CH641492A5

CH641492A5 - Antibiotische substanz.

Info

Publication number: CH641492A5
Application number: CH486279A
Authority: CH
Inventors: Mamoru Arai; Akio Torikata; Ryuzou Enokita; Tatsuo Haneishi; Mutsuo Nakayima
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1978-05-24
Filing date: 1979-05-23
Publication date: 1984-02-29
Also published as: IT7968118A0; DE2921085A1; GB2021558A; DE2921085C2; US4336249A; JPS54160302A; GB2021558B; JPS6024717B2; FR2426697B1; AT364082B; FR2426697A1; NL7904094A; US4332902A; IT1120973B; ES480904A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue antibiotische Substanz, Mycoplanecin genannt, die mittels eines neuen Mikroorganismus, nämlich Actinomycetes nov. sp. Stamm No. 41042, hergestellt werden kann, und auf ein Verfahren zur Herstellung von Mycoplanecin durch Züchtung eines Mycoplanecin erzeugenden Mikroorganismus, vorzugsweise eines Mikroorganismus der Gattung Actinoplanes.

Die neue antibiotische Substanz, nämlich Mycoplanecin, lässt sich durch die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften charakterisieren:

(1) Farbe und Zustand: Weisses Pulver

(2) Schmelzpunkt 161 bis 167 °C

(3) Spezifische Drehung: [a]^ - 66° (c = 0,4, Chloroform)

(4) Elementaranalyse:

C = 61,78%; H = 8,48%; N = 11,75%

(nach dem Trocknen bis zur Erreichung eines konstanten Gewichts)

s (5) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Bloss terminale Absorption beim Messen bei 20 Hg/ml in 50 vol-%iger wässriger methanolischer Lösung, wie dies aus Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen ersichtlich ist;

(6) Infrarotabsorptionsspektrum: gemessen in einer KBr-io Tablette, gemäss Fig. 2 der beiliegenden Zeichnungen;

(7) Magnetisches Kernresonanzspektrum, in Deuterochloroform als Lösungsmittel unter Verwendung von Tetramethylsilan (TMS) als innerer Standard gemessen, gemäss Fig. 3 der beiliegenden Zeichnungen;

15 (8) In Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Aceton und Chloroform löslich; in Benzol spärlich löslich und in Wasser unlöslich;

(9) Mit 50 vol-%iger wässriger Schwefelsäure braungefärbt, bei Dünnschichtchromatographie über Kieselgel mit

20 Jod und Kaliumpermanganat positiv und mit Ninhydrin und 2,4-Dinitrophenylhydrazin negativ reagierend;

(10) je 1 Mol Glycin, Prolin, Leucin, 2-Amino-5-methyl-hexansäure, N-Methylthreonin, N-Methylleucin, Methylpro-lin und Äthylprolin und 2 Mol N-Methylvalin (nach der Hy-

25 drolyse mit 6n-Salzsäure während 20 Stunden bei 105 °C feststellbar) enthaltend; und

(11) starke antibakterielle Wirkung gegenüber verschiedenen Bakterien der Gattung Mycobacterium.

Überdies zeigt Mycoplanecin einen Rf-Wert von 0,15 30 (mittels Dünnschichtchromatographie über Kieselgel, F 254,

0.25 mm, No. 5715, erhältlich bei der Fa. Merck and Co. Ine), sofern mittels Äthylacetat entwickelt wird, und einen Rf-Wert von 0,64, sofern mit einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 95:5 Volu-

35 menteilen entwickelt wird.

Ein erfindungsgemäss verwendbarer neuer Mikroorganismus ist Actinomycetes nov. sp. Stamm No. 41042, welcher aus einer Bodenprobe isoliert worden ist, welche in Sumoto City, Hyogo Prefecture, Japan, gesammelt worden war. Der 40 Stamm wurde am 23. Mai 1978 unter der No. FERM-P-4504 beim Technical Research Institute of the Microbial Industry, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (auch Fermentation Research Institute genannt) hinterlegt. Der Stamm wurde 45 überdies unter der No. NRRL-11462 beim US Department of Agriculture hinterlegt.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung der neuen antibiotischen Substanz, nämlich Mycoplanecin, wobei dieses Verfahren darin besteht, dass man einen Mycoplanecin erzeugenden Mikroorganismus, vorzugsweise einen Mikroorganismus der Gattung Actinoplanes, züchtet und hierauf aus der Kulturbrühe Mycoplanecin isoliert.

Die Morphologischen und physiologischen Eigenschaften von Actinomycetes nov. sp. Stamm No. 41042 sind die folgenden:

1. Morphologische Eigenschaften

60 Sofern der Stamm Nr. 41042 in einem Medium ISPA, vorgeschrieben durch International Streptomyces Project (ISP), während 14 Tagen bei 28 °C gezüchtet und unter dem Mikroskop beobachtet wird, zeigt er die folgenden morphologischen Eigenschaften: sphärische bis subsphärische Sporan-65 gien mit einem gewöhnlichen Durchmesser von 7 bis 15 p. und Sporen der Grösse von 0,8 n x 1,3 jj. mit Flagellen, welche in einer 1/15 molaren Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 eine Motilität von ca. 40 Minuten aufweisen. Die

50

55

3 641

Wachstumsresultate auf verschiedenen Medien bei 28 °C

Calcium-

SM

mässig, blass während 14 Tagen finden sich in der folgenden Tabelle 1.

malat-Agar

orange (4-8-7)

AM

kein Wachstum

Tabelle 1

s

SP SG

nicht erzeugt schwach gebildet

Art des

Bezeich

Eigenschaften

Bezeich

Eigenschaften

Mediums nung des Stammes

Art des

No. 41042

Mediums nung des Stammes

No. 41042

Hefe-Malz-Agar

SM

reichlich,

10

reichlich,

(ISP 2)

dunkelgelblich-orange

Hickey-

SM

AM

(8-7-8)

kein Wachstum

Tresner-Agar

gelblichbraun (8-6-8)

SP

nicht erzeugt

AM

schwache Spur eines

SG

nicht gebildet

15

Luftmycelwachstums

SP

nicht erzeugt

Weiszenmehl-

SM

reichlich,

SG

nicht gebildet

Agar (ISP 3)

gelblich braun

Bennett-

SM

reichlich,

(10-6-8)

Spuren von Luftmycelien

AM

20 Agar

dunkelgelblich-

SP '

blass gelblichbraun

AM

orange (8-7-8)

SG

(4-8-9)

kein Wachstum

nicht gebildet

SP

nicht erzeugt

SG

schwache Bildung

Stärke-Salze-

SM

massig, dunkel

25

Agar (ISP 4)

AM

gelblich orange (8-7-8)

kein Wachstum

Saccharose-nitrat-Agar

SM

weniger gut, blassorange (4-8-7)

SP

nicht erzeugt

AM

kein Wachstum

SG

reichlich

30

SP SG

nicht erzeugt reichlich

Glycerin-Aspar-

SM

reichlich,

agin-Agar

blassgelblichbraun

Glucose-

SM

mässig,

(ISP 5)

4-8-8)

Asparagin-

bräunlichweiss

AM

kein Wachstum

35 Agar

(2-9-8)

SP

nicht erzeugt

AM

kein Wachstum

SG

nicht gebildet

SP SG

nicht erzeugt schwache Bildung

Art des

Bezeich

Eigenschaften

Mediums nung des Stammes

40 Tomatenbrei-

SM

mässig,

No. 41042

Weizenmehl-Agar

blass gelblichbraun (6-8-9)

Tyrosin-Agar

SM

reichlich,

AM

kein Wachstum

(ISP 7)

hellbraun (8-6-7)

SP

nicht erzeugt

AM

kein Wachstum

45

SG

nicht gebildet

SP

blass gelblichbraun

SG

nicht gebildet

Glycerin-Glycin-Agar

SM

reichlich,

blass gelblich

Nähragar

SM

weniger gut,

50

braun (6-8-8)

blassorange

AM

kein Wachstum

(4-8-7)

SP

nicht erzeugt

AM

kein Wachstum

SG

nicht gebildet

SP

nicht erzeugt

-

SG

nicht gebildet

Glucose-55 nitratagar

SM

mässig,

dunkelgelblich-

Emerson-

SM

mässig, blass

orange (8-7-8)

Agar

gelblichbraun (6-8-8)

AM SP

kein W achstum dunkelgelb (10-7-9)

AM

kein Wachstum

60

SG

nicht gebildet

SP

gelblichbraun

(10-6-8)

Abkürzungen: SM: Substratmycelium

SG

nicht gebildet

AM: Luftmycel

SP: Lösliches Pigment

Wasseragar

SM

mager, gelblich

65

SG: Sporangium

grau (1-9-10)

AM

kein Wachstum

2. Physiologische Eigenschaften

SP

nicht erzeugt

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes No.

SG

mässig gebildet

41042 finden sich in der Tabelle 2.

641492

4

Tabelle 2

Die verwendeten Medien waren die folgenden:

Medium A: Trypton-Hefe-Extraktbrühe (ISP 1)

Tyrosinasereaktion

Positiv (stark)

Medium B: Pepton-Hefe-Extrakt-Eisen-Agar (ISP 6).

Nitratreduktion

Positiv (stark)

Die Verwertung der Kohlenstoffquelle durch den Stamm

Hydrolyse von Stärke

Negativ s Nr. 41042 auf einem Pridham-Gottlieb-Agarmedium bei

Gelatineverflüssigung

Positiv (stark)

28 °C während 14 Tagen ergibt sich aus der folgenden Ta

Peptonisierung von

belle 3:

Milch 26 °C

Positiv (pH 6,0)

Koagulierung von

Milch 26 °C

Positiv

10

Melaninbildung

Medium A

Positiv

MediumB

Positiv

Temperaturbereich

für das Wachstum

9,0 bis 32,5 °C

15

(auf ISP 2 Medium) "

(optimale Temperatur

für das Wachstum

18,5 bis 29 °C)

Tabelle 3

Medium

C

D

Medium

C

D

D-Glucose

+ +

Raffinose

_

L-Arabinose

+ +

Inulin

-

D-Xylose

+ +

Dextrin

+ +

D-Fructose

+

+ +

Stärke

+

L-Rhamnose

+

+ +

i-Inositol

-

D-Galactose

+ +

D-Mannitol

-

+

D-Mannose

+ +

Dulcitol

-

Saccharose

+

+ +

Salicin

-

D-Cellobiose

+

+ +

Natriumacetat

-

Melibiose

-

—

Natriumsuccinat

-

ß-Lactose

-

+

Glycerin

-

+ +

Maltose

+

Cellulose

-

Trehalose

-

+

Blindversuch

-

+ + : bestens verwertet

+ : verwertet

-: nicht verwertet

Es wurden die folgenden Medien verwendet: Tabelle 5

Medium C: Pridham-Gottlieb-Agar 45

Medium D: Pridham-Gottlieb-Agar plus Hefe-Extrakt 0,5%. Saccharidkomponenten in der Gesamtzelle

3. Zusammensetzung der Mycelien Glukose Galactose Mannose Arabinose Xylose

Ein saures Hydrolysat der Mycelien wurde mittels Papier- + + Spuren Spuren Spuren

Chromatographie nach den Methoden gemäss B. Becker et al in Applied Microbiology, 12,421-423 (1964) und 13,236-243

Wie aus den oben beschriebenen Eigenschaften eindeutig hervorgeht, gehört der Stamm Nr. 41042 der Gattung Actinoplanes der Familie Actinoplanaceae innerhalb der Art Ac-55 tinomycetes an. Dies ergibt sich aus der Bildung von sphärischen bis subsphärischen Sporangien, motilen Sporen und Zellwänden vom Typus II. Der neue Stamm wird daher als Actinoplanes nov. sp. Stamm No. 41042 bezeichnet.

Bekanntlich sind die Eigenschaften von Actinomycetes-60 Stämmen einschliesslich von Actinoplanes nicht starr und können durch natürliche Vorgänge und zufolge künstlicher Mutation leicht Änderungen eingehen. Wenn auch die vorliegende Erfindung die Herstellung eines neuen Antibiotikums, nämlich von Mycoplanecin, insbesondere durch Züchtung 6S des oben definierten Actinoplanes nov. sp. Stammes No. 41042 zum Gegenstand hat, so können ebenfalls Mutanten dieses Organismus und ganz allgemein beliebige Actinopla-nesstämme, welche Mycoplanecin zu erzeugen vermögen, ver-

(1965) und M.P. Lechevalier et al in «The Actinomycetales», 311-316 (1970) analysiert. Die Resultate finden sich in den folgenden Tabellen 4 und 5.

Tabelle 4

Zellwandart

Art der Glycin Arabinose Galactose

Diaminopimelinsäure

Meso LL Hydroxy

+ — + 4- Spuren +

Aus diesen Resultaten wird bestätigt, dass die Zellwandart dem Typus II entspricht.

5 641492

wendet werden, sofern diese antibiotische Substanz erhalten dene Mycoplanecin durch Zugabe eines mit Wasser mischba-wird. ren Lösungsmittels, wie z.B. Methanol, Äthanol, Isopropanol

Die erfindungsgemässe Züchtigung eines Mycoplanecin oder Aceton, extrahieren. Das Lösungsmittel kann hierauf erzeugenden Mikroorganismus kann unter den für die Züch- aus dem Extrakt entfernt und der Rückstand erneut mit ei-tung von Actinoplanes-Arten üblicherweise zur Anwendung 5 nem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z.B. gelangenden Bedingungen geschehen. Vorzugsweise wird Chloroform, Äthylacetat, Methylisobutylketon oder Methy-

man Schüttelkulturen oder submerse Kulturen mit Belüftung lenchlorid, extrahiert werden. Das im flüssigen Anteil der und Rühren in einem flüssigen Medium verwenden. Kulturbrühe vorhandene Mycoplanecin kann ebenfalls mit

Das für die Züchtung verwendete Nährmedium kann eine einem solchen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel solche Zusammensetzung aufweisen, wie sie üblicherweise für io extrahiert werden, worauf man es normalerweise mit dem aus die Züchtung von Actinomyceten verwendet wird. Es kann dem Mycelteil gewonnenen Extrakt vereinigt und einengt, um daher eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, z.B. Glucose, auf diese Weise einen rohen Mycoplanecinextrakt zu erhalten. Arabinose, Galactose, Mannose, Saccharose, Maltose, Dex- Andererseits kann man Mycoplanecin durch direkte Zu-trin, Stärke, Glycerin, ein vegetabilisches Fett oder Öl, wie gäbe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie z.B. z.B. Sojabohnenöl, Maisöl oder Baumwollsamenöl, ein tie- 1S eines oben genannten Lösungsmittels, zur Kulturbrühe ohne risches Fett oder Öl, wie z.B. Hühneröl oder Speck, oder Abtrennen des Mycéliums aus dem flüssigen Anteil extrahie-

Fischöl, eine assimilierbare Stickstoffquelle, z.B. Sojaboh- ren, den so erhaltenen Extrakt filtrieren und einengen, um das nenmehl, Erdnussöl, Baumwollsamenmehl, Fischmehl, Mais- Lösungsmittel zu entfernen, und hierauf den Rückstand er-quellflüssigkeit, Weizenmehl, abgerahmte Milch, Pepton, neut, wie oben beschrieben, mit einem mit Wasser nicht Fleischextrakt, lebende Hefe, Hefeextrakt, Casaminosäure, 20 mischbaren Lösungsmittel extrahieren.

Natriumnitrat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumsulfat, Das so erhaltene Mycoplanecin kann mit Hilfe einer belie-

und ein anorganisches Salz, z.B. Natriumchlorid, Kalium- bigen, für die Reinigung von Verbindungen mit ähnlichen chlorid, Phosphate, Magnesiumcarbonat, Calciumcarbonat physiko-chemischen Eigenschaften bekannten Methode wei-oder Calciumchlorid enthalten. Es kann ferner auch kleine ter gereinigt werden. Vorzugsweise wird man zur Reinigung Mengen verschiedener anderer Metallsalze, z.B. Ferrosulfat, 25 ein Adsorptionsmittel oder eine im Gegenstrom arbeitende Kupfersulfat, Magnesiumsulfat, Zinksulfat oder Kobaltsul- Verteilungsmethode verwenden. Geeignete Adsorptionsmit-fat, enthalten. tel umfassen Aluminiumoxyd, Kieselgel, Sephadex (Marken-

Die Züchtung in einem flüssigen Medium erfolgt Vorzugs- bezeichnung für eine Reihe von sich von Polysacchariden abweise aerob mit Durchlüftung und Rühren, wobei man in ei- leitenden organischen Verbindungen) oder Cellulose. Vor-nem solchen Falle dem Medium ein Antischaummittel zuge- 30 zugsweise wird man die Trennung mittels der Säulenchroma-ben kann. Geeignete Antischaummittel sind Silikonöle, vege- tographie unter Verwendung von Kieselgel als Trägermittel tabilische Öle oder oberflächenaktive Mittel. und Methanol, Äthylacetat oder Chloroform oder einer Mi-

Die Züchtung erfolgt vorzugsweise im wesentlichen bei ei- • .schung davon als Eluiermittel durchführen. Die präparative nem neutralen pH-Wert und bei einer Temperatur zwischen Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kiesel-18 °C und 30 °C, vorzugsweise bei ungefähr 28 °C. 35 gel ist ebenfalls für die Erzeugung von stark gereinigtem My-

Der Titer des in der Kulturbrühe bei zunehmender Züch- coplanecin wirksam.

tung erzeugten Mycoplanecins lässt sich mittels der Becher- Das so erhaltene gereinigte Mycoplanecin zeigt bei den testmethode unter Verwendung von Mycobacterium smeg- Färbereaktionen mit Schwefelsäure, Kaliumpermanganat matis ATCC 607 als Testmikrob quantitativ bestimmen. Die oder Jod auf den kieselgelhaltigen Dünnschichtchromato-maximale Erzeugung von Mycoplanecin ist im allgemeinen 40 grammen einzelne Stellen und besitzt ebenfalls die weiter nach Ablauf von 3 bis 5 Tagen der Züchtung erzielt. oben beschriebenen physikalischen und chemischen Eigen-

Mycoplanecin findet sich sowohl im flüssigen Anteil als schaften.

auch im Mycelanteil der Kulturbrühe, welche erfindungsge- Die minimalen Hemmkonzentrationswerte (MIC) für mäss erzeugt wird. Um das Antibiotikum aus der Kultur- Mycoplanecin in Bezug auf verschiedene Mikroorganismen brühe nach beendeter Züchtung zu gewinnen, können das 45 finden sich in der folgenden Tabelle 6. Die Bewertung erfolgte Mycel und andere feste Bestandteile zuerst durch Filtrieren in folgender Weise: Für Mycobacterien erfolgte sie nach der aus der flüssigen Phase beseitigt werden, wobei man beispiels- Inkubation während 5 Wochen bei 37 °C mit Hilfe der Verweise Diatomeenerde als Filterhilfsstoff einsetzt. Diese Tren- dünnungsmethode unter Verwendung von 1 %igem Rinderse-nung kann auch durch Zentrifugieren geschehen. Das im My- rum enthaltendem flüssigem Dubos-Medium, bei allgemei-celanteil oder im Filtrat oder in der überstehenden Flüssigkeit50 nen Bakterien nach der Inkubation während 24 Stunden bei vorhandene Mycoplanecin kann hierauf in üblicher Weise 37 °C mit Hilfe der Agarverdünnungsmethode unter Verwen-isoliert und gereinigt werden, wobei man die physiko-chemi- dung eines Herzinfusionsagarmediums und bei Pilzen und sehen Eigenschaften des Mycoplanecins berücksichtigen Hefen nach der Inkubation während 48 Stunden bei 26 °C mit wird. Hilfe einer Agarverdünnungsmethode unter Verwendung ei-

So kann man beispielsweise das im Mycelanteil vorhan- 55 nes Sabouraud-Agarmediums.

641492

6

Tabelle 6

Testorganismus

Mycobacterium kansasii Mycobacterium fortuitum Mycobacterium intracellulare Micobacterium intracellulare Mycobacterium tuberculosis

Matsudo Mycobacterium tuberculosis Maru

Mycobacterium tuberculosis H37

Mycobacterium tuberculosis H37R.V

Mycobacterium tuberculosis H2

Mycobacterium bovis BCG Mycobacterium bovis ushi-10 Mycobacterium tuberculosis (Streptomycin-resistent Mycobacterium smegmatis Mycobacterium phlei Micrococcus luteus

Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa

Candida albicans Aspergillus oryzae

Pénicillium chrysogenum

Trichophyton mentagrophytes Pyricularia oryzae

*Medium DM: Dubos-Medium, wobei für die beiden Stämme Mycobacterium smegmatis ATCC 607 und Mycobacterium phlei dieses Medium 10% Rinderserum enthielt.

Medium H: Herzinfusionsagarmedium

Medium S: Sabouraud-Agarmedium

Die Toxizität der antibiotischen Substanz, d.h. von Mycoplanecin, wurde bestimmt, indem man Mycoplanecin intraperitoneal in Dosierungsmengen von 100 mg/kg Körpergewicht Mäusen verabreichte. Dabei konnte man feststellen, dass keine Maus starb.

Die Herstellung von Mycoplanecin wird durch die folgenden Beispiele, welchen keine einschränkende Bedeutung zukommen soll, erläutert.

Beispiel 1

Ein 500 ml Sakaguchikolben wurde mit 100 ml eines Samenkulturmediums versetzt, dessen pH-Wert vor der Sterilisierung 7,0 betrug und welches die folgende Zusammensetzung aufwies (die Prozentsätze sind in Gew./Vol. ausgedrückt):

Glucose 1 %

Glycerin 1 %

Weizenmehl 0,5%

Medium*

MIC

(Hg/ml)

IFM 2069

DM

0,025

IFM 2079

DM

1,56

IFM 2073

DM

0,39

IFM 2083

DM

0,39

IFM 2026

DM

0,195

IFM 2027

DM

0,39

IFM 2028

DM

0,78

IFM 2029

DM

0,39

IFM 2030

DM

0,78

IFM 2031

DM

0,78

IFM 2032

DM

0,1

IFM 2033

DM

0,1

ATCC 607

DM

0,08

DM

0,01

PCI 1001

H

0,0125

209PJC-1

H

>400

PCI 219

H

>400

NIHJJC-2

H

>400

PCI 602

H

>400

OX 19

H

>400

1331

H

>400

SANK

H

>400

73860

Yu 1200

S

>400

SANK

S

>400

11262

SANK

12768

S

>400

SANK

22374

S

>400

SANK

16975

s

>400

45 Saccharose

1 %

Sojabohnenmehl

2 %

Casaminosäure

0,5%

lebende Hefe

1 %

Calciumcarbonat

0,1%

50 Wasser q.s.

Dieses Medium wurde mit einer Kultur von Actinoplanes nov. sp. Stamm No. 41042 angeimpft und die Schüttelkultur 55 während 96 Stunden bei 28 °C durchgeführt. Die so erhaltene Kulturbrühe wurde dann in 5 ml Portionen aufgeteilt und jede Portion in einem Sagakuchikolben inokuliert, wobei jeder Kolben 100 ml eines Produktionsmediums enthielt, dessen pH-Wert vor der Sterilisierung bei 7,0 lag und welches die 60 folgende Zusammensetzung aufwies (die Prozentsätze sind in Gew./Vol. ausgedrückt):

Glycerin 0,5%

Saccharose 2 %

Sojabohnenmehl 1 %

65 lebende Hefe 1 %

Maisquellflüssigkeit 0,5%

C0C12.6H20 0,001% Wasser q.s.

7 641 492

Das wechselseitige Schütteln der Kultur wurde hierauf Beispiel 2 während 96 Stunden bei 28 °C durchgeführt. Die so erhalte- Zehn 500 ml Sakaguchikolben, welche jeweils 100 ml einen Kulturbrühen wurden vereinigt. nes Samenkulturmediums gleicher Zusammensetzung wie in Zu 4 Liter der vereinigten Kulturbrühen (pH 7,2) wurden Beispiel 1 enthielten, wurden mit einer Kultur von Actinopla-5 gew./vol.%iges Celite 545 (Warenzeichen für einen Filter s nes nov. sp. Stamm No. 41042 inokuliert und dann die Schüt-der Firma Johns Manville Product Corporation, U.S. A.) hin- telkultur während 96 Stunden bei 28 °C geschüttelt.

zugegeben und die Brühe dann filtriert, um die Flüssigkeit Ein 30 Liter Fermentierkolben, welcher 15 Liter eines vom die Mycelien enthaltenden Filterkuchen zu trennen. Das Produktionsmediums gleicher Zusammensetzung wie in Bei-

Filtrat wurde mit 2 Liter Äthylacetat extrahiert, um das noch spiel 1 enthielt, wurde mit 750 ml der nach den obigen Anga-

vorhandene Mycoplanecin zu gewinnen, während der Mycel- 10 ben erzeugten Kulturbrühe inokuliert und hierauf unter kuchen mit 2 Liter 20 Vol.-% Wasser enthaltendem Aceton Schütteln und Belüften bei 250 Umdrehungen pro Minute,

extrahiert wurde. Das Aceton wurde unter vermindertem bei einer Temperatur von 28 °C und einer Belüftung von 15

Druck abdestilliert und der Rückstand mit 2 Liter Äthylace- Liter/Minute während 80 Stunden behandelt.

tat extrahiert. Die aus dem Filtrat gewonnenen Äthylacetat- Zur so erhaltenen Kulturbrühe wurden 15 Liter Aceton extrakte und der Mycelkuchen wurden dann vereinigt, wobei 15 hinzugegeben, worauf das Gemisch gerührt und das Produkt man 4 Liter vereinigte Extrakte erhielt. mit Hilfe von 500 g Celite filtriert wurde. 25 Liter des Filtra-

Diese vereinigten Extrakte wurden zweimal jeweils mit 1 tes wurden durch Verdampfen unter vermindertem Druck

Liter einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewa- eingeengt, um das Aceton abzudestillieren. Die verbleibende sehen. Die gewaschenen Extrakte wurden über wasserfreiem Flüssigkeit (15 Liter) wurde mit 7 Liter Methylenchlorid ver-

Natriumsulfat getrocknet und hierauf durch Eindampfen un- 20 setzt und die Lösung hierauf unter Schütteln und Rühren ex-

ter vermindertem Druck eingeengt, bis man 1,07 g einer öli- trahiert. Der Rückstand wurde mit weiteren 7 Liter Methy-

gen Substanz erhielt. lenchlorid weiter extrahiert und die Extrakte wurden verei-

Diese ölige Substanz wurde in wenig Chloroform gelöst nigt. Dann wurde das Lösungsmittel verdampft, wobei man und auf einer 20 g Kieselgel enthaltenden Säule, welche zuvor 1,8 g einer öligen Substanz erhielt.

mit Chloroform behandelt worden war, adsorbiert. Dann 25

wurde die Säule mit Chloroform gewaschen und die Verunrei- Eine Lösung dieser öligen Substanz in wenig Chloroform nigungen wurden unter Verwendung einer Mischung von wurde auf einer 50 g Kieselgel enthaltenden und mit Chloro-

Chloroform und Äthylacetat in einem Mischungsverhältnis form beschickten Säule adsorbiert. Dann wurde Mycoplane-

von 1:1 Vol.-Teilen und hierauf mit nur Äthylacetat eluiert. ein mit einem Lösungsmittelsystem, welches 99 Vol.-% Chlo-

Das so erhaltene Mycoplanecin wurde hierauf mit einem 30 roform und 1 Vol.-% Methanol enthielt, daraus eluiert.

Mischlösungsmittel, welches 95 Vol.-% Äthylacetat und 5 400 ml der aktiven Fraktionen wurden gesammelt und

Vol.-% Methanol enthielt, eluiert. 1 Liter einer aktiven Frak- durch Verdampfen unter vermindertem Druck eingeengt, wo-

tion wurde aus den eluierten Fraktionen abgetrennt und unter bei man 390 mg eines weissen Pulvers erhielt. Eine Lösung vermindertem Druck durch Verdampfen eingeengt, wobei dieses weissen Pulvers in wenig Chloroform wurde hierauf der man 130 mg eines weissen Pulvers erhielt. 35 präparativen Dünnschichtchromatographie unter Verwen-

110 mg dieses weissen Pulvers wurden in wenig Chloro- dung einer Kieselgelplatte (5717 der Firma Merck & Co. Inc.)

form gelöst und die erhaltene Lösung durch eine Sephadex unterworfen und mit einer Mischung von 95 Vol.-% Chloro-

LH-20 (erhältlich bei der Firma Pharmacia Co. Limited, form und 5 Vol.-% Methanol entwickelt. Die aktiven Bande

Schweden) enthaltende, mit Chloroform beschickte Säule ge- wurden mit Äthylacetat extrahiert, wobei man 250 mg My-

leitet und hierauf mit Chloroform eluiert. Die so gesammel- 40 coplanecin als weisses Pulver erhielt, welches einen Reinheits-

ten, aktiven Fraktionen wurden durch Eindampfen unter ver- grad von ungefähr 90% aufwies, wie sich dies durch einen mindertem Druck eingeengt, wobei man 90 mg Mycoplane- Bioassay feststellen liess.

ein als weisses Pulver erhielt. Dieses gereinigte Produkt zeigte Auf den beiliegenden Zeichnungen werden in den Figuren bei der Dünnschichtchromatographie über Kieselgel unter 1,2 und 3 das Ultraviolettspektrum, das Infrarotspektrum

Anwendung von Jod, Schwefelsäure und Kaliumpermanga- 45 bzw. das magnetische Kernresonanzspektrum von Mycopla-

nat einzelne Stellen. necin wiedergegeben.

C

1 Blatt Zeichnungen

Claims

641492 PATENTANSPRÜCHE

(1) Farbe und Zustand: Weisses Pulver

1. Antibiotische Substanz, nämlich Mycoplanecin, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:
2. Verfahren zur Herstellung der antibiotischen Substanz Mycoplanecin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mycoplanecin erzeugenden Mikroorganismus züchtet und aus der entstandenen Kulturbrühe Mycoplanecin isoliert.

(2) Schmelzpunkt 161 bis 167 °C
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mycoplanecin erzeugenden Mikroorganismus Actinoplanes nov. sp. Stamm No. 41042, NRRL-11462 verwendet.

(3) Spezifische Drehung: [a]^ - 66° (c = 0,4, Chloroform)
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung bei einer Temperatur von 18 bis 30 °C erfolgt.

(4) Elementaranalyse:

C = 61,78%; H = 8,48%; N = 11,75% (nach dem Trocknen bis zur Erreichung eines konstanten Gewichts)

(5) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Bloss terminale Absorption beim Messen bei 20 [ig/ml in 50 vol-%iger wässriger methanolischer Lösung, wie dies aus Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen ersichtlich ist;

(6) Infrarotabsorptionsspektrum: gemessen in einer KBr-Tablette, gemäss Fig. 2 der beiliegenden Zeichnungen;

(7) Magnetisches Kernresonanzspektrum, in Deuterochloroform als Lösungsmittel unter Verwendung von Tetramethylsilan (TMS) als innerer Standard gemessen, gemäss Fig. 3 der beiliegenden Zeichnungen;

(8) In Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Aceton und Chloroform lösüch; in Benzol spärlich löslich und in Wasser unlöslich;

(9) Mit 50 vol-%iger wässriger Schwefelsäure braungefärbt, bei Dünnschichtchromatographie über Kieselgel mit Jod und Kaliumpermanganat positiv und mit Ninhydrin und 2,4-Dinitrophenylhydrazin negativ reagierend;

(10) je 1 Mol Glycin, Prolin, Leucin, 2-Amino-5-methyl-hexansäure, N-Methylthreonin, N-Methylleucin, Methylpro-lin und Äthylprolin und 2 Mol N-Methylvalin (nach der Hydrolyse mit 6n-Salzsäure während 20 Stunden bei 105 °C feststellbar) enthaltend; und

(11) starke antibakterielle Wirkung gegenüber verschiedenen Bakterien der Gattung Mycobacterium.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur bei ungefähr 28 °C liegt.