5'-diphosphat

ITP

Inosin-5 '-triphosphat

3'-UMP

3'-Uridylsäure (Üridin-3'-monophosphat)

tRNA

Transfer-Ribonukleinsäure

DNA

D eoxyribonukleinsäure

DNase

Deoxyribonuklease poly(A)

Polyadenylsäure

Bindung von Enzymen an das Trägermaterial gemäss Beispiel 5a.

Alkalische Phosphatase

Aus E. Coli (Boehringer, 200 u.g) werden gegen 0,2 M Phosphatpuffer (pH 8,0) dialysiert und das Volumen der Enzymlösung auf400 (J.1 gebracht. Die Enzymlösung wird mit 10 mg Trägermaterial nach 5a vermischt und die Lösung für 2 h bei leichtem Rühren stehen gelassen. Die Lösung wird umgeschüttelt und 100 [J.1 der Suspension werden in eine kleine Säule gepackt (Durchmesser der Säule 2 mm, Bettvolumen des Mittels 10 ul). Die Säule wird mit 0,05 M Trispuffer (pH 7,5) gewaschen und dann mit Substratlösung (0,05 M Glycinpuffer (pH 10,5), 5,5 mM p-Nitrophenylphosphat, 0,5 mMMgCl2) äquilibriert. Die Flussgeschwindigkeit wird auf 4 sec. pro Säulenvolumen eingestellt und kontinuierlich Fraktionen gesammelt. Nach einigen Sekunden hat sich der Umsatz auf ein konstantes Niveau eingependelt . Aus diesem Niveau wird die Aktivität errechnet. 1 g Mittel besitzt die Aktivität von 1,3 mg freiem Enzym. Durch Nachinkubation der gesammelten Fraktionen für mehrere Stunden kann die Verunreinigung mit abgelöstem Enzym gemessen werden; eine solche Verunreinigung ist unmessbar klein.

Nach einwöchigem Stehen des Mittels bei Raumtemperatur in Glycinpuffer (pH 10,5) ist keine Abnahme der Aktivität zu beobachten.

Lysinbindung

Standardtest: 1 mMLysinin0,2MKaliumphosphatpuffer, 50 mg Trägermaterial pro 1 ml Lösung. Nach 1 h Umsatz bei 4° C wird die Fixierung des radioaktiven Lysins gemessen.

Fixierung von Lysin bei anderen Pufferbedingungen:

Standardbedingung 100 %

0,02 M Phosphat pH 8,0 133%

0,02 M Phosphat pH 6,7 48%

0,05 M HEPES pH 7,4 80%

0,05 M Imidazol pH 8,0 90%

Das entstandene Mittel ist bei neutralem pH kein Anionenaus-tauscher. Dazu wird die Bindung von radioaktivem ADP an das Lysinmaterial gemessen. 1 g Mittel bindet weniger als 1 p Mol (IO"12 Mol) ADP.

Unter Standardbedingungen werden auch die folgenden Enzyme in aktiver Form an das Trägermaterial gebunden: Trypsininhibitor aus Sojabohnen (Merck)

Das erhaltene Mittel hat eine reversible Bindungskapazität von 3,1 mg Trypsin/g.

Lactatdehydrogenase aus Schweinemuskeln (Boehringer) Die Aktivität des Mittels ist zu hoch, um die genaue Belegungsdichte messen zu können (50 E/g)

Apyrase aus Kartoffeln (Sigma)

Urease aus Schwertbohnen (Boehringer)

Diaphorase (Sigma)

Die Standardbedingungen sind: 50 mg Trägermaterial werden mit der Lösung von 10 mg Enzym in 1 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gemischt und die Suspension unter gelegentlichem Schwenken bei 4° C 2 h inkubiert. Im Überstand werden mindestens Vi der eingesetzten Enzymaktivität zurückgewonnen und können erneut für Bindungsreaktionen eingesetzt werden.

5b) Beispiel für die Verwendung von Polyäthylenglycol als Schwingarm bei einem Trägermaterial aus Dextrangelen Das Trägermaterial aus Sephadex wird in völlig analoger Weise wie im vorigen Beispiel dargestellt; jedoch wird die Lösung des Schwingarms ersetzt durch eine Lösung von 20 ml Polyäthylenglycol 200 in 200 ml THF.

Das erhaltene Produkt ist dem vorhergehenden sehr ähnlich ; die erreichten Bindungskapazitäten sind jedoch allgemein geringer als im vorhergehenden Beispiel; so ist die Lysinbindungskapazität z. B. 5,6 [tMol/g und die Aktivität der gebundenen Lactatdehydrogenase beträgt 16 Einheiten/g.

6a) Herstellung eines Trägermaterials aus granulärer Zellulose

[Zellulose für Dünnschichtchromatographie (Merck) nativ, Granulat.]

2,5 g Zellulose werden im Vakuum getrocknet, in einer Lösung von 0,5 ml TDI und 0,375 ml Katalysatorsuspension in 150 ml THF aufgeschwemmt und unter Rühren für 30 min zum Rückfluss erhitzt. Das Material wird danach in eine Lösung von 2 g Butindiol in 150 ml THF gegeben und 30.min zum Rückfluss erhitzt. Es wird abermals gewaschen und filtriert und der Kuchen in einer Lösung von 2,5 gTDI und 0,25 ml Triäthylamin in 150 ml THF aufgeschwemmt. Das Material wird abgesaugt, gründlich mit wasserfreiem THF gewaschen und im Vakuum getrocknet. Eigenschaften: feines gelbliches Granulat Lysinbindungskapazität in wässriger Lösung: 4,5 [iMol/g Bindung von Enzymen an das Trägermaterial gemäss Beispiel 6a). Die Bindung erfolgt unter Standardbedingungen, wie oben beschrieben.

Trypsin.

1 g Mittel besitzt eine Aktivität äquivalent zu 1,8 mg Enzym. Polynucleotidphosphorylase.

Eine partiell angereicherte Enzymfraktion aus E. coli. 1 g Mittel besitzt die gleiche Aktivität wie 0,8 mg der eingesetzten Präparation. Als Test wurde die Bildung von hochpolymerem poly U aus UDP gemessen. Die Halbwertszeit beträgt bei kontinuierlichem Betrieb etwa 14Tage; d. h. nach 14Tagen sinkt der Umsatz bei kontinuierlichem Betrieb des Flussreaktors bei Raumtemperatur auf die Hälfte des ursprünglichen Wertes. In dieser Zeit werden etwa 10 000 Säulenvolumina umgesetzt. Da keine Enzymspuren in den Durchläufen zu finden sind, wird die Abnahme mit Denaturierung oder Zerfall des Enzyms in die Untereinheiten erklärt.

RNA-Polymerase.

Eine partiell angereicherte Präparation aus E. coli. AlsTest wurde die Synthese von Poly AU an einer hochmolekularen

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Matrize von poly dAT gemessen. Die Stabilität des gebundenen Enzyms übertrifft die des freien um ein Vielfaches.

Guanylatkinase.

Eine partiell angereicherte Rohfraktion aus E. coli. Die Säule eignet sich zur enzymatischen Synthese von GDP und GTP und bietet besondere Vorteile bei der Synthese von radioaktiv markiertem GDP, GTP, IDP und ITP.

Diphosphokinase.

Eine partiell angereicherte Proteinfraktion aus E. coli. Das Mittel lässt sich einsetzen zur Markierung des - Phosphats von Nucleosid- und Desoxynucleosidtriphosphaten.

Diphosphokinase und Polynucleotidphosphorylase.

Partiell angereicherte Proteinfraktionen aus E. coli werden gemischt und dann gebunden. Das Mittel tauscht bei Nucleosid-triphosphaten und Nucleosiddiphosphaten spezifisch das ß-Phos-phat gegen zugesetztes radioaktives Phosphat aus.

Prostatische saure Phosphatase.

Eine partiell angereicherte Proteinfraktion aus menschlichem Samen.

Die erwähnten immobilisierten Rohenzyme lassen sich ausgezeichnet für die Herstellung von Substraten für die Nucleinsäure-synthese einsetzen. In freier Lösung sind diese Rohenzyme für die Herstellung nicht brauchbar, da sich Nucleasen und andere abbauende Enzyme, die in den Rohenzymen als Verunreinigungen enthalten sind, nicht oder nur mit erheblichem Aufwand aus den Substratpräparationen entfernt werden können. Die Verwendung von gebundenen Enzymen umgeht dieses Kontaminationsproblem unter der Voraussetzung, dass das gebundene Enzym stabil gebunden bleibt und nicht langsam vom Reaktor ausgewaschen wird. Bei den nach dem beschriebenen Verfahren angewandten Mitteln ist die Stabilität realisiert.

Ribonuclease aus Pancreas.

Das Mittel zerlegt hochmolekulares poly U vollständig in 3 '-UMP und spaltet tRNA in das typische Oligonucleotidgemisch. Sterische Hinderung wird nicht beobachtet. Die Belegungsdichte ist hoch.

6b) Herstellung eines Trägermaterials aus Zellulosewatte

Die Herstellung erfolgt wie in Beispiel 6a, jedoch wird als Träger 2 g medizinische Watte verwendet.

Eigenschaften: Die äussere Erscheinungsform der Watte ist unverändert bis auf eine leicht gelbliche Farbe.

Lysinbindungskapazität in wässriger Lösung: 0,75 u,Mol/g

Enzyme werden gebunden wie in Beispiel 6a beschrieben ; die Belegungsdichte ist jedoch niedriger wegen der relativ kleinen Oberfläche des Trägers.

Das Trägermaterial bietet Vorteile bei der Umsetzung von hochviskosen Lösungen; beispielsweise bei der Spaltungvon hochmolekularer DNA durch DNase oder bei der Synthese von hochmolekularem poly A durch Polynucleotidphosphorylase.

7) Herstellung eines Trägermaterials aus Agarose

Gequollene Agarose lässt sich ohne Zerstörung der Gelstruktur nicht trocknen. Daher muss das Wasser durch Auswaschen mit einem geeigneten Lösungsmittel entfernt werden.

100 ml (Absetzvolumen) Sepharose 4B (makroporöse 4 % Agarosegel in Perlform, Pharmacia) wird ausgiebig mit trockenem Dioxan gewaschen. Die letzten Feuchtigkeitsspuren werden durch Stehenlassen der Dioxansuspension über Molekularsieb für mindestens 24 h entfernt. Das Volumen der Suspension wird mit Dioxan auf 150 ml gebracht und 2 ml Toluoldiisocyanat-2,4 und 1 ml Katalysatorsuspension werden zugefügt. Die Suspension wird für 30 min bei Raumtemperatur langsam gerührt und dann filtriert und mit Dioxan gewaschen. Ein scharfes Trockensaugen des Materials muss vermieden werden. Der Kuchen wird in 100 ml Dioxan aufgeschwemmt und 10 g Butindiol-1,4 werden zugegeben. Nach Rühren für 1 h wird abermals filtriert und gewaschen. Das Material wird zu einer Lösung von lOgToluol-

diisocyanat und 1 ml Triäthylamin in 100 ml Dioxan gegeben und bei Raumtemperatur für 30 min sanft gerührt. Die Gelperlen werden sorgfältig gewaschen und im Vakuum getrocknet. Eigenschaften des Materials: Gelbe Perlen, die Quellfähigkeit 5 und die Porengrösse sind durch Quervernetzung herabgesetzt; die mechanische Festigkeit und die Schmelztemperatur sind erheblich heraufgesetzt. Bei 65° C ist noch keine Veränderung der Gelstruktur zu bemerken; die Gelstruktur wird auch durch Trocknen nicht merklich verändert. Wenn unter Feuchtigkeits-10 ausschluss aufbewahrt, ist über einen Zeitraum von mehreren Monaten keine Abnahme der Bindungskapazität zu beobachten. Lysinbindungskapazität in wässriger Lösung: 10 (iMol/g Hämoglobinbindungskapazität: 230 mg/g

15 Bindung von biologischem Material an das Trägermaterial gemäss Beispiel 7 Trypsin inhibitor aus Sojabohnen (Merck)

1 g Mittel adsorbiert und desorbiert spezifisch 18,6 mg Trypsin. Die Kapazität wird durch mehrmaliges Benutzen des Mittels 20 nicht herabgesetzt. Die folgenden, sehr empfindlichen Enzyme, die die Synthese von hochmolekularen Nucleinsäuren katalysieren, lassen sich erfolgreich an Trägermaterial gemäss Beispiel 7 binden und in Flussreaktoren einsetzen:

DNA Polymerase, eine hochangereicherte Präparation aus E.

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coli.

RNA-Polymerase, eine homogene Präparation aus E. coli.

Polynucleotidphosphorylase, eine hochangereicherte Präparation aus E. coli.

3o RNA-Replikase, eine homogene Präparation aus E. coli-Zellen, die mit dem Phagen Qß infiziert waren. Die Stabilität der immobolisierten Enzyme übertrifft die der Enzyme in Lösung um ein Vielfaches.

Rifampicin; Antibiotica werden am besten in organischen 35 Lösungsmitteln gebunden. 5 g Trägermaterial nach Beispiel 7 werden in einer Lösung von 50 mg Rifampicin und 0,1 ml Triäthylamin in 100 ml trockenem Dioxan aufgeschwemmt. Nach langsamem Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird das Mittel abgesaugt und gründlich mit Wasser gewaschen. Das rotbraune Mittel wird als wässrige Suspension aufbewahrt und verliert während mehrmonatigem Aufbewahren keine merklichen Mengen von Rifampicin. Das Mittel absorbiert spezifisch RNA-Polymerase.

8a) Präparation eines Trägermaterials aus Polyacrylamid 10 g BioGel P10 (mikroporöse Perlen, 100-200 mesh, BioRad Laboratories) werden in 100 ml Hydrazinhydrat gequollen und für 3 h auf 80° C erhitzt. Danach wurde ausgiebig mit Wasser gewaschen und die Gelperlen in 100 ml eiskalter 0,5 M HCl 50 aufgeschwemmt und bei 0° mit 0,5 M NaN02-Lösung titriert (Indikator: Jodstärkepapier, 185mlNaN02-Lösungwurden benötigt). Das Gel wird abgesaugt und mit eiskaltem Wasser rasch gewaschen. Dann wird das Gel in 100 ml 10 % Polyäthylen-iminlösung (in Wasser) aufgeschwemmt und über Nacht stehen 55 gelassen. Polyäthylenimin wird dabei an die Oberfläche gebunden und liefert die zur Weiterreaktion notwendigen reaktionsfähigen Gruppen. Das Produkt wird mit Wasser und dann mit Alkohol gewaschen und in vacuo getrocknet. Eventuell auftretende Klümpchen werden zerstossen, so dass ein feines Pulver erhalten wird.

Der so modifizierte Träger wird in 100 ml Dioxan aufgeschwemmt und mit 2 ml Toluoldiisocyanat versetzt. Unter Rühren wird für 30 min auf 40° C erwärmt, dann wird filtriert und mit Dioxan gewaschen. Das erhaltene Material wird in einer Lösung ft5 von 2 g Butindiol-1,4 in 100 ml Dioxan aufgeschwemmt und unter Rühren für 30 min auf 40° C erwärmt. Das erhaltene Produkt wird abgesaugt, mit Dioxan gewaschen und in einer Lösung von 5 ml Toluoldiisocyanat in 100 ml Dioxan aufgeschwemmt. Nach Erwärmen für 30 min auf 50° C (ohne Katalysator) wird filtriert,

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gewaschen und getrocknet.

Eigenschaften : feine mikroporöse Perlen, in Wasser leicht schwellend.

Lysinbindung in wässriger Lösung: 17,6 [iMol/g Hämoglobinbindung in Pufferlösung: 14,8 mg/g

8b) Desaktivierung des Trägermaterials (Bildung verkappter, aber noch reaktionsfähiger Isocyanatgruppen): Je 100 mg des oben beschriebenen Trägermaterials aus Polyacrylamid werden in einer Lösung von 10 mg Desaktivierungsmittel in 2 ml Dioxan aufgeschwemmt und 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die desaktivierten Materialien werden abfiltriert, mit Dioxan gewaschen und getrocknet. Die Hämoglobinbindungskapazitäten der desaktivierten Trägermaterialien sind wie folgt:

Ohne D esaktivierungsmittel 100 %

Nitrophenol-4 114%

Dinitrophenol-1,4 116 %

Thiophenol-4 87 %

N-Hydroxysuccinimid 109 %

N-Hydroxypiperidin 121 %

Benzimidazol 115 %

9) Herstellung von Trägermaterial aus porösem Glas 4 g controlied pore Glasperlen (makroporöse Perlen, Poren-grösse 900 Â) wird mit 100 ml einer 1 % Lösung von y-Aminopro-pyltriäthoxysilan in Aceton vermischt. Das Aceton wird im Rotationsverdampfer bei mässigem Unterdruck und mässiger Wärme abgezogen. Der Rückstand wird über Nacht bei 115° C inkubiert. Durch diese bekannte Vorreaktion werden die zur Weiterreaktion benötigten reaktionsfähigen Gruppen zur Verfügung gestellt. Das Produkt wird mit 100 ml einer 2 % Lösung von Tetramethylendiisocyanat versetzt und bei Raumtemperatur ohne Katalysator für 30 min umgesetzt. Das Produkt wird abgesaugt, gewaschen und dann mit 100 ml einer 5 % Lösung von wasserfreiem Phloroglucin in THF umgesetzt. Es wird erneut filtriert und gewaschen und schliesslich wird das Produkt mit 100 ml einer 5 % Lösung von Toluoldiisocyanat in THF versetzt. Das Produkt wird gewaschen und getrocknet.

Die Bindung von Enzymen oder anderen Proteinen (z.B. Antikörper) erfolgt unter den oben genannten Bedingungen.

Beispiel für die Benutzung von Trägermaterialien zur Herstellung von Chromatographiematerial:

Das beschriebene Trägermaterial wird mit einer Lösung von 3-Aminophenylboronsäure in einem polaren aprotischen organischen Lösungsmittel umgesetzt. Das entstehende Material ist für die Chromatographie von Zuckern, Nucleosiden und Nucleoti-den in wässriger Lösung geeignet.

Bei den genannten Beispielen wird ein Katalysator benutzt, der sich beispielsweise wie folgt herstellen lässt:

Äquimolare Mengen von Natrium und Imidazol werden in wasserfreiemToluol nach bekannten Verfahren zu Natriumimi-dazolid umgesetzt. Die Suspension wird auf etwa 1 Mol/1 eingestellt.

Als bevorzugte Anwendungen kommen in Frage:

1) Trägergebundene Enzyme zur Benutzung in Flussreaktoren. Als Träger sind modifizierte Dextrane oder Zellulose vorzuziehen, die günstige Werte für Temperatur- und Druckstabilität besitzen und Enzyme nicht daniturieren. Versuche sind mit zahlreichen Enzymen gemacht worden. Alle geprüften Enzyme besassen ausreichend Aktivität, um hohe Flussraten zu gestatten. Die Stabilität der immobilisierten Enzyme war in den meisten Fällen sehr hoch. Verunreinigungen der Reaktionsprodukte mit Spuren von Enzymen waren nicht nachweisbar.

2) Trägergebundene Proteine, Oligonucleotide, Aminosäuren, Antibiotika und sonstige biologische Substanzen zur Affi-nitätschromatographie von Enzymen. Wegen der höheren Bindungskapazität (grosse Porenweite) wird als Träger am besten Agarose eingesetzt, dahohe Flussraten und Temperaturstabilität für dieses Material nicht gefordert werden.

3) Einführung verschiedener chemischer Gruppen in Säulenmaterial, z.B. zur Produktion von Ionenaustauschern oder anderen chromatographischen Materials. Auf Schwingarme kann für dieses Material verzichtet werden, die erreichbare Kapazität ist sehr hoch.

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PATENTANSPRÜCHE tenden Träger und mindestens einem Bindungsmittel mit minde stens zwei reaktive Gruppen aufgebaut ist. Die Erfindung betrifft

1. Verfahren zur Herstellung eines geformten Trägermate- weiterhin ein mindestens eine reaktive Gruppe aufweisendes rials, das zur kovalenten Bindung mit biologisch aktiven Stoffen Trägermaterial zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stof-befähigte Gruppen aufweist und aus einem möglichst mehrere 5 fen, insbesondere Enzyme, und ein Mittel, welches einen biolo-freie -NH2 oder OH-Gruppen enthaltenden Träger und minde- gisch aktiven Stoff enthält, der durch ein Trägermaterial der stens einem Bindungsmittel mit mindestens zwei reaktiven Grup- genannten Art immobilisiert ist.

pen aufgebaut ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger mit Das Ausgangsmaterial ist ein in der Regel polymer aufgebau-einem gegebenenfalls verkappten Diisocyanat derart umgesetzt ter «Träger», beispielsweise Zellulose, Agarose, Dextrane od. wird, dass noch freie, zur kovalenten Bindung befähigte Isocya- 10 dgl. Wesentlich ist, dass dieser Träger NH2-oder OH-Gruppen natgruppen am so erhaltenen Trägermaterial verbleiben. aufweist. Sollte dies bei einem Träger von Haus aus nicht der Fall
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sein, so müssen diese Gruppen durch eine Vorreaktion angela-Diisocyanat oder verkapptes Diisocyanat in einem wasserfreien gert bzw. zur Verfügung gestellt werden.

organischen aprotischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Kata- Ein «Bindungsmittel» bzw. eine «Bindungsgruppe» ist ein lysators mit einem wasserfreien Träger umgesetzt und gegebe- 15 Material bzw. Molekülteil, welches Gruppen aufweist, die eine nenfalls isoliert wird. kovalente Bindung mit dem biologisch aktiven Stoff eingehen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich- Dieses Bindungsmittel stellt andererseits die Verbindung mit net,dasseinTrägereingesetztwird.derinKugelform,Perlform, dem Träger her, und zwar entweder direkt oder indirekt. Faserform wie Watte, oder in Granulatform vorliegt. Unter einem «Kupplungsmittel» wird eine Substanz verstan-
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch 20 den, die jedenfalls die unmittelbare Verbindung zu dem Träger gekennzeichnet, dass man den Träger zunächst mit Diisocyanat herstellt. Es kann sich dabei auch um das «Bindungsmittel»

als Kupplungsmittel umsetzt, sodann durch Reaktion der freien handeln. Bindungsmittel und Kupplungsmittel haben gemein-Isocyanatgruppenmit einem mindestens bifunktionellen sam, dass sie jeweils zwei reaktive Gruppen aufweisen.

Brückenglied ein modifizierter Träger mit freien Amino- und/ Unter einem «Brückenglied» wird eine chemische Verbindung oder Hydroxylgruppen erzeugt wird, welcher dann mit gegebe- 25 verstanden, die zwei oder mehrere reaktionsfähige Gruppen nenfalls verkapptem Diisocyanat als Bindungsmittel zu dem enthält, um einerseits mit dem Kupplungsmittel und andererseits

Trägermaterial umgesetzt werden. mit dem Bindungsmittel in Verbindung zu treten. Ein Brücken-
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass glied hat die Aufgabe, den Abstand zwischen Träger und Bin-zur Erhöhung der Belegungsdichte zwei oder mehr als Bindungs- dungsmittel zu vergrössern, um einer sterischen Hinderung auf mittel eingesetzte Diisocyanate oder verkappte Diisocyanate an 30 diese Weise entgegenzuwirken.

ein Brückenglied mit mindestens drei reaktionsfähigen Amino- Der Begriff «Trägermaterial» wird für eine kettenartige Kom-und/oder Hydroxylgruppen gebunden werden. bination verwendet, die mindestens aus dem Träger und einem
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch Bindungsmittel besteht; die Kombination kann aber auch einen gekennzeichnet, dass die Reaktivität der Isocyanatgruppen oder Träger, ein Kupplungsmittel, ein Brückenglied («Schwingarm») der verkappten Isocyanatgruppen des Trägermaterials zur Erzie- 35 und ein Bindungsmittel aufweisen. In der so gebildeten Kombi-lung einer spezifischen Bindung durch Verwendung eines Desak- nation im Trägermaterial reagieren jeweils reaktionsfähige tivierungsmittels vermindert wird. Gruppen der Substanzen miteinander, die die Kombination
7. Mindestens eine reaktive Gruppe aufweisendes geformtes bilden. Weist der Träger beispielsweise eine reaktionsfähige Trägermaterial zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stof- Gruppe auf, dann muss das Kupplungsmittel für diese Kombina-fen,insbesondere Enzyme,erhaltennach dem Verfahren gemäss 40 tion eine reaktive Gruppe besitzen.

Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive Gruppe Unter «reaktionsfähiger» Gruppe wird eine nukleophile Grup-eine Isocyanatgruppe oder eine verkappte Isocyanatgruppe ist, pe verstanden, insbesondere Hydroxyl- oder Aminogruppen. die an einer am Träger hängenden Bindungsgruppe gebunden ist. Eine «reaktive» Gruppe ist eine solche Gruppe einer Substanz,
8. Trägermaterial nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, die mit einer reaktionsfähigen Gruppe leicht eine Additions-dass die Bindungsgruppe über ein Brückenglied und ein Kupp- 45 oder Kondensationsreaktion eingeht.

lungsmittel mit dem Träger verbunden ist. Ein «biologisch aktiver Stoff» ist ein solches Material, welches
9. Trägermaterial nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekenn- entweder selbst biologisches Material ist oder aber auf jeden Fall zeichnet, dass die vom Bindungsmittel und/oder dem Kupplungs- mit einem biologischen Material in Wechselwirkung treten kann, mittel eingegangenen Bindungen substituierte Urethan- oder Es kann beispielsweise ein Protein, ein Enzym od. dgl. sein, aber substituierte Harnstoffbindungen darstellen. 50 auch ein anorganisches oder organisches Material, welches ein
10. Mittel, enthaltend einen biologisch aktiven Stoff, der durch Substrat für ein Enzym darstellt.

ein Trägermaterial immobilisiert ist, dadurch gekennzeichnet, Ein «Mittel» ist ein Trägermaterial mit einem biologisch dass sich eine reaktive Gruppe des biologisch aktiven Stoffes mit aktiven Stoff.

einer Isocyanatgruppe des Trägermaterials nach Anspruch 7 Es ist bekannt, Träger mit Hydroxylgruppen, vor allem Poly-

verbunden hat. 55 saccharide wie Zellulose, Dextran und Agarose, zu aktivieren, so
11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass dass sie zur Bindung an biologisch aktive Stoffe, die Aminogrup-eine Aminogruppe des biologisch aktiven Stoffs mit dem Träger- pen oder Hydroxylgruppen enthalten, befähigt sind. Beispielsmaterial zu einem substituierten Harnstoff verbunden ist. weise werden Agarosegele durch Cyanbromid in Gegenwart von
12. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Alkali aktiviert, so dass sie dann Proteine und andere biologische eine Hydroxylgruppe des biologisch aktiven Stoffes mit dem 60 Stoffe binden können. Die Bindung ist jedoch nicht stabil genug. Trägermaterial zu einem substituierten Urethan verbunden ist. Es entstehen mehrere Bindungstypen, die unterschiedliche Stabilität aufweisen. DasTrägermaterialmussunmittelbarvor

Gebrauch hergestellt werden, ist also nicht lagerfähig. Über die genaue Umsetzung bestehen mehrere Theorien. Eine exakte Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines 65 Klärung liegt bisher nicht vor (Methods in Enzymology. Band 34. geformten Trägermaterials, das zur kovalenten Bindung mit Seiten 13 bis 30).

biologisch aktiven Stoffen befähigte Gruppen aufweist und aus Gemäss einer weiteren bekannten Methode kann eine Kupp-

einem möglichst mehrere freie -NH2- oder -OH-Gruppen enthal- lung zwischen dem Träger und dem biologisch aktiven Stoff auch

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durch Reagentien (Bindungsmittel) erzeugt werden, die zwei oder mehrere reaktive Gruppen enthalten.

Beispielsweise wird Zellulose durch Cyanurchlorid aktiviert, wobei das entstehende Trägermaterial noch reaktive Chlorgruppen enthält, die mit Proteinen reagieren können. Nachteilig dabei ist, dass das Cyanurchlorid eine Denaturierung von empfindlicherem biologisch aktivem Material bewirkt (Nature, Band 216, Jahrgang 1967, Seiten 514, 515).

Es ist weiterhin bekannt, Agarose mit Divinylsulfon zu kuppeln. Das dabei entstehende Trägermaterial addiert biologisch aktives Material, beispielsweise Protein, schonend und in guten Ausbeuten. Da die Bindung jedoch sehr schwach ist, verliert das Mittel das gebundene Protein sehr leicht (Methods in Enzymolo-gy a.a.O.).

Es ist weiterhin bekannt, Trägermaterial dadurch herzustellen, dass Agarose mit Bisoxiranen zur Reaktion gebracht wird. Das entstehende Trägermaterial bindet Proteine unter Bildung von stabilen Bindungen. Zur Realisierung der Bindung sind jedoch extreme pH-Bedingungen notwendig, bei denen viele empfindliche Substanzen, beispielsweise biologisch aktiver Stoff, zerstört werden (Methods in Enzymology a.a.O.).

Zur Bindung von Makromolekülen, die mit anderen Makromolekülen in Wechselwirkung treten sollen, ist zur Ausbildung dieser Wechselwirkung ein genügender Abstand von der Oberfläche des Trägers notwendig. Es ist bekannt, diesen Abstand von Fall zu Fall durch Zwischenschalten einer geeigneten Verbindung, die als Brückenglied oder auch als Schwingarm wirkt, zu schaffen. So ist es beispielsweise bekannt, Agarose mit Cyanbromid zu aktivieren, um dann daran ein längerkettiges Diamin zu binden, das als Brückenglied wirkt. Die freie Gruppe wird succinyliert und die Carboxylgruppe wird durch N-Hydro-xysuccinimid und Dicyclohexylcarbodiimid aktiviert. Hierzu ist jedoch ein erheblicher chemischer Aufwand notwendig. Die Handhabung während der Umsetzung ist schwierig und für Grossansätze kaum durchführbar (Biochemiatry, Band 11, Jahrgang 1972, Seiten 2291-2299).