CH642459A5 - Procede de preparation d'un support d'epreuve radioimmunologique en phase solide et son application. - Google Patents
Procede de preparation d'un support d'epreuve radioimmunologique en phase solide et son application. Download PDFInfo
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Description
La présente invention concerne dans son ensemble un procédé de préparation d'un support d'épreuve radioimmunologique en phase solide intéressant à utiliser dans des colonnes chromatographiques. Selon l'un de ses aspects, l'invention concerne un procédé de préparation d'un support sous forme de tablette qui, par contact avec une solution d'antigène-anticorps, gonfle en épousant la forme de la colonne. Selon un autre de ses aspects, l'invention propose un support sous forme de tablette qui est aisément transporté, conservé et utilisé dans des méthodes diagnostiques cliniques à déroulement automatique.
L'avènement de l'analyse radioimmunologique en 1959, à la suite d'études publiées par Yalow et Berson dans «Nature» 184, 1648 (1959), comme technique diagnostique de marquage pour remplacer les épreuves biologiques lentes alors en usage, à révolutionné de nombreux domaines de l'analyse et de la recherche cliniques, en raison de sa spécificité et de son extrême sensibilité.
La technique de l'analyse radioimmunologique est basée sur l'aptitude d'un anticorps et d'un antigène spécifique à former un complexe antigène-anticorps réversible. L'épreuve est conduite par addition d'une quantité déterminée d'un antigène marqué par un isotope radio-actif à des échantillons qui renferment un anti-sérum et des quantités connues d'antigène «de référence». Pendant l'incubation, l'antigène marqué et l'antigène non marqué se disputent un nombre limité de sites de fixation sur l'anticorps. Après l'incubation, l'antigène lié à l'anticorps est séparé de l'antigène libre et la courbe de variation du rapport de la fraction libre à la fraction liée peut être représentée graphiquement en fonction de la dose. Un échantillon inconnu de sérum peut ensuite être éprouvé par la même méthode et la concentration de l'antigène peut être déterminée d'après la courbe de référence de la réponse en fonction de la dose. Souvent, les méthodes classiques d'analyse radioimmunologique sont peu pratiques, elles prennent du temps et leurs étapes sont des sources d'erreur, parce qu'elles nécessitent des pipetages multiples et de nombreux tubes à essai, la conduite des essais en double, des périodes prolongées d'incubation et des opérations de séparation difficiles et inefficaces.
Les améliorations apportées à l'analyse radioimmunologique ont été axées très récemment sur l'utilisation d'épreuves radioimmunologiques en phase solide et sur l'automatisation. L'expression «épreuve radioimmunologique en phase solide» est utilisée par commodité dans le présent mémoire pour désigner des méthodes dans lesquelles un anti-sérum relatif à un antigène spécifique est immobilisé sur ou dans un support insoluble dans l'eau, un support d'immunosorption ou une matrice dont le pouvoir immobilisant a pour but de faciliter la séparation de l'antigène libre de celui qui est immobilisé par liaison à l'antisérum.
Comme indiqué, l'une des améliorations apportées à l'analyse radioimmunologique réside dans l'utilisation de dispositifs analytiques automatiques. Ces dispositifs sont couramment recherchés non seulement pour l'analyse radioimmunologique, mais aussi pour d'autres études de micro-analyse, par exemple pour la recherche biochimique, l'analyse clinique courante, les études enzymatiques, etc.
Des dispositifs analytiques à postes multiples qui utilisent la force centrifuge ont récemment été mis à la disposition de la micro-analyse rapide d'une grande variété de liquides tels que des liquides corporels, par exemple le sérum sanguin, des produits alimentaires, etc. Par exemple, un instrument de ce genre qui a été conçu pour rendre automatique l'analyse radioimmunologique est vendu par la firme Union Carbide Corporation sous la marque déposée «Centria». Le dispositif Centria offre plusieurs partricularités intéressantes pour la conduite d'épreuves immunologiques en solution. Le dispositif comporte (a) un appareil de pipetage automatique qui distribue les échantillons et les réactifs, (b) le module, c'est-à-dire l'incubateur/séparateur, dans lequel la force centrifuge est utilisée pour déclencher et arrêter simultanément des incubations et des séparations radioimmunologiques multiples et (c) un groupe formé d'un compteur gamma et d'un calculateur, qui compte trois tubes simultanément et transforme les comptages en unités de concentration. D'autres détails concernant la réalisation et l'utilisation du dispositif «Cen-tria» sont donnés dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3 953 172. Comme indiqué dans ledit brevet, l'appareil utilise des colonnes d'adsorption pour séparer les composants à analyser. Dans le passé, la pratique courante a consisté à se procurer des colonnes contenant déjà la substance adsorbante appropriée, ces colonnes étant prêtes à être utilisées sans autre préparation. Bien que la plupart de ces
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colonnes ait donné satisfaction, elle ne parvenait pas à satisfaire aux exigences optimales imposées aux techniques diagnostiques cliniques. Lorsque des colonnes adsorbantes sont utilisées dans des dispositifs basés sur l'emploi de la force centrifuge, elles doivent posséder certaines caractéristiques auxquelles n'ont pas à satisfaire, ordinairement, des méthodes chromatographiques classiques qui sont uniquement basées sur l'écoulement par gravité. Par exemple, des colonnes utilisées dans un champ de forces centrifuges peuvent subir une fissuration ou un tassement dû à une perte d'eau interstitielle. En outre, des colonnes qui ont été préparées plusierus jours ou plusieurs mois avant leur utilisation peuvent aussi subir une fissuration, un tassement et une perte d'eau pendant l'entreposage et le transport.
On vient de découvrir que les inconvénients mentionnés à propos de ces colonnes peuvent être évités par l'utilisation d'un support pour épreuve radioimmunologique en phase solide, présenté sous la forme d'une tablette. La tablette est plus aisément manipulée, entreposée, transportée et utilisée que ne le sont les colonnes chromatograpiques humides connues actuellement en usage. Il suffit à l'opérateur de placer une tablette dans chaque colonne et, par contact avec une solution d'antigène-anticorps, la tablette gonfle en épousant la configuration de la colonne.
La présente invention a donc pour but de réaliser des supports pour épreuves radioimmunologiques qui sont intéressants à utiliser dans des dispositifs conçus pour la conduite de telles épreuves. Elle a aussi pour but de réaliser des supports qui sont utilisés dans des colonnes incorporées à un appareil analytique basé sur l'emploi de la force centrifuge pour mélanger et transférer les corps réactionnels. Un autre objectif de la présente invention est de réaliser des supports sous la forme d'une tablette, qui peuvent être conservés avec sûreté jusqu'au moment de leur utilisation. Ces supports doivent gonfler à l'intérieur des colonnes pour former des substrats gélifiés uniformes. L'invention a en outre pour but de proposer un procédé de préparation de ces nouvelles tablettes et un procédé permettant d'utiliser ces dernières dans une épreuve radioimmunologique. Un autre objectif de l'invention réside dans la réalisation d'un support en phase solide pour épreuve radioimmunologique formé d'un gel lié à une protéine, formé d'au moins un antisérum et d'un gel chroma-tographique. Un autre but de l'invention est de réaliser, sous forme de tablette, un gel, lié à une protéine, de «Sepharose 4B» et d'un antisérum contenant des anticorps de lapin.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la descripiton détaillée qui va suivre.
L'invention concerne dans son ensemble un procédé de préparation d'un support en phase solide pour épreuve radioimmunologique et ses applications. Le procédé consiste:
(a) à former par contact en phase liquide un gel lié à une protéine, (1) d'au moins un antisérum et (2) d'un gel chroma-tographique capable de retenir sélectivement un ou plusierus composants contenus dans la solution renfermant l'anti-gène-anticorps,
(b) à lyophiliser le gel lié à la protéine,
(c) à subdiviser le gel séché pour former une poudre et
(d) à transformer la poudre en un support en phase solide, tel qu'une tablette.
Des tablettes préparées conformément au procédé de l'invention se sont montrées tout à fait aptes à être utilisées dans des colonnes chromatographiques de l'appareil «Centria». Comme indiqué dans les exemples, on peut préparer des tablettes dont les dimensions et la capacité d'adsorption des liquides ont des valeurs prédéterminées suffisantes pour l'analyse particulière qui doit être conduite. Par exemple, des tablettes pesant 80 mg et contenant environ 35 mg de la forme séchée du gel lié à la protéine peuvent être utilisées avantageusement dans l'épreuve radioimmunologique de dosage de l'hormone stimulant la thyroïde (HST). Ce test utilise une réaction immunologique dans laquelle des molécules marquées et non marquées d'hormone HST se disputent des sites de fixation sur une molécule spécifique d'anticorps. Le dispositif «Centria» utilise la force centrifuge pour mélanger les différents réactifs en même temps sur un disque spécial et, après incubation, pour séparer la fraction liée et la fraction libre d'antigène par passage sur les colonnes contenant un second anticorps fixé sur les supports en phase solide de l'invention. L'organe de retenue placé à la base de la colonne a une porosité et une composition choisies de manière que tout le liquide transféré reste dans la colonne en vue de son adsorption par la tablette. Ce n'est que lorsque la force centrifuge s'élève au-dessus de la valeur nécessaire pour transférer les fluides du disque que le liquide passe à l'extérieur de la colonne.
Le procédé de la présente invention est paticulièrement intéressant à appliquer à la préparation de supports chromatographiques qui sont utilisés dans la technologie en phase solide basée sur l'utilisation d'un second anticorps. On a observé que beaucoup des gels d'emploi courant tels que ceux qui sont vendus par la firme Pharmacia sous les marques déposées «Sephadex G-25» et «Sephadex A-50» se heurtent à des difficultés croissantes en présence de molécules de grand poids moléculaire. Au contraire, on pense qu'un avantage de la technologie en phase solide impliquant le second anticorps et utilisant les supports de la présente invention est qu'il n'existe aucune limite à la grandeur moléculaire de l'antigène auquel cette technologie peut être apliquée. Cela est vrai notamment dans le cas de supports préparés à partir de «Sepharose 4B», qui est également un produit de la firme Pharmacia.
Les supports de l'invention ne sont pas limités à l'épreuve radioimmunologique de dosage de l'hormone Stimulantia thyroïde, mais peuvent être utilisés avec d'autres antisérums pour diverses analyses.
Comme ón l'a déjà indiqué et comme on le répétera dans les exemples, après la préparation du gel, ce dernier est lié à l'antisérum choisi et lavé par des techniques courantes. Ensuite, le gel lié à la protéine est déshydraté par lyophilisation, subdivisé et comprimé en tablettes. Il y a lieu de remarquer que bien que les tablettes de la présente invention soient particulièrement aptes à être utilisées dans des dispositifs impliquant un champ de forces centrifuges comme le dispositif «Centria» mentionnée ci-dessus, l'invention n'est naturellement pas limitée à l'utilisation de tels dispositifs. Les avantages résultant de la facilité de conservation, de transport et d'utilisation rendent ces dispositifs très bien adaptés à des analyses chromatographiques basées sur l'écoulement par gravité.
L'expression «gel chromatographique» utilisée dans le présent mémoire signifie que la matrice ou le support est capable de subir une expansion par adsorption de liquide et de retenir sélectivement un ou plusieurs composants renfermés dans une solution contenant un antigène et un anticorps, tout en permettant l'élimination par lavage des autres composants du support.
Comme on l'a indiqué précédemment, les meilleurs supports préparés par le procédé de l'invention sont ceux qui sont formés de «Sepharose 4B», dextrane réticulé du commerce produit par la firme Pharmacia. Selon les caractéristiques désirées de gonflement et de rétention, diverses autres substances du type de support, par exemple «Sephadex» G-25 et A-50, agarose de la firme Biorad, etc., peuvent aussi
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être incorporées aux supports en phase solide de la présente invention.
L'invention est illustrée par les exemples suivants.
Exemple 1 Préparation de supports en phase solide Cet exemple illustre le mode opératoire de la préparation d'un support en phase solide impliquant un second anticorps. On utilise d'un bout à l'autre de la préparation des formes classiques d'appareillage de laboratoire et de verrerie (que l'on rince à l'hydroxyde de sodium 5N). Dans chaque cas, on utilise des réactifs de qualité pharmaceutique.
(a) Solutions tampons - Pour un litre de gel, on utilise les tampons ci-après dans la préparation du support. Leur composition est la suivante:
Tampon Composition
Quantité préparée
A B
4 litres
3,5 litres
/3,5 litres
D
/5 litres
400 ml
30
NaHCOs, 0,1 M, pH 8,33,6 g de NaHCÛ3/4 litres
NaHCOa, 0,1 M, NaCl, 0,5 M, pH 8 5 litres 42 g de NaHC03/5 litres 146,25 g de NaCl/5 litres NaHCOs, 0,1 M, C2H7NO IM, pH 9 29,4gNaHC03 217 ml deCîHîNO 16,2 M,
-231 ml de HCl à 32%
CHsCOONa 0,1 M, NaCl, 1 M, pH 4 5 litres 41gdeCH3COONa 292,3 g de NaCl -72 cm3 de CH3COON Borate de sodium 0,1 M, NaCl, IM, pH 8 6 litres 35 37,2gdeH3B03 )
350,7 g de NaCl [/6 litres
-21 cm3 de NaOH 10N (12 g/30 cm3) J Phosphate de sodium 0,03 M, NaN3, 4 litres 0,02%, pH 7,5 3,18 g de NaH2P04 1 13,76 g de Na2HP04 [ /4 litres 0,8 g de NaN3 J
Mêmé tampon + 0,2% de sérum-albumine 400 ml de bœuf, 5% de lactose, 1% de dextrane T10 400 ml de tampon F + 0,8 g de sérum-albumine de bœuf
+ 20 g de lactose
+ 4 g de dextrane T10 50
est ensuite lavé dans 5 litres d'eau distillée à +4°C, puis dans 2,5 litres de tampon A.
(c) Liaison de la protéine au gel - Le «gâteau» de gel est s recueilli à l'aide d'une spatule et placé au fond d'un bêcher de 5 litres. L'entonnoir de Büchner est rincé avec du tampon B et l'antisérum d'anticorps anti-lapin est ajouté (le volume dépend de la qualité de l'antisérum; par exemple, on ajoute 50 ml de sérum «Wellcome»). Le volume total antisérum plus 10 tampon B est égal à 500 ml. Il y a donc un volume de gel plus un demi-volume de protéine pour le processus de liaison. La liaison est effectuée par rotation d'une tige à la température du laboratoire en 4 heures.
Lorsque la liaison est terminée, le mélange est filtré sur un 15 entonnoir de Büchner. Une fraction du filtrat est gardée à +4°C pour servir de témoin. Le gel est ensuite lavé avec des portions aliquotes de 1500 ml de chacun des tampons A, B et C. Pour chaque lavage, on agite le mélange pendant 15 minutes et on soutire le liquide avant d'effectuer le lavage 20 suivant. Après le dernier lavage, le «gâteau» de gel est transvasé au fond d'un bêcher de 5 litres et le Büchner est lavé avec deux litres de tampon C que l'on transfère dans le bêcher de manière qu'il y ait un volume de gel et un demi-volume de tampon C. Après agitation par rotation pendant 1 heure, on 2s laisse reposer le mélange pendant environ 16 heures. Après cette période de repos, on agite le mélange pendant 15 minutes et on verse la suspension dans l'entonnoir de Büchner puis on soutire le liquide. On rince ensuite le gel et on le lave comme indiqué ci-après:
40
Les tampons au carbonate ont été préparés le matin de leur jour d'utilisation, tandis que les autres tampons ont été préparés la veille.
(b) Préparation d'un gel - On dissout 10 g de bromure de cyanogène BrCN dans un litre d'eau distillée dans un bêcher de 5 litres, puis on ajoute 1 litre d'une suspension de gel de «Sepharose» 4B (marque déposée d'un gel de la firme Pharmacia). Le récipient ayant contenu le gel est rincé avec un litre d'eau distillée qui est ensuite ajoutée au mélange. Immédiatement après, le pH est ajusté à une valeur comprise entre 10,5 et 11,5 et il est maintenu dans cette plage pendant environ 5 minutes par l'addition goutte à goutte d'hydroxyde de sodium 5N (environ 10 ml). Le mélange contenant le gel est versé immédiatement dans un entonnoir de Büchner de 3 litres (porosité N° 3) et la solution est aspirée sous vide. Le gel
Agitation du gel pendant 15 minutes avec 1500 ml de tampon A, et retrait du liquide.
Lavage avec 1500 cm3 de tampon B, agitation pendant 15 minutes et retrait du liquide.
1500 cm3 de tampon D, agitation pendant 15 minutes, retrait du liquide.
1500 cm3 de tampon E, agitation pendant 15 minutes, retrait du liquide.
Le cycle de lavage avec les tampons D et E est accompli trois fois.
1500 cm3 de tampon E, agitation pendant 15 minutes, retrait du liquide.
45 1500 cm3 de tampon F, agitation pendant 15 minutes, retrait du liquide.
Le gel est ensuite reconstitué dans un bêcher d'un litre avec 400 cm3 de tampon G.
(d) Lyophilisation - Le gel est transféré dans deux plateaux en acier inoxydable, puis lyophilisé. Ensuite, il est soumis à un essai en vue de déterminer le poids nécessire pour recueillir 400 [il de solution d'incubation. On vérifie
55 ensuite ce poids pour s'assurer qu'il correspond à la capacité maximale de liaison.
(e) Préparation d'une tablette - Lorsque la lyophilisation du gel est terminée, la substance solide est pulvérisée, le cas
60 échéant, pour former un produit homogène. Le produit est ensuite tamisé sur un tamis de porosité égale à 0,25 mm (Saulas et compagnie, 16 rue du Buisson Saint-Louis, 75010 Paris). Des tablettes pesant, par exemple, 80 mg sont formulées en mélangeant environ 35 mg du produit tamisé,
65 environ 44 mg de phosphate dicalcique et 1 mg de stéarate de magnésium, et en comprimant le mélange sur une pastilleuse (Frogerais type AM, 15 rue de l'Yseu, 94400 Vitry/Seine) à 4000 kg/ cm2.
5
642459
Exemple 2 de transfert. Chaque disque de transfert est ensuite disposé
Des échantillons cliniques de sérum de sang humain sont sur le module du séparateur d'incubation. Après avoir analysés pour déterminer le taux d'hormone stimulant la thy- mélangé les réactifs et les échantillons, on fait incuber le roïde (HST) en utilisant l'appareil «Centria» de la firme mélange obtenu pendant 24 ou 48 heures. Après cette période
Union Carbide Corporation. On traite simultanément des s d'incubation, l'anneau de colonnes est chargé avec les tubes à
échantillons renfermant des taux inconnus de HST et des essai et des colonnes sont pourvues de tampons hydrophobes,
solutions de référence dont les taux sont connus. On conduit dans le module incubateur/séparateur. On place dans chaque cet essai en chargeant dans 20 positions de coupelle, à chaque colonne une tablette préparée comme indiqué dans l'exemple fois 250 microlitres d'un échantillon clinique particulier de précédent. Le mélange est transféré sur les colonnes par l'ac-
sérum et, dans 16 positions de coupelle, 250 microlitres de io tion de la force centrifuge. La tablette gonfle et la phase solide solutions de référence. Les solutions de HST de référence que fixe entièrement l'anticorps spécifique de l'hormone HST. La l'on utilise contiennent, respectivement, 0,0 jiU/ml, phase solide est lavée au bout de 10 minutes de seconde incu-
2,0jiU/ml, 4,0 |iU/ml, 10 [iU/ml, 20 uU/ml, 40 uU/ml et bation avec environ 2,5 ml de solution tampon (tampon au
100 [iU/ml. L'hormone 125 I-HST est reconstituée avec 5 ml phosphate 0,015 M, pH 7,5). On mesure ensuite les colonnes d'eau distillée, ce qui donne environ 20 000 chocs par minute 15 sur le troisième module de l'appareil «Centria» et on note les par 50 [il. L'antisérum de l'hormone HST est reconstitué avec valeurs indiquées par le calculateur.
17 ml d'eau distillée et le tampon (liaison non spécifique) est II va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à
reconstitué avec 3 ml d'eau distillée. titre explicatif mais nullement limitatif, et que de nombreuses
Les réactifs et les échantillons (50 p,l) sont introduits auto- modifications peuvent y être apportées sans sortir de son matiquement à la pipette dans les cavités choisies des disques 20 cadre.
B
Claims (7)
- 642 4592REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un support en phase solide destiné à être utilisé dans des colonnes d'épreuve radioimmu-nologique et subissant un gonflement par contact avec une solution contenant un antigène et un anticorps pour épouser la forme desdites colonnes, procédé caractérisé par le fait qu'il consiste:(a) à établir un contact en phase liquide, pour former un gel lié à une protéine, entre (i) au moins un antisérum et (ii) un gel chromatographique capable de retenir sélectivement un ou plusieurs composants renfermés dans une solution contenant un antigène et un anticorps,(b) à lyophiliser le gel lié à la protéine,(c) à subdiviser le gel séché pour former une poudre, et(d) à transformer la poudre en un support en phase solide.
- 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la poudre est formée de particules de diamètre suffisamment petit pour qu'elles traversent un tamis dont la porosité est égale à 0,25 mm.
- 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le support en phase solide affecte la forme d'une tablette.
- 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le support en phase solide affecte la forme d'une tablette qui se compose dudit gel séché lié à la protéine, de phosphate dicalcique et de stéarate de magnésium.
- 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le support en phase solide affecte la forme d'une tablette et contient une quantité suffisante de gel lié à la protéine pour absorber au moins 400 microlitres d'une solution contenant un antigène et un anticorps.
- 6. Support en phase solide destiné à être utilisé dans des colonnes d'épreuve radioimmunologique et gonflant par contact avec une solution contenant un antigène et un anticorps pour épouser la forme desdites colonnes, obtenu par le procédé suivant la revendication 1.
- 7. Méthode radioimmunologique perfectionnée dans laquelle des échantillons et des réactifs sont mélangés et transférés sur des colonnes chromatographiques par la force centrifuge, caractérisée par le fait qu'elle consiste à placer dans les colonnes des tablettes préparées par un procédé suivant la revendication 1 et à faire croître la force centrifuge dans une mesure nécessaire pour mélanger les échantillons et les réactifs et pour les transférer sur la colonne contenant les-dites tablettes, de manière que ces dernières gonflent et épousent la configuration des colonnes.
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