CH642454A5

CH642454A5 - Mikroelektrophoretische vorrichtung.

Info

Publication number: CH642454A5
Application number: CH1154878A
Authority: CH
Inventors: Benjamin Wolf Grunbaum
Original assignee: Nasa
Priority date: 1977-11-10
Filing date: 1978-11-09
Publication date: 1984-04-13
Also published as: ES481037A1; ES474998A1; GB2007711B; FR2408832A1; DE2847444C2; FR2408832B1; GB2007711A; DE2847444A1; US4130471A; CA1116062A

Description

Die Erfindung betrifft eine mikroelektrophoretische Vorrichtung zum Trennen und Identifizieren von Komponenten von zwei oder mehr Proteinsystemen mit einer durch mindestens einen Steg unterteilten, ein Gel enthaltenden Schale zur Aufnahme der zu untersuchenden Eiweissgemische in getrennten Abteilen, wie sie in Patentanspruch 1 definiert ist. Die Erfindung betrifft ferner Membranen und Gelschalen, wie sie in Patentanspruch 2 bzw. Patentanspruch 4 definiert sind.

s In einer älteren Patentanmeldung, nämlich DE-OS 27 52 029.2, die am 22. November 1977 eingereicht worden ist, ist eine in verschiedenen Richtungen verbesserte mikroelektrophoretische Vorrichtung beschrieben, durch welche mikroelektrophoretische Verfahren bzw. Untersuchungen io stark vereinfacht und standardisiert werden. Diese Vorrichtung umfasst (a) Modelle, in welchen sowohl eine Membran oder eine Platte in derselben Grundapparatur verwendet werden kann, (b) Modelle, in welchen die zweidimensionale Zerlegung einer Eiweissprobe, die auf eine gelgefüllte Schale bzw. 15 Platte aufgebracht worden ist, ermöglicht wird und (c) einen Probenapplikator und weitere Hilfsmittel, die das gleichzeitige und präzise Einsetzen und Ausrichten von beispielsweise 10 Proben erlauben.

Diese Apparatur kann in vorteilhafter Weise mit verschie-20 denen konventionellen Vorrichtungen und Techniken, die mit in einzelne Abteile unterteilten Gelplatten bzw. -schalen arbeiten, wie sie von Siebert et al. in US-PS 3 616 387 (vgl. Figur 5 und Spalte 3, Zeilen 53 bis 55) beschrieben sind, und mit geschlitzten Membranen, wie sie von Zec in US-PS 3 317 418 2S (vgl. Figur 7) beschrieben sind, verwendet werden. Eine besondere Verbesserung wird zusammen mit den in der vorliegenden Patentschrift erläuterten Hilfsmitteln ermöglicht, indem die erfindungsgemässe Vorrichtung den Forschern und Laboratoriumstechnikern eine neue und verbesserte Metho-30 dologie zur Trennung spezifischer Proteine des Blutes in Mi-krolitermengen erlaubt. Diese spezifischen Proteine werden dann durch Anwendung von immunologischen Techniken oder - häufiger - durch Anwendung von Indikatorfarbstoffen, die sich chemisch mit einer ganz bestimmten und keiner 35 anderen Eiweiss- bzw. Proteinart verbinden, identifiziert. Die Berührung dieser Farbstoffe mit den für die Elektrophorese bestimmten Proben erfolgt in der Form eines Überzuges, und zwar entweder als Celluloseacetatmembran auf Gel oder als Gel auf einer Celluloseacetatmembran. Die Überzüge sind 40 mit dem geeigneten spezifischen Substrat vorimprägniert worden, so dass auf der Celluloseacetatmembran ein permanenter visueller Nachweis des Musters erzeugt wird, gleichgültig, ob die Membran als Unterlagemedium oder als Überzug dient. Diese Technik ist von Grunbaum in der Arbeit «An 45 Automatic One-to-Eight Sample Applicator for Fast Qualitative and Quantitative Microelectrophoresis of Plasma Proteins ...», Microchem. J. 20,495-510 (1975) beschrieben worden.

Die Apparatur ist anwendbar in der reinen Forschung so-50 wie auf den Gebieten der Medizin, Immunologie, Genetik, Biochemie und der Gerichts-Naturwissenschaft. Elektrophoretische Verfahren, die in erheblichem Masse die Anwendbarkeit der Apparatur erhöhen, umfassen Bestimmungen signifikanter polymorpher Enzymsysteme wie Milchsäure-Dehy-55 drogenase (LDH), alkalische Phosphatase (AP) und Kreatin-Phosphokinase (CPK). Sie kann für diagnostische Zwecke zur Bestimmung von spezifischen Antikörpern von Antigenen im Blut verwendet werden. In Gerichtslaboratorien kann sie zur Phänotypisierung genetischer Varianten von Enzymen 60 oder anderen Proteinen im Blut zum Zwecke der Identifizierung oder Individualisierung dienen.

Eine partielle Liste der Faktoren im Blut, die unter Verwendung der Apparatur bestimmt werden können, umfasst folgende Substanzen:

Milchsäure- Dehydrogenase (LDH),

alkalische Phosphatase (AP),

Kreatin-Phosphokinase (CPK), Erythrocytsäure-Phosphatase EAP),

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Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6PD), Adenylatkinase (AK),

Hämoglobin (Hb),

Haptoglobin (Hp),

gruppenspezifische Komponenten (Gc),

Lipoprotein (Lp),

Adenosin-Deaminase (ADA), 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGD),

Glyoxylase I (GLO-I), Glutamin-pyruvin-transaminase(GPT),

Esterase D (EsD),

Glutathion-Reduktase (GsR),

Immunoglobuline (Ig).

Die gruppenspezifischen Komponenten Gc sind besondere a-Globuline, die unter anderem in Naturwissenschaften, 49, Seiten 16/17 und 108 (1962) beschrieben sind.

Die Erfindung betrifft ferner Membranen und Gelschalen, wie sie in Patentanspruch 2 bzw. Patentanspruch 4 definiert sind.

Mit Hilfe der vorliegenden Vorrichtung ist es jetzt unter anderem möglich, genau und schnell gleichzeitige elektrophoretische Trennungen mehrerer polymorpher Proteinsysteme unterschiedlichen Ursprungs oder unterschiedlicher Natur, sowohl auf einem Gel als auch auf einer Membran durchzuführen und sichtbare Nachweise von Mustern zu entwickeln, die durch Berührung der der Elektrophorese unterworfenen Proben entweder mit einer Membran oder einem Gel (entsprechend der jeweiligen Situation) entwickelt worden sind, wobei die Membran oder das Gel mit einem geeigneten spezifischen Reagens zum Sichtbarmachen des der Elektrophorese unterworfenen Proteinsystems vorimprägniert worden ist.

Die Verfügbarkeit der neuen abgepackten Gele und Membranen, beide für die Elektrophorese und, wenn mit spezifischen Substraten vorimprägniert, zur Entwicklung der elek-trophoresierten (d.h. elektrophoretisch behandelten) Proteine, erlaubt ein hohes Ausmass an Standardisierung zwischen weit auseinanderliegenden Laboratorien. Eine solche Verbesserung wird auf medizinisch-diagnostischem Gebiet willkommen sein, von ganz unschätzbarem Wert ist sie jedoch bei Massenuntersuchungen auf dem Gebiet der Phänotypie, wie sie sowohl in der genetischen Forschung als auch zu Identifizierungszwecken für gerichtliche Untersuchungen u.ä. durchgeführt werden.

Die beigefügten Zeichnungen dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. In den Zeichnungen bedeuten

Figuren lAbis 1J eine Darstellung zweier Ausführungsformen der Grundapparatur gemäss der Erfindung in auseinandergezogener Form und im Querschnitt: links mit einer Membran und einer Membranbrücke; rechts mit einer Gelschale und einer Geltemperaturkontrollplatte;

Figur 2 einen Querschnitt durch die zusammengesetzte Apparatur mit Membran und Membranbrücke;

Figur 3 eine Vorderansicht des Tanks von Figur 1 zusammen mit einer Gelschale und einer Temperaturkontrollplatte;

Figuren 4A bis 4D eine auseinandergezogene Vorderansicht der Apparatur von Figur 2 mit Membran und Membranbrücke;

Figur 5 eine Seitenansicht der Temperaturkontrollplatte, die mit der Gelschale benutzt wird,

Figur 6 eine Detailansicht der Applikatorspitze von Figur 1;

Figur 7 eine Draufsicht auf eine in Abteile unterteilte Schale;

Figuren 7A und 8 Querschnitte durch die Gelschale mit den Abteilen von Figur 7 sowie einer Gelschale ohne Unterteilungen;

Figur 9 eine Draufsicht auf einen einrastenden, dicht schliessenden Deckel für die Gelschalen von Figuren 7 und 8;

Figure 10 und 11 einen Querschnitt durch die Vorderansicht einer Gelschale mit Abteilen bzw. Unterteilungen, die zur Aufnahme eines Gleitdeckels bestimmt ist;

Figuren 12 und 13 Querschnitte durch die Vorderansicht s einer weiteren Ausführungsform einer Gelschale mit Abteilen, auf die der Gleitdeckel aufgesetzt ist;

Figur 14 einen Querschnitt durch die Vorderansicht einer Schale mit Deckel, wobei die Schale ein Gel enthält, welches von einer geschlitzten Membran überlagert ist;

io Figur 15 eine Draufsicht auf eine in vier Abteile unterteilte Schale, welche ein Gel enthält und eine über dieses gelegte, geschlitzte Membran;

Figur 16 einen Querschnitt durch die Vorderansicht einer Schale gemäss Figur 15 zusammen mit dem einschiebbaren i5 Deckel (Gleitdeckel);

Figur 17 eine Draufsicht auf ein geschlitztes Blatt Filterpapier, welches mit verschiedenen Entwicklergemischen zum Entwickeln der elektrophoresierten Proteine imprägniert ist;

Figur 18 eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungs-20 form des geschlitzten Blattes von Figur 17, welches aus einer Polyester-Grundschicht besteht, welche mit Celluloseacetat beschichtet ist;

Figur 18A einen Querschnitt durch das Blatt von Figur

17;

25 Figur 19 einen Teil eines entwickelten Elektrophoreto-grammes, auf welchem drei Proteingemische in Gegenwart von je zwei geeigneten Protein-Standardpräparaten in zwei verschiedenen Konzentrationen getrennt worden sind;

Figur 20 eine Draufsicht auf eine viereckige Schale mit ei-30 ner eingegossenen Schicht eines Geles, welches mit Ampholi-nen, die zum Elektrofokussieren dienen, vermischt ist;

Figur 21 eine Draufsicht auf eine viereckige Schale, die mit einem zuvor eingegossenen Gel gefüllt ist, welches zur Elektrophorese des Haptoglobin-Hämoglobin-Komplexes 35 oder anderer Proteine dient;

Figur 22 eine Vergrösserung des Bereiches der Schale von Figur 21, in welcher die die Probe aufnehmenden Vertiefungen in dem Gel angeordnet sind;

Figur 22A den Bereich der Schale von Figur 22, jedoch 40 versehen mit einer entfernbaren geschlitzten Wegwerfschablone aus Plastikmaterial;

Figur 22B einen Querschnitt der Vorderansicht der Scha-len-Schablonen-Einheit von Figur 22A;

Figur 23 eine Draufsicht auf eine Schale mit einem zuvor 45 eingegossenen Gel, welches für die Überkreuz-Elektrophorese bestimmt ist.

Die Apparatur wird zunächst mit Bezug auf die Figuren 1A bis 1F, 2 und 4 - soweit es sich um die Ausführungsform mit einem Membransystem handelt - und mit Bezug auf die 50 Figuren 1 A, 1B, IE bis 1J und 3 - soweit es sich um die andere Ausführungsform mit einem Gel handelt - beschrieben. Die einzelnen Figuren werden gleichzeitig erläutert, um Wiederholungen zu vermeiden und die Zusammenhänge zu verdeutlichen.

55 Hinsichtlich des Membransystems zeigen die Figuren 1 und 2 Querschnitte der Apparatur in auseinandergezogener und zusammengesetzter Form, während die Figuren 4A bis 4D eine auseinandergezogene Vorderansicht derselben Teile darstellen.

60 Die Vorrichtung besteht aus einem Tank bzw. Behälter 10, welcher eine Elektrolytlösung (nicht dargestellt) enthält. In dem Behälter sind Zwischenwände 19 fest angeordnet. Weiterhin sind entfernbare Zwischenwände 24, eine Scheidewand 23, Elektrodenrahmen 26 und 28, welche sich aus 65 Schlitzen in der Innenwand 8 bis in Schlitze in der Innenwand 9 erstrecken, vorgesehen. Auf der Scheidewand 23 sitzen ein Membranhalter 14 und zwei der entfernbaren Zwischenwände 24. Man erkennt weiterhin die Nut 20 des Membran-

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halters 14, die am oberen Ende der Scheidewand 23 anliegt. Der Membranhalter 14 weist Zungen 21,22 und Zähne 18 auf. Die Zähne 18 greifen in Perforationslöchern in einer Membran 16 ein und halten den Mittelteil der Membran gespannt. Die Enden der Membran 16 tauchen in die Elektrolytlösung (nicht dargestellt) ein. Die Membran muss aus einem Material hergestellt sein, das die Elektrolytlösung in alle Bereiche derselben saugt, so dass die Membran stets gesättigt bleibt. Darüberhinaus muss die Membran eine ausreichende Festigkeit aufweisen, um der Kraft der Zähne zu widerstehen, wenn sie nass ist. Die Membran kann beispielsweise aus Celluloseacetat, Papier oder dem Material Cellogel hergestellt sein. Eine Celluloseacetatmembran kann als beständiger Nachweis der Analyse aufbewahrt und gelagert werden.

Eine Applikatoreinheit 30 passt auf die Abdeckung 12. Die Applikatoreinheit ist mit zwei Füssen 33,34 ausgestattet. Der Fuss 34 weist einen von ihm abstehenden Registrierstift 38 auf, während der Fuss 33 mit einem abstehenden Laufstift 35 ausgestattet ist. Der Registrierstift 38 und der Laufstift 35 sind so ausgebildet, dass sie in einen Laufstiftschlitz bzw. Registrierstiftloch an der Abdeckung 12 bzw. dem Probenhalter eingreifen können.

Die Abdeckung 12 weist männliche und weibliche Verbindungen 11,13 auf, welche den Kontakt mit dem Elektrodendraht 29 über Federzwischenverbindungen 15 bzw. 17 an dem Elektrodenrahmen 26 herstellen. Wenn die Abdeckung 12 von dem Behälter 10 abgenommen wird, wird die elektrische Verbindung zu dem Elektrodendraht 29 durch die Federverbindungen unterbrochen. Der Elektrodendraht 29 ist in seinen Einzelheiten in Figur 1B dargestellt. Ein Platindraht 29 läuft um den geschlitzten Umfang des Elektrodenrahmens 26. Der Draht ist mit Metallkontakten 25 und 27 verbunden, die eine Leitung zu den Federverbindungen 15 und 17, die in Figur 2 dargestellt sind, herstellen. Wie man aus Figur 4D erkennt, sind die beiden Elektrodenrahmen 26 und 28 in den Behälter 10 eingesetzt, welcher in seinen Wänden Schlitze aufweist, die die Rahmen aufnehmen können.

In den Figuren 1F und 4A ist die Applikatoreinheit dargestellt, welche mehrere Applikatorknöpfe 39 aufweist, die ihrerseits dazu dienen, einen Applikator zu halten, der in seinen Einzelheiten in Figur 6 dargestellt ist.

Die Applikatorknöpfe 39 werden mit einer Anzahl von Blattfedern 45 gehalten, die jeden Knopf einzeln an seinem Platz halten. Ein Freigabeknopf 40 ist mit einem verlängerten Arm 41 ausgestattet, der sich über alle parallel ausgerichteten Blattfedern 45 erstreckt. Wird der Knopf 40 nach unten gedrückt, so werden alle Blattfedern freigesetzt, was dazu führt, dass alle Applikatorknöpfe 39 infolge der Schwerkraft nach unten fallen. Der Freigabeknopf 40 ist mit einer Nut 42 ausgestattet, in welche, wenn der Knopf in der heruntergedrückten Stellung ist, ein Verschlussstab 44 eingreift, so dass der Freigabeknopf in der unteren Stellung gehalten wird. Wird der Applikator nicht betätigt, so sitzt eine Schutzkappe (nicht dargestellt) über der Öffnung in der Abdeckung 12.

In Figur 6 sind weitere Einzelheiten der Applikatorspitze

46 gezeigt. Die Applikatorspitze weist eine Kapillaröffnung

47 zur Aufnahme der Probenflüssigkeit auf. Die Applikatorspitze 46 wird durch zwei unter Federkraft stehende Splinte 49 an ihrer Stelle gehalten, so dass die Spitze leicht entfernt werden kann.

Die Applikatorspitze 46 kann unterschiedliche Länge oder Breite aufweisen, um so beispielsweise die Menge der darin enthaltenen Probe zu verändern, oder um mehr als eine Aufbringungsstelle zu versorgen.

In den Figuren 1D und 4C ist der Membranhalter 14 in allen Einzelheiten dargestellt. Der Membranhalter ist einstük-kig aus einem flexiblen Plastikmaterial gegossen. Der Halter weist Zähne 18 auf und lässt sich nach innen biegen, so dass die Zähne 18 in die entsprechenden Perforationslöcher in einer Membran 16 eingreifen. Nach dem Freigeben geht von dem Halter 14 eine Zugkraft auf die Membran aus, so dass letztere gespannt gehalten wird. Um ein Reissen der Mem-5 bran zu verhindern, sind die Zähne 18 vorzugsweise halbzylindrische oder zylindrische Vorsprünge, während die Membran-Perforationslöcher 113, siehe Figur 19, rund sind.

Das elektrophoretische Gelsystem wird durch die Figuren 1A, 1B, 1F bis 1J, 3 und 5 verdeutlicht, welche einen ausein-io andergezogenen Querschnitt und eine Vorderansicht der zusammengesetzten Teile zeigen. In diesem System sind die Membran 16 und der Membranhalter 14 durch eine Gelplatte oder -schale 103, eine Geltemperaturkontrollplatte 80 und einen Fliesspapierstreifen 107 ersetzt.

i5 Die Temperaturkontrollplatte 80 ist mit vier Haltern ausgestattet, von denen zwei, nämlich 82 und 84, gezeigt sind. Die Halter 82 und 84 dienen dazu, eine viereckige Schale 103 aufzunehmen und an der Stelle zu halten. Die Schale 103 enthält das Gelmaterial 104, z.B. ein Agarosegel, welches zur Li-20 poproteintrennung verwendet werden kann. Eine Temperaturkontrollflüssigkeit, die von der Flüssigkeitszufuhr 99 durch die Zuführöffnung 100 zugeführt und durch die Abführöffnung 102 abgeführt wird, zirkuliert in der Platte 80; vgl. Figur 5.

25 In Figur 3 ist die Temperaturkontrollplatte 80 in dem Behälter 10 angeordnet. Die quadratische Schale 103 mit dem Gel 104 ist auf die Platte 80 gesetzt und wird von den Haltern 82,84 an Ort und Stelle gehalten. Die Schale 103 ist vorzugsweise aus einem Material hergestellt, das eine gut elektrische 30 Isolierungswirkung hat und eine gute thermische Leitfähigkeit aufweist. Darüberhinaus muss die Schale gegenüber der Elektrolytflüssigkeit inert sein. Da die Platte zur Aufnahme einer quadratischen Schale ausgebildet ist, ist eine Drehung des Gelmediums um 90° möglich. Eine grössere Auftrennung 35 kann erreicht werden, wenn man zwei Wanderungsrichtungen auf dem Gel 104 zulässt. Zuerst wird die Probe auf einem linearen Weg durch den elektrischen Strom auseinandergezogen. Danach wird die Gelschale um 90° gedreht und es wird eine zweite Trennung in einer Richtung senkrecht zur ersten Rich-40 tung vorgenommen.

Der Kontakt mit der Elektrolytlösung erfolgt über die Dochte 106,108, welche an den Rändern auf dem Gel aufliegen und sich nach unten durch Dochtlöcher (nicht dargestellt) in der Platte 80 in die Elektrolytlösung erstrecken. Der Behäl-45 ter 10 weist Dochthalter 110 und 111 auf, die die unteren Enden der Dochte aufnehmen und diese in der Elektrolytlösung an der Stelle halten. Die Dochthalter verhindern, dass die Dochte von dem Gel abgleiten und sie richten die Dochte aus, so dass sie das Gel 104 gleichmässig über die ganze Oberflä-50 che berühren. Die Ausrichtung der Dochte verhindert, dass sich ein Kontaktgradient ausbildet. Die Dochte 106 und 108 können beispielsweise aus Filterpapier oder einem Kunst-stoffschwamm-Material bestehen.

Während des Elektrophoreseprozesses fliesst elektrischer 55 Strom durch das Gel 104 und bewirkt dabei die Entstehung von Wärme in dem Gel. Durch die thermische Leitfähigkeit in dem Gel werden die Banden verbreitert, was zu Fehlern führt infolge einer ungenügenden Auftrennung. Diese Verbreiterung der Banden wird erleichtert, wenn man eine Flüs-60 sigkeit durch die Platte 80 leitet, deren Temperatur niedriger ist als die Umgebungstemperatur. Bei einigen Massnahmen hat es sich als günstig erwiesen, wenn die Plattentemperatur bei etwa 4 °C liegt. Fliesspapierstreifen 107, die aus demselben Material hergestellt sind wie die Dochte 106,108 und die 65 mit der Elektrolytlösung imprägniert sind, sind längs der Ränder der Oberfläche des Gels 104 angeordnet, um den elektrischen Kontakt zwischen dem Gel und den Dochten während der Elektrophorese zu erleichtern.

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Die restlichen Figuren erläutern verschiedene Ausfüh- Farbreagentien, mit denen sie zuvor imprägniert worden ist, rungsformen von Schalen und Deckeln bzw. Abdeckungen in Berührung bringt. Auf diese Weise ist beispielsweise eine (Figuren 7 bis 16 und 20 bis 21A) sowie von Membranen (Fi- Blutserumprobe, welche die Isoenzyme der Milchsäure-De-guren 17 bis 19) gemäss vorliegender Erfindung, die in der hydrogenase (LDH) enthält, auf das Gel 104 im Abteil A der eingangs erwähnten Apparatur zur Durchführung diagnosti- 5 Schale 130 aufgebracht worden, welches nach der elektropho-scher Untersuchungen und zu Identifizierungszwecken ver- retischen Trennung mit dem Streifen A der Membran 95 in wendet werden können. Berührung gebracht wurde, der zuvor mit Tetrazoliumfarb-In Figur 7 erkennt man eine Draufsicht auf eine Elektro- Stoff oder anderen üblichen Komponenten imprägniert wor-phoreseschale 120, welche im wesentlichen aus einem quadra- den ist, die dazu dienen können, das Elektrophoretogramm tischen Behälter mit flacher Bodenfläche 128 und einer um- io dieses bestimmten Enzymsystems sichtbar zu machen. In entlaufenden Wand 122 besteht. Eine Anzahl von geraden Un- sprechender Weise wurden die anderen Abteile und Streifen terteilungsrippen 121 trennen die Schalenfläche in einzelne (B, C, D) verwendet, um die Komponenten verschiedener po-Abteile, die dauerhaft gekennzeichnet sind, indem in jedes lymorpher Enzyme des Blutes sowie anderer Proteinsysteme Abteil 160 ein Buchstabe eingedruckt ist. Die umlaufende entweder aus der gleichen Blutprobe oder aus Blutproben verwand kann mit einer oberen Kante 123 versehen sein, die eine 15 schiedenen Ursprungs festzustellen und zu identifizieren. In Schulter 129 bildet, die mit einem entsprechenden umlaufen- den übrigen Abteilen und unter Verwendung der Streifen B, C den Rand an einer Abdeckung zusammenwirkt. Die in Ab- bzw. D wurden so Kreatin-Phosphokinase (CPK) alkalische teile unterteilte Schale 120 ist in Figur 7A im Querschnitt dar- Phosphatase (AP) und Gesamt-Protein gleichzeitig elektro-gestellt. In Figur 8 ist daneben, ebenfalls im Querschnitt, eine phoretisiert und entwickelt; vgl. ebenfalls Figur 15. Ausführungsform einer üblichen Gelschale 103 dargestellt, 20 Die Figuren 17 und 18 zeigen Draufsichten auf Teile von die mit einer Gelschicht 104 gefüllt ist. zwei verschiedenen geschlitzten Membranen, die mit Substra-Figur 9 zeigt eine Art einer Abdeckung für Gelschalen ten oder anderen farberzeugenden Reagentien vorimprägniert 103,120, welche im wesentlichen aus einer dünnen flachen worden sind, welche für die Proteinsysteme, die in den Zeich-Platte 127 besteht, welche einen umlaufenden Rand 126 auf- nungen angegeben sind, erforderlich sind.

weist und so ausgebildet ist, dass sie dicht in den umlaufenden 25 So erkennt man in Figur 17 fünf Streifen 116 einer durch Rand 123 an der Schulter 129 der Gelschalen 103,120, passt. Schlitze 96 getrennten Membran 115, die mit den Buchstaben Eine zusammengesetzte Anordnung aus Schale und Abdek- A, B, C, D und E bezeichnet sind und die sich bis zu den um-kung erkennt man in Figur 14. Diese besteht aus der Schale laufenden Randflächen 116 erstrecken. Die ganze Membran 120, der Abdeckung 125, der Gelschicht 104 und der ge- 115 kann aus Filterpapier hergestellt sein, wobei die Randflä-schlitzten Membran 95, alle im Querschnitt dargestellt. Die 30 chen 116 mit Paraffin getränkt und die einzelnen Streifen mit Ausführungsformen aus Schale und aufpressbarer Abdek- Substraten oder Entwicklungsflüssigkeiten imprägniert sind, kung, die in den Figuren 7 bis 9 und 14 dargestellt sind, kön- die für die angezeigten Enzym- und Proteinsysteme, nämlich nen ausserdem mit verschiedenen üblichen Hilfsmitteln zum (LDH(A), CPK(B), Plasmaprotein(C), Hämoglobin(D) so-dichteren Verschliessen der Einheit und zum Stapeln versehen wie andere Systeme (XYZ) (E) erforderlich sind. Nach dem sein. 35 Entwickeln kann die getrocknete Membran als dauerhafter Die Figuren 10 bis 13 zeigen weitere Ausführungsformen Nachweis des Elektrophoretogramms aufbewahrt werden, der Schalen und Abdeckungen gemäss vorliegender Erfin- In den Figuren 18 und 18 A ist ein undurchlässiger Typ ei-dung, wobei entweder eine Abdeckung 135 in einer von den ner Membran dargestellt. Auch hier ist die Membran 136 wie-Wänden einer Schale 130 gebildeten Laufrille oder aber eine derum durch Schlitze 96 in Streifen geteilt, wobei jeder Cellu-Schale 140 in einer von den Wänden einer Abdeckung 145 ge- 40 loseacetatstreifen (A,B,C,D) mit einem bestimmten Enzymbildeten Laufrille gleitet. Eine ausreichende Abdichtung der substrat und/oder Farbentwicklungssystem wie angezeigt, zusammengefügten Einheiten aus Schale und Abdeckung nämlich CPK, LDH, Phosphoglucomultase (PGM) sowie ankann auf verschiedene Weise erreicht werden. Beispielsweise deren Systemen (XYZ) auf dem Streifen A, B, C bzw. D im-können sowohl die Schalen 140 als auch die Abdeckung 145 prägniert ist. Ein wesentliches Kennzeichen dieser bestimm-an gegenüberliegenden Seiten mit senkrecht zu den Laufril- 45 ten Membran ist jedoch, dass die Celluloseacetatstreifen 138 lenwänden 131,132 verlaufenden Endwänden (nicht darge- von einer inerten, resistenten und nicht porösen Polyesterstellt) versehen sein, so dass die Enden der Einheit geschlossen platte 137 (Mylar-Polyester) getragen werden, wie sich beson-sind. Es ist auch möglich, flache ebene Flächen (nicht darge- ders deutlich aus Figur 18A ergibt, einem Querschnitt durch stellt) oder Schultern in den Endwandbereichen der Schalen die Membran von Figur 18. Weitere Polymersubstanzen wie vorzusehen, die dicht mit den Abdeckungsflächen zusammen- so Polyamide, Polyimide, Polyäthylen, halogenierte Polyäthy-passen und so eine zusätzliche Abdichtung bilden. lene u.ä. können ebenfalls anstelle eines Polyesters als inerte Figur 15 zeigt in der Draufsicht eine Schale, die der von nicht poröse Unterlageplatte dienen, wenn dies im Einzelfall Figur 14 entspricht, jedoch mit der Ausnahme, dass die erwünscht ist.

Schale nur drei sie unterteilende Stege bzw. Rippen 121 auf- Figur 19 zeigt den Typ eines Musters, das sich auf einer weist. Kreisförmige Löcher 113 dienen zur Aufnahme der 55 Membran nach der Trennung und der Farbentwicklung zeigt.

Zähne 18 des Membranhalters 14, der in den Figuren 1D und Drei Streifen, 200,201 und 202 einer Membran 95, welche

4C gezeigt ist. In der Figur 15 sowie im Querschnitt derselben durch Schlitze 96 getrennt sind, sind dargestellt. Jeder Strei-

Schale, die in Figur 16 gezeigt ist, erkennt man also eine fenteil weist drei mit A, B und C bezeichnete Kolonnen 160

Schale 130 mit vier Abteilen, die von den drei Stegen bzw. auf. Auf jeden Streifen war eine andere polymorphe Bluten-

Rippen 121 gebildet werden. Man erkennt weiterhin in Figur 60 zymprobe aufgebracht worden, die anschliessend elektropho-

16 die zwischen den Laufrillen 131 gleitende Abdeckung 135. retisch auseinandergezogen, d.h. zur Wanderung weg vom ur-

Die Abteile sind mit einem Gel 104 gefüllt, auf welchem die sprünglichen Aufbringungspunkt gebracht worden ist. Der

Elektrophorese verschiedener Blutenzym- und Proteinsy- Aufbringungspunkt ist die erste Reihe (I) unter dem Punkt A;

steme durchgeführt worden ist, sowie eine geschlitzte Mem- von diesem aus geht die Wanderung zu den Strichen, die in bran 95, welche vier Streifen 160 aufweist, die mit den Buch- 65 den Entfernungen II, III, IV, V und VI angezeigt sind. Stan-

staben A, B, C und D markiert und durch Schlitze 96 getrennt dardpräparate polymorpher Systeme laufen zusammen mit sind. Die geschlitzte Membran liegt über dem Gel, so dass sie jeder unbekannten Probe in zwei unterschiedlichen Konzen-

die Proteine auf dem Gel mit den Enzymsubstraten oder trationen B und C, um so die Identifizierung und die Mengen-

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bestimmung der unbekannten Proben zu unterstützen. Durch Verwendung des Einsatzes frei von Flüssigkeit zu halten. Die Vergleich der Komponenten der unbekannten Substanz in in Figur 21 dargestellte Schale mit dem eingegossenen Gel Kolonne A des Streifens 200 mit den benachbarten Kolonnen wurde also in der Weise hergestellt, dass zunächst der Einsatz B und C lässt sich leicht erkennen, dass die Komponente IV bzw. die Schablone 150 in eine leere Schale 103 eingesetzt der Probe offensichtlich höher in der Konzentration ist als 5 wurde, indem die Stifte 151 in die Vertiefungen 149 gesteckt normal (B, C). Dasselbe gilt für die Menge der Komponente wurden. Ein Gel bildendes flüssiges Präparat wurde dann in VI der Probe im Streifenteil 202. Bei der Probe im Streifen 201 die Schale gegossen, so dass sich nach dem Abkühlen das Gel erkennt man andererseits, dass die Komponente V fehlt und 104 bildete. Die Schale mit dem Gel wurde mit einer geeigne-dass eine Komponente VI aufscheint, die in den Standardprä- ten Abdeckung (nicht dargestellt) versehen; in dieser F orm paraten B und C nicht vorhanden ist. In diesem Fall handelt io kann die Einheit zum Versand gebracht oder gelagert werden, es sich also um den Typ des gleichzeitig hergestellten Ein- ohne dass eine Beschädigung befürchtet werden muss, bis sie

Blatt-Nachweises, der mit der Vorrichtung und der Arbeits- für die Elektrophorese gebraucht wird. Zu diesem Zeitpunkt weise gemäss vorliegender Erfindung durchgeführt werden wird der Plastikeinsatz bzw. die Schablone 150 entfernt und kann und der zur Identifizierung und quantitativen Bestim- Proteinproben und Standardpräparate können in die Vertie-mung von bis zu 10 verschiedenen oder gleichen Proteinsyste- 15 fungen 148 des Gels für die Elektrophorese gegeben werden, men aus einer Blutprobe oder von bis zu 10 Blutproben die- Diese vorstehend beschriebene Art einer Schale wird haupt-nen kann. Mit solchen Profilen wird die Aufgabe der Diagno- sächlich für die genetische Typisierung von polymorphen stizierung verschiedener klinischer Zustände oder die Identifi- Proteinen verwendet, beispielsweise für die die Bestimmung zierung von Klassen von Individuen erheblich vereinfacht in- des Haptoglobin-Hämoglobin-Komplexes; sie kann jedoch folge der Menge an Information, die gleichzeitig auf einem 20 auch zur Trennung vieler anderer Proteingemische, die ein Elektrophoretogramm erzeugt und beobachtet werden kann. hochwirksames Trennmedium wie Acrylamidgel erfordern, Figur 20 stellt eine Draufsicht auf die bereits beschriebene verwendet werden. Das Polyacrylamidgel in der Schale kann quadratische Schale 103 dar, welche mit einem Polyacryl- entweder eine durchgehend gleichmässige Polymerkonzentra-amid-Gel 104, in welchem Ampholine dispergiert sind, gefüllt tion oder eine sich linear stufenweise ändernde Konzentration ist; diese Art von Isomeren von Polyaminopolycarbonsäuren 25 aufweisen. Die Polyacrylamidmoleküle wirken als ein mecha-werden üblicherweise für Elektrofokussierungsverfahren mit nisches Sieb, welches sowohl die Trennung als auch die Abhoher Trennschärfe verwendet. Nach Anlegen eines elektri- Scheidung unterstützt.

sehen Feldes mit Hilfe von speziellen Elektroden (nicht dargestellt), welche direkt auf die Oberfläche des Gels gesetzt werden, bildet sich ein linearer pH-Gradient aus und die in einem 30 In Figur 23 ist eine quadratische Schale mit einem einge-solchen Gradienten elektrophoresierten Proteinmoleküle gossenen Gel dargestellt, in welcher die Verwendung spezifi-konzentrieren sich in sehr schmalen Zonen, in welchen die scher Antiseren bei der Kreuz- und Quer-Elektrophorese bei elektrische Nettoladung an einem gegebenen Molekül Null der Analyse von australischem Antigen (infektiöse Hepatitis), ist. In einem solchen System ist die einzige Variable, die die Syphilis und anderen Infektionskrankheiten möglich ist. Die Trennung beeinflusst, der isoelektrische Punkt eines gegebe- 35 Schale und die Methode können auch zur Artenidentifizie-nen Proteins. Es ist nicht erforderlich, in den Behälter 10 der rung bei der Prüfung von frischem oder getrocknetem Blut Grundapparatur gemäss Figur 1A eine Pufferlösung zu ge- oder anderen physiologischen Flüssigkeiten eingesetzt werben. Die Kühlung des Gels mit der Platte 80 gemäss Figuren 3 den. Man erkennt aus den Zeichnungen, dass die vorbereitete und 5 ist sehr wichtig, weil eine sehr hohe Spannung angelegt Gelschale 103 im Grundsätzlichen der von Figur 21 entwird, die eine hohe Stromstärke zur Folge hat, was wiederum 40 spricht, jedoch mit der Ausnahme, dass die Gelschicht 104 die Entwicklung einer grossen Wärmemenge bedeutet, die so- mit drei Linienpaaren von je 10 Vertiefungen 148 versehen ist, fort abgeführt werden muss. Die erfindungsgemässe Appara- wobei die Linien mit 1,2,3,4,5 und 6 (160) bezeichnet sind, tur erlaubt es, die Elektroden in behebiger Richtung anzu- Die Schalen werden in derselben Weise hergestellt wie die von bringen. Darüberhinaus bietet sie eine einfache, leicht stan- Figur 21, wobei jedoch 6 Plastikschablonen anstelle einer ein-dardisierbare Alternative zu der schwierigen Herstellung von 45 zigen (150), die für die Schalen der Figuren 21 bis 22B benutzt Gelen unmittelbar vor der Verwendung, eine Alternative, die wurde, verwendet werden müssen. Die Schablonenstifte 151 hinsichtlich der Handhabung, des Transportes und der Lage- (Figuren 22A und 22B) fassen in zylindrische Vertiefungen rung den bisher handelsüblichen flexiblen Platten überlegen 149 und die Schale wird dann in der bereits beschriebenen ist. Weise mit Gel 104 gefüllt. Vor der Verwendung werden die

Figur 21 ist eine Draufsicht auf eine Schale 103, welche 50 Schablonen entfernt, so dass die Vertiefungen 148 zur Aufein zuvor eingegossenes Gel 104 enthält. In dem Gel sind in nähme von Antigen- und Antiserumproben frei liegen. Die einer Reihe 10 rechteckige Vertiefungen 148 zur Aufnahme Gelvertiefungen werden paarweise verwendet, wobei die An-von Proben gemacht worden. Der Teil der Schale, der die zur tigenprobe in die Vertiefung gegeben wird, die auf der elek-Probenaufnahme bestimmten Vertiefungen 148 enthält, ist in trisch negativen Seite des Paares (Reihen 1,3 und 5) liegt, die vergrössertem Massstab in Figur 22 dargestellt, um weitere 55 durch ein Minuszeichen (—), welches auf die linke Seite der Einzelheiten zu zeigen. Die Schalen-Schablonen-Einheit er- umlaufenden Schalenwand 122 gedruckt ist, angezeigt ist; die kennt man weiterhin in der Figur 22A (in Draufsicht) und in spezifische Antiserumprobe wird in die Vertiefung auf der po-Figur 22B (im Querschnitt). sitiven Seite des Paares (Reihen 2,4 und 6) gegeben. Wird

Spannung an die bis zu 30 Proben in der Schale gelegt, so In diesen Figuren erkennt man, dass die umlaufende 60 wandern die Antigen- und Antiserumproteine aufeinander zu Wand 122 der Schale 103 mit zwei zylindrischen Vertiefungen und reagieren, wenn sie sich kreuzen oder treffen, und erzeu-149 versehen ist, die zur Aufnahme von Stiften 151 dienen, gen eine sichtbare Niederschlagslinie. Neun solcher Linien mit welchen ein entfernbarer Kunststoffeinsatz bzw. eine sol- 205, die sich nur zwischen bestimmten Paaren gebildet haben, che Schablone 15 in der Schale befestigt werden kann. Die sind in Figur 23 zu erkennen. Das Fehlen einer solchen Niedargestellte Schablone 150 weist zehn Zungen 151 auf, mittels 65 derschlagslinie zwischen einem Paar von Vertiefungen zeigt welcher die Vertiefungen 148 in dem Gel ausgebildet werden, die Abwesenheit des spezifischen Antigens in der Probe, die in wenn dasselbe zuerst in die Schale 103 gegossen wird und um die linke Vertiefung des Paares gegeben worden war, an. die Vertiefungen in der Zeit zwischen der Herstellung und der Bei der Herstellung der verschiedenen vorbereiteten Gel

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schalen und Membranen der vorstehend beschriebenen Art ist Im Falle von Membranen ist es jedoch auch möglich, insta-

es möglich, die Zugabe aller instabilen Substrate und Reagen- bile Igredientien sicher zum Zeitpunkt der Herstellung der tien zu dem vorbereiteten Gel bzw. der vorbereiteten Mem- Membran einzuschliessen, indem man die Technik der Ge-

bran bis zum Augenblick der Verwendung hinauszuzögern. friertrocknung anwendet.

C

4 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Mikroelektrophoretische Vorrichtung zum Trennen und Identifizieren von Komponenten von zwei oder mehr Proteinsystemen mit einer durch mindestens einen Steg unterteilten, ein Gel enthaltenden Schale zur Aufnahme der zu untersuchenden Eiweissgemische in getrennten Abteilen, gekennzeichnet durch eine Membran (16,95,115,136), die durch wenigstens einen Schlitz (96) in Streifen (116,138) unterteilt ist, die in Abteile (160) der Schale (120,130,140) passen und die in direkte Berühung mit dem Gel (104) bringbar ist, wobei entweder jeder Streifen (116,138) oder das Gel mit einem sichtbar machenden Reagens, welches für ein polymorphes Proteinsystem spezifisch ist, vorimprägniert ist.
2. Elektrophoretische Membran für eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1, in welcher das Gel nicht vorimprägniert ist, gekennzeichnet durch eine Celluloseacetatmem-bran, welche durch wenigstens einen Schlitz in wenigstens zwei Streifen unterteilt ist, wobei jeder Streifen mit einem sichtbar machenden Reagens, welches für eines der polymorphen Proteinsysteme aus der Milchsäure-Dehydrogenase, alkalische Phosphatase, Kreatin-Phosphokinase, Erythrocyt-säure-Phosphatase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Adenylatkinase, gruppenspezifische Komponente Gc, Lipoprotein, Adenosin-Deaminase, 6-Phosphoglukonat-De-hydrogenase, Glutamin-Pyruvin-Transaminase und Esterase D umfassenden Gruppe spezifisch ist, imprägniert ist.
3. Membran nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass dieselbe aus einer Polyestergrundschicht besteht, welche in den die Reagentien enthaltenden Streifenbereichen mit Celluloseacetat beschichtet ist.
4. Elektrophoretische Gelschale für eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1, in welcher die Membran nicht vorimprägniert ist, gekennzeichnet durch eine flache, Gel enthaltende Schale, die durch mindestens einen Unterteilungssteg in wenigstens zwei Abteile unterteilt ist, wobei das Gel in jedem Abteil mit einem sichtbarmachenden Reagens imprägniert ist, welches für eines der polymorphen Proteinsysteme, die in Patentanspruch 2 aufgeführt sind, spezifisch ist.
5. Gelschale nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass dieselbe mit einer dicht schliessenden Abdek-kung versehen ist, so dass die Einheit für eine geeignete mikroelektrophoretische Apparatur zur gleichzeitigen Bestimmung von bis zu 30 Proteinproben durch Elektrophorese verwendet werden kann.
6. Gelschale nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Schale und die Abdeckung in einer Gleitanordnung vereinigt sind.
7. Gelschale nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass dieselbe in dem Gel 30 Paar für die Probenaufnahme bestimmte Schlitze enthält, wobei die Paare so angeordnet sind, dass eine Überkreuz-Wanderung von Antigen und Antiserum erreicht werden kann, so dass sich sichtbare Niederschlagslinien ausbilden.
8. Gelschale nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Schale durch parallele Stege in zehn Abteile unterteilt ist.
9. Gelschale nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel Isomere von Polyaminopolycarbon-säuren vom Typ, wie sie zur Elektrofokussierung verwendet werden, enthält.