CH645607A5

CH645607A5 - Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von co-enzym q.

Info

Publication number: CH645607A5
Application number: CH930578A
Authority: CH
Inventors: Ko Aida; Kinya Uchida; Izumi Kawada; Hideichi Itoh
Original assignee: Ko Aida
Priority date: 1977-09-05
Filing date: 1978-09-05
Publication date: 1984-10-15
Also published as: NL7808778A; GB2005662A; DE2838252B2; GB2005662B; ES473041A1; FR2401993B1; DK147602C; DE2838252C3; DK389078A; DE2838252A1; DK147602B; IT1157168B; FR2401993A1; IT7850934A0; CA1105860A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Co-enzym Q der Formel I

H3CO.

HJCO

O

A.

CH:

(I)

CH2-CH=C -CHz-KflH CHs in welcher n einen Wert von 1-10 besitzt, auf mikrobiologischem Wege.

Die Co-enzyme Q, auch Ubichinone genannt, sind, wie man aus der Formel I sieht, 2,3-Bimethoxy-5-methyl-l,4-benzochinone, die eine Isopren-Seitenkette in der 6-StelIung des Chinonkernes enthalten.

Wenn in dem Co-enzym Q der oben angegebenen allgemeinen Formel I, n einen Wert von 8 besitzt, dann handelt es sich um das Co-enzym Qs.

Wenn in der oben angeführten allgemeinen Formel n für 5 die Zahl 9 steht, dann handelt es sich um das Co-enzym Q9.

Wenn in der oben angegebenen allgemeinen Formel n den Wert 10 besitzt, dann handelt es sich um das Co-enzym Qio-

Co-enzym Q ist häufig bei Tieren, Pflanzen, Mikroorga-io nismen und ähnlichen anzutreffen, und es spielt eine wichtige Rolle als konstitutives Element des Übertragungssystemes für terminale Elektronen.

In jüngster Zeit hat man herausgefunden, dass Co-enzym Q hervorragende medizinische und physiologische Wirksam-is keiten bei der Behandlung verschiedener krankhafter Zustände aufweist. Besonders das Co-enzym Q10 wird als ganz speziell wertvolles medizinisch verwendbares Mittel angesehen, weil das Co-enzym Q des Menschen das Co-enzym Q10 ist.

20 Man kann das Co-enzym Q erhalten, indem man es aus tierischen oder pflanzlichen Geweben oder aus Mikroorganismen extrahiert, oder indem man es chemisch synthetisiert. Es ist jedoch schwierig Co-enzym Q herzustellen, indem man es aus tierischen oder pflanzlichen Geweben in grossem Aus-25 mass extrahiert. Ferner ist es auch schwierig Co-enzym Q durch eine organische Synthese herzustellen, weil in diesem Fall die Ausbeuten ungünstig liegen. Aus diesem Grunde sind alle diese obigen Verfahren nicht befriedigend, wenn man in industriellem Massstab ein Co-enzym Q herstellen 30 will. Wenn man anderseits nach einem Arbeitsverfahren zur Extraktion von Mikroorganismen das Co-enzym Q herstellen will, dann besteht natürlich die Möglichkeit, dass dieses Verfahren deshalb in wirtschaftlicher Weise angewandt werden kann, weil möglicherweise grössere Ausbeuten an Zellen 35 und dementsprechend grössere Ausbeuten an Co-enzym Q erhalten werden können.

Es ist ferner bekannt, dass Mikroorganismen die zur Gattung Pseudomonas gehören in der Lage sind, die Co-enzyme Q8, Qt, und Q10 zu bilden.

40 Ziel der vorliegenden Erfindung war es daher, solche Verbindungen herauszufinden, die in der Lage sind zu einem bedeutenden Ansteigen des Gehaltes an Co-enzym Q pro Zelleinheit zu führen, wenn diese fraglichen Verbindungen dem Zuchtmedium zugesetzt werden, und zwar im Vergleich 45 zu der gebildeten Menge, wenn diese fraglichen Verbindungen nicht in dem Zuchtmedium enthalten sind.

Es ist bekannt, dassp-Hydroxybenzoesäure sowie Essigsäure und deren Salze in der Lage sind, den Gehalt an Co-enzym Q pro Zelleinheit zu erhöhen, wenn man diese Verbindung einem Zuchtmedium zusetzt. Es sei in diesem Zusammenhang auf die japanische Patentveröffentlichung Nr. 20 396/1972 hingewiesen. Ferner ist es auch bekannt, dass die Isopren-Seitenkette bei der Biosynthese über das Gera-nyl-pyrophosphat und das Farnesyl-pyrophosphat gebildet 55 wird, wobei bei dieser Biosynthese die Kondensation von Isopentenyl-pyrophosphat und Dimethyl-allyl-pyrophos-phat wiederholt wird. Da jedoch diese Vorläufer in der Biosynthese nur schwierig durch die Zellmembran hindurchwandern können, hatte bisher noch niemand den Versuch unternommen, derartige Vorläufer einem Zuchtmedium zuzusetzen um den Gehalt an Co-enzym Q zu erhöhen.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man dann, wenn man einen Mikroorganismus aus der Gattung 65 Pseudomonas, der in der Lage ist, das Co-enzym Q zu bilden, in einem Zuchtmedium züchtet, die Ausbeute an dem erwünschten Produkt wesentlich erhöhen kann, indem man dem Zuchtmedium bestimmte Substanzen zusetzt.

5G

60

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Co-enzym Q der Formel I

H3CO.

CH3

(I)

HaCO-^^Y^CHz-C^C " CH2"hiH

0

CH:

worin n einen Wert von 1-10 besitzt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Mikroorganismus aus der Gattung Pseudomonas, der in der Lage ist, das Co-enzym Q zu bilden, in einem Zuchtmedium züchtet, zu dem man mindestens eine Verbindung aus der Gruppe von Verbindungen, welche die folgenden Verbindungen: Isopentenylalkohol, Di-methyl-allyl-alkohol, Geraniol, Isopentenylacetat, Dime-thyl-allyl-acetat, Gernyl-acetat und ß-Methylcrotonsäure umfasst, zusetzt und das gebildete Co-enzym Q gewinnt.

Vorzugsweise werden nach dem erfindungsgemässen Verfahren Co-enzym Qs, Co-enzym Q9 und Co-enzym Q10 hergestellt, denn diese Co-enzyme Q sind vom wirtschaftlichen Standpunkt her bedeutend.

Es zeigte sich, dass die beim erfindungsgemässen Verfahren dem Zuchtmedium zugesetzten, oben genannten Verbindungen von Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas leicht verbraucht werden und dass diese Verbindungen in der Lage sind, den Gehalt an Co-enzym Q pro Zelleinheit wesentlich zu erhöhen.

Beliebige Mikroorganismen, die in der Lage sind, Co-enzym Q zu bilden, können zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens herangezogen werden.

Ein Beispiel für einen Mikroorganismus, der in der Lage ist, Co-enzym Qi0 zu bilden, ist der Mikroorganismus Pseudomonas diminuta, der bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 - USA, am 7. Juli 1953 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 11 568 hinterlegt ist. Dieser Mikroorganismus wurde auch beim Institute of Applied Microbiology (IAM), 1-1,1-chome, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113 mit der Hinterlegungsnummer IAM 1513 hinterlegt. Auch andere Mikroorganismen können jedoch bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung von Co-enzym Q10 herangezogen werden.

Beispiele für Mikroorganismen, die in der Lage sind Co-enzym Qo zu bilden sind beispielsweise Pseudomonas schuyl-killiensis, die bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 - USA - am 20. Juli 1978 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31 419 hinterlegt wurde (dieser Mikroorganismus wurde ferner auch beim Institute of Applied Microbiology (IAM), Tokyo University, Tokyo, Japan mit der Hinterlegungsnummer IAM 1126 hinterlegt), sowie Pseudomonas denitrificans, die bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland - USA - am 30. Juni 1960 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 13 867 hinterlegt wurde (dieser Mikroorganismus wurde ferner auch am Institute of Applied Microbiology (IAM) Tokyo University, Tokyo, Japan, mit der Hinterlegungsnummer IAM 12 023 hinterlegt), und ferner Pseudomonas olevorans, die bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 - USA - am 17. April 1941 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 8062 hinterlegt wurde (dieser Mikroorganis-

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mus wurde ferner auch am Institute of Applied Microbiology (IAM), Tokyo University, Tokyo, Japan, mit der Hinterlegungsnummer IAM 1508 hinterlegt), sowie ferner Pseudomonas putrefaciens, die bei der American Type Culture Col-5 lection (ATCC), 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 - USA - mit der Hinterlegungsnummer ATCC 8071 hinterlegt wurde. Dieser Mikroorganismenstamm konnte von der fraglichen Hinterlegungsstelle vor dem September 1977 auf Antrag bezogen werden. Ferner ist der frag-10 liehe Mikroorganismus auch beim Institute of Applied Microbiology (IAM) mit der Hinterlegungsnummer IAm 1509 hinterlegt. Auch weitere, ähnliche Mikroorganismenstämme können bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung von Co-enzym Q9 verwendet wer-15 den.

Mikroorganismen, die in der Lage sind, Co-enzym Q8 zu bilden sind beispielsweise Pseudomonas rubescens, die bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 - USA - am 20 10. März 1955 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 12 099 hinterlegt wurde (dieser Mikroorganismus wurde ferner auch beim Institute of Applied Microbiology (IAM), Tokyo University, Tokyo, Japan mit der Hinterlegungsnummer IAM 1510 hinterlegt), Pseusomonas fulva, die bei der Ame-25 rican Type Culture Collection (ATCC), 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 - USA - am 20. Juli 1978 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31 418 hinterlegt wurde (dieser Mikroorganismus wurde ferner beim Institute of Applied Microbiology (IAM), Tokyo University, Tokyo, Ja-30 pan mit der Hinterlegungsnummer IAM 1529 hinterlegt), sowie Pseudomonas putida, die bei der American Type Culture Collection (ATCC) 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 - USA - mit der Hinterlegungsnummer ATCC 4359 hinterlegt wurde. Dieser Mikroorganismen-35 stamm konnte bei der American Type Culture Collection bereits vor dem September 1977 auf Antrag frei bezogen werden. Ferner ist der fragliche Mikroorganismus auch am Institute of Applied Microbiology (IAM) mit der Hinterlegungsnummer IAm 1506 hinterlegt. Auch weitere ähnliche 40 Mikroorganismen können zur Herstellung von Co-enzym Qs nach dem erfindungsgemässen Verfahren herangezogen werden.

In dem Zuchtmedium, das zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens herangezogen wird, können. 45 Zuckerarten, wie zum Beispiel Glucose, Melassen und ähnliches, und beliebige andere derartige Materialien als Substanzen herangezogen werden, die den Kohlenstoff für die Mikroorganismen liefern. Derartige Materialien können also als Kohlenstoffquellen in dem Zuchtmedium eingesetzt wer-5o den. Anorganische Stickstoffverbindungen, wie zum Beispiel Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und ähnliches, und auch organische Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie zum Beispiel Maisquellwasser, Fischfleischextrakte, Peptone, Hefeextrakte und ähnliches, können als Material her-55 angezogen werden, das den für die Mikroorganismen nötigen Stickstoff liefert, also als Stickstoffquellen. Ausserdem können als organische Salze, also als Mineralstofflieferanten, Materialien wie Kaliumsalze, Natriumsalze, Magnesiumsalze, Salze der Phosphorsäure und der Schwefelsäure 60 verwendet werden.

Die Züchtung der Mikroorganismen wird im allgemeinen durch Rühren unter Lufteinwirkung und unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes im Bereich von 4-8 durchgeführt, wobei die Züchtungstemperatur im allgemeinen im Bereich 65 von 25-35 °C liegt, und die Züchtungszeit im allgemeinen 10-50 Stunden beträgt.

Die beim erfindungsgemässen Verfahren durchzuführende Zugabe von Isopentenyl-alkohol, Dimethyl-allyl-alkohol,

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Geraniol, Isopentenyl-acetat, Dimethyl-allyl-acetat, Gera-nyl-acetat und ß-Methyl-crotonsäure kann in geeigneter Weise, d.h. durch ein gewünschtes Zugebeverfahren und zu einer gewünschten Zeit erfolgen. Beispielsweise kann die gesamte Menge dieses Zusatzes beim Beginn der Züchtung zugesetzt werden, oder zu irgendeinem gewünschten Stadium des Wachstums des Mikroorganismus während der Züchtung, oder man kann die Gesamtmenge allmählich durch kleine Zugabenmengen zusetzen, beispielsweise gemäss dem Zustand der Fermentation. Ausserdem ist es möglich den erfindungsgemässen Zusatz als einzigen Zusatz beizugeben, oder in Kombination mit anderen Zusätzen. Die Menge an Zusatz, die beim erfindungsgemässen Verfahren gemacht werden soll, liegt üblicherweise im Bereich von 1 x 10-s bis 5 x 10"3 Mol Zusatz pro Liter, und zwar bezogen auf die endgültige Konzentration, und insbesondere liegt die Menge im Bereich von 5 x 10" 5 bis 5 x 10~4 Mol pro Liter Zuchtmedium.

Nach der Züchtung wird das gebildete Co-enzym Q aus den Zellen extrahiert, und von den übrigen Materialien abgetrennt. Beispielsweise können die nassen Zellen, die durch Zentrifugieren gewonnen werden, extrahiert werden, indem man ein hydrophiles Lösungsmittel anwendet, wie zum Beispiel Aceton oder ähnliches. Eine das Co-enzym Q enthaltende Fraktion wird dann in ein Lösungsmittel eingebracht, wie zum Beispiel in Petroläther oder ähnliches. Anschliessend wird dann die das Co-enzym Q enthaltende Fraktion einer fraktionierten Reinigung unterworfen, beispielsweise unter Verwendung von Aluminiumoxyd oder ähnlichem, wobei man dadurch dann das Co-enzym Q isolieren kann.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wurde die Identifikation des Co-enzyms Q durchgeführt, indem man das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Produkt mit einer Standardprobe mit Hilfe des UV-Spektrums und der Bestimmung der Schmelzpunkt verglich, sowie indem man eine Dünnschichtchromatographie mit umgekehrter Phase durchführte, in welcher eine Mischung aus Aceton + Wasser im Mischungsverhältnis 95: 5 als Lösungsmittelsystem angewandt wurde, und indem man weitere Identifikationen durchführte.

Die Erfindung sei nun anhand der folgenden Beispiele noch näher erläutert:

Beispiel 1

In einen Gärbehälter eines Fassungsvermögens von 30 Litern gab man 15 Liter eines Zuchtmediums, welches einen pH-Wert von 7,0 besass. Dieses Zuchtmedium enthielt die folgenden Bestandteile in den angegebenen Mengen:

Bestandteil Menge in %

KH2P04 0,05

Na2HP04 0,15

MgS04-7H20 0,05

Glucose 1,0

Pepton 1,0

Hefeextrakt 0,2

Man sterilisierte dann den Inhalt mit Dampf und gab 645 mg Isopentenyl-alkohol, gelöst in 10 ml Äthanol, zu. Anschliessend wurde Pseudomonas schuylkilliensis, die bei der American Type Culture Collection USA mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31419 hinterlegt ist, und beim Institute of Applied Microbiology, Tokyo die Hinterlegungsnummer IAM-1126 besitzt, und die vorher in 500 ml eines Zuchtmediums der gleichen Zusammensetzung, wie sie oben angegeben wurde, während 24 Stunden gezüchtet wurde, in das oben beschriebene Zuchtmedium eingeimpft, und man züchtete während 24 Stunden unter Belüftung bei einer Temperatur von 27 °C. Die Belüftung wurde durchgeführt, indem man 15 Liter Luft pro Minute durchblies.

Nach dieser Züchtungsperiode wurde die Zuchtbrühe ab-zentrifugiert, wobei man 418 g an nassen Zellen erhielt, die einer Menge von 87 g trockenen Zellen entsprachen.

Zu den nassen Zellen setzte man 2 Liter Aceton zu und extrahierte unter Rühren. Anschliessend wurden dann die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt. Dieses Arbeitsverfahren wurde noch zweimal wiederholt. Die so erhaltenen Acetonextrakte wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, um das Aceton abzudestillie-ren. Anschliessend wurde die dabei zurückbleibende Lösung dreimal mit je 1 Liter Petroläther extrahiert und die so erhaltenen Petrolätherschichten wurden miteinander vereinigt. Die so erhaltene Petrolätherphase wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann unter verminderten Druck eingeengt. Dabei verblieb als Rückstand ein Öl, welches in einer geringen Menge an Petroläther gelöst wurde und dann einer Chromatographie auf Aluminiumoxyd unterworfen wurde. Bei dieser Chromatographie verwendete man als Elutionsmittel eine Mischung aus Petroläther und Äthyläther.

Aus dem so erhaltenen Eluat, welches das Co-enzym Q enthielt, destillierte man das Lösungsmittel ab. Das dabei zurückbleibende Öl wurde in einer kleinen Menge Äthanol gelöst, und man liess es in einem Kühlschrank stehen, wobei sich Kristalle von Co-enzym Q9 abschieden. Diese Kristalle wurden dreimal aus Äthanol umkristallisiert, und man erhielt dabei 142,6 mg an Kristallen von Co-enzym Q9.

Anderseits wurde die gleiche Züchtung, wie sie oben beschrieben ist, durchgeführt indem man 15 Liter eines Kulturmediums gleicher Zusammensetzung verwendete, dem jedoch kein Isopentenyl-alkohol zugesetzt worden war. In gleicher Weise wie dies oben beschrieben wurde, erhielt man dabei 359 g an nassen Zellen, entsprechend 69 g an trockenen Zellen. Auch in der Folge wurden die gleichen Arbeitsverfahren wie oben beschrieben durchgeführt, man erhielt jedoch in diesem Fall nur 81,42 mg an Kristallen des Co-enzyms Q9.

Unter Zugrundelegung der obigen Ergebnisse wurde die Wirkung des Isopentenyl-alkoholes auf die Bildung von Co-enzym Qg berechnet. Durch die Zugabe des Isopentenyl-alkoholes zur der Zuchtbrühe konnte die Ausbeute an Co-enzym Q9 pro Liter Zuchtbrühe um 75% erhöht werden, und pro Liter trockener Zellen um 39%. Aus diesen Ergebnissen sieht man deutlich, dass durch die Zugabe von Isopentenyl-alkohol die Ausbeute an gebildetem Co-enzym Q9 wirksam erhöht werden kann.

Beispiel 2

Das Arbeitsverfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass jetzt 1,16 g an Geraniol anstelle des Isopentenyl-alkoholes zugesetzt wurden. Man erhielt bei diesem Züchtungsverfahren 390 mg an nassen Zellen, entsprechendes g an trockenen Zellen. Die so erhaltenen nassen Zellen wurden den gleichen Arbeitsverfahren unterworfen, die in Beispiel 1 beschrieben sind, und man erhielt so 104,7 mg an Kristallen des Co-enzyms Q9.

Zu Vergleichszwecken wurde der gleiche Mikroorganismus unter Verwendung eines Zuchtmediums der gleichen Zusammensetzung gezüchtet, dem man jedoch kein Geraniol zugesetzt hatte. Man erhielt dabei 327 g an nassen Zellen, entsprechend 63 g an trockenen Zellen. Aus diesen Zellen wurden 74,3 mg an Kristallen des Co-enzyms Q9 erhalten.

Unter Zugrundelegung der obigen Ergebnisse wurde die Wirksamkeit des Geraniols auf die Bildung des Co-enzyms

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Qg berechnet. Dabei zeigte es sich, dass durch die Zugabe des Geraniols zu dem Züchtungsmedium die Ausbeute an dem Co-enzym Q9 pro Liter der Zuchtbrühe um 41 % gesteigert werden konnte, und pro Gramm der trockenen Zellen um 30% erhöht wurde.

Beispiel 3

Es wurde der Mikroorganismus Pseudomonas rubescens, der bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 12 099 und bei Institute of Applied Microbiology, Tokyo, unter der Hinterlegungsnummer IAM-1510 hinterlegt ist, wurde im gleichen Zuchtmedium gezüchtet und in der gleichen Weise gezüchtet, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist. Man erhielt dabei 410 g an nassen Zellen, entsprechend 73 g an trockenen Zellen. Diese Zellen wurden in der gleichen Weise behandelt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, und man erhielt dabei 58,4 mg des Co-enzym Q8.

Zu Vergleichszwecken wurde anderseits der gleiche Mikroorganismus in dem gleichen Zuchtmedium gezüchtet, mit Ausnahme dessen, dass jetzt kein Geraniol zugesetzt wurde. Man erhielt dabei 390 g an nassen Zellen, entsprechend 74 g trockenen Zellen. Aus diesen Zellen wurden 44,4 mg an dem Co-enzym Q8 erhalten.

Basierend auf den obigen Ergebnissen wurde wieder der gleiche Vergleich gemacht, wie dies in Beispiel 1 bereits beschrieben ist. Man sieht daraus, dass durch die Zugabe von Geraniol zu dem Kulturmedium die Ausbeute an dem Co-enzym Qg pro Liter Zuchtbrühe um 32% gesteigert werden konnte, und pro Gramm trockenen Zellen um 33%.

Beispiel 4

Es wurde der Mikroorganismus Pseudomonas diminuta, der bei der American Type Culture Collection mit der Nummer ATCC 11 568, und beim Institute of Applied Microbiology, Tokyo, mit der Nummer IAM-1513 hinterlegt ist, nach dem gleichen Arbeitsverfahren gezüchtet, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, mit Ausnahme dessen, dass jetzt Natrium-acetat anstelle der Glucose in der Formulierung des Zuchtmediums enthalten war. Ferner bestand der Unterschied zu Beispiel 1 auch darin, dass drei Fraktionen zu je 300 ml an dem Isopentenyl-alkohol getrennt zugesetzt wurden, also eine Gesamtmenge von 900 mg.

Bei diesem Verfahren erhielt man 380 g der nassen Zellen, entsprechend 69 g trockenen Zellen, und diese wurden dann den gleichen Behandlungen unterworfen, die in Beispiel 1 beschrieben sind. Dabei erhielt man 30,5 mg an Kristallen des Co-enzyms Q10.

Anderseits wurde der gleiche Mikroorganismus in einem Zuchtmedium gezüchtet, dem kein Isopentenyl-alkohol zugesetzt worden war, und man erhielt dabei 320 g an nassen Zellen, entsprechend 61 g an trockenen Zellen. Aus diesem Material wurden 19,8 mg an Kristallen des Co-enzyms Q10 erhalten.

Unter Zugrundelegung der oben angegebenen Ergebnisse und unter Durchführung derselben Vergleiche, die auch in Beispiel 1 gemacht wurden, zeigte es sich, dass durch die Zugabe des Isopentenyl-alkoholes die Ausbeute an dem Co-enzym Q10 pro Liter der Zuchtbrühe um 54,0% gesteigert werden konnte, und die Steigerung der Ausbeute pro Gramm der trockenen Zellen betrug 38%.

Beispiel 5

Es wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren durchgeführt, mit Ausnahme dessen, dass jetzt der Mikroorganismus Pseudomonas denitrificans, der bei der American Type

Culture Collection mit der Nummer ATCC 13 867, und beim Institute of Applied Microbiology, Tokyo, unter der Nummer IAM-12 023 hinterlegt ist, gezüchtet wurde. Ferner unterschied sich das hier angewandte Verfahren von demjenigen des Beispiels 1, dass zwei Portionen zu je 1 g an Geraniol getrennt zu dem Zuchtmedium zugesetzt wurden, also insgesamt 2 g. Die Zugabe erfolgte zu verschiedenen Zeiten während der Züchtung. Bei diesem Verfahren erhielt man 395 g an nassen Zellen, entsprechend 76 g an trockenen Zellen, und die so erhaltenen Zellen wurden dann den gleichen Behandlungsverfahren unterworfen, die in Beispiel 1 beschrieben sind. Dabei erhielt man 63,1 mg an Kristallen des Co-enzyms Q9.

Anderseits wurde der gleiche Mikroorganismus in einem Zuchtmedium gezüchtet, welchem kein Geraniol zugesetzt worden war. Man erhielt dabei 328 g an nassen Zellen, entsprechend 63 g an trockenen Zellen. Aus diesen wurden 37,2 mg des Co-enzyms Q9 erhalten.

Basierend auf den oben angegebenen Ergebnissen wurde der gleiche Vergleich der Resultate gemacht, wie dies in Beispiel 1 erläutert ist. Dabei sieht man, dass durch die Zugabe des Geraniols die Ausbeute an dem Co-enzym Q9 pro Liter der Zuchtbrühe um 69% gesteigert wurde, und die Steigerung der Ausbeute pro Gramm an trockenen Zellen betrug 41%.

Beispiel 6

Das Arbeitsverfahrendes Beispiels 1 wurde durchgeführt, mit Ausnahme dessen, dass jetzt der Mikroorganismus Pseudomonas fulva, der bei der American Type Culture Collection die Hinterlegungsnummer ATCC 31 418 besitzt, und beim Institute of Applied Microbiology, Tokyo, mit der Nummer IAM-1529 hinterlegt ist, verwendet wurde. Im weiteren unterschied sich die hier angewandte Verfahrensweise vom Beispiel 1 dahingehend, dass jetzt drei Portionen von je 1 g an Isopentenyl-alkohol getrennt zu verschiedenen Zeitpunkten während der Züchtung zugesetzt wurden, also insgesamt 3 g. Man erhielt dabei 390 g an nassen Zellen, entsprechend 73 g an trockenen Zellen, und diese wurden dann der gleichen Behandlung unterworfen, die in Beispiel 1 beschrieben ist. Dabei erhielt man 86,4 mg an Kristallen des Co-enzyms Q8.

Anderseits wurde der gleiche Mikroorganismus in einem Zuchtmedium gezüchtet, dem man keinen Isopentènylalko-hol zugesetzt hatte. In diesem Fall erhielt man 350 g an nassen Zellen, entsprechend 67 g an trockenen Zellen. Aus diesen wurden 60,5 mg an Kristallen des Co-enzyms Q8 erhalten.

Unter Zugrundelegung der obigen Ergebnisse wurde ein Vergleich der Resultate so durchgeführt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Man sieht daraus, dass durch die Zugabe des Isopentenyl-alkoholes die Ausbeute an dem Co-enzym Qg pro Liter der Zuchtbrühe um 43% gesteigert wurde, und die Steigerung der Ausbeute pro Gramm an trockenen Zellen betrug 31%.

Beispiel 7

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass als Mikroorganismus Pseudomonas rubescens, der bei der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer ATCC 12 099, und beim Institute of Applied Microbiology, Tokyo, mit der Nummer IAM-1510 hinterlegt ist, verwendet wurde, und dass in diesem Fall 645 mg an Dimethyl-allyl-alkohol dem Zuchtmedium zugesetzt wurden. Man erhielt dabei 430 g an nassen Zellen, entsprechend 80 g an trockenen Zellen, und diese wurden so behandelt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben s

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ist. Dabei wurden 86 mg an Kristallen des Co-enzyms Q8 erhalten.

Anderseits wurde der gleiche Mikroorganismus in dem entsprechenden Zuchtmedium gezüchtet, in diesem Fall wurde jedoch kein Dimethyl-allyl-alkohol zugesetzt. Dabei erhielt man 390 g an nassen Zellen, entsprechend 76 g an trok-kenen Zellen. Aus diesen Zellen wurden 68 mg an Kristallen des Co-enzyms Q8 erhalten.

Unter Zugrundelegung der obigen Ergebnisse wurden die gleichen Vergleiche angestellt, wie dies in Beispiel 1 erfolgte. Daraus sieht man, dass durch die Zugabe des Dimethyl-allyl-alkoholes die Ausbeute an dem Co-enzym Q8 pro Liter der Zuchtbrühe um 26% gesteigert wurde, und die Steigerung der Ausbeute pro Gramm an trockenen Zellen betrug 20%.

Beispiel 8

Das in Beispiel 1 beschriebene Arbeitsverfahren wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass jetzt als Mikroorganismus Pseudomonas fulva, der bei der American Type Culture Collection die Hinterlegungsnummer ATCC 31 418, und beim Institute of Applied Microbiology, Tokyo, die Hinterlegungsnummer IAM-1529 aufweist, verwendet wurde. Ferner wurden jetzt zu dem Zuchtmedium 750 mg an ß-Methyl-crotonsäure zugesetzt. Man erhielt dabei 540 g an nassen Zellen, entsprechend 105 g an trockenen Zellen,-und diese Zellen wurden den gleichen Behandlungen unterworfen, die in Beispiel 1 erläutert sind. Dabei gewann man 102 mg an Kristallen des Co-enzyms Qa.

Anderseits wurde der gleiche Mikroorganismus im gleichen Kulturmedium gezüchtet, wobei jedoch jetzt keine ß-Methyl-crotonsäure zugesetzt wurde. Man erhielt dabei 525 g an nassen Zellen, entsprechend 103 g an trockenen Zellen, und aus diesen Zellen gewann man 79 mg an Kristallen des Co-enzyms Q8.

Basierend auf den obigen Ergebnissen wurde der gleiche Vergleich der Resultate gemacht, der auch in Beispiel 1 beschrieben ist. Dabei stellte man fest, dass durch die Zugabe der ß-Methyl-crotonsäure die Ausbeute an dem Co-enzym Q8 pro Liter der Zuchtbrühe um 28% gesteigert wurde, und die Steigerung der Ausbeute pro Gramm an trockenen Zellen betrug 26%.

Beispiel 9

Das Arbeitsverfahren des Beispiels I wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass jetzt als Mikroorganismus Pseudomonas olevorans, der bei der American Type Culture Collection mit der Nummer ATCC 8062, und beim Institute of Applied Microbiology, Tokyo, mit der Nummer IAM-1508 hinterlegt ist, verwendet wurde. Ferner unterschied sich die Verfahrensweise von derjenigen des Beispiels 1 auch noch dahingehend, dass jetzt 960 mg an Dimethyl-allyl-acetat zugesetzt wurden. Dabei erhielt man 490 g an nassen Zellen, entsprechend 94 g an trockenen Zellen, und diese wurden der gleichen Behandlung unterworfen, die in Beispiel 1 beschrieben ist. Dabei wurden 96 mg an Kristallen des Co-enzyms Qg erhalten.

Anderseits wurde der gleiche Mikroorganismus in einem Zuchtmedium gezüchtet, dem diesmal kein Dimethyl-allyl-acetat zugesetzt wurde. Dabei erhielt man 470 g an nassen Zellen, entsprechend 90 g an trockenen Zellen, und. aus diesem Material wurden 68 mg an Kristallen des Co-enzyms Q9 gewonnen.

Basierend auf den obigen Ergebnissen wurde der gleiche Vergleich gemacht, der in Beispiel 1 erläutert ist. Dabei sieht man, dass durch die Zugabe des Dimethyl-allyl-acetates die Ausbeute an dem Co-enzym Q9 pro Liter der Zuchtbrühe um 42% gesteigert wurde, und die Steigerung der Ausbeute pro Gramm an trockenen Zellen betrug 34%.

Beispiel 10

5 Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass jetzt als Mikroorganismus Pseudomonas schuylkilliensis, der bei der American Type Culture Collection die Hinterlegungsnummer ATCC 31 419 besitzt, und beim Institute of Applied Microbiology, Tokyo, io mit der Nummer IAM-1126 hinterlegt wurde, eingesetzt wurde. Ferner wurden zu dem Zuchtmedium jetzt 1,47 g an Geranyl-acetat zugesetzt. Man erhielt dabei 530 g an nassen Zellen, entsprechend 93 g an trockenen Zellen, und diese wurden der gleichen Behandlung unterworfen, die in Beispiel 15 1 beschrieben ist. Dabei erhielt man 120 mg an Kristallen des Co-enzyms Qg.

Zu Vergleichszwecken wurde der gleiche Mikroorganismus in einem gleichen Zuchtmedium gezüchtet, wobei jedoch jetzt kein Geranyl-acetat beigegeben wurde. Dabei er-20 hielt man 525 g an nassen Zellen* entsprechend 90 g an trok-kenen Zellen, und aus diesen Zellen wurden 98 g an Kristallen des Co-enzyms Q9 erhalten.

Basierend auf diesen obigen Ergebnissen wurde der gleiche Vergleich angestellt, der auch in Beispiel 1 gemacht wur-25 de. Durch die Zugabe des Geranyl-acetates wurde die Ausbeute an dem Co-enzym Q9 pro Liter Zuchtbrühe um 23% gesteigert, und die Steigerung der Ausbeute pro Gramm an trockenen Zellen betrug 19%.

30 Beispiel 11

Es wurde wieder das in Beispiel I beschriebet Verfahren eingehalten, mit Ausnahme dessen, dass der verwendete Mikroorganismus Pseudomonas denitrifîcans, der bei der American Type Culture Collection die Hinterlegungsnummer 35 ATCC 13 867 besitzt, und beim Institute of Applied Microbiology, Tokyo, mit der Nummer IAM-12 023 hinterlegt ist, verwendet wurde. Ferner unterschied sich das verwendete Zuchtmedium von dem in Beispiel I eingesetzten dahingehend, dass jetzt eine Mischung aus960 mg an Isopentenyl-40 acetat und 1,47 g Geranyl-acetat zugegeben wurde. Man erhielt dabei 480 g an nassen Zellen, entsprechend 96 g an trockenen Zellen. Diese Zellen wurden der gleichen Behandlung unterworfen, die in Beispiel I beschrieben ist. Dabei wurden 115 mg an Kristallen des Co-enzyms Q9 erhalten. 45 In einem Vergleichsversuch wurde der gleiche Mikroorganismus in einem Zuchtmedium wachsen gelassen, dem jedoch keine Mischung an Isopentenyl-acetat und Geranyl-acetat zugesetzt wurde. Man erhielt dabei 490 g an nassen Zellen, entsprechend 98 g an trockenen Zellen. Aus diesen so wurden 76 mg an Kristallen des Co-enzyms Q9 erhalten.

Basierend auf den obigen Ergebnissen wurde der gleiche Vergleich gemacht, wie in Beispiel 1. Durch die Zugabe der Mischung aus Isopentenyl-acetat und Geranyl-acetat wurde die Ausbeute an dem Co-enzym Q9 pro Liter des Zuchtme-55 diums um 51 % gesteigert, und pro Gramm an trockenen Zellen um 54%.

Beispiel 12

Es wurde das gleiche Züchtungsverfahren durchgeführt, 6o wie in Beispiel 4, mit Ausnahme dessen, dass der Mikroorganismus Pseudomonas diminuta, der bei der American Type Culture Collection die Hinterlegungsnummer ATCC 11 568 besitzt, und bei dem Institute of Applied Microbiology, Tokyo, mit der Nummer IAM-I5I3 hinterlegt ist, jetzt gezüch-6s tet wurde, indem man eine Mischung aus 960 mg Isopentenyl-acetat und 960 mg Dimethyl-allyl-acetat zusetzte. Man erhielt dabei 495 g an nassen Zellen, entsprechend 98 g an trockenen Zellen. Diese wurden der gleichen Behandlung

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unterworfen, die in Beispiel 1 beschrieben ist, wobei man 53 mg an Kristallen des Co-enzyms Q10 erhielt.

Anderseits wurde der gleiche Mikroorganismus in einem Zuchtmedium gezüchtet, dem jedoch diesmal nicht die Mischung aus Isopentenyl-acetat und Dimethyl-allyl-acetat zu- s gesetzt wurde. Dabei erhielt man 480 g an nassen Zellen, entsprechend 94 g an trockenen Zellen. Aus diesem Material wurden 39 mg an Kristallen des Co-enzyms Q10 erhalten.

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Basierend auf den obigen Ergebnissen wurde der gleiche Vergleich angestellt, der auch in Beispiel 1 gemacht wurde. Daraus ersah man, dass durch die Zugabe des Isopentenyl-acetates und des Dimethyl-allyl-acetates die Ausbeute an dem Co-enzym Qi0 pro Liter Zuchtbrühe um 36% gesteigert wurde. Die Steigerung der Ausbeute pro Gramm an trockenen Zellen betrug 32%.

s

Claims

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PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Co-enzym Q der Formel I

CH3

CH2-CH=C -CH2-)-nH

I n

CHs

(I)

worin n einen Wert von 1-10 besitzt, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus aus der Gattung Pseudomonas, der in der Lage ist das Co-enzym Q zu bilden, in einem Zuchtmedium züchtet, zu dem man mindestens eine Verbindung aus der Gruppe von Verbindungen, welche die folgenden Verbindungen: Isopentenylalkohol, Dimethyl-allyl-alkohol, Geraniol, Isopentenyl-acetat, Dimethyl-allyl-acetat, Gernyl-acetat und ß-Methyl-crotonsäure umfasst, zusetzt und das gebildete Co-enzym Q gewinnt.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus Pseudomonas diminuta mit der Hinterlegungsnummer bei der American Typ Culture Collection ATCC 11 568 ist, und dass das gebildete Co-enzym Q das Co-enzym QI0 ist.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus Pseudomonas schuylkilliensis mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31 419, Pseudomonas denitrificans mit der Hinterlegungsnummer ATCC 13 867 oder Pseudomonas olevorans mit der Hinterlegungsnummer ATCC 8062 ist, und dass das gebildete Co-enzym Q das Co-enzym Q9 ist.
4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus Pseudomonas rubescens mit der Hinterlegungsnummer ATCC 12 099 oder Pseudomonas fulva mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31 418 ist, und dass das gebildete Co-enzym Q das Co-enzym Q8 ist.