CH643459A5

CH643459A5 - Mikrobielles zellwandgeruest mit adjuvans- und antitumorwirkung enthaltende, verfestigte pharmazeutische zubereitung und ihre herstellung.

Info

Publication number: CH643459A5
Application number: CH847978A
Authority: CH
Inventors: Yuichi Yamamura; Ichiro Azuma; Katsusuke Ennyu; Osamu Aoki
Original assignee: Yuichi Yamamura; Ichiro Azuma; Katsusuke Ennyu; Osamu Aoki
Priority date: 1977-08-09
Filing date: 1978-08-09
Publication date: 1984-06-15
Also published as: US4543253A; BE869610A; AU3879178A; HU179726B; FR2399844A1; FR2399844B1; DK352578A; DK153443C; SE7808414L; JPS5428813A; AU526788B2; DK153443B; IT7826609A0; FI782442A7; DE2834893C2; FI65370B; GB2002229B; SE447629B; DE2834893A1; NL7808337A

Description

Die vorliegende Erfindung bezeiht sich auf eine verfestigte pharmazeutische Zubereitung, welche ein mikrobielles Zellwandgerüst mit ausgeprägter Adjuvans- und Antitumorwirkung, ein als Träger wirkendes Öl, ein Suspensionsmittel und ein Dispergiermittel enthält. Diese Zubereitung ist als immunotherapeutisches Mittel gegen menschliche Tumore wertvoll. Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Zubereitung.

Bekanntlich besitzen Zellwandgerüste (nachstehend als «CWS» bezeichnet), welche sich von Mikroorganismen, z. B. der Gattung Mycobacterium, z.B. M. bovis BCG, der Gattung Nocardia, z.B. Nocardia rubra, od.dgl. ableiten, Ad-juvans- und Antitumorwirkungen. Da aber das CWS eine wasserunlösliche Substanz ist, liess sich diese nicht in Form eines üblichen wässrigen Injektionspräparates dem Menschen verabreichen. Es war daher für eine wirksame Verabreichung für die therapeutische Behandlung des Menschen erforderlich, solche CWS in Form von Suspensionen anzuwenden. Das CWS wurde in öl-gebundener Form und daraus durch Bildung einer Öl-in-Wasser-Suspension das gebrauchsfertige Präparat hergestellt. So weiss man, dass das CWS von Mycobacterium bovis BCG, welches mit einem s Mineralöl, z. B. Drakeol 6 VR, behandelt und in einer Kochsalzlösung und 0,2%igem Tween 80 (Warenzeichen) suspendiert worden war, zur Hemmung des Tumorwachstums oder zur Rückbildung bereits bestehender Tumoren bei Tieren wirksam ist. [I. Azuma et al., Gann (Cancer), 65,493-505 io (1974); T. Yoshimoto et al., Gann (Cancer), 67,441-445 (1976) und B. Zbar et al., J. Nath. Cancer Inst., 52, '1571-1577 (1974)]. Solche mit Öl formulierte BCG-CWS sind für die Verlängerung der Überlebensdauer und für die Verbesserung des immunologischen Status von mit Tumoren i5 behafteten Patienten wirksam. [Y. Yamamura, et al., Gann (Cancer), 67, 669-677 (1976), Y. Yamamura, et al., Gann (Cancer), 66, 355-363 (1975) und K. Yasumoto, et al., Gann (Cancer), 67,787-795 (1976)].

In neuerer Zeit wurde berichtet, dass eine Suspension 20 von Öl-gebundenem CWS von Nocardia rubra, welches im wesentlichen in der obigen Weise hergestellt worden war, als immunotherapeutisches Mittel für menschliche Tumore wirksam ist. [(I. Azuma, et al., Gann (Cancer), 67, 669-677 (1976)].

25 Wenngleich die Öl-gebundenen CWS manche Vorteile bezüglich der Anwendung und der Qualitätssteuerung als immunotherapeutische Mittel im Vergleich mit lebenden Mikroorganismen aufweisen, so muss daraufhingewiesen werden, dass solche Suspensionen von Öl-gebundenem CWS 30 unbeständig sind und nicht länger als 1 Tag im gleichen Zustande zu verharren vermögen, so dass die Qualität der so erhaltenen Präparate verschlechtert und der Wirkungsgrad solcher Präparate Neigung zu Verschlechterung zeigt. Man muss daher solche Suspensionen von mit Öl behandelten 35 CWS stets unmittelbar vor deren Verwendung, d. h. vor deren Verabreichung an Patienten, herstellen. Dabei handelt es sich um ein kompliziertes und für die Therapie unbequemes Vorgehen. Daher ist es im wesentlichen unmöglich, solche Suspensionspräparate für die praktische Therapie an Ort 40 und Stelle im Krankenhaus anzuwenden.

Um die oben erwähnten Schwierigkeiten und Nachteile eines Suspensionspräparates von Öl-gebundenem CWS zu vermeiden und die wirksame und praktische Anwendung in einem Krankenhaus zu ermöglichen, wurden nun beständige 45 Präparate von Öl-gebundenem CWS geschaffen, welche ohne Wirkungsverlust während langer Zeit gelagert werden können. Es wurde nämlich ein verfestigtes Präparat von an Öl haftendem CWS geschaffen, welches beständig und für die Verwendung in Krankenhäusern und auch für die indu-50 strielle Herstellung bestens geeignet sind.

Die erfindungsgemässen verfestigten pharmazeutischen Präparate werden durch Lyophilisieren einer Suspension von CWS, einem als Träger wirkenden Öl, einem Suspensionsmittel und einem Dispersionsmittel hergestellt. 55 Das erfindungsgemäss zu verwendende Zellwandgerüst (CWS) leitet sich insbesondere von Mikroorganismen der Gattung Nocardia, z.B. Nocardia rubra, Nocardia paraffmi-ca, Nocardia asteroides usw., der Gattung Mycobacterium z.B. Mycobacterium bovis usw., der Gattun Corynebac-60 terium, z.B. Corynebacterium diphtheriae, usw., der Gattung Arthrobacter, z.B. Arthrobacter paraffmeus usw., od.dgl. ab.

Das erfindungsgemäss zu verwendende Zellwandgerüst kann hergestellt werden durch Fraktionieren und Reinigen 65 von Zellwänden aus Zellen von gezüchteten Bakterien, und dies in an sich bekannter Weise [I. Azuma, et al., J. Nath. Cancer Inst., 52, 95 (1974) und I. Azuma, et al., Biken J., 18, 1 (1975)].

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Ein Beispiel eines solchen Präparates von CWS findet sich in der folgenden Beschreibung.

Das erfindungsgemäss zu verwendende, als Träger wirkende Öl sollte ein Öl sein, welches die Adjuvans- und An-titumorwirkungen zu stabilisieren vermag. Ein solches Trä-geröl kann ein natürlichesoder synthetisches oder halbsynthetisches Öl sein. Solche Öle sind beispielsweise solche, wie sie in Immunology, 27, 311-329 (1924) beschrieben sind. Vorzugsweise handelt es sich um tierische Öle, wie z.B. Squalen, Vitamin-A-Öl, Vitamin-E-Öl. Ubichinon usw., sowie Metabolite davon, ferner pflanzliche Öle, wie z.B. Mig-lyol, AD-65 (Markenbezeichnung für eine Mischung aus Erdnussöl, Aracel und Aluminiummonostearat) usw., synthetische oder halbsynthetische Öle dieser Art, wie z.B. Squalan, Vitamin-A-palmitat usw., Mineralöle, wie z. B. flüssiges Paraffin, Bayol F (Wz.), Drakeol 6VR (Wz., Pennsylvania Refining Co.) usw., und vorzugsweise Squalen, Squalan, Miglyol, Drakeon 6VR und Vitamin-A-palmitat. Bezüglich der oben zu Erläuterungszwecken erwähnten Trägeröle sei daraufhingewiesen, dass solche Öle wirksam und wertvoll zur Förderung des CWS-Transportes zu und einer lange währenden CWS-Aufrechterhaltung in dem zu behandelnden Körpergebiet (z.B. das Thymuszellengewebe) und zur Förderung dessen immunisierenden Eigenschaften sind.

Als solche Trägeröle kann man beispielsweise tierische Öle, insbesondere Squalen, nennen, und dies weil solche Trägeröle sich aus natürlichen Quellen ableiten und demzufolge zum lebenden Körper des Menschen eine Affinität aufweisen.

Als erfindungsgemäss verwendbares Suspensionsmittel kann man übliche Emulgiermittel, wie z.B. Kohlenwasserstoffe, wie gepulverter Akaziengummi, Tragantpulver, Agar, peptische Substanzen, Natriumalginat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose usw., Protein oder Phospholipid, z.B. Deutoplasm, Casein, Gelatine, Lecithin usw., Poly-alkoholester, z.B. Polyoxyäthylensorbitan-monolaurat (Tween-20), -monopalmitat (Tween-40), -monostearat (Tween-60) oder -monooleat (Tween-80), Sorbitan-mono-laurat (Span-20), -monopalmitat (Span-40), -monostearat (Span-60), -monooleat (Span-80) usw., nennen. Als Emulgiermittel wird man mit Vorteil einen Polyalkoholester und insbesondere einen Polyoxyäthylensorbitanester, wie Poly-oxyäthylensorbitanmonooleat, verwenden.

Bevorzugte Beispiele von Dispersionsmitteln, welche verwendet werden, sind Zucker und Zuckerkalkohole, wie Glucose, Mannitol, Sorbitol usw. Insbesondere Zuckeralkohole und noch lieber Mannitol wird man für diese Zwecke verwenden.

Was die Wirksamkeit des Dispersionsmittels im verfestigten pharmazeutischen Präparat anbelangt, so sei darauf hingewiesen, dass dieses Mittel nicht nur die Herstellung einer Suspension erleichtert, sondern zu einer isotonischen Suspension führt.

Das Verhältnis einer jeden Komponente in dem verfestigten Präparat dieser Erfindung, d.h. CWS, Trägeröl, Suspensionsmittel und Dispergiermittel, kann in geeigneter Weise gewählt werden. Bevorzugte und vernünftige Mengenverhältnisse ergeben sich aus den weiter unten erwähnten Beispielen.

Das verfestigte pharmazeutische Präparat kann beispielsweise so hergestellt werden, dass man eine Mischung einer jeden Komponente der oben erwähnten Art in an sich bekannter Weise suspendiert und die so erhaltene Suspension lyophilisiert. Zu diesem Zwecke wird man beispielsweise das CWS vorteilhafterweise in einen Homogenisator für Gewebe einbringen und das als Trägermittel wirkende Öl zugeben, wobei man gewünschtenfalls das Gemisch zu einer glatten Paste mahlt. Dieses Gemisch wird hierauf tropfenweise mit einer wässrigen Lösung des Dispersionsmittels, welches ein Suspensionsmittel enthält, hinzugegeben und das Gemisch gemahlen und homogenisiert. Auf diese Weise erhält man eine einheitliche Suspension, welche hierauf in eine Ampulle eingefüllt wird. Der Ampulleninhalt wird dann rasch beispielsweise mittels flüssigem Stickstoff zum Gefrieren gebracht und lyophilisiert.

Das erfindungsgemäss hergestellte, verfestigte pharmazeutische Präparat kann verwendet werden, indem man es durch Zugabe von sterilisiertem Wasser vor der Verabreichung an Patienten erneut suspendiert, wobei dieses Präparat dann wertvolle Vorteile aufweist, welche aus den nachstehenden Angaben hervorgehen.

(1) Das erfindungsgemässe verfestigte pharmazeutische Präparat kann wesentlich länger gelagert werden als eine frisch hergestellte Suspension von an Öl haftendem CWS, wobei nicht nur die physikalische Beständigkeit, sondern auch das Ausmass der Wirkungseigenschaften im wesentlichen unverändert bleiben.

Dabei ist zu bemerken, dass die frisch zubereitete Suspension eines mit Öl behandelten CWS sich gewöhnlich innerhalb von 1 Stunde zersetzt, wobei eine nichteinheitliche und ungleichmässige Suspension entsteht, welche sich nur mit Schwierigkeiten in eine einheitliche Suspension zurücküberführen lässt. Auch ergibt sich dabei eine Suspension, welche die ursprüngliche therapeutische Wirksamkeit von CWS nach längerer Lagerungsdauer nicht mehr aufweist.

(2) Die erfindungsgemässe verfestigte pharmazeutische Zubereitung kann leicht in die gleichmässige Suspension von mit Öl behandeltem CWS reproduziert werden, wobei eine solche Suspension äusserst beständig ist und im gleichen Zustande verbleibt wie die frisch zubereitete Suspension, indem man lediglich sterilisiertes Wasser hinzugibt, was selbst nach Ablauf einer langen Lagerungsdauer noch möglich ist. Eine solche erneut suspendierte Zubereitung zeigt die gleiche Wirkung wie eine frisch zubereitete Suspension von an Öl haftendem CWS und übt die bessere therapeutische Wirkung von CWS aus als eine nach der bisherigen Methode hergestellte Suspension, und dies während wesentlich längerer Zeitdauer.

(3) Bisher wurden die Suspensionen von an Öl haftendem CWS jeweils unmittelbar vor der Verabreichung hergestellt, wie dies oben erwähnt worden ist. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Herstellung einer Suspension von an Öl haftendem CWS äusserst schwerfällig und sehr schwierig ist, weil eine einzelne Dosis an CWS eine äusserst geringe Menge von beispielsweise ungefähr 100 bis 300 (ig darstellt. Somit ist es schwierig, eine Suspension gleicher Qualität mit bestimmten Mengen zu erzielen. Selbst in jenen Fällen, in denen grössere Mengen einer Suspension von an Öl haftendem CWS gleichzeitig zur Verhinderung dieser Nachteile hergestellt wird, ist eine solche Suspension äusserst unbeständig und lässt sich, wie bereits erwähnt, nicht während langer Dauer lagern. In solchen Fällen kann nur ein kleiner Teil der Suspension therapeutisch verwendet werden, während der Rest verworfen wird. Erfindungsgemäss ist es hingegen leicht und ohne weiteres möglich, ein verfestigtes Präparat zu erzeugen, welches die gewünschte kleine Menge an mit Öl behandeltem CWS in grösserem Umfange enthält, wobei man die Qualität des Produktes steuern kann.

Bezüglich der besseren Beständigkeit und des höheren Wirkungsvermögens einer aus einem erfindungsgemässen verfestigten Präparat reproduzierten Suspension ist zu bemerken - und dies stellt die erfinderische Tätigkeit und unerwartete Eigenschaften der vorliegenden Erfindung dar -,

dass eine solche dauerhafte und längere Stabilität und ein solches besseres Wirkungsvermögen wohl jenem Umstände zuzuschreiben ist, dass das an Öl haftende CWS in einer der5

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60

65

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artigen reproduzierten Suspension sich gleichmässig disper-gieren lässt, wobei das dispergierte an Öl haftende CWS in feinen Kügelchen mit einem Durchmesser von beispielsweise ungefähr 5 \i ohne Agglutination an grösseren Partikeln zugegen sein kann.

Wie aus den obigen Darlegungen hervorgeht, gelang es zum ersten Male, ein Antitumormittel aus an Öl haftendem CWS von guter Qualität in industriellem Ausmass zu liefern, dank welchem die Verwendung von CWS in der Praxis in Krankenhäusern ermöglicht wird. Es handelt sich hier um eine epochale Erfindung, welche sich heilsam für Krebskranke auswirken wird.

Zur Stützung der erfinderischen und technischen Vorteile der erfindungsgemässen verfestigten pharmazeutischen Präparate mögen die nachstehenden pharmakologischen und pharmazeutischen Testresultate dienen.

Materialien und Methoden

Adjuvante:

Die Herstellung des Zellwandgerüsts (CWS) von Nocardia rubra (nachstehend als N.rubra bezeichnet) ist weiter oben beschrieben worden.

Drakeol 6VR (Pennsylvania Refining Co., Butler, U.S. A.), Squalen (Tokyo Kasei Co., Ltd., Japan) und Squalan (Katayama Kagaku Co., Ltd., Japan) wurden als Öl für die Herstellung von ölgebundenem CWS von N. rubra verwendet.

Antigene:

m-[4-(4'-Monophenylazo)-phenl]-N-acetyl-L-tyrosin (AVA-N-acetyl-tyrosin) und bakterielle a-Amylase aus ABA (ABA-BaA) wurden nach der Methode in J. Biol. Chem., 238,1726-1730 (1959) hergestellt. Bakterielle a-Amylase (Li-quefying Type, Lot No. E5X01), gereinigt von Bacillus sub-tilis, wurde bei Seikagaku Kogyo Co., Ltd., Japan, käuflich erworben.

Tumore:

Leukemia EL4 von Mäusen vom C57BL/6J-Stamm, Ma-stocytoma P815-X2 von Mäusen vom DBA/2-Stamm, Meth A von Mäusen vom BALB/c-Stamm, Fibrosarcoma in Mäusen vom C57BL/6J-Stamm durch 3-Methylcholanthren induziert und als MC 104 bezeichnet, wurden verwendet.

EL4, Mastocytoma P815-X2 und Meth A wurden durch den Durchgang von Aszites in syngenetischen weiblichen Mäusen in Serien gehalten. MC 104 wurde serienmässig durch subkutane Transplantation in syngenetischen Mäusen eingeführt.

Mäuse:

Als Mäuse wurden 6- bis 8Wochen alte weibliche Mäuse vom Stamm BALB/c, C578BL/6J und DBA/2 bei Shizuoka Jikken Dobutsu Nokyo, Shizuoka, Japan bezogen. Die Tiere wurden bedingungslos mit Futter (von der Firmai Oriental Yeast Ind., Japan) und Wasser versehen.

Lösung des Mediums:

Das minimale essentielle Medium nach Eagle (MEM), welches 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 (ig/ml Strepto-mycin enthielt, wurde bezogen bei Research Foundation von Microbial Diseases, Osaka University, Japan. Das Medium RPMI-1640 für Gewebekultur wurde von Nissui Seiyaku Co., Ltd., Japan erhalten. Das Serum von Kalbsföten (Lot No. 4055722) wurde bei Flow Laboratories (Rockville, USA) gekauft und durch Erwärmen während 30 Minuten auf 56 °C vor der Verwendung inaktiviert.

Direkter Cytotoxizitätstest:

Eine Suspension von Tumorzellen (Meth A) in MEM-Lösung wurde mit dem gleichen Volumen von an Öl haftendem CWS oder Öltröpfchen gemischt und während 60 Minuten in einem eiskalten Wasserbade gehalten. Die Lebensfähigkeit der Tumorzellen wurde durch den Eosin Y Exklusionstest bestimmt.

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Bestimmung der Adjuvans-Wirkung in bezug auf die Induktion von verzögerter Hypersensivität:

Meerschweinchen wurden einer Primärimmunisierung in vier Pfoten bei Gesamtmengen von 50 (ig ABA-N-Acetyl-lo tyrosin in Gegenwart oder in Abwesenheit von CWS von N. rubra in verschiedenen Trägerölen als Wasser-in-Ölemulsion durchgeführt. Zwei Wochen später wurde ein Hauttest mit 100 (ig ABA-BaA durchgeführt und die Reaktion 24 Stunden bzw. 48 Stunden nach der intradermalen Injektion des 15 Testantigens gemessen.

Durch Zellen vermittelter Cytotoxizitätstest:

Mäuse vom Stamm C57BL/6J (H-2b) wurden intraperitoneal mit lebefähigen Zellen von Mastocytoma P815-X2 20 (H-2a) in Gegenwart oder in Abwesenheit von an Öl haftendem CWS von N.rubra immunisiert. 11 Tage nach der Immunisierung wurde der durch die Zellen vermittelte Cytotoxizitätstest durchgeführt, indem man die Milzzellen von immunisierten Mäusen und die 51Cr-markierten Zellen von 25 Mastocytom P8I5-X2 nach der Mehtode von Brunner et al. [Immunology, 18, 501-515 (1970)] mit gewissen Modifikationen [T. Taniyama et al., Jpn. J. Microbiol. 19,255-264 (1975)] zur Anwendung brachte. Das Verhältnis der Milzzellen (Effektorzellen) zu den mit slCr markierten Zellen vom 30 Mastocytom P815-X2 (Scheibenzellen) betrug 100 : 1. Die Xysis der Scheibenzellen wurde in Prozenten der spezifischen Lysis der Scheibenzellen gemäss folgender Formel ausgedrückt:

35 Prozent an spezifischen Scheibenzellen-Lysis maximales in Freiheitsetzen - spontanes X in Freiheitsetzen

Das maximale in Freiheitsetzen von Chrom wurde durch 40 vollständige Zellenlysis gemessen, wobei Scheibenzellen allein gefroren und zweimal aufgetaut wurden.

Herstellung von an Öl haftendem CWS von N.rubra: Das verfestigte Präparat von CWS von N.rubra wurde 45 nach den Angaben in den folgenden Beispielen hergestellt:

Resultate

Wirkung von CWS von N.rubra, behandelt mit verschiede-

50 nen

Ölen in bezug auf durch Zellen angesprochene

Cytotoxizität in allogenen Mäusen:

Das CWS von N.rubra wurde mit Squalen oder Brakeol 6VR behandelt und in einer 0,2% Tween 80 Lösung enthal-55 tenden, 0,9%igen Kochsalzlösung suspendiert. Mäuse vom Stamm C57BL/6J wurden mit einer Mischung von Mastocy-tomzellen und Adjuvantien gemäss obigen Angaben immunisiert. Wie aus der Tabelle I hervorgeht, waren die Präparate von CWS von N. rubra, welche mit Drakeol 6VR und 60 physiologischer Kochsalzlösung, mit Squalen und Kochsalzlösung oder Squalen und Mannitol behandelt worden waren, eindeutig wirksam als Adjuvans für die Induktion von Effektorzellen in der Milz von allogenetischen Mäusen. Es geht auch daraus hervor, dass lyophilisierte Adjuvantien, welche 65 durch Zugabe von sterilisiertem Wasser vor Gebrauch erneut suspendiert worden waren, genau gleich wirksam waren wie die Adjuvantien, welche vor Gebrauch frisch zubereitet wurden.

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Direkte Cytotoxizität in bezug auf Tumorzellen:

Wie aus der Tabelle II hervorgeht, zeigen sämtliche getesteten, CWS von N. rubra enthaltenden Präparate keine Cytotoxizität, wenn diese Adjuvantien und die Tumorzellen (Meth A aus BALB/c) in einem Eiswasserbade während 60 Minuten gehalten wurden. Dagegen zeigten lyophilisierte Präparate, welche Squalen und eine 0,9%ige Kochsalzlösung, welche 0,2% Tween 80 enthielt, eine gewisse Toxizität in bezug auf Tumorzellen. Frisch zubereitete Präparate zeigten keine cytotoxischen Eigenschaften unter den gleichen Bedingungen. Hingegen waren lyophilisierte Präparate von CWS von N.rubra, welche mit Squalen und Mannitol behandelt worden waren, keine phytotoxischen Eigenschaften.

Antitumorwirkung von an Öl haftendem N. rubra CWS: Die Antitumorwirkung von N. rubra CWS, behandelt mit Squalen, Squalan oder Drakeol 6VR und in 5,6%iger Mannitollösung, welche 0,2% Tween 80 enthielt, suspendiert, wurde unter Verwendung von transplantablen Tumoren in syngenetischen Mäusen getestet. Wie aus den Tabellen III, IV, V und VI hervorgeht, besitzen die mit verschiedenen Arten von Ölen behandelten Präparate von N. rubra CWS nahezu die gleiche Wirkung bezüglich der Unterdrückung von Tumorwachstum von EL-4 Leukämie, Meth A und MC 104 bei syngenetischen Mäusen. Wie aus der Tabelle III hervorgeht, ist die Unterdrückungswirkung von CWS von N. rubra in bezug auf das Wachstum von Meth A bei Mäusen vom Stamm BALB/c nicht verschieden zwischen frisch zubereitetem Drakeol und Kochsalzlösung enthaltenden Präparaten und Squalen und Mannitol enthaltenden Präparaten oder Squalan und Mannitol enthaltenden Präparaten, s welche vor Gebrauch lyophilisiert und in sterilisiertem Wasser suspendiert worden waren.

Wirksamkeit von Ölpräparaten auf die verzögerte Hypersen-sivität von Meerschweinchen:

io CWS von N. rubra wurde in einer Mischung eines Öls, z.B. Drakeol 6VR, Squalen oder Squalan, und Arlacel A in einem Verhältnis von 85 : 15 suspendiert und hierauf mit einer Lösung von ABA-N-Acetyltyrosin in Gegenwart oder in Abwesenheit von CWS von N. rubra in Form einer Wasser-15 in-Ölemulsion gemischt. Meerschweinchen wurden dann durch intramuskuläre Injektion der obigen Mischung von Adjuvant und Antigen immunisiert. Nach 2 Wochen wurde der Hauttest mit ABA-BaA durchgeführt und die Hautreaktion nach intradermaler Injektion des Testantigens nach Ab-20 lauf von 24 bzw. 48 Stunden festgestellt. Wie aus derTabelle VII hervorgeht, wurde eine positive Hautrekation in bezug auf ABA-BaA bei Meerschweinchen beobachtet, welche mit ABA-N-Acetyltyrosin zusammen mit CWS von N. rubra und Squalen oder Squalan sowie Drakeol 6VR als Wasser-25 in-Ölemulsion immunisiert worden waren.

Die Testdaten finden sich in den folgenden Tabellen.

Tabelle I

Wirkung von an Öl haftendem N.rubra CWS bezüglich der zellular übermittelten Cytotoxizität gegenüber dem Mastocytom P815-X2 in Mäusen vom Stamm C57BL/gJ

Mäuse wurden immunisiert mit: Spezifische Scheibenzellen-

Lysis (%)

Versuch la Versuch 2b

Zellen von Mastocytoma P815-X2 (1 x 104)

+ N.rubra CWS-Squalen-Mannitol 64,2 41,1 + N.rubra CWS-Drakeol 6VR-Mannitol - 58,3

+ N.rubra CWS-Squalen-

Kochsalzlösung

50,4

-

+ N.rubra CWS-Drakeol 6VR-

Kochsalzlösung

26,9

28,4

+ Squalen-Mannitol

8,2

14,1

+ Drakeol 6VR-Mannitol

-

8,7

+ Squalen-Kochsalzlösung

2,3

+ Drakeol 6VR-Kochsalzlösung

0,7

16,8

Zellen von Mastocytoma P815-X2

(3 x 107) allein

87,9

67,5

Bemerkung:

Jeweils 3 Mäuse vom Stamm C57BL/6J wurden intraperitoneal mit einer Mischung von Mastocytomzellen und an Öl haftendem CWS von N.rubra immunisiert. Nach 11 Tagen wurde die durch die Zellen verursachte Cytotoxicität durch Inkubation von Milzzellen auf immunisierten Mäusen und slCr-markierten Mastocytomzellen in einem Verhältnis von 100:1 während 20 Stunden bestimmt. Sämtliche Versuche wurden doppelt durchgeführt.

a Frisch zubereitete Adjuvantien wurden verwendet. b Lyophilisierte Materialien wurden durch Zugabe von sterilisiertem Wasser vor Gebrauch erneut in Suspension gebracht.

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Tabelle II

Direkte Cytotoxizität bezüglich Tumorzellen (Meth A) von an Öl haftenden N.rubra CWS in vitro

Tumorzellen wurden vermischt Konzentration Lebefähigkeit (%) mit: von CWS von

N.rubra

Frisch Lyoph-zubereitet ilisiert

N.rubra CWS-Squalen-

2 mg/ml

90,0

89.7

Mannitol

0,4 mg/ml

88,8

85,0

N.rubra CWS-Squalen-

2 mg/ml

92,3

87,0

Kochsalzlösung

0,4 mg/ml

87,9

91,7

N.rubra CWS-Drakeol 6VR-

2 mg/ml

86,7

85,8

Kochsalzlösung

0,4 mg/ml

86,4

84,7

Öltröpfchen

Squalen-Mannitol

-

83,3

87,1

Squalen-Kochsalzlösung

-

75,5

45,5

Drakeol 6VR-

Kochsalzlösung

-

87,1

79,1

MEM

100

Bemerkung:

Eine aus Tumorzellen (Meth A aus Mäusen vom Stamme _BALB/c) gebildete Suspension (4 x 107/ml in MEM) wurde mit an Öl haftendem N.rubra CWS oder Öltröpfchen vermischt und während 60 Minuten in einem Eiswasserbade gehalten. Hierauf wurde die Lebefähigkeit von Tumorzellen durch den Eosin Y Exklusionstest geprüft. Die Werte zeigen die Verhältnisse in bezug auf die Lebensfähigkeit von Tumorzellen in M EM-Lösung.

Tabelle IV

Unterdrückung von Tumorwachstum (Meth A) mit an Öl haftendem CWS von N.rubra in Mäusen vom Stamme BALB/c

Präparate3 Versuch Nummer

0823 1108

N.rubra CWS (100 ng) behandelt 10 mit:

Squalen-Mannitol

10/10

8/10b

Squalan-Mannitol

10/10

Drakeol 6VR-Mannitol

10.10

10/10

Miglyol-Mannitol

10/10

i5 Vergleichsversuch (Öltröpfchen)

Squalen-Mannitol

2/10

0/10

Squalan-Mannitol

-

0/10

Drakeol 6VR-Mannitol

0/10

Miglyol-Mannitol

2/10

0/10

20 MEM

0/10

Bemerkung:

Ein Gemisch von durch 3-Methylcholanthren induziertem Fibrosar-kom (Meth A) (1 x 105) und 100 |ig an Öl haftendem CWS von 25 N.rubra oder Öltröpfchen wurde intradermal in weibliche Mäuse vom Stamme BALB/c inokuliert. Die Zahlen geben die Resultate nach 42 Tagen nach erfolgter Inokulation wieder.

a Lyophilisierte Materialien wurden vor Gebrauch mit sterilisiertem

Wasser erneut suspendiert.

b Anzahl an tumorfreien Mäusen/Anzahl an getesteten Mäusen.

30

Tabelle III

Bekämpfung von Tumorwachstum (Meth A) mit an Öl haftendem CWS von N.rubra in weiblichen Mäusen vom Stamme BALB/c

Präparate Frisch Lyophilisiert zubereiteta) b)

N.rubra CWS (100 jag) behandelt mit:

Squalen 10/10

Squalen 9/10

Drakeol 6VR 10/10 Vergleichsversuch (Öltröpfchen)

Squalen 0/10

Drakeol 6Vr 0/10

9/10c 10/10

0/10 0/10

40

Tabelle V

Unterdrückung des Tumorwachstums (MC104) mit an Öl haftendem CWS von N.rubra bei weiblichen Mäusen vom Stamm C57BL/6J

50

55

Bemerkung:

Eine Mischung von Tumorzellen (Meth A, 2 x 105) und 100 |ig an Öl haftendem CWS von N.rubra oder Öltröpfchen wurde intradermal weiblichen Mäusen vom Stamm BALB/c verabreicht.

Die Zahlen zeigen die Werte nach 4 Wochen nach Ablauf der Inokula-

tion.

a N.rubra CWS wurde mit verschiedenen Ölen behandelt und in einer 0,2% Tween 80 enthaltenden, 0,9%igen Kochsalzlösung suspendiert. Das Präparat wurde vor Gebrauch hergestellt. b N.rubra CWS wurde mit verschiedenen Ölen behandelt und in 0,2% Tween 80 enthaltendem 5,6%igem Mannitol suspendiert und lypophilisiert. Die Präparate wurden vor Gebrauch mit sterilisiertem Wasser frisch suspendiert.

c Anzahl von tumorfreien Mäusen/Anzahl der getesteten Mäuse.

Präparate3

Versuch

Nummer

0819

1109

N.rubra CWS (100 ng) behandelt

mit:

Squalen-Mannitol

6/10

10/10

Squalan-Mannitol

-

10/10

Drakeol 6VR-Mannitol

7/10

Miglyol-Mannitol

7/10

10/10

Vergleichsversuch (Öltröpfchen)

Squalen-Mannitol

0/10

Squalan-Mannitol

0/10

Drakeol 6VR-Mannitol

0/10

Miglyol-Mannitol

0/10

Bemerkung:

Ein Gemisch von durch 3-Methylcholanthren induziertem Fibrosar-kom (MC104) (1 x 106) und 100 (ig an Öl haftendem N.rubra CWS 60 oder Öltröpfchen wurde intradermal weiblichen Mäusen vom Stamme C57BL/6J verabreicht. Die Werte zeigen die Resultate 42 Tage nach erfolgter Inokulation.

a Es wurden lyophilisierte Materialien vor Gebrauch mit sterilisiertem Wasser erneut suspendiert.

6 Zahl der tumorfreien Mäuse/Zahl der getesteten Mäuse.

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Tabelle VI

Unterdrückung von Tumorwachstum (EL-4 Leukämie) mit an Öl haftendem CWS von N.rubra bei weiblichen Mäusen vom Stamm C57BL/6J

Präparate3

Versuchszahl

0824

0830

0907

N.rubra CWS (100 jxg) behandelt mit:

Squalen-Mannitol

8/10

9/10

7/10b

Drakeol 6VR-Mannitol

5/10

7/10

5/10

Miglyol-Mannitol

4/10

8/10

Vergleichsversuch (Öltreopfchen)

Squalen-Mannitol

0/10

Drakeol 6VR-Mannitol

0/10

Miglyol-Mannitol

0/10

MEM

0/10

Bemerkung:

Ein Gemisch von El-4 Leukämiezellen (1 x 105)und 100 (ig an Öl haftendem CWS von N.rubra oder Öltröpfchen wurde intradermal in weibliche Mäuse vom Stamm C57BL/6J inokuliert. Die Zahlen zeigen die Resultate nach 28 Tagen nach erfolgter Inokulation.

a Die lyophilisierten Materialien wurden vor Gebrauch mit sterilisiertem Wasser erneut suspendiert.

b Zahl der tumorfreien Mäuse/Zahl der getesteten Mäuse.

Tabelle VII

Wirkung von Ölpräparaten auf die verzögerte Hypersensitivität zum Bezug auf ABA-N-Acetyltyrosin bei Meerschweinchen

Meerschweinchen wurden Hautreaktion in bezug auf AB A-mit ABA-N-Acetyltyrosin bakterielle a-Amylase immunisiert, und zwar mit:

N.rubra CWS (100 fig) in Drakeol 6VR-Arlacel A (85:15)

in Squalen-Arlacel A (85:15)

in Squalan-ArlacelA(85:15) Vergleichsversuch [Drakeol 6VR-Arlacel A (85:15)]

23,4±0,8mm 20,1 + 1,3 18,9+0,5

0

25,7±0,7mma) 17,9+1,0 16,6+0,6

0

Bemerkung:

5 Meerschweinchen wurden jeweils mit 50 ng ABA-N-Acetyttyrosin in Gegenwart oder in Abwesenheit von 100 (ig CWS von N.rubra, suspendiert in verschiedenen Arten von Ölträgern als Wasser-in-ÖlemuI-sion immunisiert. 2 Wochen nach erfolgter Immunisierung wurden die Hautteste mit 100 ng ABA-bakterieller a-Amylase durchgeführt, a) Durchschnittliche Hautreaktion (Verhärtung, mm Durchmesser)

± üblicher Fehlwerte.

Das in den folgenden Beispielen verwendete Nocardia rubra-CWS wurde wie folgt hergestellt:

Nocardia rubra wurde in einem Medium, welches 2% Polypepton und 1 % Hefeextrakte (pH 7,0) während 3 Tagen bei 30 °C gezüchtet und die Kulturbrühe (18 Liter) filtriert. Dann wurden ungefähr 400 g feuchtes Mycel in 1 Liter Wasser suspendiert und mit Dynomill (0,1 bis 0,2 mm Kügel-chen; 3000 Umdrehungen pro Minute; 2 Liter pro Stunde) dreimal gemahlen. Die erhaltene Substanz wurde bei einem pH-Wert von 7,5 gepuffert, mit Nukleinsäure-Acidase (DNase und RNase) während 30 Minuten behandelt und hierauf zentrifugiert (800xg, 15 Minuten). Die obenaufflies-

sende Flüssigkeit wurde abgetrennt und weiter zentrifugiert (10 000 bis 20 OOOxg, 30 Minuten). Der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und in 1 Liter Aceton suspendiert und während 24 Stunden gerührt. Der Niederschlag wurde s durch Filtrieren gesammelt, in 2% Triton X-100 (1 Liter) suspendiert, während 24 Stunden gerührt und hierauf zentrifugiert (10 000 bis 20 OOOxg, 30 Minuten). Der Niederschlag wurde erneut mit Triton X-100 in der oben erwähnten Weise behandelt. Der entstandene Niederschlag wurde io mit einer Mischung (1 Liter) Äthanol und Wasser (Mischungsverhältnis 1:1) und hierauf mit Wasser (1 Liter) zweimal gewaschen und zentrifugiert (10 000 bis 20 OOOxg, 30 Minuten). Der Niederschlag wurde in Veronal-Puffer-material (pH 9,5) suspendiert, mit 50 mg Pronase unter Rüh-15 ren bei Zimmertemperatur während 24 Stunden behandelt und hierauf zentrifugiert (10 000 bis 20 OOOxg, 30 Minuten). Der so erhaltene Niederschlag wurde mit 1 Liter Wasser dreimal gewaschen und zentrifugiert (10 000 bis 20 OOOxg, 30 Minuten). Der Niederschlag wurde mit einer Mischung (1 20 Liter) von Diäthyläther und Äthanol (Mischungsverhältnis 1:1) gewaschen, unter vermindertem Druck bei Zimmertemperatur während 3 Tagen getrocknet, pulverisiert und hierauf abgesiebt (125 ft), wobei man ein feines Pulver von N. rubra CWS (ungefähr 7 g) erhielt. 25 Das erfindungsgemäss erhaltene, verfestigte Material wurde erneut in sterilisiertem Wasser suspendiert und intrapleural, intralesional, intradermal, subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal in Dosierungseinheiten von 10 bis 2000 ng und vorzugsweise von 100 bis 300 jig CWS verab-30 reicht.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern.

35

40

Beispiel 1

N.rubra CWS Miglyol

5,6%ige Mannitollösung, enthaltend 0,2% Tween 80

4 mg 2 Tropfen

1 ml

CWS von N. rubra (140 mg) wurde in einen Gewebehomogenisator eingebracht, welcher mit einem Teflonstössel (Takashima Shoten Co., Ltd., Japan) ausgerüstet ist. 70 Tropfen Miglyol wurden aus einer 27-gauge Injektionsnadel einer Spritze zu CWS hinzugegeben und das Gemisch bei 45 1000 Umdrehungen pro Minute zu einer glatten Paste vermählen. Hierauf wurde eine 5,6%ige wässrige Lösung (35 ml) Mannitol, enthaltend 0,2% Tween 80, der Paste hinzugegeben und das Vermählen solange fortgesetzt, bis man eine gleichmässige Suspension von kleinen Öltröpfchen, weise che mit dem CWS von N. rubra vereinigt waren, erhielt. Für die Herstellung eines lyophilisierten Materials wurde die an Öl haftende Suspension von N. rubra CWS in 35 Violen (10 ml Volumen) eingebracht, unter Anwendung von flüssigem Stickstoff rasch gefroren und hierauf bei Zimmertem-55 peratur lyophilisiert. 1 ml sterilisiertes Wasser wurde dann dem lyophilisierten Material zugegeben, wobei man vor Gebrauch eine Suspension herstellte.

60

Beispiel 2

N. rubra CWS 4 mg

Drakeol-6VR 2 Tropfen

5,6%ige Mannitollösung, enthaltend 2,2% Tween 80 1 ml

Drakeol-6VR wurde, anstatt wie in Beispiel 1 Miglyol, verwendet und das Gemisch in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man zu einem erstarrten Präparat gelangte.

643 459

Beispiel 3

N. rubra CWS 4 mg

Squalen 2 Tropfen

5,6%ige Mannitollösung, enthaltend 0,2% Tween 80 - 1 ml

Anstelle von Miglyol, wie dies in Beispiel 1 der Fall ist, wurde Squalen verwendet und das Gemisch in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt. Dabei erhielt man 1 verfestigtes Präparat.

Beispiel 4

N.rubra CWS 4 mg

Vitamin-A-palmitat 2 Tropfen

5,6%ige Mannitollösung, enthaltend 0,2% Tween 80 1 ml

Anstelle von Miglyol, wie dies in Beispiel 1 der Fall ist, wurde Vitamin-A-palmitat verwendet und das Gemisch in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, um zu einem verfestigten Präparat zu gelangen.

s

Beispiel 5

N. rubra CWS 4 mg

Miglyol 2 Tropfen

5,6%ige GlucoselÖsung, enthaltend io 0,2% Tween 80 4 ml

Anstelle einer 5%igen wässrigen Lösung von Mannitol, wie dies in Beispiel 1 der Fall ist, wurde eine 5%ige wässrige GlucoselÖsung verwendet und das Gemisch in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man zu einem er-ls starrten Präparat gelangte.

Claims

643 459 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfestigte pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein mikrobielles Zellwandgerüst mit ausgeprägter Adjuvans- und Antitumorwirkung, ein als Träger wirkendes Öl, ein Suspensionsmittel und ein Dispergiermittel enthält.

2. Zubereitung nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Zellwandgerüst aus der Gattung Nocardia enthält.

3. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das als Träger wirkende Öl ein tierisches Öl, ein Pflanzenöl, ein Mineralöl oder ein halbsynthetisches Öl ist.

4. Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das als Träger wirkende Öl Squalen, Squalan oder Vitamin-A-palmitat ist.

5. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Suspensionsmittel ein Polyalkoholester ist.

6. Zubereitung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Suspensionsmittel ein Polyoxyäthylensorbitan-ester ist.

7. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Dispergiermittel Zucker oder ein Zuckeralkohol ist.

8. Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Dispersionsmittel Mannitol, Sorbitol oder Glucose ist.

9. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Zellwandgerüst aus Nocardia rubra, ein tierisches Öl, einen Polyoxyäthylensorbitanester und einen Zuckeralkohol enthält.

10. Zubereitung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Zellwandgerüst von Nocardia rubra, Squalen, ein Polyoxyäthylensorbitanmonooleat und Mannitol enthält.

11. Verfahren zur Herstellung einer verfestigten pharmazeutischen Zubereitung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Suspension lyophilisiert, welche ein mikrobielles Zellwandgerüst, ein als Träger wirkendes Öl, ein Suspensionsmittel und ein Dispergiermittel enthält.

12. Verfahren nach Anspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Suspension lyophilisiert, welche ein Zellwandgerüst von Nocardia rubra, Squalen, ein Polyoxyäthy-lensorbitanmonooleat und Mannitol enthält.