CH642046A5 - 1alpha-hydroxycalcioic-saeure und ester davon. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Verbindungen, die durch eine Vit-amin-D-ähnliche Wirksamkeit charakterisiert sind.

Insbesondere betrifft die Verbindung Derivate von Vitamin D3.

Die antirachitische Wirksamkeit der D-Vitamine und insbesondere von Vitamin D3 und deren Anwendung als Nahrungszusätze ist gut bekannt.

Es ist nunmehr auch gut bekannt, dass diese Vitamine, um wirksam zu sein, in vivo metabolisiert werden müssen, um die physiologischen Funktionen, mit denen sie im Zusammenhang stehen, zum Ausdruck zu bringen. Das Vitamin wird zuerst in der Leber hydroxyliert unter Bildung von 25-Hydroxyvitamin D, von dem man annimmt, dass es den hauptsächlichen, im Blutstrom zirkulierenden, Metaboliten darstellt. Diese Verbindung kann anschliessend in der Niere weiter hydroxyliert werden, wobei vorwiegend la,25-Dihydroxyvitamin D oder 24,25-Dihydroxyvitamin D gebildet wird. Die la-hydroxylierte Form von Vitamin D wird im allgemeinen als die physiologisch wirksame oder hormonelle Form des Vitamins und als verantwortlich dafür, was als Vitamin-D-artige Wirksamkeiten bezeichnet wird, wie eine gesteigerte intestinale Absorption von Calcium und Phosphat, die Mobilisierung von Knochenmineralien und die Zurückhaltung von Calcium in den Nieren, angesehen.

Es verbleibt jedoch die Möglichkeit, dass ein weiterer Metabolismus von la,25-Dihydroxyvitamin D erforderlich ist, um einige oder sämtliche Reaktionen zu bewirken.

Stand der Technik

In der Patentliteratur oder anderer Literatur finden sich Hinweise auf verschiedene Vitamin-D-Derivate. Vergleiche beispielsweise die US-Patentnummern: 3 565 924, gerichtet auf 25-Hydroxycholecalciferol; 3 697 559, gerichtet auf 1,25-Dihydroxycholecalciferol; 3 741 996, gerichtet auf la-Hydroxycholecalciferol; 3 907 843, gerichtet auf 24,25-Di-5 hydroxycholecalciferol; 3 739 001, gerichtet auf25,26-Di-hydroxycholecalciferol; 3 786 062, gerichtet auf 22-Dehydro-25-hydroxycholecalciferol; 3 847 955, gerichtet auf 1,24,25-Trihydroxycholecalciferol; 3 906 014, gerichtet auf 3-Deoxy-la-hydroxycholecalciferol; 4 069 321, gerichtet auf die Her-io Stellung von verschiedenen Seitenketten-fluorierten Vitamin-D3-Derivaten und Seitenketten-fluorierten Dihydrotrachy-sterol3-Analogen.

Darstellung der Erfindung

Es wurde nun ein Derivat von Vitamin D gefunden, das eine gewisse antirachitische Wirksamkeit aufweist und von dem man annimmt, dass es die metabolisch wirksame Form des Vitamins sein kann, die für einige der vorstehend genannten biologischen Reaktionen verantwortlich ist. Diese 20 Verbindung wurde identifiziert als la,3ß-Dihydroxy-9,10-seco-24-norchola-5,7,10(19)-trien-23-säure, die hier zweckmässiger als la-Hydroxycalcioicsäure oder la(OH)-23-(COOH)D, bezeichnet wird. Ester der vorstehenden Verbindung fallen ebenfalls in den Bereich der Erfindung, wie im 25 folgenden näher ausgeführt.

Die rasche Bildung und die hohen Ausbeuten, mit denen es in vivo aus 1,25-Dihydroxycholecalciferol gebildet wird, stehen im Einklang mit der Annahme, dass dieses saure Derivat möglicherweise die metabolisch aktive Form des Vit-30 amins ist, die verantwortlich für einige der biologischen Reaktionen ist, die Vitamin D hervorruft.

Bester Weg zur Ausführung der Erfindung 35 Jeder von 57 männlichen Albinoratten im Gewichtsbereich von 200-250 g wurde intrajugular 1 |xg la,25-Di-hydroxyvitamin-D3, enthaltend 3,65 x 105 dpm [3a3H]-la,25-dihydroxyvitamin-D3 in 0,1 ml Äthanol verabreicht. Das tritiierte Vitamin wurde zugesetzt, um den Metaboliten 40 durch Chromatografie zu verfolgen und Rückgewinnungen durch Szintillationszählung von Aliquoten zu berechnen.

Sechs Stunden nach der Dosierung wurden die Tiere durch Decapitieren getötet und ihre Lebern wurden entnommen und auf Eis gelagert. Nach dem Zusatz eines gleichen 45 Volumens von destilliertem Wasser zu den 460 g der gewonnenen Lebern wurde mit einem Brinkman-Polytron-Homo-genisator (Brinkman Instruments, Inc., Westbury, N.Y.) homogenisiert. Das Homogenisat wurde in Rundkolbenflaschen gefroren und lyophilisiert, was eine Ausbeute von so 136,4 g trockenes Gewebe erforderte.

Die lyophilisierten Lebern wurden zweimal während 24 Stunden bei 4 °C mit 1 : 1 Chloroform : Methanol extrahiert, gefolgt vom Filtrieren. Der resultierende Rückstand wurde mit 800 ml Methanol gespült, wobei restliches Lösungsmittel 55 auf dem Filter ausgepresst wurde. Die Extrakte wurden vereint und mit einem Rotationsverdampfer verdampft.

Der Rückstand von der Verdampfung wurde in einem System aufgeteilt, das 100 ml H20 : 200 ml Methanol : 200 ml Chloroform enthielt. Die wässrige Schicht wurde vor der 60 Aufteilung mit Ammoniumhydroxid alkalisch gemacht (pH 8,5). Die wässrige Phase wurde durch Zusatz von 25 ml Chloroform gewaschen und aufgeteilt. Die ursprüngliche Chloroformphase wurde mit 90 ml Wasser (pH 8,5) und 140 ml Methanol gewaschen. Die Chloroformphasen von 65 den Auftrennungen wurden vereint und es zeigte sich, dass sie 2,1 % des dosierten Tritiums enthielten, wohingegen die vereinten wässrigen Phasen 6,0% des dosierten Tritiums enthielten.

1, worin R Wasser-1, worin R Methyl

3

642 046

Die wässrigen Phasen wurden mit einem Rotationsverdampfer zur Trockene verdampft unter Verwendung von Äthanol, um restliches Wasser azeotrop zu machen. Der Rückstand wurde in 150 ml 95% Äthanol filtriert, um ausgefällte Proteine zu entfernen.

Das Filtrat wurde zur Trockene verdampft, das gewonnene Material wurde in 40 ml 95% Methanol suspendiert und anschliessend chromatografiert an einer 3 x 17 cm DEAE-Sephadex-A-25-Säule (ein chromatografisches Material, auf den Markt gebracht von der Pharmacia Corporation, Piscataway, N.Y., und enthaltend Diäthylaminoäthyl-gruppen, gebunden durch Ätherbindung an die Glucosereste von vernetzten Dextranperlen). Die DEAE-Säule wurde bereitet durch Prääquilibrieren mit 0,3 m Ammoniumbicar-bonat in 80% Methanol, gefolgt von einem extensiven Spülen mit 95% Methanol. Die Chromatografie wurde durchgeführt durch Eluieren nacheinander mit 200 ml 95% Methanol, gefolgt von 400 ml 0,1 m Ammoniumbicarbonat in 90% Methanol und anschliessend 200 ml 0,3 m Ammonium-carbonat. Der radioaktiv beladene Peak, eluiert mit 0,1 m Ammoniumbicarbonat und festgestellt durch Szintillations-zählen von Fraktions-Aliquoten, wurde gewonnen durch Vereinigung der Elutionsvolumina 374 bis 594 ml. Es zeigte sich, dass dieser Peak 72% des wässrig-phasigen Tritiums enthielt, was 5,2% des dosierten Tritiums darstellte. Der beladene Peak vom DEAE wurde in 10 ml Methanol gelöst und chromatografiert an einer 2 x 57 cm LH-20-Sephadex-(ein Hydroxypropylätherderivat von Polydextran, Handelsprodukt der Pharmacia Corporation, Piscataway, N.Y.)-Säule, äquilibriert und eluiert mit Methanol. Die Peakfrak-tionen, die zwischen 110 und 170 ml eluierten, wurden vereint, was eine 65% Ausbeute an Radioaktivität darstellte. Diese Probe wurde zur Trockene verdampft und anschliessend in 7 ml Methanol gelöst.

Diazomethan (hergestellt durch Standardmethoden und gewonnen in einer Ätherlösung) wurde zu der gelösten Probe bei Raumtemperatur bis zur Beibehaltung einer gelben Farbe, was einen Überschuss des Methylierungsmittels anzeigte, gefügt. Die Lösungsmittel wurden unter einem Strom von Stickstoff verdampft und der Rückstand wurde in 20 ml H20 (pH 85) : 40 ml Methanol : 40 ml Chloroform, aufgeteilt. Es zeigte sich, dass die Methyl-Veresterung zu einer 99%igen Ausbeute geführt hatte, was aus der Chloroformlöslichen Radioaktivität errechnet wurde. Die Chloroformphase wurde verdampft und chromatografiert an einer 1 x 57 cm LH-20-Sephadex-Säule, äquilibriert und eluiert mit 40% Hexan in Chloroform. 71 % der Chloroform-löslichen Radioaktivität wurde in einem Peak gewonnen, der zwischen 94 und 126 ml eluierte. Diese Peakfraktionen wurden vereint und verdampft.

Eine Hochdruckflüssigkeitschromatografie (HPLC) wurde an einem Waters-Modell ALP/GPC 204 Instrument (Waters Associates, Milford, MA.), ausgerüstet mit einem Mo-dell-440-Absorbanzdetektor, überwachend bei 254 nm, durchgeführt. Der methylierte Peak von der LH-20-Säule wurde in eine 4,6 mm x 25 cm Zorbax-ODS- (Octadecyl-silan, gebunden an Siliziumdioxidperlen, erhältlich durch die Du Pont Co., Wilmington, Delaware) -HPLC-Säule, äquilibriert in 30% H20 in Methanol und betrieben bei 4300 psi mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml pro Minute, injiziert. Das Gebiet, das zwischen 36 und 48 ml eluierte, wurde gesammelt, unter Bildung einer 89% Ausbeute an Radioaktivität. Diese gesammelte Probe wurde an einem getad-phasigen HPLC-System, chromatografiert, bestehend aus einer 4,6 mm x 25 cm Zorbax-SIL- (erhältlich durch Du Pont Co., Wilmington, Delaware) -Säule, äquilibriert in 7% 2-Propanol in Hexan und betrieben bei 1400 psi mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml pro Minute. Ein scharfer,

symmetrischer UV-Absorbanz-Peak bei 42,5 ml, abgetrennt durch Basen-Linien-Absorbanz an beiden Seiten, zeigte die Reinheit des Metaboliten. Die Elutionsvolumina 40-45,5 ml wurden vereint, mit einer Ausbeute an Radioaktivität von 92% für diese Säule. Dieser Peak enthielt 281 Nanomol des Metaboliten, was 25,3% des wässrigen, löslichen Tritiums und 2,04% des dosierten Tritiums darstellte.

Das Ultraviolettspektrum, erhalten auf einem Beck-mann-Modell-24-Aufzeichnungsspektrofotometer (Beckman Instrument, Inc., Fullerton, Kalifornien) zeigte ein Absor-banzmaximum bei 265 nm und eine Spektralform, die charakteristisch für das Vitamin-D-Trien ist.

Um die Reinheit sicherzustellen, wurde die Probe erneut an dem geradphasigen HPLC-System unmittelbar vor der Massenspektroskopie chromatografiert. Man erhielt ein Massenspektrum mit geringer Auflösung unter Verwendung eines AEI-MS9 (Associated Electrical Industries) Massen-spektrometers, gekuppelt mit einem DS-50-Datensystem (Scientific Data Systems). Das Spektrum, das auffallende Peaks bei M/e 388 (10,4% des Basispeaks), 370 (13,6%), 352 (9,6%), 314 (1,7%), 287 (1,4%), 269 (1,6%), 251 (3,8%), 152 (18,0%) und 134 (100%) zeigte, bewies, dass die isolierte Verbindung Methyl-la,3ß-dihydroxy-9,10-seco-24-nor-chola-5,7,10(19)-trien-23-oat (Methyl-la-hydroxycalcioat) ist.

Die Verbindung hat folgende Struktur:

COOCH:

OH

Die Identität der Verbindung wurde durch folgende Kriterien festgestellt:

Das Ultraviolettspektrum zeigt ein intaktes Vitamin-D-cis-trien. Das molekulare Ion bei M/e 388 steht im Einklang mit dieser Struktur. Die auffallenden Peaks bei M/e 370 und 352 repräsentieren Verluste von einem oder beiden Hydroxy-len des A-Rings. Dass der A-Ring bei Hydroxylfunktionen trägt und vom la,25-Dihydroxyvitamin-D-A-Ring unverändert ist, wird bestätigt durch die Fragmente bei M/e 152 und 134. Die Ionen bei M/e 287,269 und 251 repräsentieren den Verlust der Seitenkette und den anschliessenden Verlust eines bzw. beider A-Ring-Hydroxyle, was unveränderte C-und D-Ringe und ein intaktes 18-Methyl demonstriert. Schliesslich stellt das Fragment bei M/e 314 eine McLaffer-ty-Umlagerung mit Verlust von C3Hö02 dar, was zeigt, dass der Methylesterteil sich am 23-Kohlenstoff und nicht am 21-Kohlenstoff befindet. Nichtberichtete Peaks in dem Spektrum stehen im Einklang mit der Struktur.

Bei den vorstehend angegebenen Methoden ist die isolierte Verbindung der Methylester des Naturprodukts. Die Estergruppe kann hydrolysiert werden durch Zusatz von 10% KOH in 90% Methanol und Erwärmen bei 50 °C unter

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

642 046

4

Stickstoff während 60 Minuten. Die freie Säure kann erhalten werden durch langsames Senken des pH-Werts auf den pH-Wert 6 mit ln-Chlorwasserstoffsäure, Verdampfen der Lösungsmittel und Suspendieren des Gemischs in 95% Äthanol. Die resultierende Suspension wird zur Entfernung von KCl filtriert, wobei man la,3ß-Dihydroxy-9,10-seco-24-norchola-5,7,10(19)-trien-23-säure in der Äthanollösung erhält. Diese Verbindung wird durch die folgende Struktur dargestellt:

10

15

20

C.OOR

Falls gewünscht, kann diese Verbindung leicht in kristalliner Form erhalten werden, durch Kristallisieren aus alkoholischen Lösungsmitteln, z.B. Methanol.

In der vorstehenden Beschreibung wurden alle Szintilla-tionszählungen mit einem Modell 3255 Flüssigszintillations-zähler erhalten, der erhältlich ist von Packard Instruments, Downers Grove, Illinois.

Anstatt den Methylester in die Säure (la-Hydroxycal-cioicsäure) umzuwandeln, kann er, falls gewünscht, in ändere Alkylester umgewandelt werden, wobei die Methylgruppe ersetzt wird durch Gruppen wie Äthyl, Propyl, Butyl oder Benzyl. Beispielsweise führt die Behandlung des Methylesters mit Natriumäthoxid zu einer Umesterung unter Bildung des entsprechenden Äthylesters (Äthyl-la-hydroxy-calcioat). In gleicher Weise können die Propyl-, Butyl- und Benzylester erhalten werden durch Behandeln des Methylesters mit dem entsprechenden Natriumalkoholat.

Alternativ können diese verschiedenen Ester hergestellt werden aus der Säure durch Behandeln mit dem geeigneten Alkohol (z. B. Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol oder Benzylalkohol) in Anwesenheit eines geeigneten Kondensationsmittels, wie eines Carbodiimids (z. B. Dicyclohexyl-carbodiimid).

Die vorstehende Umesterung und die Umwandlung der Säure in den Ester sowie die Reagentien, die geeignet sind, und die zur Erzielung der Reaktionen führen, sind dem Fachmann wohlbekannt.

So weisen die erfindungsgemässen Verbindungen die allgemeine Formel auf,

worin R ausgewählt ist aus der Gruppe von Wasserstoff, einer Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen und Benzyl.

25 Leinetestuntersuchung oder Untersuchung der Heilung von Rachitis

Die biologische Aktivität der Verbindung wurde wie in US-Pharmacopeia, 14th Revision [Mack Publishing Co., Easton, Pa (1955)] durchgeführt. Die la-Hydroxy-30 calcioicsäure wurde i.p. täglich während sechs Tagen bei täglichen Dosierungen von 12 ng in einem Propylenglykol-Ve-hikel verabreicht. Kontrollen erhielten nur das Propylen-glykol. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben, dargestellt als Einheiten der antirachiti-35 sehen Wirksamkeit pro jag Verbindung.

Tabelle 1

Ratte Nr. Aktivität Durchschnitt

40"

Kontrolle

45

la(OH)-23(COOH)D

50

1

0

2

0

3

0

4

0

5

0

6

0

1

7,0

2

14,0

3

14,0

4

0

5

0

0,0

7+3

Aus den vorstehenden Daten ist ersichtlich, dass die la-55 Hydroxycalcioicsäure eine antirachtische Wirksamkeit aufweist.

Darüber hinaus zeigt ihre rasche Produktion in hoher Ausbeute innerhalb weniger Stunden nach der Verabreichung von l,25-Dihydroxyvitamin-D3 (1,25-Dihydroxy-60 cholecalciferol) wie vorstehend aufgezeigt, dass diese Verbindung ein physiologisch aktiver Metabolit des hormonellen Systems von Vitamin D ist.

Claims (3)

1. 642 046
2. 2. Eine Verbindung nach Anspruch stoff ist.

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   worin R ausgewählt ist aus der Gruppe von Wasserstoff, einem Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Benzyl.
3. 3. Eine Verbindung nach Anspruch ist.

   Technisches Gebiet