CH645405A5

CH645405A5 - Verfahren zur gewinnung eines mikroorganismenstammes.

Info

Publication number: CH645405A5
Application number: CH389779A
Authority: CH
Inventors: Christopher Ball; John Sheriff Collins; Paul Frederick Hamlyn
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1978-04-26
Filing date: 1979-04-25
Publication date: 1984-09-28
Also published as: DK169879A; BE875844A; FR2424320B1; FR2424320A1; NL7903251A; JPH0348792B2; IT7948848A0; JPS54163880A; GB2021640A; IT1116868B; GB2021640B; US4368263A; DE2916736A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung der Fungus-Species Acremonium chrysogenum (früher als Cephalosporium acremonium bezeichnet), die für die Herstellung von Cephalosporinen verwendet werden kann. Sie betrifft weiterhin den verfahrensgemäss hergestellten Stamm und seine Verwendung zur Herstellung von Cephalosporinen.

Cephalosproin C wird kommerziell durch Kultivieren von A. chrysogenum und Extrahieren des Cephalosporins C aus dem Kulturmedium gewonnen. Obgleich andere Fungus-Spezies ebenfalls Cephalosporin C erzeugen können, sind sie für den vorliegenden Zweck nicht von kommerzieller Bedeutung. Weiterhin ist bekannt, dass auch andere Cephalosporine, wie Desacetyl- und Desacetoxy-Cephalosporin C durch Kultivieren von A. chrysogenum gewonnen werden können.

Es sind bereits erhebliche Anstrengungen unternommen worden, um Stämme von A. chrysogenum, die hinsichtlich der Cephalosporinherstellung optimale Eigenschaften zeigen, zu selektieren. Die wichtigste Eigenschaft ist natürlich die Herstellung des gewünschten Cephalosporins in hohen Ausbeuten. Jedoch sind auch andere Eigenschaften eines Stammes, der für ein kommerzielles Verfahren verwendet wird, wünschenswert, wie z.B. gute Sporenbildung und eine hohe Wachstumgsgeschwindigkeit in Agaroberflächenkultur oder Submerskultur.

Die Selektion von wünschenswerten Stämmen aus natürlichen oder induzierten Mutanten ist ein langsames Verfahren. Ein Hauptgrund für die langsame Entwicklung solcher Arbeiten beruht auf der Wahrscheinlichkeit, dass durch die Selektion bezüglich einer gewürischten Eigenschaft (wie z.B. die Herstellung von Cephalosporin in hohen Ausbeuten) eine andere gewünschte Eigenschaft (wie z.B. hohe Wachstumsgeschwindigkeit) nachteilig beeinflusst wird. Somit wäre es äusserst wünschenswert, wenn man in der Lage wäre, verschiedene Stämme von A. chrysogenum zu kreuzen, um einen verbesserten Stamm zu erhalten, der die besten Eigenschaften der beiden Mutterstämme auf sich vereinigt.

Die Kreuzung verschiedener Stämme von A. chrysogenum ist äusserst schwierig. Diese Spezies hat hauptsächlich einkernige Hyphenkompartments und weist keinen Geschlechtszyklus auf. Es wurde behauptet (Nuesch et al. Gen. Ind. Micro-org. [1973] 1,309 bis 334), dass gelegentlich Heterokaryone in A. chrysogenum synthetisiert werden können durch gemischte Kulturen von keimenden Konidien und dass Abkömmlinge einer Kernverschmelzung entweder direkt oder vorzugsweise nach vorhergehender Selektion von Heterozygoten erhalten werden können. Dieses Verfahren ist erfah-rungsgemäss jedoch sehr mühsam, unergiebig und unverläss-lich, insbesondere dann, wenn man versucht, divergierende Stämme zu kreuzen. Obwohl dieses Verfahren von theoretischem Interesse ist, stellt es keinen gangbaren Weg dar für die Erzeugung verbesserter Stämme von A. chrysogenum im Hinblick auf die kommerzielle Herstellung von Cephalosporinen.

Es wurde nun gefunden, dass verschiedene Stämme von A. chrysogenum und selbst Stämme stark divergierender Natur erfolgreich durch Protoplastverschmelzung gekreuzt werden können, um rekombinierte Segreganten oder andere Kernverschmelzungsprodukte zu erzeugen.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Erzeugung eines verbesserten Stammes von A. chrysogenum, welcher zur Erzeugung eines Cephalosporins befähigt ist. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Mutterstämme von A. chrysogenum der Protoplast- und Kernverschmelzung unterwirft und den verbesserten Stamm aus der Nachkommenschaft (oder einem Mutanten davon) selektiert.

Der Ausdruck «verbesserter Stamm» steht für einen Stamm, der verglichen mit den Mutterstämmen Verfahrensvorteile bei der Herstellung von Cephalosporinen aufweist. Beispiele solcher Verfahrensvorteile schliessen eine verbesserte Sporenbildung, Wachstumsgeschwindigkeit oder Cephalosporingehalt, verbesserte Stabilität, verbesserte Wachstumsmerkmale auf verschiedenen Medien, erleichterte Extraktion usw. ein.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man den verbesserten Stamm von A. chrysogenum, der durch Protoplast- und Kernverschmelzung von Mutterstämmen von A. chrysogenum und Selektion des verbesserten Stamms aus der Nachkommenschaft (oder einem Mutanten davon) hergestellt worden ist, kultiviert und ein Cephalosporin aus dem Kulturmedium isoliert.

Die Mutterstämme von A. chrysogenum, die zur Erzeugung des verbesserten Stammes dienen sollen, können so ausgewählt werden, dass sie gemeinsam in dem Kreuzungspro5

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

645 405

dukt gewünschte Eigenschaften erzeugen (d.h. in den Kernverschmelzungsprodukten) wie z.B. hohe Ausbeute an Cephalosporin, gute Wachstumsgeschwindigkeit und gute Sporenbildung. Dies ist jedoch nicht so wesentlich und manchmal weist die Nachkommenschaft eine vorteilhafte Eigenschaft auf, die bei den Mutterstämmen nicht gefunden werden kann.

Es ist nicht notwendig, jedoch wünschenswert, die Mutterstämme in irgendeiner Weise zu behandeln, um die Selektion der Nachkommenschaft zu erleichtern. Beispielsweise können die Mutterstämme genetisch markiert werden, wie z.B. mit auxotrophen Markierungsmitteln. Die Verwendung von auxotrophen Markierungsmitteln erleichtert die Selektion der Nachkommenschaft, da zur Verhütung des Wachstums der Mutterstämme Minimalmedien verwendet werden können. Andere verwendbare Markierungsmittel sind Farbe und Arzneimittelresistenz.

Es ist wünschenswert, solche markierten Stämme zu verwenden, die keine Hfr-Rückmutation der Markierungsmittel zeigen, so dass die aus den Kreuzungen erhaltenen Selektan-ten mit hoher Wahrscheinlichkeit als «nonrevertants» klassifiziert werden können. Weiterhin wird das Selektionsverfahren vereinfacht, wenn in jedem Mutterstamm mindestens zwei auxotrophe Markierungsmittel vorhanden sind. Dadurch fällt die Wachstumsgeschwindigkeit der Mutterstämme auf Minimalmedien auf praktisch Null und verringert darüber hinaus die Wahrscheinlichkeit eines signifikanten Wachstums der «revenants» auf Minimalmedien.

Die Markierungsmittel können auf herkömmliche Weise durch mutagene Chemikalien oder Bestrahlungen in die Mutterstämme eingeführt werden oder es können durch herkömmliche Verfahren markierte Stämme durch natürliche Mutationen erhalten werden.

Bei einem alternativen Verfahren werden die Mutterstämme vor der Protoplast und Kernverschmelzung jeweils mit einem verschiedenen irreversiblen Stoffwechselinhibitor behandelt. Dadurch zeigt jeder Mutterstamm verschiedene und komplementäre Aspekte seines inhibierten Stoffwechsels. Die so behandelten Mutterstämme können dann nach Entfernung des nicht umgesetzten Inhibitors der Protoplast- und Kernverschmelzung unterworfen werden. Durch die induzierten Stoffwechselinhibitionseffekte sind nur solche Zellen wachstumsfähig, die aus der Verschmelzung der Mutterstämme stammen, wobei sich die nicht inhibierten Stoffwechselaspekte der Elternstämme gegenseitig in dem Ausmass ergänzen, dass ein Überleben der Zelle gewährleistet ist.

Diese Methode wird von W.E. Wright in Expérimental Cell Research 112 (1978), 395 bis 407 beschrieben.

Vor der Bildung der Protoplaste werden die Mutterstämme bis zu einer geeigneten Populationsgrösse auf herkömmliche Weise, z.B. in Schüttelkolben kultiviert. Die Natur des Kulturmediums kann die Ausbeute an Protoplast beeinflussen, im allgemeinen wird jedoch für das Wachstum von A. chrysogenum ein herkömmliches verwendet. Ebenso wird die maximale Ausbeute an Protoplasten von dem Mycel der kultivierten Mutterstämme gegen Ende der exponentiellen Wachstumsphase erhalten. Das Mycel wird dann durch Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen und zur Entfernung des Kulturmediums gewaschen.

Es wurde festgestellt, dass die Ausbeute an Protoplasten wesentlich erhöht werden kann, wenn man das erhaltene Mycel mit einem Thiolsensitiser, einer Thiolverbindung, die die Protoplasterzeugung fördert, behandelt. Der bevorzugte Thiolsensitiser ist Dithiothreit, vorzugsweise in Konzentrationen von 0,005 bis 0,1 Mol, beispielsweise etwa 0,01 Mol, und in einem pH-Bereich von 6 bis 8,5, beispielsweise etwa 7,3. Unter Verwendung von Dithiothreit (0,01 Mol), kann das Mycel beispielsweise 15 Minuten bis 3 Stunden bei 20 bis 40 °C, vorzugsweise Vi bis V/i Stunden bei etwa 30 °C und einem pH-Wert von 7,3 inkubiert werden. Andere Thiolsensitiser sind z.B. 2-Mercaptoäthanol, Cysteamin und Thioglykolat.

Das behandelte Mycel wird dann gewaschen und mit einer protoplastogenen Kombination von Enzymen behandelt. Eine Reihe geeigneter Enzymkombinationen sind im Handel erhältlich, wie z.B. Cytophaga-Enzym Li (British Drug House, Poole) und Oxoporus-Cellulase (E. Merck, Darmstadt). Diese Präparate sind Undefinierte Mischungen, die verschiedene Enzyme wie z.B. ß-Glucanase, Chitinase, Protease und Lipase enthalten. Das Mycel wird mit dem Enzympräparat solange inkubiert, bis eine ausreichende Ausbeute an Protoplasten erhalten worden ist. Der pH-Wert, die Temperatur des Inkubationsmediums und die Inkubationszeit sollten entsprechend den Eigenschaften des verwendeten Systems ausgewählt werden, beispielsweise etwa pH 6,8, etwa 30 °C und etwa 3 Stunden im Falle des Cytophaga-Enzyms Li. Typische Enzymkonzentrationen liegen in dem Bereich 0,05 bis 20 mg/ml, beispielsweise ca. 2 mg/ml für das Cyto-haga-Enzym Li und 2 bis 40 mg/ml für Oxoporus-Cellulase. Es ist ebenfalls wichtig zu beachten, dass der osmotische Druck des Mediums in einem solchen Bereich liegt, der die Stabilität der Protoplasten gewährleistet und der beispielsweise einer 0,5- bis ll,0molaren, vorzugsweise etwa 0,9molaren Natriumchloridlösung äquivalent ist. Der osmotische Druck des Inkubationsmediums kann mit anorganischen Salzen eingestellt werden, beispielsweise mit Natriumchlorid oder mit Zucker oder Zuckeralkohol. Es ist vorteilhaft Magnesium zuzusetzen, beispielsweise als Magnesiumsulfat in Konzentrationen von 0,005 bis 0,1 Mol, vorzugsweise etwa 0,02 Mol.

Die folgenden Kriterien scheinen geeignet zu sein, um Protoplaste zu charakterisieren: osmotische Fragilität; Verlust an Festigkeit, was zu einer sphärischen Form führt; und die Beobachtung, dass die Protoplaste durch eine Pore treten und die leeren Zellwände zurücklassen.

Nach der Inkubation wird die Mischung der Protoplaste und das teilweise verdaute Mycel abgetrennt, beispielsweise durch Filtrieren durch ein Medium geeigneter Porengrösse, wie z.B. durch eine Schicht Baumwolle oder durch mildes Zentrifugieren beispielsweise 5 Minuten bei 200 bis 300 g.

Falls es sich als notwendig erweisen sollte, kann die Trennstufe wiederholt werden. Das Filtrat oder der Überstand ist eine Suspension, die im wesentlichen aus Protoplasten und wenig Mycelfragmenten besteht. Die Protoplaste können gewaschen werden, indem man sie ein- oder zweimal zentrifu-giert, beispielsweise 5 Minuten bei 700 g und jeweils anschliessend in einer osmotischen stabilisierenden Lösung suspendiert (beispielsweise 0,9molare Natriumchloridlösung) und schliesslich in der osmotisch stabilisierenden Lösung wieder suspendiert.

Anstelle der Verwendung des Mycels ist es auch möglich, die Protoplaste aus Konidien oder Arthrosporen von A. chrysogenum unter Verwendung ähnlicher Methoden zu erzeugen.

Die Lebensfähigkeit der Protoplaste kann mit Hilfe des «plating out»-Verfahrens auf osmotisch stabilisiertem (beispielsweise mit 2% Rohrzucker und 0,8 Mol Natriumchlorid) und nicht stabilisiertem Wachstumsmedium untersucht werden. Die Protoplaste sind osmotisch fragil und überleben nicht nach dem «plating out» von mit Wasser gewaschenen Suspensionen auf nicht stabilisierten Medien. Somit rührt jedes Wachstum auf diesen Medien von den Mycelfragmenten her, die als Verunreinigung in den Protoplastpräparaten vorhanden sind. Auf stabilisiertem Medium ist ein hoher Anteil der Protoplaste gewöhnlich lebensfähig und bildet schliesslich Kolonien. Die Lebensfähigkeit der Protoplaste variiert zwischen etwa 5 und 80%. Etwa 5 bis 20% des Wachstums auf stabilisiertem Agar ist auf die Mycelfragmente zurückzuführen. Da die Protoplaste osmotisch fragil sind,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

645 405

4

sollte in jeder Verfahrensstufe darauf geachtet werden, dass eine angemessene osmotische Pufferung des Mediums gewährleistet ist.

Die Protoplaste aus den Mutterstämmen werden dann gemischt. Um die Wahrscheinlichkeit für die gewünschte Verschmelzung zwischen den Protoplasten von zwei oder mehr Mutterstämmen zu maximieren, wird vorzugsweise eine angenähert gleiche Anzahl von lebensfähigen Protoplasten von jedem Stamm eingesetzt. Falls es gewünscht wird, kann die Mischung der Protoplaste aus einer Mischung der Mycelien aus den Mutterstämmen hergestellt werden, jedoch bringt dies im allgemeinen keinen Vorteil für dieses Verfahren.

Die Protoplaste werden in Gegenwart eines «Fusogens» (ein die Verschmelzung förderndes Mittel) verschmolzen. Obwohl die Verschmelzung teilweise spontan stattfindet, ist die Wahrscheinlichkeit für eine spontane Verschmelzung zu gering. Es gibt eine Reihe Reagentien mit fusogener Wirkung, jedoch werden Polyalkylenglykole, insbesondere Polyäthylen-glykol, vorgezogen. Das Polyäthylenglykol hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von 1000 bis 8000, beispielsweise 6000. Das Glykol wird als Lösung in einem wässrigen Puffer vorzugsweise in einer Konzentration von 20 bis 60%, beispielsweise etwa 30%, eingesetzt. Der pH-Wert liegt vorzugsweise in einem Bereich von 5 bis 10, z.B. ca.7,5. Das Verfahren wird durch die Anwesenheit von Calciumionen, beispielsweise in Konzentrationen von 0,002 bis 1,0 Mol, z.B. etwa 0,01 Mol, gefördert. Die Aggregation der Protoplaste erfolgt rasch und man lässt das Reagens etwa 1 Minute bis 2 Stunden, beispielsweise 5 bis 20 Minuten bei einer Inkubationstemperatur von 0 bis 30 °C, beispielsweise 25 °C, einwirken.

Das fusogene Reagens wird dann mit einer osmotischsta-bilisierenden Lösung durch verdünnen entfernt und die Protoplaste (von denen einige verschmolzen sind) werden zentri-fugiert und gewaschen. Die Waschflüssigkeit sollte im Hinblick auf die Protoplaste isotonisch sein, z.B. eine 0,9molare Natriumchloridlösung.

Die Selektion des gewünschten Kernverschmelzungsprodukts kann mit einer im wesentlichen herkömmlichen Methode durchgeführt werden. Falls auxotrophe Mutterstämme eingesetzt worden sind, wird die Verschmelzungsmischung nach dem «plating out»-Verfahren auf osmotisch stabilisierte Minimalregenerationsmedien gebracht, die manchmal ergänzt sind, jedoch immer so ausgewählt sein müssen, dass nicht die Mutterstämme sondern nur bestimmte Kernverschmelzungsprodukte und irgendwelche gebildeten Hete-rokaryone wachsen können. Die Stämme der zuletzt genannten beiden Typen sind prototroph. Es wurde festgestellt, dass zwei allgemeine Typen von Prototrophen gewonnen wurden, nämlich stabile und instabile. Die stabilen Prototrophen sind bei äquivalenter «plating»-Dichte gekennzeichnet durch eine annähernd gleiche Zahl von Kolonien auf einem vollständigen Medium und auf einem Minimalmedium mit vorausgehender Subkultur auf einem vollständigen Medium. Diese Stämme sind rekombinierte Segreganten und können unter Verwendung herkömmlicher Methoden unbegrenzt vermehrt werden. Man darf erwarten, dass sie die von beiden Mutterstämmen abgeleiteten Eigenschaften aufweisen. Diese stabilen prototrophen rekombinierten Segreganten unterliegen nicht der Ségrégation bei Behandlung mit rekombinogenen Mitteln (Mittel, die die Rekombination fördern) wie beispielsweise p-Fluorphenylalanin oder Gammastrahlen, d.h. sie zeigen im Hinblick auf die bei der Rekombinationsstufe verwendeten Markierungsmittel keine Änderung in der genetischen Konstitution.

Die instabilen Prototrophen zeigen nach der Reinigung durch Kultivierung auf Minimalmedien schliesslich ein instabiles Verhalten auf vollständigen Medien, was zur Bildung von Auxotrophen führt.

Neben der oben abgehandelten prototrophen Nachkommenschaft kann das «plating» der Verschmelzungsmischung auf eine Reihe von selektiven Regenerationsmedien manchmal dazu führen, dass sämtliche in dem Rekombinationsverfahren eingesetzten Erbfaktoren, wie in Beispiel 1 beschrieben, wieder erhalten werden. Die Selektion eines verbesserten Stammes aus den durch die Kernverschmelzung erhaltenen Produkten kann in der gleichen Weise wie ein herkömmliches Brütprogramm durchgeführt werden und wird in erster Linie von der besonderen Kombination von Eigenschaften, die die Nachkommenschaft haben soll, abhängen. Entsprechend der herkömmlichen Praxis sollte eine grosse Anzahl von Kernverschmelzungsprodukten untersucht werden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, einen Stamm zu finden, der den Mutterstämmen in signifikanter Weise überlegen ist. Falls es wünschenswert erscheint, kann ein solcher Stamm einem Mutationsprogramm unterworfen werden mit dem Ziel, diesen Stamm weiter zu verbessern.

Kernverschmelzungsprodukte, z.B. rekombinierte Segreganten, die Cephalosporin erzeugen und von der Species A. chrysogenum durch Protoplastverschmelzung erhalten werden, sind bislang nicht hergestellt worden.

Der verbesserte Stamm kann für die Herstellung eines Cephalosporins auf bekannte und herkömmliche Weise kultiviert werden.

Somit kann der Stamm unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise in einer Submerskultur, unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff, kultiviert werden. Das verwendete Fermentationsmedium sollte eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verdaubare Stickstoffquelle und, falls es wünschenswert erscheint, das Wachstum fördernde Substanzen und anorganische Salze enthalten.

Geeignete Kohlenstoffquellen sind z.B. Traubenzucker, Rohrzucker, Stärke, lösliche Stärke, n-Paraffine, pflanzliche oder tierische Öle, Essigsäure, Methanol, Glycerin, Sorbit und Äthanol.

Geeignete Stickstoffquellen sind z.B. natürliche Stick-stoff-enthaltende Substanzen oder aus ihnen hergestellte Materialien, wie z.B. Fleischextrakte, Peptone," Kasein, Mais-maischflüssigkeit, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Trypton, Baumwollsamenmehl und Weizenkleie. Stickstoff-enthal-tende organische oder anorganische Verbindungen können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise Harnstoff, Nitrate und Ammoniumsalze, wie Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat.

Anorganische Salze, die in dem Fermentationsmedium verwendet werden können, sind z.B. Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate und Phosphate von Kalium, Magnesium und Calcium.

Das Wachstum fördernde Substanzen, die verwendet werden können, sind z.B. Cystein, Cystin, Thiosulfat, Methyl-oleat und insbesondere Methionin und ebenso Spurenelemente wie Eisen, Zink, Kupfer und Mangan.

Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und Fermentationszeit, werden so ausgewählt, dass der eingesetzte Stamm maximale Mengen des gewünschten Cephalosporins erzeugen kann. Beispielsweise wird die Fermentation bei einer Temperatur zwischen 15 und 45 °C, vorzugsweise etwa 25 °C und bei einem pH-Wert von 4 bis 9, vorzugsweise etwa 6, und in einem Zeitraum von 1 bis 20 Tagen, vorzugsweise 4 bis 10 Tagen durchgeführt.

Die Abtrennung des gewünschten Cephalosporins von der Kulturbrühe kann bequem mit herkömmlichen Mitteln durchgeführt werden, z.B. durch Fultrierender Kulturbrühe, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Filterhilfsstoffes, wie Diatomeenerde, durch Waschen der Zellen mit Wasser und durch Gewinnung des gewünschten Cephalosporins aus der Mischung des Filtrats und der Waschflüssigkeiten.

5

lü

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

b5

5

645 405

Die Kulturbrühe oder das Filtrat kann gegebenenfalls zu Beginn mit einer Säure, wie z.B. einer Mineralsäure, behandelt werden, um mässig lösliche Salze und porteinhaltige Materialien aus der Nährlösung auszufällen oder jegliches anwesendes Penicillin N zu zerstören. Penicillin N kann auch durch Behandlung mit Penicillinase zerstört werden. Die Kulturbrühe oder das Filtrat können gegebenenfalls weiter gereinigt werden durch Lösungsmittelextraktion oder durch Ionenaustauschadsorption, um lipophile Verunreinigungen zu entfernen.

Zur Gewinnung des gewünschten Cephalosporins können herkömmliche Methoden verwendet werden, beispielsweise Absorptions- oder Adsorptionschromatographie oder Ausfällungsmethoden.

Absorbtions- oder Adsorbtionsmittel, die verwendet werden können, sind beispielsweise Aktivkohle, Ionenaustausch-harze und nicht-ionische Adsorptionsharze. Die Eluierung des Cephalosporins kann insbesondere durch Verwendung von wässrigen Lösungen erfolgen. Insbesonderes bevorzugte Ionenaustauschharze sind schwach basische Anionenaustau-scher, aus denen das Cephalosporin mit beispielsweise gepufferten Ammonium-, Natrium- oder Kaliumacetat eluiert werden kann. Stark basische Anionenaustauschharze, aus denen das Cephalosporin mit beispielsweise 1-molarer Essigsäure eluiert werden kann, können ebenfalls verwendet werden. Nicht-ionische Adsorptionsharze sind z.B. mit Divinylbenzol vernetzte Styrolpolymere mit grosser Oberfläche wie z.B. Amberlite XAD-4. Das Cephalosporin kann mit einer wässrigen alkoholischen oder ketonischen Lösung, wie z.B. einer wässrigen Isopropanol- oder wässrigen Acetonlösung eluiert werden.

Das Cephalosporin kann aus den wässrigen Lösungen beispielsweise unter Verwendung von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Ketonen, z.B. Aceton oder niedrigen Alkanolen, ausgefällt werden.

Das Cephalosporin kann ebenso aus konzentrierten wässrigen Lösungen in Form eines Metallsalzes ausgefällt werden, wie z.B. als Alkalimetallsalz, insbesondere als Natrium- oder Kaliumsalz.

Es kann wünschenswert sein, das fermentierte Cephalosporin vor der Isolierung in ein Derivat zu überführen, beispielsweise durch Reaktionen entweder der in Stellung 7 oder in Stellung 3 befindlichen Seitenketten. So kann die Amin-gruppe der in Stellung 7 befindlichen Seitenkette durch eine beispielsweise in den britischen Patentschriften 1 041 985, • 1 302 015 oder 1 313 207 beschriebenen Gruppe substituiert werden, wie durch eine Arylgruppe (z.B. 2,4-Dinitrophenyl-gruppe), eine Acylgruppe, eine insbesondere eine niedere Alkanoylgruppe (z.B. Acetylgruppe), eine Halogenniederal-kanoylgruppe (z.B. Chloracetyl- oder Dichloracetylgruppe), eine Aroylgruppe (z.B. Benzoyl-, Chlorbenzoyl-, Nitroben-zoyl- oder Tosylgruppe), eine Niederalkoxycarbonylgruppe (z.B. tert.-Butoxycarbonylgruppe), eine Arylniederalkoxycar-bonylgruppe (z.B. Benzyloxycarbonylgruppe) oder eine Di-acylgruppe, wie z.B. die Phthaloylgruppe. Die in Stellung 7 befindliche Seitenkette kann ebenso beispielsweise nach dem Verfahren der britischen Patentschrift 1 272 769 in eine 4-Car-boxybutanamidogruppe oder nach dem Verfahren der britischen Patentschrift 1 355 347 durch eine 5-Carboxy-5-(2,6-dimethyl-3,5-dicarbäthoxy-l,4-dihydropyrid-l-yl)-pent-anamidogruppe in ein Dihydropyridinderivat überführt werden. Das Cephalosporin C kann durch Behandlung mit einer Esterase in das Desacetylcephalosporin C überführt werden, beispielsweise nach den Verfahren der britischen Patentschriften 1 080 904 oder 1 474 519.

Das Verfahren zur Abtrennung des Derivats des fermentierten Cephalosporins wird von der Natur des Produktes und der verwendeten Reaktion abhängig, aber es können im allgemeinen herkömmliche Methoden angewandt werden.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Die Beschreibung der Stämme von A. chrysogenum, die in den folgenden Beispielen verwendet wird, steht in Einklang mit der in «Cephalosporium-artige Schimmelpilze (Hyphomycetes)» von Walter Gams (BR. Deutschland) 1971, Seiten 109 bis 111 dargestellten Beschreibung.

Beispiel 1

Zwei von dem A. chrysogenum-Stamm M8650 (ATCC 14553) abgeleitete auxotrophe Mutanten wurden gekreuzt. Die Kreuzung war Rot Arg Leut (CMI 227144) x Weiss Arg Met (CMI 227145). Die Abkürzungen Arg, Met und Leu zeigen einen Bedarf für Arginin, Methionin bzw. Leucin an. «Rot» bedeutet eine rote Mycelpigmentierung und «Weiss» bedeutet eine weisse Mycelpigmentierung. Die Arg-Mutanten waren nicht allelisch.

Die beiden Mutterstämme wurden getrennt in Schüttelkolben in einem wässrigen Medium der folgenden Zusammensetzung kultiviert:

Rohrzucker 36 g/1 L-Asparagin 7,5 g/1

KH2PO4 15 g/1

K2HPO4 21 g/1 Na2S04 0,75 g/1 Mg SO2 • 7H2O 0,18 g/1 «Salzlösung» 1 ml/1 CaCh 0,06 g/1 natürlicher pH-Wert

Die «Salzlösung» enthielt:

Fe (NH4)2 (S04)2 ■ 6H2O 15 g/100 ml

MNS04-4H2Û 3 g/100 ml

ZnS04-7H20 3 g/100 ml

Cu S04-5H20 0,8 g/100 ml

Dieses Medium wurde in konischen 250 ml-Kolben in 40 ml aliquoten Teilen dispensiert. Nach 20minütiger Aufbewahrung im Autoklaven bei 121 °C wurde jedem Kolben 1 ml sterile Traubenzuckerlösung (10,8 % Gew./Vol.) hinzugefügt. Die Kolben wurden dann mit einer den auxotrophen Bedarf der Mutterstämme deckenden Menge an Aminosäure bis zu einer Endkonzentration von 0,01% aufgefüllt. Zusätzlich wurde jedem Kolben 2 ml einer sterilen wässrigen Lösung der folgenden Zusammensetzung hinzugegeben:

Rohrzucker 25 g/1 Kornmaischflüssigkeit 0,1 % (als Stickstoff) Ammoniumacetat 5,5 g/1 CaCOa 5 g/1

Vor der 20minütigen Aufbewahrung im Autoklaven bei 121 °C wurde der pH-Wert mit KOH auf 6,5 eingestellt.

Jede Schüttelflasche wurde dann mit dem geeigneten Stamm geimpft, 48 Stunden für den weissen Stamm und 72 Stunden für den roten Stamm inkubiert (25 °C, 250 U/min) und zur Impfung eines zweiten Kolbens mit demselben Medium (40 ml) verwendet. Die Aberntung erfolgte nach 48 bzw. 72 Stunden und das Mycel wurde durch Vakuumfiltration durch ein Papierfilter gewonnen. Das Mycel wurde zwei-oder dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, dann (Gesamtnassgewicht 1 bis 2 g) in einer 0,01-molaren Dithio-threitlösung in einem auf pH 7,3 eingestellten Citrat/ Phosphatpuffer (10 ml) wieder suspendiert und unter leichtem Schütteln 1 Stunde lang bei 30 °C inkubiert.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

645 405

6

Das mit Dithiothreit behandelte Mycel wurde anschliessend mit destilliertem Wasser gewaschen und in einer auf pH 6,8 eingestellten Pufferlösung (10 ml), die Cytophaga-Enzym Li (20 mg, erhältlich von BDH), 0,8 Mol NaCl und 0,02 Mol MgSÜ4 enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde unter leichtem Schütteln 3 Stunden lang bei 30 °C inkubiert.

Die erhaltene Mischung von Protoplasten und teilweise verdautem Mycel wurde durch Baumwolle filtriert, um das Mycel zu entfernen und das Filtrat wurde 5 Minuten lang bei 700 g zentrifugiert. Das tablettenförmige Produkt wurde zweimal mit isotonischer Salzlösung (0,9molare Natriumchloridlösung) gewaschen und schliesslich in isotonischer Salzlösung suspendiert.

Die Herstellung von Protoplasten wurde sichergestellt durch das Auftreten von kleinen sphärischen Zellen, die sich von den unverdauten Mycelfragmenten erheblich unterschieden. Die Lebensfähigkeit der Protoplasten konnte durch «plating out» auf osmotisch stabilisiertem (2% Rohrzucker und 0,8 Mol pro Liter NaCI) und auf nicht stabilisiertem Herzinfusionsagar (Bacto Herzinfusionslösung [Difco] geliert mit Oxoidagar) bestimmt werden. Die Protoplaste waren osmotisch fragil und überlebten auf nicht stabilisiertem Agar nicht. Die Lebensfähigkeit der Protoplaste betrug etwa 70% und etwa 15% des Wachstums auf dem stabilisierten Agar war auf die Mycelfragmente zurückzuführen.

Protoplaste von jedem Mutterstamm (1 bis 2 x 106 von jedem Auxotroph pro ml) wurden in isotonischer Salzlösung (5 ml) suspendiert, vermischt und 5 Minuten bei 700 g zentrifugiert. Das tablettenförmige Produkt wurde in einer 30%igen Lösung von Polyäthylenglykol (Molekulargewicht 6000) in einem auf pH 7,5 eingestellten Glycinpuffer (2 ml), der 0,01 Mol Calciumchlorid enthielt und auf 30 °C vorgewärmt worden war, suspendiert und 10 Minuten lang bei 30 °C inkubiert. Nach der Verdünnung mit isotonischer Salzlösung (6 ml) wurde das Präparat 5 Minuten bei 700 g zentrifugiert, zweimal mit isotonischer Salzlösung gewaschen und schliesslich in isotonischer Salzlösung suspendiert.

Die Verschmelzungsmischung wurde zunächst nach dem «plating out»-Verfahren auf eine Reihe von osmotisch stabilisierten selektiven Regenerationsmedien, die in der Kopfzeile der folgenden Tabelle aufgeführt sind, aufgebracht. Sporen und Hyphenfragmente wurden aus den Wachstumszentren der Regenerationsmedien entfernt und auf Minimalmedien und vollständige Medien «geplated». Wiederholtes aufeinanderfolgendes «plating» der erhaltenen Kolonien auf Minimalmedien und vollständigen Medien führte zu einer Reinigung der Nachkommenschaft und stellte einen Stabilitätstest dar.

Das Minimalmedium (Czapek Dox Minimalagar) hatte folgende Zusammensetzung:

Czapek Dox

Rohrzucker

NaNOs

KH2PO4

MgS04-7Hi0

KCl

FeS04

Agar (Oxoid Nr. 3)

3 Gew.-% 0,2 Gew.-% 0,1 Gew.-% 0,05 Gew.-% 0,05 Gew.-% 0,001 Gew.-% 2 Gew.-%

20 Vor der 20minütigen Aufbewahrung im Autoklaven bei 121 °C wurde der pH-Wert mit KOH auf 6,8 eingestellt.

Das vollständige Medium (Sabourauds-Agar) hatte folgende Zusammensetzung:

25 Maltose 4Gew.-%

Pepton (Oxoid bact. neutralisiert) 1 Gew.-%

Malzextrakt (Oxoid) 2,4 Gew.-%

Agar (Oxoid Nr. 3) 2 Gew.-%

30 Vor der 20minütigen Aufbewahrung im Autoklaven bei 121 °C wurde der pH-Wert mit NaOH auf 7,5 eingestellt.

Die aus dem vollständigen Medium erhaltenen und gereinigten Kolonien wurden dann wie die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Stämme hinsichtlich der Farbe und der 35 Wachstumserfordernisse charakterisiert. Die Zahl solcher aus jedem einzelnen selektiven Medium erhaltenen Stämme ist in der Tabelle aufgeführt. Die Stämme schliessen Prototrophe ein, die bei Behandlung mit p-FIuorphenylalanin oder durch Einwirkung von Gammastrahlen nicht der Ségrégation unter-40 Hegen. «MM» bedeutet Minimalmedium und «MM+» bedeutet osmotisch stabilisiertes Minimalmedium.

Tabelle I

selektives Regenerationsmedium Stämme MM* MM+ + MM* + MM+ + MM* + Gesamt

Arginiti Methionin Leucin Leucin +

Methionin

Rot Arg Leu

(Mutterstamm)

1

8

7

18

Weiss Arg Met

(Mutterstamm)

11

8

13

32

Rot Leu Met

2

Weiss Leu Met

3

Rot Arg Met

2

Weiss Arg Leu

1

4

5

Rot Arg

3

4

2

1

10

Weiss Arg

1

7

13

2

3

26

Rot Leu

5

3

8

Weiss Leu

3

11

14

Rot Met

1

2

Weiss Met

1

4

7

Rot

3

1

2

8

Weiss

18

'6

12

8

15

59

Rot Arg Leut Met

Weiss Arg Leu Met

1

2

7

645 405

Die Wachstumsgeschwindigkeiten und die Sporenbildungseigenschaften der isolierten Nachkommenschaft wurden bestimmt.

Tabelle II zeigt einen Vergleich der Wachstumsgeschwindigkeiten der Mutterstämme und einer prototrophen Nachkommenschaft, dem Stamm P.

Tabelle III zeigt einen Vergleich der Sporenbildungswerte der Mutterstämme und einer Weiss-Arg-Met-Nachkommenschaft, dem Stamm Q.

Der Stamm P zeigte sowohl auf einem festen Medium als auch in einer Submerskultur eine signifikant höhere Wachstumsgeschwindigkeit als beide Mutterstämme, während der Stamm Q einen signifikant höheren Sporenbildungsgrad als die beiden Mutterstämme zeigte.

Tabelle II

Eigenschaften

Mutterstamm Mutterstamm Prototrophe

Rot Arg Leu

Weiss Arg

Nachkom

Met menschaft

Stamm P

Wachstungsgeschwin-

digkeit auf festem

Medium (mm/Std. auf

Sabourauds-Agar)

0,031

0,063

0,083

Wachstum in

Submerskultur (g

Trockengewicht pro

Liter nach 5 Tagen)

2,5

7,2

17,3

Die Verschmelzungsmischung wurde nach dem «plating out»-Verfahren auf osmotisch stabilisierte Minimalmedien gebracht. Die Sporen- und Hyphenfragmente wurden den Wachstumszentren entnommen und dann auf vollständige 5 Medien «geplated». Die Minimal- und vollständigen Medien hatten die in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzungen. Die somit erhaltenen Kolonien wurden beispielsweise hinsichtlich ihrer Farbe, ihrem Wachstum und hinsichtlich ihrer Eigenschaft, Cephalosporin C zu erzeugen, charakterisiert. 10 Es wurde festgestellt, dass von etwa 600 Prototrophen oder Nikotinamid-bedürftigen Nachkömmlingen 35 einen grösseren Cephalosporin C-Gehalt zeigten als die Mutterstämme, d.h. einen Überschuss von 100 Einheiten, wenn sie unter den gleichen Bedingungen kultiviert wurden. 15 Ein Nachkömmling, Stamm R, hatte die in Tabelle IV angegebenen Eigenschaften. Der Stamm R zeigte einen signifikant höheren Cephalosporin C-Gehalt als beide Mutterstämme und wies eine Wachstumsgeschwindigkeit und einen Sporenbildungsgrad auf, der zwischen der Wachstumsge-20 schwindigkeit und dem Sporenbildungsgrad der beiden Mutterstämme lag.

Tabelle IV

25

Eigenschaften

Mutterstämme Stamm A Stamm B

Nachkommenschaft Stamm R

Wachstumserfordernisse Nikotina- Keine

Tabelle III

30

Mycelfarbe Rot Möglichkeit zur

Weiss

Eigenschaften

Mutterstamm Mutterstamm Nachkom-

Verwendung von Sulfat

Rot Arg Leu Weiss Arg menschaft bei der

Met Stamm Q

35 Cephalosporinsynthese Ja

Nein

Weiss Arg

Cephalosporin

Met

C-Erzeugung 100

30

Nikotina-

mid

Weiss

Ja

210 Einheiten

Sporenbildung (durchschnittliche Zahl an Sporen pro Kolonie auf Sabourauds-Agar nach 3 Wochen bei 25 °C)

<103

107

45

Beispiel 2

Zwei sehr divegierende Stämme von A. chrysogenum, Stämme A und B, beide von A. chrysogenum ATCC 14553 abgeleitet, hatten die in Tabelle IV dargestellten Eigenschaften.

Mit Hilfe herkömmlicher Mutationsmethoden wurden in beide Stämme auxotrophe Markierungsmittel eingeführt. Dann wurden Sporen von beiden Stämmen ferner UV-Strahlung ausgesetzt, so dass etwa 99% der Sporen abgetötet wurden. Die überlebenden Sporen wurden dann hinsichtlich ihrer Wachstumserfordernisse untersucht und von jedem Stamm wurde ein Mutant selektiert, der geeignete Wachstumsbedarfmutationen zeigte, um so als auxotrophes Markierungsmittel dienen zu können. Auf diese Weise wurde ein Mutant des Stammes A selektiert, der zusätzlich zu dem Nikotinamidbedarf einen Bedarf an Aneurin aufwies, dargestellt in Tabelle IV, und ein Mutant des Stammes B selektiert, der einen Bedarf für sowohl Arginin als auch Aneurin zeigte.

Analog dem Verfahren von Beispiel 1 wurden diese beiden markierten Stämme dann getrennt 48 Stunden lang kultiviert und aus dem Mycel von jedem Stamm wurden Protoplaste hergestellt. Anschliessend wurden die Protoplaste der beiden Stämme gemischt und verschmolzen.

Wachstumsgeschwindigkeit (mm/Std. auf

Sabourauds-Agar) 0,012 0,083

Sporenbildung

(durchschnittliche

Anzahl von Sporen pro

Kolonie auf

Sabourauds-Agar nach

3 Wochen bei 25 ° C) < 103 106

0,042

105

Beispiel 3

so Ein auxotropher Mutant, abgeleitet von dem A. chrysoge-num-Stamm M8650 (ATCC 14553) wurde mit einem auxotrophen Mutanten, abgeleitet von dem Stamm C0728 (CMI 237183), der seinerseits durch mehrere herkömmliche Mutationsschritte von dem Stamm M8650 abgeleitet war, gekreuzt. 55 Die Kreuzung war Arg Met (M8650) x Leu (C0728). Die Abkürzungen Arg, Met und Leu zeigen einen Bedarf für Arginin, Methionin bzw. Leucin an. Die beiden auxotrophen Mutterstämme sind am 20. April 1978 unter der Bezeichnung CMI 227145 bzw. am 19. April 1979 unter der Bezeichnung CMI so 237183 II beim Commonwealth Mycological Institute, Kew (Surrey, England) hinterlegt worden.

Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 wurden diese beiden markierten Stämme getrennt 48 Stunden lang kultiviert und Protoplaste aus dem Mycel von jedem Stamm her-65 gestellt. Die Protoplaste der beiden Stämme wurden dann gemischt und verschmolzen.

Die Verschmelzungsmischung wurde nach dem «plating out»-Verfahren auf osmotisch stabilisierte Minimalmedien

645 405

8

aufgebracht. Sporen und Hyphenfragmente wurden den Wachstumszentren entnommen und dann auf Minimalmedien und vollständige Medien «geplated», um die Stabilität der isolierten Produkte zu bestätigen. Die Minimal- bzw. vollständigen Medien hatten die in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzungen.

Die stabilen prototrophen rekombinierten Stämme, die aus dieser Kreuzung erhalten wurden und die Mutterstämme wurde getrennt wie folgt fermentiert: Die Stämme wurden auf Sabourauds Agar (Zusammensetzung wie in Beispiel 1) 10 1 Tage lang bei 25 °C kultiviert. Von diesen Kulturen abgeschabte Sporen und Hyphenfragmente wurden zur Impfung von Schüttelkolben, die ein Medium (16 ml) der folgenden Zusammensetzung enthielten, verwendet:

Kornmaischflüssigkeit Lactose

Traubenzucker Methionin

Phenylacetyläthanolamin

Calciumcarbonat

Harnstöff

Ammoniumsulfat

Maisöl

Maismaischflüssigkeit Ammoniumacetat Rohrzucker Calciumcarbonat

0,l%"(als Stickstoff) 5,5 g/1 25 g/1 10 g/1

Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 6,5 eingestellt. Nach 20minütiger Aufbewahrung im Autoklaven bei 121 °C wurden die Schüttelkolben 48 Stunden inkubiert (25 °C, 250 U/min). Ein Impfstoff von 0,5 ml wurde dann aus jedem Schüttelkolben entnommen und zur Impfung eines zweiten Schüttelkolbens, der ein Medium (9,5 ml) der folgenden Zusammensetzung enthielt, verwendet:

0,5 % (als Stickstoff) 46 g/1 2 g/1

2.3 g/1 1,5 g/1

16 g/1 0,8 g/1

3.4 g/1

6 Tropfen pro Kolben

Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 6,6 eingestellt. Nach 20minütiger Aufbewahrung im Autoklaven bei 121 °C wurden die Schüttelkolben 120 Stunden inkubiert (25 °C, 250 U/min).

Die insbesonders verbesserte Eigenschaft der isolierten rekombinierten Stämme war ein erhöhter Gehalt an Desace-tylcephalosporin C, der chemisch ermittelt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle V dargestellt.

Tabelle V

25

Stamm chemische Untersuchung (ug/ml)

Desactylcephalosporin

M8650

0

C0728

310

rekombinierter Stamm 1

827

rekombinierter Stamm 2

809

rekombinierter Stamm 3

843

G

Claims

645 405

1. Verfahren zur Erzeugung eines Stammes von Acremo-nium chrysogenum, der zur Erzeugung eines Cephalosporins befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, dass man Mutterstämme von Acremonium chrysogenum der Protoplast- und Kernverschmelzung unterwirft und den gewünschten Stamm aus der Nachkommenschaft selektiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutterstämme behandelt worden sind, um die Selektion der Nachkommenschaft zu erleichtern.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass jeder der Mutterstämme vor der Protoplast- und Kernverschmelzung mit auxotrophen Markierungsmitteln genetisch markiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Mutterstamm mit mindestens zwei auxotrophen Markierungsmitteln genetisch markiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Mutterstamm vor der Protoplast- und Kernver-schmelzung durch Farbe oder Arzneimittelresistenz genetisch markiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutterstämme vor der Protoplast- und Kernverschmelzung jeweils mit einem verschiedenen irreversiblen Stoffwechselinhibitor behandelt werden, um verschiedene und komplementäre Stoffwechselinhibitionswirkungen zu • erzielen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mycelien, Arthrosporen oder Koni-dien der Mutterstämme zur Förderung der Protoplasterzeugung mit einem Thiolsensitiser behandelt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Thiosensitiser Dithiothreit verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Protoplastverschmelzung in Gegenwart eines Polyäthylenglykols mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 8000 durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Protoplastverschmelzung in Gegenwart von Calciumionen in einer Konzentration von 0,002 bis 1,0 Mol durchgeführt wird.

11. Stamm von Acremonium chrysogenum, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.

12. Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Acremonium chrysogenum nach Anspruch 11 kultiviert und ein Cephalosporin aus dem Kulturmedium isoliert.