CH644455A5

CH644455A5 - Procede d'analyse quantitative des nucleotides cycliques et ensemble de reactifs pour la mise en oeuvre de ce procede.

Info

Publication number: CH644455A5
Application number: CH376280A
Authority: CH
Inventors: Itaru Yamamoto
Original assignee: Yamasa Shoyu Kk
Priority date: 1979-05-18
Filing date: 1980-05-14
Publication date: 1984-07-31
Also published as: FR2456777A1; GB2050602B; GB2050602A; FR2456777B1; CA1140046A; DE3018593A1; JPS55152459A; US4350761A

Description

La présente invention a pour objet un procédé d'analyse quantitative de nucléotide cyclique fondé sur la méthode de dosage immunologique enzymatique (désignée habituellement par le terme anglais de «enzyme immunoassay method» qui sera utilisé, dans la description qui va suivre, sous l'abréviation EIA). L'invention a également pour objet un ensemble de réactifs pour la mise en œuvre de ce procédé.

Au cours de ces dernières années, le monophosphate cyclique d'adénosine-3',5' (désigné, ci-dessous, par l'abréviation cAMP) a fait l'objet de nombreuses études, en tant qu'intermédiaire dans l'action des hormones, et ses effets physiologiques en relation avec le monophosphate cyclique de guanosine-3',5' (désigné, ci-dessous, par l'abréviation cGMP), le monophosphate cyclique d'inosine-3',5' (cIMP), le monophosphate cyclique de cytidine-3',5' (cCMP), et le monophosphate cyclique d'uridine-3',5' (cUMP) sont en voie d'être élucidés.

On constate, en particulier, que dans le cas où un organisme vivant se trouve dans un état anormal ou pathologique, résultant, par exemple, d'une maladie, les teneurs en cAMP et cGMP dans les cellules ou les fluides de cet organisme subissent des fluctuations. En se fondant sur cette constatation, on considère de plus en plus que la mesure des teneurs de ces substances dans les organismes vivants revêt une grande importance non seulement dans le domaine de la recherche médicale fondamentale mais également en vue du diagnostic, de la prévention et du traitement des maladies, en médecine clinique. On considère, par exemple, que le dosage du cAMP et du cGMP dans des échantillons d'organisme vivant, tels que les leucocytes de patients souffrants d'asthme, la peau de patients atteints de psoriasis, les plaquettes sanguines de patients atteints de thrombocytose, le sang et l'urine de patients atteints de pseudohypoparathyroidisme, le fluide cérébrospinal de malades atteints de psychose dépressive, est utile pour le diagnostic et le traitement de ces maladies. Il est, en outre, à prévoir que les relations entre ces nucléotides cycliques et un grand nombre d'états pathologiques seront, un jour, élucidées. En conséquence, la mise au point de procédés simples, pratiques et d'une précision élevée pour le dosage quantitatif des nucléotides cycliques présente un intérêt considérable.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

644 455

L'un des procédés actuellement connus d'analyses quantitatives des nucléotides cycliques, tels que le cAMP et le cGMP, est la méthode de dosage radio-immunologique (désignée, ci-dessous, par l'abréviation RIA, correspondant à la dénomination anglaise, couramment employée, de cette méthode: «radioimmunoassay»).

La méthode RIA comprend la mise en réaction compétitive d'un nucléotide cyclique d'un organisme vivant et d'un nucléotide cyclique marqué au moyen d'un isotope radioactif avec un anticorps correspondant au nucléotide cyclique à doser et la mesure du rayonnement émis par le nucléotide cyclique marqué qui s'est lié à l'anticorps ou bien par le nucléotide cyclique non lié à l'anticorps de manière à en déduire la quantité de nucléotide cyclique contenue dans l'échantillon à doser.

La marche à suivre pour effectuer l'analyse quantitative, avec une très grande précision, des nucléotides cycliques en combinant à la méthode RIA certaines opérations telle que la succinylation du nucléotide cyclique, en vue d'améliorer son affinité à l'égard de l'anticorps obtenu en utilisant comme antigène l'albumine de ce nucléotide cyclique succinylé ainsi que l'utilisation d'une solution tampon d'imidazole comme milieu réactionnel de la réaction antigène-anticorps en vue d'augmenter le taux de liaison, la sensibilité et la stabilité du produit obtenu lors de cette réaction, est décrite, par exemple, dans la publication suivante: Biochemical Medicine volume 18, pages 257-273 (1977).

La mise en œuvre de ces méthodes RIA s'accompagnent toutefois de différents inconvénients qui résultent fondamentalement de l'utilisation de radio-isotopes. L'un de ces inconvénients réside, par exemple, dans le risque de dommages au corps humain, ainsi que dans le risque de contamination du milieu sous l'effet du rayonnement. Un autre inconvénient réside dans la nécessité de disposer d'installations et de matériels spéciaux en vue d'éviter la contamination par la radioactivité. D'autres inconvénients résident dans la nécessité d'utiliser des instruments de mesure coûteux pour la mesure du rayonnement, celle de devoir disposer de l'expérience et des autorisations nécessaires à la manipulation des isotopes radioactifs et, en général, les inconvénients résultant de la manipulation, du transport et du stockage des radio-isotopes compte tenu de l'instabilité de ces derniers.

On a récemment étudié et mis au point, dans le but de résoudre les problèmes liés à la mise en œuvre de la méthode RIA, des méthodes EIA dans lesquelles on utilise, pour le marquage, des enzymes au lieu d'isotopes radioactifs. Certaines de ces dernières méthodes ont déjà été effectivement utilisées comme méthodes d'analyses quantitatives des a-fétopro-téines, des antigènes HBs, des antigènes carcinoembryoni-ques, de la tyroxine, de la digoxine, de la IgE, etc. Cependant, aucune indication n'a encore été donnée concernant l'analyse quantitative de nucléotides cycliques par la méthode EIA.

La présente invention résulte de recherches effectuées en vue de la mise au point d'un procédé d'analyse quantitative de nucléotides cycliques fondé sur la méthode EIA. Le but de l'invention est de fournir un procédé d'analyse dont la sensibilité, la précision et la reproductibilité soient comparables ou supérieures à celles de la méthode RIA.

A cet effet, le procédé selon l'invention est caractérisé par le fait qu'il comprend les opérations suivantes: acylation d'un nucléotide cyclique, dans un échantillon à doser, au moyen d'un agent d'acyjation, mise en réaction concurrentielle du dérivé acylé de nucléotide cyclique ainsi obtenu et d'une quantité spécifique d'un nucléotide cyclique marqué au moyen d'une enzyme avec une quantité spécifique d'un anticorps du nucléotide cyclique correspondant, le nucléotide marqué étant formé par liaison par l'intermédiaire d'un acide dicarboxylique d'un nucléotide cyclique, correspondant à ce dérivé acylé, avec une enzyme, séparation du nucléotide cyclique marqué qui s'est lié à l'anticorps et du nucléotide cyclique marqué non lié à l'anticorps, et mesure de l'activité enzymatique de l'une de ces deux fractions de nucléotide cyclique, de manière à en déduire la quantité de nucléotide cyclique contenue dans l'échantillon à doser. L'invention a également pour objet un ensemble de réactifs pour la mise en œuvre de ce procédé, caractérisé par le fait qu'il comprend: un nucléotide cyclique marqué au moyen d'une enzyme, un anticorps d'un nucléotide cyclique, immobilisé sur un support insoluble, un anhydride d'acide, une amine organique tertiaire, une solution tampon, une solution étalon de nucléotide cyclique, un substrat d'enzyme et un agent d'arrêt de réaction.

Conformément à des formes d'exécution particulière de cet ensemble, celui-ci comprend, en outre, un inhibiteur de la phosphodiestérase et/ou un agent de séparation.

De préférence, l'anticorps du nucléotide cyclique est immobilisé sur un support insoluble.

Enfin, un nucléotide cyclique marqué, faisant partie de l'ensemble de réactifs qui vient d'être mentionné, ce nucléotide cyclique marqué étant caractérisé par le fait qu'il est constitué par un nucléotide cyclique lié avec une enzyme par l'intermédiaire d'un acide dicarboxylique.

La mise en œuvre de l'invention permet d'effectuer le dosage quantitatif de très petites quantités de nucléotides cycliques, avec une grande précision, et, grâce à l'importante amélioration de la sensibilité et du procédé de dosage, d'utiliser une petite quantité d'échantillon, très dilué, ce qui permet d'effectuer, simultanément, plusieurs essais répétitifs de dosage d'un même nucléotide cyclique ou d'une pluralité de nucléotides cycliques différents. En outre, l'invention permet d'effectuer le dosage sur un échantillon de fluide provenant d'un organisme vivant, comme l'urine ou le sang, sans dépro-téination de cet échantillon ainsi que de doser des extraits acides de tissus provenant d'organisme vivant sans nécessiter un traitement préliminaire telle qu'une Chromatographie.

Conformément à un mode opératoire particulièrement avantageux, on peur effectuer l'analyse quantitative de nucléotides cycliques ayant une concentration aussi basse que

0.5 f mole. Il semble qu'aucun procédé de dosage, fondé sur la méthode EIA, permettant l'obtention d'une sensibilité de dosage aussi élevée à l'égard de composés à bas poids moléculaire tels que les nucléotides cycliques n'ait été connu jusqu'à présent.

L'invention sera mieux comprise grâce à la description détaillée qui va suivre des caractéristiques générales ainsi que des détails relatifs au procédé et à l'ensemble de réactifs selon l'invention, ainsi que d'exemples spécifiques de mise en œuvre de l'invention, en se référant au dessin annexé, dans lequel:

la figure 1 est un graphique représentant la courbe d'étalonnage du cAMP obtenue lors de la mise en œuvre du procédé selon l'invention, conformément à l'exemple No 1 ; et la figure 2 est un graphique représentant la courbe d'étalonnage du cGMP obtenue dans l'exemple 2.

Dans la description qui va suivre, le terme «nucléotide cyclique» est utilisé afin de désigner collectivement le cAMP, le cGMP, le cIMP, le cCMP et le cUMP. En outre, le terme «nucléotide cyclique acylé» désigne un dérivé du type 2'-0-acyl d'un nucléotide cyclique.

1. Préparation des échantillons soumis à l'analyse

Il n'y a pas de restriction particulière en ce qui concerne la préparation des échantillons provenant d'organisme vivant. Les fluides provenant d'organisme vivant, tels que le sang, le liquide cérébrospinal et l'urine ne nécessitent aucun traitement préalable et peuvent être directement soumis à l'analyse.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

644 455

4

Cependant, afin d'éviter la décomposition des nucléotides cycliques au cours de l'opération de dosage, résultant de la présence de phosphodiestêrase dans l'échantillon, il est préférable d'ajouter un inhibiteur de phosphodiestêrase, en concentration appropriée, dans l'échantillon. Comme inhibiteur de phosphodiestêrase on peut utiliser, par exemple, l'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) et la thêophiline. On utilise habituellement l'EDTA avec une concentration finale de 5 à 10 mM. Dans le cas d'un échantillon de sang, on utilise comme échantillon soumis à l'analyse la partie surnageante (plasma) obtenue par séparation par centrifugation, de la manière habituelle.

On prépare les échantillons de tissu ordinaire sous forme d'extraits aqueux, par extraction au moyen d'un acide (par exemple, l'acide chlorhydrique, l'acide perchlorique ou l'acide trichloracétique), ou au moyen d'une base (par exemple, un mélange d'hydroxyde de baryum-sulfate de zinc) ou par un solvant organique hydrophile.

2. Réaction d'acylation. Agent d'acylation

Comme agent d'acylation, on utilise un anhydride d'acide et une amine organique tertiaire. Ces composés sont mélangés immédiatement avant d'effectuer la réaction d'acylation.

Comme anhydride d'acide, on utilise un anhydride choisi parmi les anhydrides d'acide dicarboxylique correspondant au résidu d'acide dicarboxylique d'un antigène (résultant de la liaison entre un nucléotide cyclique et une protéine support par l'intermédiaire d'un acide dicarboxylique) utilisé dans la production d'un anticorps correspondant à un nucléotide cyclique ou encore un anhydride d'acide mono ou dicarboxylique semblable à ces acides dicarboxyliques. L'antigène peut être représenté par la formule suivante:

O O Il II

protéine support-C-Z-C-2'-0-nucléotide cyclique

Le symbole Z du reste acide dicarboxylique représente un groupe alkylène ayant 1 à 8 atomes de carbone, un groupe alkynylène ayant 2 à 6 atomes de carbone, un groupe alkyny-lène ayant 2 à 6 atomes de carbone, un groupe cycloalkylène ayant 4 à 10 atomes de carbone, une groupe arylène ayant 6 à 10 atomes de carbone, un groupe oxaalkylène ayant 4 à 8 atomes de carbone, un groupe azaalkylène ayant 4 à 8 atomes de carbone ou un groupement similaire. De préférence, on utilise un anhydride d'acide dans lesquel le reste Z est un groupe alkylène ayant 1 à 8 atomes de carbone et, plus particulièrement, un reste d'acide succinique ou d'acide glutarique dans lesquels le groupement Z est un alkylène ayant respectivement 2 et 3 atomes de carbone. Dans le cas où le reste d'acide dicarboxylique est un reste d'acide succinique, on peut utiliser, comme anhydride d'acide mono ou dicarboxylique analogue à l'anhydride succinique, des anhydrides d'acide comprenant un reste alkyl ou alkylène ayant 1 à 4 atomes de carbone, comme l'anhydride acétique, l'anhydride propionique, l'anhydride butyrique et l'anhydride malonique.

On peut éventuellement utiliser des anhydrides d'acide sous forme d'une poudre, mais, de préférence, on utilise une solution de cet anhydride dans un solvant organique car on obtient ainsi une excellente miscibilité avec les aminés organiques tertiaires et les échantillons soumis à l'analyse ce qui facilite sa manipulation. Comme solvant organique, on peut utiliser un solvant capable de dissoudre les acides de manière stable et n'ayant pas d'effet nuisible sur la réaction antigène-anticorps ainsi que sur l'activité de l'enzyme utilisée pour le marquage. Comme solvant organique, on peut utiliser, par exemple, l'acétone la pyridine, le dioxane, l'acétonitrile, le diméthylsulfoxyde, le diéthylène-glycol-diméthyl-éther, l'héxaméthyl triamide phosphorique, le tétrahydropyrane et l'acétate de méthyl cellosolve. L'acétone convient particulièrement bien.

La quantité d'anhydride d'acide à utiliser dépend de sa nature. Par exemple, dans le cas de l'anhydride succinique, on utilise habituellement 2 à 6 mg et, de préférence, de 3,5 à 4,5 mg par 100 [il d'échantillon. On a constaté que si la quantité d'anhydride d'acide est trop élevée, il se produit des effets indésirables tel que le dépôt de l'anhydride d'acide lors de la réaction d'acylation et il y a un certain risque d'effet défavorable sur les processus subséquents tels que la réaction antigène-anticorps.

Comme amine tertiaire organique, on peut utiliser une amine tertiaire organique ayant la propriété de se mélanger facilement et de manière uniforme avec la solution d'anhydride d'acide dans le solvant organique et avec l'échantillon soumis à l'analyse, de ne pas avoir d'effet défavorable sur la réaction antigène-anticorps et de favoriser la réaction d'acylation. On peut utiliser, par exemple, comme amine tertiaire organique des aminés tertiaires aliphatiques telles que la triéthylamine, la tri-n-butylamine et des aminés similaires, et des bases hétérocycliques telles que 4-morpholino-N,N'-dicyclohéxyl-carboxamidine, la pyridine, la trimêthylpyri-dine, la quinoline, le l,8-diazabicyclo-[5,4,0]-undécène-7 et des composés du même genre, la triéthylamine et la 4-morpholino-N,N'-dicyclohexyl carboxamidine étant les bases que l'on utilise de préférence. En ce qui concerne la quantité d'amines tertiaires organiques utilisée, elle est habituellement, par exemple dans le cas de la triéthylamine, de 15 jil ou moins, et de préférence de 10 ul ou moins, pour 100 ul d'échantillon. Une quantité trop élevée d'amines tertiaires organiques provoque l'élévation de la valeur du pH et nuit à la réaction d'acylation.

2-2: Conditions dans lesquelles on effectue la réaction d'acylation:

On ajoute à l'échantillon soumis à l'analyse l'agent d'acylation préparé par mélange de l'anhydride d'acide et de l'amine tertiaire organique et l'on provoque la réaction d'acylation. Il n'y a pas de limitation particulière en ce qui concerne les conditions dans lesquelles on effectue cette réaction. Par exemple, dans le cas d'une réaction de succinylation, il suffit généralement d'une durée de réaction de 5 à 60 minutes à la température ambiante.

Réaction antigène-anticorps effectuée en concurrence:

Nucléotide cyclique marqué au moyen d'une enzyme:

Une enzyme utilisable pour le marquage de l'antigène,

lors de la mise en œuvre de la méthode EIA, présente, de préférence, les propriétés suivantes:

L'enzyme elle-même a une grande spécificité et elle est soluble.

L'échantillon soumis à l'analyse ne contient pas la même enzyme.

L'échantillon soumis à l'analyse ne renferme pas le substrat, une substance inhibitrice de l'action de l'enzyme ou une autre substance susceptible de jouer un rôle perturbateur.

L'échantillon soumis à l'analyse ne renferme pas une enzyme agissant en concurrence sur le même substrat.

L'enzyme est stable pendant une longue durée dans les conditions usuelles de conservation, à l'état sec ou en solution.

La réaction enzymatique forme une substance pouvent être détectée facilement et, en outre, la détection de la substance ainsi produite n'est pas perturbée par une autre substance présente en même temps qu'elle dans le milieu d'analyse.

L'enzyme présente une activité élevée après sa liaison avec le ligand.

Comme enzyme capable de satisfaire les conditions indi5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

644 455

quées ci-dessus, de manière relativement bonne, et d'être utilisée dans un procédé d'analyse conforme à la méthode EIA, on peut, par exemple, citer les enzymes suivantes: la ß-D-galactosidase, la Peroxydase, la phosphatase alcaline, la glucose oxydase, la glucoamylase, le lysozime, la malate déhydrogénase, la glucose-6-phosphate déhydrogénase et l'acé-thylcholine estérase. Outre ces enzymes, on peut également envisager l'utilisation de la lipase, de la ß-glucuronidase, de l'hyaluronidase, de la ß-glucosidase, etc. Récemment, un procédé d'analyse utilisant également un fragment actif d'enzyme a fait l'objet d'une publication (dans la demande de brevet japonais publiée No. 9316/1978). Parmi ces enzymes, c'est la ß-D-galactosidase qui convient le mieux, car son utilisation permet de détecter avec la plus grande sensibilité les produits formés lors de la réaction enzymatique. En outre, on dispose d'un procédé de préparation de cet enzyme dans lequel l'enzyme ainsi obtenue a une grande stabilité et une activité spécifique élevée.

On effectue la liaison d'un nucléotide cyclique et d'une enzyme destinée au marquage de l'antigène par l'intermédiaire d'un acide dicarboxylique comme dans le cas d'un antigène utilisé pour la production d'un anticorps. Conformément au procédé généralement utilisé pour effectuer cette liaison, on commence par lier, par l'intermédiaire d'un groupe ester de liaison, le grope 2'-hydroxyl du nucléotide cyclique et l'un des groupes carboxyles de l'acide dicarboxylique, cette opération étant effectuée par réaction d'acylation, de la manière usuelle, et on provoque ensuite la condensation de l'autre groupe carboxyle libre du reste d'acide dicarboxylique de ce nucléotide cyclique acylé avec le groupe amino de l'enzyme utilisé pour le marquage de l'antigène.

Il n'y a pas de limitation spéciale en ce qui concerne le procédé de condensation du nucléotide cyclique acylé et de l'enzyme utilisée pour le marquage de l'antigène. On peut utiliser tout procédé approprié ne diminuant pas l'activité enzymatique de l'enzyme utilisée pour le marquage. Comme exemple d'un tel procédé, on peut citer, par exemple, le procédé à l'anhydride acide qui comprend la mise en réaction d'un chloroformate d'alkyle, tel que le chloroformate d'éthyl-eou le chloroformate d'isobutyle, avec le nucléotide cyclique acylé, en présence d'une base telle que la triéthylamine, de manière à former des anhydrides mixtes, et la mise en réaction de ces derniers avec l'enzyme.

Comme autre exemple spécifique d'un procédé de condensation approprié, on peut mentionner le procédé au car-bodiimide selon lequel on fait réagir, en présence d'un réactif du type carbodiimide, le nucléotide cyclique acylé et l'enzyme utilisée pour le marquage de l'antigène. Comme réactif du type carbodiimide, on peut utiliser, par exemple, le dicyclo-hexylcarbodiimide (DCC), le l-éthyl-3-(3-diméthylaminopro-pyle)-carbodiimide (EDC), le l-éthyl-3-(3-diéthylaminopro-pyle)-carbodiimide, le l-cyclohéxyl-3-(2-morpholinoéthyle)--carbodiimide, le l-cyclohéxyl-3-(4-diéthylamino-cyclohéxyl)--carbodiimide et le tétrafluoroborate de N-Méthyl-N,N'-di-tert-butylcarbodiimidium. L'utilisation d'autres agents de condensation que ceux qui viennent d'être énumérés, par exemple, du N-ethyl-5-phényl-isoxazolium-3'-sulfonate (réactif de Woodward K) n'est pas à exclure à condition qu'un tel agent de condensation n'exerce pas des effets allant à l'encontre du but de l'invention. On choisit les conditions de la réaction de condensation conformément à la pratique habituelle.

On peut également recourir à un procédé selon lequel on utilise la réaction de Ugi que l'on effectue en ajoutant un isocyanure tel que le 3-(diméthylamino) propyl isocyanure et un aldéhyde, tel que l'acétaldéhyde, ou une cétone à un mélange en solution du nucléotide cyclique acylé et de l'enzyme utilisée pour le marquage de l'antigène.

Anticorps du nucléotide cyclique

On prépare l'anticorps du nucléotide cyclique par un procédé qui comprend l'immunisation d'animaux tels que les lapins, les chevaux, les moutons, les bovins et les rats par un antigène produit en provoquant la liaison entre le nucléotide cyclique et une protéine support, par l'intermédiaire d'un acide dicarboxylique, de la manière décrite ci-dessus. Comme protéine support, on peut utiliser, par exemple, l'albumine du sérum, la globuline, l'hémocyanine, l'ovalbumine et le fibri-nogène. Parmi ces protéines, c'est l'albumine du sérum que l'on utilise généralement. On connaît par exemple le procédé selon lequel on provoque la liaison entre le nucléotide cyclique succinylé et l'albumine de sérum humaine et on utilise le produit ainsi obtenu pour l'immunisation de lapins, de chevaux, de bovins, etc (comme décrit dans la publication suivante: The Journal of Biological Chemistry, vol. 247, No 4, pages 1106-1113 [1972]). On utilise comme anticorps un antisérum obtenu de cette façon.

On peut également utiliser un anticorps purifié et isolé obtenu à partir d'un anti-sérum. En outre, on peut également utiliser une fraction active d'anticorps tel qu'un fragment F (a b')2 obtenu par traitement enzymatique, par exemple par la pepsine, d'un anticorps et un fragment F a b' obtenu par traitement de l'anticorps par un agent réducteur tel que la 2-mer-captoéthylamine.

Pour l'utilisation dans le procédé EIA en phase liquide, on prépare l'anticorps sous forme de solution dans une solution tampon appropriée. Par contre, pour l'utilisation dans un procédé EIA en phase solide, on prépare l'anticorps sous forme immobilisée sur un support soluble. Le procédé en phase solide présente des avantages découlant de la facilité de la mise en œuvre de l'analyse.

Comme support insoluble pour l'immobilisation de l'anti- , corps, on peut utiliser n'importe lequel des supports utilisés habituellement pour la mise en œuvre de la méthode EIA. Comme exemple spécifique de tels supports insolubles, on peut citer les silicones, le verre, les céramiques, les polystyrènes, les Polyacrylamides réticulés, les matières plastiques, la carboxyméthyl-cellulose, la diéthyl-aminoéthyl cellulose, la cellulose, le dextrane réticulé et le papier filtre. Au besoin, on peut utiliser le support après avoir revêtu sa surface au moyen d'un dérivé organique de silane, tels que le y-mercaptopropyl-triméthoxysilane, le y-aminopropyltriéthoxysilane, le N-ß-aminoéthyl-Y-aminopropyltriméthoxysiIane, le N-ß-amino-éthyl-a-méthyl-y-aminopropyldiméthoxyméthylsilane et le N-bis^-hydroxyéthyl-Y-aminopropyltriéthoxysiiane. Il n'y a pas de limitation particulière en ce qui concerne la forme du support, celui-ci pouvant être, par exemple, sous forme de granulés, de particules, de tiges, de feuilles, de sphères, etc.

L'immobilisation de l'anticorps sur le support insoluble peut être effectuée de toute manière connue appropriée. Par exemple, on peut utiliser un procédé consistant à provoquer l'adsorption directe et physique de l'anticorps sur le support insoluble ou bien un procédé selon lequel on lie l'anticorps au moyen d'un agent de liaison chimique bi-fonctionnel tels que le glutaraldéhyde, le sulfure de 2,2-dipyridyle ou le p,-p'-difluoro-m,m'-dinitrophényl sulfone..

Il est particulièrement avantageux d'utiliser un support revêtu obtenu par absorption physique de l'anticorps sur un support à base de silicone ou bien un support revêtu par un silane organique. En effet, dans ce cas, la liaison non spécifique du ligand enzymatique lié est inhibée, la quantité d'anticorps immobilisé sur le support est constante et, en même temps, l'immobilisation est effectuée de manière très stable ce qui permet l'obtention d'une excellente sensibilité, précision et reproductibilité lors du dosage.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

644 455

6

Réaction antigène-anticorps

Après la réaction d'acylation, on dilue habituellement l'échantillon soumis à l'analyse avec un facteur de dilution de 5 à 6 fois, au moyen d'une solution tampon. Pour la préparation d'une solution étalon de nucléotide cyclique, on acyle la solution étalon.de base puis on la dilue successivement, de manière multiplicative, au moyen d'une solution tampon et on utilise pour le dosage les solutions ainsi obtenues.

Comme solution tampon utilisable pour effectuer les dilutions, on peut utiliser toute solution tampon permettant le déroulement stable de la réaction antigène-anticorps, sans qu'il y ait de limitation spéciale en ce qui concerne la nature de cette solution tampon. On peut, par exemple, utiliser une solution tampon de phosphate de sodium 0,1 M (pH 6,9), qui contient 0,1 M de chlorure de sodium, 1 mM de chlorure de magnésium et 0,1 à 3% de sérum bovin. Cependant, on peut également utiliser d'autres tampons tels que le tampon tris-hydrochloridrique, le tampon à l'acétate, le tampon au citrate-phosphate et le tampon à l'imidazole qui sont utilisables pour la mise en œuvre de la méthode EIA.

La réaction antigène-anticorps est effectuée par adjonction de l'échantillon soumis à l'analyse et d'une quantité spécifique du nucléotide cyclique marqué à l'enzyme, ces substances étant ajoutées soit simultanément soit l'une après l'autre, à une quantité spécifique d'anticorps immobilisés sur un support insoluble ou d'anticorps solubles.

Les conditions de réaction varient en fonction de paramètres tels que la nature de l'agent d'acylation utilisé ainsi que la manière de préparer l'anticorps mais, habituellement, on effectue cette réaction à une température de 1 à 5 °C, pendant une durée de 6 à 48 heures.

On choisit, bien entendu, le nucléotide cyclique marqué à l'enzyme ainsi que l'anticorps en fonction de la nature du nucléotide cyclique à doser. Dans le cas où l'on désire effectuer simultanément l'analyse d'une pluralité de nucléotides cycliques dans un même lot, on utilise un mélange de nucléotides cycliques correspondants aux nucléotides cycliques à doser, marqués au moyen d'enzymes différentes de façon à effectuer concurremment chacune des réactions antigène-anticorps correspondant à chacun des nucléotides cycliques.

Mesure de l'activité enzymatique

Après la fin de la réaction antigène-anticorps, on sépare, de la manière habituelle, le nucléotide cyclique marqué à l'enzyme qui s'est lié à l'anticorps (cette fraction étant désignée ci-dessous par la lettre «B») du nucléotide cyclique marqué à l'enzyme qui ne s'est pas lié à l'anticorps (cette fraction étant désignée ci-dessous par la lettre «F») et on mesure l'activité enzymatique de l'une ou l'autre de ces fractions.

Dans le cas de la variante de mise en œuvre du procédé en phase solide, la séparation des fractions «B» et «F» peut être convenablement effectuée par un procédé tel que l'aspiration, la décantation ou la fïltration. Dans le cas de la variante de mise en œuvre du procédé en phase liquide, on effectue la séparation par un procédé selon lequel on utilise un agent de séparation approprié. Comme procédé de séparation on peut utiliser, par exemple, le procédé au double anticorps qui comprend la préparation d'un deuxième anticorps de l'anticorps du nucléotide cyclique, ou du fragment F (a b'> ou F a b'

dans un autre animal et l'utilisation du second anticorps ainsi obtenu pour provoquer la précipitation de la fraction «B» ainsi qu'un procédé de séparation par adjonction de sel, en utilisant le sulfate d'ammonium, pour la séparation des fractions «B» et «F».

Pour la mesure de l'activité enzymatique, on peut utiliser tout procédé approprié connu, compatible avec le but de l'invention, ce procédé étant choisi en fonction de la nature de l'enzyme utilisé pour le marquage de l'antigène. Par exemple, on peut utiliser le procédé décrit dans la publication suivante: George Guibault; Handbook of Enzymatic Methods of Analysis; Clinical and Biochemical Analysis, Vol. 4, Marcel Dekker, Inc., 1976.

Dans le cas où l'on utilise la ß-D-galactosidase comme enzyme pour le marquage de l'antigène, on peut utiliser un procédé selon lequel on mesure l'intensité de fluorescence de la 4-méthylumbelliférone formée par réaction enzymatique, en utilisant le 4-méthylumbelliféryl-P-D-gaIactoside comme substrat d'enzyme, cette mesure étant effectuée au moyen d'un fluoromètre à 360 nm pour l'excitation et 450 nm pour l'émission. Comme autre méthode de dosage de la ß-D-galactosidase par fluorescence, on connaît, par exemple, le procédé selon lequel on effectue la mesure de la fluorescence du 6-hydroxyfluorane, en utilisant comme substrat le 6-hydroxy-fluorane-ß-D-galactopyranoside, et le procédé selon lequel on mesure la fluorescence de la fluorescéine en utilisant comme substrat le fluoresceinodi-ß-D-galactopyranoside. On connaît en outre des procédés spectrophotométriques tel que celui selon lequel on utilise comme substrat l'o-nitrophényl^-D-galactoside et on soumet à la colorimêtrie l'o-nitrophénol produit par la réaction enzymatique.

Les valeurs de mesure obtenues en utilisant la solution étalon de nucléotide cyclique permettent d'obtenir une courbe d'étalonnage permettant de déduire la quantité de nucléotide cyclique contenue dans l'échantillon dosé.

Ensemble de réactifs pour l'analyse quantitative

Afin de permettre la mise en œuvre du procédé selon l'invention die manière simle et pratique, on combine un certain nombre de réactifs indispensables pour la mise en œuvre de ce procédé sous forme d'un ensemble de réactifs ou trousse d'analyse. Pour la mise en œuvre du procédé conformément à la variante selon laquelle on opère en phase solide, cet ensemble de réactifs ou trousse d'analyse peut être, par exemple, composé de la combinaison des réactifs suivants:

a) nucléotide cyclique marqué au moyen d'une enzyme.

b) anticorps de nucléotide cyclique immobilisé sur un support insoluble.

c) anhydride d'acide d) amine tertiaire organique e) solution tampon f) solution étalon de nucléotide cyclique g) substrat d'enzyme h) agent d'arrêt de réaction.

Si nécessaire, on peut également combiner à cet ensemble i) un inhibiteur de phosphodiestêrase et d'autres réactifs.

Dans le cas d'une trousse d'analyse destinée au dosage d'un seul nucléotide cyclique, on choisit les réactifs a), b) et f) de façon que les nucléotides cycliques de ces réactifs soient identiques au nucléotide cyclique à analyser. Dans le cas d'une trousse d'analyse destinée au dosage simultané d'une pluralité de nucléotides cycliques, le réactif a) se présentera, soit sous forme d'une pluralité de réactifs séparés pour chacun des nucléotides cycliques à doser, soit sous forme d'un réactif unique renfermant, en mélange, les nucléotides cycliques marqués correspondant à tous les nucléotides cycliques à doser. Ceci s'applique également au cas des réactifs b) et f). Dans le cas où l'on désire doser simultanément une pluralité de nucléotides cycliques dans un seul et même lot, il y a lieu de choisir les enzymes utilisées pour le marquage, dans le réactif a) en fonction de la nature des nucléotides cycliques à analyser. Les substrats d'enzyme des réactifs g) doivent être choisis en fonction de la nature des enzymes utilisées pour le marquage. La solution tampon du réactif e) peut également se présenter dans des récipients séparés correspondant respectivement à une solution tampon distinée à être utilisée pour effectuer la dilution et une solution tampon à utiliser pour le

5

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

644 455

lavage. Comme agent d'arrêt de réaction du réactif h), on peut utiliser toute substance appropriée capable de mettre fin à la réaction enzymatique, cette substance étant convenablement choisie en fonction des caractéristiques de l'enzyme utilisée pour le marquage. Par exemple, on peut utiliser des réactifs alcalins tels que le carbonate de sodium et une solution hydroxyde de sodium dans la glycine, ainsi que des réactifs acides tels que l'acide chlorhydrique.

Dans un ensemble de réactifs, ou trousse d'analyse, pour la mise en œuvre du procédé conformément à la variante selon laquelle on opère en phase liquide, on remplace le réactif b) par un anticorps soluble et on ajoute un agent de séparation, désigné par l'appellation réactif b'), à l'ensemble de réactifs.

On va maintenant donner des exemples, non limitatifs, de mise en œuvre du procédé selon l'intention.

Exemple 1. Dosage du cAMP

Formation de cAMP succinylé marqué à la ß-D-galactosi-dase. On dissout 4,29 mg de 2'-0-succinyI-cAMP dans 500 (il d'une solution tampon de phosphate de sodium 0,01 M (pH 6,0) renfermant 0,15 M de chlorure de sodium, 1 mM de chlorure de magnésium (désigné ci-dessous par le terme de «solution tampon A»). A la solution résultante, on mélange 50 p.1 (5 x 10~5 mol) de ß-D-galactosidase (fabriqué par la société Sigma Inc.) puis on y ajoute 5 mg de l-éthyl-3-(3-diméthyl-aminopropyl) carbodiimide et l'on fait réagir le mélange à 4 °C pendant 3 heures. On fait dialyser le liquide réactionnel contre la solution tampon A de façon à préparer le cAMP succinylé marqué à la ß-D-galactosidase.

Préparation d'un anticorps immobilisé sur un disque de silicone.

En utilisant un poinçon, on prépare de petits disques de silicone (ayant chacun un diamètre de 6 mm, une épaisseur de 1 mm et un poids de 33,0 à 38,0 mg) à partir d'une feuille de silicone. On lave soigneusement ces disques dans une solution de lavage du type Haemo-sol, de l'ean chaude et de l'eau distillée, puis on les sèche, on les pèse et on les divise en 11 groupes de poids avec des différences de 0,5 mg entre ces groupes.

On immerge un groupe de disques de silicone dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,05 M de sérum sanguin de lapin anti-succinyl-cAMP et l'on prolonge l'immersion à 4 °C, pendant 24 heures. On lave ensuite les disques de silicone ainsi traités au moyen d'une solution tampon de phosphate de sodium 0,01 M, ayant un pH de 6,9, et contenant 0,1% d'albumine de sérum sanguin bovin, 1 mM de chlorure de mangésium et 0,1 M de chlorure de sodium (désigné ci-dessous par le terme de solution tampon B).

Préparation de l'agent de succinylation:

On dissout 200 mg d'anhydride succinyque dans 4,5 ml d'acétone et on mélange 0,5 ml de triéthylamine à la solution ainsi obtenue.

Préparation d'une solution étalon de cAMP succinylé:

On mélange intimement 4 ml du tampon B 0,1 Mn, 0,5 ml d'agent de succinylation et 0,5 ml d'eau bi-distillée, de manière à préparer une solution tampon destinée à être utilisée pour diluer la solution étalon.

On place 50 jil d'une solution étalon de base de cAMP (320 p mol/ml) dans un petit tube à essai (No I) et on ajoute 50 ,ul d'agent de succinylation à cette solution étalon de base de manière à provoquer le mélange de cet agent et de cette solution. On maintient la solution ainsi obtenue à la température ambiante pendant 10 minutes puis on y ajoute 400 ul de tampon B 0,1 M de manière à préparer une solution étalon de cAMP succinylé.

On place dans neuf petits tubes à essai (Nos II à X) 250 p.1 de solution tampon destinée à la dilution de la solution étalon. On ajoute dans le tube à essai No II 250 jil de solution étalon de cAMP succinylé et on mélange cette solution à la solution tampon. Après quoi, on effectue successivement des dilutions multiplicatives de façon à préparer des solutions étalon de cAMP succinylé ayant les concentrations respectives suivantes (100 ul):

3200 f mol (No I) ' 1600 f mol (No II)

800 f mol (No III) 400 f mol (No IV)

200 f mol (No V) 100 f mol (No VI)

50 f mol (No VII) 25 f mol (No III)

12,5 f mol (No IX) 6,25 f mol (No X)

Préparation et succinylation des échantillons soumis à l'essai:

On mélange du sang humain complet à une solution aqueuse de EDTA 500 mM dans une proportion de 1 ml de celui-ci pour 10 ul de cette dernière. On soumet immédiatement le mélange ainsi obtenu à une centrifugation à 4 ° C et 2000 tours par minute, pendant 5 minutes, et l'on prélève et l'on introduit dans un tube à essai 50 ul de la partie surnageante ainsi obtenue. On mélange 50 jil de l'agent de succinylation à cette partie surnageante et l'on maintient le mélange ainsi obtenu à la température ambiante, pendant 10 minutes. Après quoi, on ajoute au mélange 400 ml de tampon B 0,1 M.

Mode opératoire du dosage:

On prépare, de la manière suivante, des petits tubes à essai.

Solution étalon (Nos I à X): 20 tubes à essai, Nos 1, 1' à 10, 10'.

Pour la solution de référence 0:2 tubes à essai, Nos 11,

11'.

Pour la solution témoin: 2 tubes à essai, Nos 12, 12'.

Pour le dosage de l'échantillon: 2 tubes à essai, Nos 13,

13'.

Dans chacun des petits tubes à essai autres que ceux qui sont destinés à recevoir le témoin, on place un disque de silicone revêtu d'anticorps préparé de la manière décrite ci-des-sus. On place dans chacun des petits tubes à essai destinés à contenir la solution témoin, un petit morceau de silicone ayant le même poids que ces disques mais ayant été soumis uniquement au traitement avec le tampon B. On ajoute 100 jj.1 de la solution tampon de dilution de la solution étalon dans chacun des tubes à essai destinés à recevoir la solution de référence 0 (Nos 11,11') ainsi que ceux qui sont destinés à recevoir la solution témoin (Nos 12, 12') et l'on ajoute 100 ,ul de chacune des solutions étalon de cAMP succinylé (Nos I à X) dans chacun des tubes à essai destinés à la solution étalon (Nos 1, 1' à 10, 10'). On ajoute 10 ml d'échantillons succinylés soumis au dosage dans chacun des tubes à essai destinés à l'échantillon soumis au dosage (Nos 13, 13').

On ajoute 10 ml d'une solution diluée de cAMP succinylé marqué à la ß-D-galactosidase dans chacun des tubes à essai et l'on maintient ceux-ci à 4 °C pendant 24 heures. Après quoi, on prélève le liquide réactionnel dans chacun des tubes à essai, au moyen d'une pipette et on lave le disque ou le morceau de silicone par adjonction de 1 ml de tampon B 0,01 M dans chacun de ces tubes. On prélève ensuite le liquide de lavage au moyen d'une pipette et l'on répète ce processus de lavage.

On transfère ces disques ou morceaux de silicone dans un tube à essai de dimension moyenne et l'on ajoute 100 jj.1 de tampon B 0,01 M à chacun de ces tubes. Puis on mélange 50 ul de 4-méthylumbelliféryl^-D-galactoside au contenu de chacun des tubes et l'on soumet le mélange ainsi obtenu dans chacun de ces tubes à une incubation à 30 °C, pendant 30 minutes.

On ajoute 2,5 ml de solution d'hydroxide de sodium 0,1 M, dans la glycine, dans chacun des tubes à essai, de manière à mettre fin à la réaction enzymatique. On mesure ensuite, au

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

644 455

8

moyen d'un fluoromètre, à 360 nm pour l'excitation et 450 nm pour l'émission, la 4-méthylumbelliférone libérée. Les résultats obtenus sont indiqués au tableau 1. La courbe d'étalonnage est représentée à la figure I.

Tableau 1

Echantillon soumis Activité Activité de la au dosage spécifique ß-D-galactosidase

(%) (p. unité/tube)

celle qui est décrite dans l'exemple 1 mais en utilisant du 2'-0-succinyl-cGMP au lieu de 2'-0-succinyl-cAMP, du sérum sanguin de lapin anti-succinyl-cGMP au lieu de sérum sanguin de lapin anti-succinyl-cAMP ainsi qu'une solution 5 étalon de base de cGMP au lieu d'une solution étalon de base de cAMP. Les résultats des mesures sont indiqués au tableau 2. La courbe d'étalonnage est représentée à la figure 2.

Tableau 2

Echantillon soumis Activité Activité de la

à l'essai spécifique ß-D-galactosidase

(%) (u unité/tube)

Témoin 0 -

Solution de référence 0 100 150 Solutions étalons:

6,25 f mol 94 141

12,5 85 128

25 73 110

50 64 96

100 49 74

200 37 56

400 27 41

800 17 26

1600 11 17

3200 9 14

Echantillon de sang complet 68 102

10

Témoin

0

-

Solution de référence 0

100

178

Solutions étalons:

6,25 f mol

93

166

12,5

85

151

25

74

132

50

62

110

100

50

89

200

38

68

400

26

46

800

18

32

1600

11

20

3200

8

14

Echantillon de sang entier

35

62

Exemple 2. Dosage du cGMP

On effectue le dosage du cGMP de la même façon que

G

2 Blatt Zeichnungen

Claims

644 455

1. Procédé d'analyse quantitative des nucléotides cycliques, caractérisé par le fait qu'il comprend les opérations suivantes: acylation d'un nucléotide cyclique dans un échantillon à doser, au moyen d'un agent d'acylation, mise en réaction concurrentielle du dérivé acylé de nucléotide cyclique ainsi obtenu et d'une quantité spécifique d'un nucléotide cyclique marqué au moyen d'une enzyme, avec une quantité spécifique d'un anticorps du nucléotide cyclique correspondant, le nucléotide marqué étant formé par liaison, par l'intermédiaire d'un acide dicarboxylique, d'un nucléotide cyclique, correspondant à ce dérivé acylé, avec une enzyme, séparation du nucléotide cyclique marqué qui s'est lié à l'anticorps et du nucléotide cyclique marqué non lié à l'anticorps, et mesure de l'activité enzymatique de l'une de ces deux fractions de nucléotide cyclique, de manière à en déduire la quantité de nucléotide cyclique contenue dans l'échantillon à doser.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit nucléotide cyclique est choisi dans le groupe comprenant le monophosphate cyclique d'adénosine-3',5', le monophosphate cyclique de guanosine-3',5', le monophosphate cyclique d'inosine-3',5', le monophosphate cyclique de cytidine-3',5', et le monophosphate cyclique d'uridine-3'-5'.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'enzyme est choisie dans le groupe comprenant la ß-D-galactosidase, la Peroxydase, la phosphatase alcaline, la glucose oxydase, la glucoamylase, la lysozyme, la malate dé-hydrogénase, la glucose-6-phosphate déhydrogénase, l'acétyl-choline estérase, la lipase, la ß-glucuronidase, l'hyaluroni-dase, la ß-glucosidase et des parties actives provenant de ces enzymes.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'agent d'acétylation est une combinaison d'un anhydride d'acide et d'une amine organique tertiaire.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'amine organique tertiaire est choisie parmi les aminés tertiaires aliphatiques et les bases hétérocycliques.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'anticorps est choisi parmi les anticorps fixés sur un support insoluble et les anticorps solubles.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le support insoluble est choisi dans le groupe comprenant les silicones, le verre, les céramiques, les polystyrènes, les Polyacrylamides réticulés, les matières plastiques, la carboxy-méthylcellulose, la diéthyl-aminoéthyl cellulose, la cellulose, le dextrane réticulé, le papier filtre et les supports revêtus de dérivé organique de silane.

8. Ensemble de réactifs pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend: un nucléotide cyclique marqué au moyen d'une enzyme, un anticorps d'un nucléotide cyclique immobilisé sur un support insoluble, un anhydride d'acide, une amine organique tertiaire, une solution tampon, une solution étalon de nucléotide cyclique, un substrat d'enzyme et un agent d'arrêt de réaction.

9. Ensemble selon la revendication 8, caractérisé par le fait qu'il comprend, en outre, un inhibiteur de la phosphodi-estérase et/ou un agent de séparation.

10. Ensemble selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le nucléotide cyclique auquel correspond l'anticorps est choisi dans le groupe comprenant le monophosphate cyclique d'adénosine-3',5', le monophosphate cyclique de guanosine-3',5', le monophosphate cyclique d'inosine-3',5', le monophosphate cyclique de cytidine-3',5', et le monophosphate cyclique d'uridine-3',5'.

11. Ensemble selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le support insoluble sur lequel est immobilisé l'anticorps est choisi dans le groupe comprenant les silicones, le verre, les céramiques, les polystyrènes, les Polyacrylamides réticulés, les matières plastiques, la carboxyméthylcellulose, la diéthyl-aminoéthyl cellulose, la cellulose, le dextrane réticulé, le papier filtre et les supports revêtus de dérivé organique de silane.

12. Ensemble selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le nucléotide cyclique marqué est constitué par un nucléotide cyclique lié avec une enzyme par l'intermédiaire d'un acide dicarboxylique.

13. Ensemble selon la revendication 12, caractérisé par le fait que le nucléotide lié avec l'enzyme est choisi dans le groupe comprenant le monophosphate cyclique d'adénosine-3',5', le monophosphate cyclique de guanosine-3',5', le monophosphate cyclique d'inosine-3',5'- le monophosphate cyclique de cytidine-3',5', et le monophosphate cyclique d'uridine-3',5'.

14. Ensemble selon la revendication 12, caractérisé par le fait que l'enzyme est choisie dans le groupe comprenant la ß-D-galactosidase, la Peroxydase, la phosphatase alcaline, la glucose oxydase, la glucoamylase, la lysozyme, la malate déhydrogénase, la glucose-6-phosphate déhydrogénase, l'acétyl-choline estérase, la lipase, la ß-glucuronidase, l'hyaluroni-dase, la ß-glucosidase et des parties actives provenant de ces enzymes.