CH648060A5 - Stabilised urease solution - Google Patents
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Abstract
Description
**WARNUNG** Anfang DESC Feld konnte Ende CLMS uberlappen **. ** WARNING ** Beginning of DESC field could overlap end of CLMS **.
PATENTANSPRÜCHE 1. Stabilisierte Urease-Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass sie Wasser, eine Puffersubstanz, ein bakteriostatisches Mittel, einen Chelatbildner, eine organische Polyhydroxy Verbindung und Urease enthält. PATENT CLAIMS 1. Stabilized urease solution, characterized in that it contains water, a buffer substance, a bacteriostatic agent, a chelating agent, an organic polyhydroxy compound and urease.
2. Stabilisierte Urease-Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Puffersubstanz N-2-Eydroxy- äthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure ist und in einer Menge von 0,5 bis 5% des Gewichtes des Wassers vorliegt. 2. Stabilized urease solution according to claim 1, characterized in that the buffer substance is N-2-hydroxy- äthylpiperazin-N'-2-ethanesulfonic acid and is present in an amount of 0.5 to 5% of the weight of the water.
3. Stabilisierte Urease-Lösung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasser praktisch frei von Schwermetallen ist. 3. Stabilized urease solution according to claim 1 or 2, characterized in that the water is practically free of heavy metals.
4. Stabilisierte Urease-Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das bakteriostatische Mittel 2,4-Dichlorphenol ist. 4. Stabilized urease solution according to one of claims 1 to 3, characterized in that the bacteriostatic agent is 2,4-dichlorophenol.
5. Stabilisierte Urease-Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das bakteriostatische Mittel in einer Menge von 0,1 bis 1,0 Gew.-% vorliegt. 5. Stabilized urease solution according to one of Claims 1 to 4, characterized in that the bacteriostatic agent is present in an amount of 0.1 to 1.0% by weight.
6. Stabilisierte Urease-Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelatbildner Äthylendiamintetraessigsäure ist. 6. Stabilized urease solution according to one of claims 1 to 5, characterized in that the chelating agent is ethylenediaminetetraacetic acid.
7. Stabilisierte Urease-Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelatbildner in genügender Menge vorliegt, um mit allen in der Lösung vorhandenen Schwermetallen Chelate zu bilden. 7. Stabilized urease solution according to one of claims 1 to 6, characterized in that the chelating agent is present in sufficient quantity to form chelates with all the heavy metals present in the solution.
8. Stabilisierte Urease-Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Puffersubstanz Triäthanolamin ist. 8. Stabilized urease solution according to claim 1, characterized in that the buffer substance is triethanolamine.
9. Stabilisierte Urease-Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Puffersubstanz in genügender Menge vorliegt, so dass die Lösung einen pH Wert zwischen 5 und 9 aufweist. 9. Stabilized urease solution according to one of claims 1 to 8, characterized in that the buffer substance is present in sufficient quantity so that the solution has a pH value between 5 and 9.
10. Stabilisierte Urease-Lösung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert zwischen 6 und 8 liegt. 10. Stabilized urease solution according to claim 9, characterized in that the pH is between 6 and 8.
11. Stabilisierte Urease-Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Polyhydroxy-Verbindung Glycerin, Äthylenglykol, Sorbit oder Propylenglykol ist. 11. Stabilized urease solution according to one of claims 1 to 10, characterized in that the organic polyhydroxy compound is glycerol, ethylene glycol, sorbitol or propylene glycol.
12. Stabilisierte Urease-Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Polyhydroxy-Verbindung in einer Menge von etwa 50 Vol.-% vorliegt. 12. Stabilized urease solution according to one of claims 1 to 11, characterized in that the organic polyhydroxy compound is present in an amount of about 50% by volume.
13. Stabilisierte Urease-Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Urease in einer Menge von mehr als 25'000 I.E. pro Liter vorliegt. 13. Stabilized urease solution according to one of claims 1 to 12, characterized in that the urease in an amount of more than 25,000 I.U. per liter.
14. Stabilisierte Urease-Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Urease in einer Menge von etwa 25'000 I.E. pro Liter vorliegt. 14. Stabilized urease solution according to one of claims 1 to 12, characterized in that the urease in an amount of about 25,000 I.U. per liter.
15. Stabilisierte Urease-Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Puffersubstanz ein Pufferungsmittel niedriger Leitfähigkeit ist, ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Stoffen: N-2-Hydroxyäthylpiperazin -N'-2-äthansulfonsäure, Triäthanolamin, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Diäthanolamin, Aminomethylpropanol und Mischungen dieser Stoffe. 15. Stabilized urease solution according to claim 1, characterized in that the buffer substance is a low-conductivity buffering agent selected from the following group of substances: N-2-hydroxyethylpiperazine -N'-2-ethanesulfonic acid, triethanolamine, tris (hydroxymethyl) aminomethane , Diethanolamine, aminomethylpropanol and mixtures of these substances.
16. Stabilisierte Urease-Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie folgende Bestandteile enthält: Wasser, N-2-hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure und Triäthanolamin als Puffersubstanz, 2,4-Dichlorphenol als bakteriostatisches Mittel, Äthylendiamintetraessigsäure als Chelatbildner, eine organische Polyhydroxy Verbindung, ausgewählt aus Glycerin, Äthylenglykol, Sorbit und Propylenglykol, und Urease-Enzym in einer Menge von mehr als 25'000 I.E. pro Liter. 16. Stabilized urease solution according to claim 1, characterized in that it contains the following components: water, N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid and triethanolamine as a buffer substance, 2,4-dichlorophenol as a bacteriostatic agent, ethylenediaminetetraacetic acid as a chelating agent , an organic polyhydroxy compound selected from glycerine, ethylene glycol, sorbitol and propylene glycol, and urease enzyme in an amount of more than 25,000 IU per liter.
17. Zubereitung zur Herstellung einer stabilisierten Urease-Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie einerseits eine konzentrierte stabilisierte Urease-Lösung folgender Zusammensetzung: Wasser, N-2-hydroxy äthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure und Triäthanolamin als Puffersubstanz, 2,4-Dichlorphenol als bakteriostatisches Mittel, Äthylendiamintetraessigsäure als Chelatbildner, eine organische Polyhydroxy-Verbindung, ausgewählt aus Glycerin, Äthylenglykol, Sorbit und Propylenglykol, und Urease Enzym in einer Menge von mehr als 25'000 I.E. pro Liter, und andererseits eine Verdünnungsflüssigkeit in Form von Wasser oder einer 0,004-gewichtsprozentigen wässrigen Lösung von 2,4-Dichlorphenol enthält, welche mit der konzentrierten stabilisierten Urease-Lösung kombinierbar ist, so dass die resultierende stabilisierte verdünnte Urease-Lösung eine Urease-Aktivität von 25'000 I.E. + 25 % pro Liter aufweist. 17. Preparation for the production of a stabilized urease solution according to claim 1, characterized in that on the one hand it contains a concentrated stabilized urease solution of the following composition: water, N-2-hydroxy äthylpiperazin-N'-2-ethanesulfonic acid and triethanolamine as a buffer substance, 2 , 4-dichlorophenol as a bacteriostatic agent, ethylenediaminetetraacetic acid as a chelating agent, an organic polyhydroxy compound selected from glycerine, ethylene glycol, sorbitol and propylene glycol, and urease enzyme in an amount greater than 25,000 IU per liter, and on the other hand a dilution liquid in the form of water or a 0.004 percent by weight aqueous solution of 2,4-dichlorophenol, which can be combined with the concentrated stabilized urease solution, so that the resulting stabilized dilute urease solution has a urease activity of 25,000 IU + 25% per liter.
Die Erfindung bezieht sich auf eine stabilisierte Urease Lösung, die insbesondere für die Harnstoffbestimmung verwendet werden kann. Mit solchen stabilisierten Lösungen kann die Harnstoffmenge in menschlichen Seren, wie Blut, Plasma u. dgl., quantitativ bestimmt werden. Die Urease Lösung eignet sich beispielsweise zur Verwendung in Harnstoffbestimmungsverfahren, die auf Leitfähigkeitsmessungen basieren. The invention relates to a stabilized urease solution which can be used in particular for the determination of urea. With such stabilized solutions, the amount of urea in human sera, such as blood, plasma and the like. Like., To be determined quantitatively. The urease solution is suitable, for example, for use in urea determination methods that are based on conductivity measurements.
Ein Verfahren für die Harnstoffbestimmung wurde von W.T. Chin und W. Kroontje in dem Artikel Conductivity Method for Determination of Urea in Anal. Chem., 33: 1757-1760 (1961) beschrieben. Das Verfahren von Chin und Kroontje basiert auf dem Unterschied der elektrischen Leitfähigkeit von Harnstoff und von Ammoniumcarbonat, das durch die Reaktion von Urease mit Harnstoff erzeugt wird, in einer Lösung. Das Verfahren von Chin und Kroontje wird in abgeänderter Form auch von P. Bourrelly und V. Bourrelly-Durand in J. Chim. Phys., 62: 673-677 (1965) und von M. Hahns und A. Rey in Biochim. Biophys. Acta, 227: 630-638 (1971) beschrieben. A method for the determination of urea has been described by W.T. Chin and W. Kroontje in the article Conductivity Method for Determination of Urea in Anal. Chem., 33: 1757-1760 (1961). The method of Chin and Kroontje is based on the difference in the electrical conductivity of urea and ammonium carbonate, which is produced by the reaction of urease with urea, in a solution. The method of Chin and Kroontje is also modified by P. Bourrelly and V. Bourrelly-Durand in J. Chim. Phys., 62: 673-677 (1965) and by M. Hahns and A. Rey in Biochim. Biophys. Acta, 227: 630-638 (1971).
Eine Verbesserung des Verfahrens zum quantitativen Bestimmen von Harnstoff unter Anwendung von Leitfähigkeitsmessungen wurde von G. Paulson, R. Roy und J. Sternberg entwickelt, beschrieben in dem Artikel A Rate-Sensing Approach to Urea-Measurement in Sein. Chem., 17: 644 (1971). Das verbesserte Verfahren beruht auf der Ermittlung der Anderungsgeschwindigkeit der Leitfähigkeit. Das Verfahren verwendet die Geschwindigkeit der Zunahme der Leitfähigkeit einer Lösung, in der Urease die Hydrolyse von Harnstoff zu Ammoniumcarbonat katalysiert: An improvement in the method for quantifying urea using conductivity measurements was developed by G. Paulson, R. Roy and J. Sternberg, described in the article A Rate-Sensing Approach to Urea-Measurement in Sein. Chem., 17: 644 (1971). The improved method is based on determining the rate of change in conductivity. The method uses the rate of increase in the conductivity of a solution in which urease catalyzes the hydrolysis of urea to ammonium carbonate:
Es wurde gezeigt, dass die beobachtete Geschwindigkeit der Änderung der Leitfähigkeit proportional ist zur Harnstoffkonzentration in der Probe.Insbesondere wurde gefunden, dass die Änderungsgeschwindigkeit in dem Intervall zwischen zehn und zwanzig Sekunden nach der Zugabe der Probe zu einer gepufferten Urease-Lösung mit pH-Wert 7 und Temperatur 34"C proportional ist zur Harnstoffkonzentration. Das Geschwindigkeitsermittlungsverfahren ist ausreichend präzis und genau, und es wird in klinischen Chemielaboratorien routinemässig angewandt. It was shown that the observed rate of change in conductivity is proportional to the urea concentration in the sample. In particular, it was found that the rate of change in the interval between ten and twenty seconds after the addition of the sample to a buffered urease solution with pH 7 and temperature 34 "C is proportional to the urea concentration. The rate determination method is sufficiently precise and accurate and it is routinely used in clinical chemistry laboratories.
Andere Verfahren für die quantitative Bestimmung von Harnstoff basieren auf kolorimetrischen und spektrophotometrischen Analysen. Beispielsweise kann in dem Reaktionsablauf Other methods for the quantitative determination of urea are based on colorimetric and spectrophotometric analyzes. For example, in the reaction sequence
die Erzeugung von Ammoniak oder COz auf photometrischem Weg quantitativ gemessen werden. Der Reaktionsablauf (2) ist der gleiche wie der Reaktionsablauf (1), ausser dass (2) so geschrieben ist, wie wenn es sich um ein nichtwässriges System handelte, um zu zeigen, dass Ammoniak und Kohlendioxid Produkte der Urease-Einwirkung auf Harnstoff sind. Das erzeugte Ammoniak kann photometrisch gemessen werden durch die Reaktion (3) NH + 4-Aminoantipyrin + NaOCl e blaue Farbe Die Intensität der erzeugten blauen Farbe kann mit der Ammoniakmenge in Beziehung gesetzt werden.Das Ammoniak kann auch durch den folgenden Reaktionsablauf gemessen werden: the production of ammonia or CO2 can be measured quantitatively by photometric means. Reaction sequence (2) is the same as reaction sequence (1) except that (2) is written as if it were a non-aqueous system to show that ammonia and carbon dioxide are products of urease action on urea . The ammonia produced can be measured photometrically by the reaction (3) NH + 4-aminoantipyrine + NaOCl e blue color The intensity of the blue color produced can be related to the amount of ammonia. The ammonia can also be measured by the following reaction sequence:
Glutarat Dehydrogenase In diesem Reaktionsablauf wirkt das NADH als Reduktionsmittel. Das NADH hat eine Absorptionslinie bei 340 mm, die beim NAD fehlt. Die Absorption bei 340 mm kann daher mit der Menge des in der Probe vorhandenen NH3 in Beziehung gesetzt werden. Glutarate dehydrogenase In this reaction process, the NADH acts as a reducing agent. The NADH has an absorption line at 340 mm which the NAD lacks. The absorption at 340 mm can therefore be related to the amount of NH3 present in the sample.
Bei Enzym-Lösungen, die für diagnostische Untersuchungen verwendet werden, ist natürlich die Stabilität der Lösungen wichtig, damit Analyseverfahren zur Verfügung gestellt werden können, welche genaue und gleichförmige Bestimmungen verschiedener Proben über einen grösseren Zeitraum ermöglichen. Instabilität von Enzym-Lösungen verunmöglicht nicht nur eine Reproduzierbarkeit der Untersuchungen, sondern kann auch die ohnehin stets steigenden Kosten von medizinischen Dienstleistungen noch erhöhen, weil die instabilen Enzym-Lösungen nach kurzer Zeit verworfen und frische Lösungen angesetzt werden müssen. In the case of enzyme solutions which are used for diagnostic examinations, the stability of the solutions is of course important so that analysis methods can be made available which enable precise and uniform determinations of different samples over a longer period of time. Instability of enzyme solutions not only makes the reproducibility of the examinations impossible, but can also increase the costs of medical services, which are always rising, because the unstable enzyme solutions have to be discarded after a short time and fresh solutions have to be prepared.
Eine kürzliche Schätzung kam zu dem Resultat, dass etwa 25 Prozent aller in vitro durchgeführten diagnostischen Untersuchungen, die jährlich in den USA vorgenommen werden, unzuverlässig sind. Unzuverlässige Untersuchungsergebnisse können zu unnötigen medizinischen Behandlungen, zum Unterlassen nötiger Behandlungen und zu Einkommensverlust führen. Die Anwendung von Bestimmungen mittels Enzymen hat, weil diese sehr spezifisch sind, in den letzten Jahren stark zugenommen, und die Anzeichen sprechen dafür, dass sich dieser Trend fortsetzen wird. Strenge Qualitätskontrollen sind jedoch erforderlich, um sicherzustellen, dass die Resultate genau und reproduzierbar sind. A recent estimate found that approximately 25 percent of all in vitro diagnostic tests performed annually in the United States are unreliable. Unreliable test results can lead to unnecessary medical treatment, neglect of necessary treatment, and loss of income. The use of determinations using enzymes, because they are very specific, has increased significantly in recent years and there are indications that this trend will continue. However, strict quality controls are required to ensure that the results are accurate and reproducible.
Dieses Erfordernis rührt von der Tatsache her, dass die genaue Natur von Enzymen und deren Reaktionsmechanismen zum grossen Teil noch unbekannt sind. This requirement arises from the fact that the exact nature of enzymes and their reaction mechanisms are still largely unknown.
Die heute bei weitem grösste Schwierigkeit bei der Herstellung von diagnostischen Reagenzien besteht in den unstabilen Eigenschaften der Enzym-Lösungen. Die gebräuchlichen diagnostischen Harnstoffbestimmungsverfahren mittels Enzym erfordern die Verwendung von labilen Ingredienzen. Wegen der labilen Natur der Enzyme muss die Herstellung solcher Enzym-Lösungen einer strengeu Qualitätskontrolle unterworfen werden, insbesondere beim Rekonstituieren der Trockenpräparate und beim Ansetzen der Enzym-Lösungen. Diese Qualitätskontrolle ist kostspielig. Wenn die Kontrolle auch in nur einer Stufe des Verfahrens nicht auf dem erforderlichen hohen Standard gehalten wird, kann die Qualität des Endproduktes schon stark beeinträchtigt sein, was dann zu einer reduzierten Genauigkeit der Untersuchungsresultate führt. By far the greatest difficulty in the manufacture of diagnostic reagents today is the unstable properties of the enzyme solutions. The usual diagnostic urea determination methods by means of enzymes require the use of labile ingredients. Because of the unstable nature of the enzymes, the production of such enzyme solutions must be subjected to strict quality control, especially when the dry preparations are reconstituted and when the enzyme solutions are prepared. This quality control is costly. If the control is not kept to the required high standard in just one step of the process, the quality of the end product can be severely impaired, which then leads to a reduced accuracy of the test results.
Die gegenwärtig zum Stand der Technik gehörenden kommerziellen Verfahren zum Stabilisieren der Aktivität von Enzymen oder Co-Enzymen arbeiten mit einem Einschliessen derselben in eine feste Matrix, entweder durch Gefriertrocknen oder durch trockenes Mischen, etwa wie beim Tablettieren trockener Pulver, insbesondere in der pharmazeutischen Diagnosemittelindustrie und verwandten Industrien, oder mit einem Immobilisieren durch Einschliessen der chemischen Struktur des Enzyms in eine feste Matrix. Diese Verfahren sind zwar hoch entwickelt, sie sind aber weder praktisch noch wünschbar und zudem kostspielig. The current state of the art commercial methods for stabilizing the activity of enzymes or co-enzymes work by entrapping them in a solid matrix, either by freeze drying or by dry mixing, such as in the tabletting of dry powders, particularly in the pharmaceutical diagnostic industry and related industries, or with immobilization by entrapping the chemical structure of the enzyme in a solid matrix. Although these methods are sophisticated, they are neither practical nor desirable, and they are also costly.
Der Hersteller ist gezwungen, das Wasser zu entfernen und ein Teilprodukt zu liefern, womit er einen Teil der Qualitätskontrolle, betreffend das Verdünnen und die Verwendung des Endproduktes, aus den Händen gibt. Die Lobarotarien müssen die hohen Kosten für Verpackung, Reagensabfall, das Gefriertrocknen und Trockenmischen tragen. Die Nützlichkeit des Produktes unterliegt ferner Beschränkungen durch die Verpackungsarten und -grössen. The manufacturer is forced to remove the water and deliver a partial product, thus giving up some of the quality control regarding the dilution and use of the end product. The lobarotarias have to bear the high costs of packaging, reagent waste, freeze drying, and dry blending. The usefulness of the product is also restricted by the types and sizes of packaging.
Zudem ist eine befriedigende Gleichförmigkeit des Produktes nur schwer erreichbar, besonders in den Laboratorien, in denen die Produkte für diagnostische Untersuchungen verwendet werden sollen. Dieser Umstand wird durch die Tattache illustriert, dass zu den meisten handelsüblichen gefriergetrockneten kontrollierten Seren (Referenz-Serum) eine zulässige Schwankung der Enzymbestandteile von Flasche zu Flasche von + 10% des Mittelwertes angegeben wird. Im allgemeinen haben die rekonstituierten Lösungen von gefriergetrockneter Urease eine Stabilität von etwa 24 Stunden bis 5 Tagen bei Zimmertemperatur. Ihre Verwendbarkeit ist dann durch diese kurze Aufbewahrungszeit begrenzt. In addition, a satisfactory uniformity of the product is difficult to achieve, especially in laboratories in which the products are to be used for diagnostic tests. This fact is illustrated by the fact that for most commercially available freeze-dried controlled serums (reference serum) a permissible fluctuation of the enzyme components from bottle to bottle of + 10% of the mean value is stated. In general, the reconstituted solutions of freeze-dried urease have a stability of about 24 hours to 5 days at room temperature. Their usability is then limited by this short retention period.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, eine Urease-Lösung zur Verfügung zu stellen, die, obwohl sie labile Bestandteile in einem flüssigen Reagens enthält, wirksam stabilisiert ist, so dass die Aktivität der labilen Bestandteile in der flüssigen Lösung erhalten bleibt. Die Stabilisierung sollte dabei in solcher Weise erfolgen, dass eine Langzeitstabilität in einem flüssigen Medium erreicht wird. The object of the present invention is therefore to provide a urease solution which, although it contains labile components in a liquid reagent, is effectively stabilized so that the activity of the labile components in the liquid solution is retained. The stabilization should take place in such a way that long-term stability in a liquid medium is achieved.
Die Herstellung einer solchen Urease-Lösung kann mit hoher Genauigkeit erfolgen. Such a urease solution can be produced with high accuracy.
Die erfindungsgemässe stabilisierte Urease-Lösung enthält Wasser, eine Puffersubstanz, ein bakteriostatisches Mittel, einen Chelatbildner, eine organische Polyhydroxy-Verbindung und Urease. The stabilized urease solution according to the invention contains water, a buffer substance, a bacteriostatic agent, a chelating agent, an organic polyhydroxy compound and urease.
Die Lösung enthält somit ein labiles Enzym, das für die diagnostische Untersuchung auf Harnsäure verwendbar ist, und sie kann langzeitstabil sein, ohne dass die Enzymaktivität, die für Leitfähigkeitsmessungen bedeutenden Eigenschaften oder die photometrische Absorption beeinträchtigt wären. Eine Qualitätskontrolle, die sich iiber die Herstellung, Verpackung, Aufbewahrung und Verwendung erstreckt, ist möglich. Der Nachteil starrer Verpackungsgrössen entfällt, und die hohen Kosten, die bei bekannten Produkten für die Verpackung, das Gefriertrocknen und die Reagensabfälle aufgewendet werden müssen, können reduziert werden. Das für Untersuchungen auf Harnstoff verwendbare flüssige Enzymsystem ermöglicht die wünschbare Flexibilität hinsichtlich der Harnstoffbestimmung. Ausführungsformen der erfindungsgemässen stabilisierten Urease-Lösung können mit frisch angesetzten, aus gefriergetrockneten Enzymen hergestellten Reagenzien verglichen werden. Solche Studien haben eine vollständige Entsprechung zwischen gealterter Lösung und frischen Reagenzien gezeigt, bei vergleichbarer Empfindlichkeit und Genauigkeit. Die flüssige Urease-Lösung hat eine bessere Reagens-Homogenität und einfachere Verpackbarkeit und ist flexibler und einfacher in der Ver wendung als gefriergetrocknete oder trocken gemischte Präparate. The solution thus contains a labile enzyme which can be used for the diagnostic test for uric acid, and it can be stable over the long term without the enzyme activity, the properties important for conductivity measurements or the photometric absorption being impaired. A quality control that extends over the manufacture, packaging, storage and use is possible. The disadvantage of rigid packaging sizes is eliminated, and the high costs that have to be expended in known products for packaging, freeze-drying and reagent waste can be reduced. The liquid enzyme system that can be used for investigations for urea enables the desired flexibility with regard to the determination of urea. Embodiments of the stabilized urease solution according to the invention can be compared with freshly prepared reagents made from freeze-dried enzymes. Such studies have shown a complete correspondence between aged solution and fresh reagents, with comparable sensitivity and accuracy. The liquid urease solution has better reagent homogeneity and easier packability and is more flexible and easier to use than freeze-dried or dry-mixed preparations.
Für die diagnostische Untersuchung auf Harnstoff bietet die Stabilisierung der labilen Komponenten und insbesondere der labilen Urease in einer gebrauchsfertigen Lösung eine neue und vorteilhafte Möglichkeit der Befriedigung der Anforderungen, die von klinischen Laboratorien gestellt werden, und der behördlichen Zuverlässigkeits-Forderungen. Die Flexibilität solcher Lösungen ermöglicht ihre Verwendung in automatisierten Messgeräten und erleichtert auch manuelle Messungen. For the diagnostic investigation for urea, the stabilization of the labile components and especially the labile urease in a ready-to-use solution offers a new and advantageous way of satisfying the requirements made by clinical laboratories and the official reliability requirements. The flexibility of such solutions enables their use in automated measuring devices and also facilitates manual measurements.
Zum Herstellen einer Ausführungsform der erfindungsgemässen Urease-Lösung kann man zunächst Tris(hydroxymethyl)aminomethan mit Wasser mischen, welches Wasser zuvor zur Entfernung von Metallen, insbesondere von Schwermetallionen, behandelt worden ist, beispielsweise mit dreifach destilliertem Wasser. Zu der Mischung kann man dann N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure, 2,4-Dichlorphenol und Äthylendiamintetraessigsäure (als deren Di-Natriumsalz) zugeben. Darauf kann der Mischung eine organische Polyhydroxy-Verbindung zugesetzt werden, z.B. Glycerin, Äthylenglykol, Sorbit oder Propylenglykol. To produce an embodiment of the urease solution according to the invention, tris (hydroxymethyl) aminomethane can first be mixed with water which has previously been treated to remove metals, especially heavy metal ions, for example with triple distilled water. N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid, 2,4-dichlorophenol and ethylenediaminetetraacetic acid (as the disodium salt thereof) can then be added to the mixture. An organic polyhydroxy compound can then be added to the mixture, e.g. Glycerin, ethylene glycol, sorbitol or propylene glycol.
Der pH-Wert der Mischung wird vorzugsweise auf etwa 6-8 eingestellt, so dass das durch die Urease-Aktivität erzeugte Ammoniak den pH-Wert nicht beeinflusst. Schliesslich kann dann noch die Urease zu der Mischung hinzugefügt werden. The pH of the mixture is preferably adjusted to about 6-8 so that the ammonia generated by the urease activity does not affect the pH. Finally, the urease can then be added to the mixture.
Eine bevorzugte stabilisierte Urease-Lösung zur Verwendung bei der Harnstoffbestimmung kann wie folgt hergestellt werden: Hinzufügen und Mischen von N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure in destilliertes Wasser. Danach Zugabe von 2,4-Dichlorphenol und Di-Natriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure zu der Mischung. Darauf Zugabe von Triäthanolamin und Einstellung des pH-Wertes in den Bereich von 6-8. Zusetzen einer organischen Polyhydroxy-Verbindung, wie Glycerin, Äthylenglykol, Sorbit oder Propylenglykol, vorzugsweise Glycerin. Dann Zugabe einer wässrigen Lösung des Enzyms Urease. Die entstehende Lösung kann für die Bestimmung von Harnstoff verwendet werden. Für die Verwendung kann die Lösung mit Wasser verdünnt werden, um eine gewünschte Urease-Aktivität einzustellen. A preferred stabilized urease solution for use in urea determination can be prepared as follows: Adding and mixing N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid into distilled water. Then add 2,4-dichlorophenol and the disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid to the mixture. Then add triethanolamine and adjust the pH to a range of 6-8. Adding an organic polyhydroxy compound, such as glycerin, ethylene glycol, sorbitol or propylene glycol, preferably glycerin. Then an aqueous solution of the enzyme urease is added. The resulting solution can be used for the determination of urea. For use, the solution can be diluted with water in order to adjust a desired urease activity.
In einer anderen Ausführungsform kann man drei Lösungen herstellen, nämlich (1) eine Ausgangs-Lösung, nachstehend Primärlösung genannt, (2) eine Reagenskonzentrat Lösung, die aus der Primärlösung hergestellt wird, und (3) eine Verdünnungslösung. Die Primärlösung kann aus destilliertem Wasser, Triäthanolamin, Äthylendiamintetraessig säure (freie Säure), N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure und 2,4-Dichlorphenol bestehen. Die Reagenskonzentrat-Lösung kann dann die Primärlösung eine organische Polyhydroxy-Verbindung, wie Glycerin, Äthylengly kol, Sorbit oder Propylenglykol, und Urease enthalten. Die Verdünnungslösung kann aus destilliertem Wasser bestehen oder aus einer Lösung von 2,4-Dichlorphenol in destilliertem Wasser, die bis zu etwa 1 Gew.-%, vorzugsweise 0,004 Gew.-%, 2,4-Dichlorphenol enthalten kann. In another embodiment, three solutions can be prepared, namely (1) a starting solution, hereinafter referred to as the primary solution, (2) a reagent concentrate solution which is prepared from the primary solution, and (3) a diluting solution. The primary solution can consist of distilled water, triethanolamine, ethylenediaminetetraacetic acid (free acid), N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid and 2,4-dichlorophenol. The reagent concentrate solution can then contain the primary solution of an organic polyhydroxy compound such as glycerol, ethylene glycol, sorbitol or propylene glycol, and urease. The dilution solution can consist of distilled water or a solution of 2,4-dichlorophenol in distilled water, which can contain up to about 1% by weight, preferably 0.004% by weight, of 2,4-dichlorophenol.
Die beschriebenen Lösungen sind während längerer Zeit lagerfähig, in der Regel in gebrauchsfertiger Form (verdünnt) während etwa eines Monats bei Zimmertemperatur. The solutions described can be stored for a long time, usually in ready-to-use form (diluted) for about a month at room temperature.
Eine noch längere Lagerfähigkeit ergibt sich bei niedrigeren Temperaturen. An even longer shelf life results at lower temperatures.
Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen und Verwendungen der erfindungsgemässen Urease-Lösung er örtert. Preferred embodiments and Uses of the urease solution according to the invention he discovers.
Die beschriebenen stabilisierten Urease-Lösungen kön nen auf klinischem Gebiet für die Bestimmung von Harnstoff verwendet werden. Sie eignen sich sowohl für mit Leitfähigkeitsmessungen arbeitende Analyseverfahren als auch für photometrische Analysen. Die Harnstoffbestimmung mittels der beschriebenen Lösungen basiert auf dem folgenden Reaktionsablauf The stabilized urease solutions described can be used in the clinical field for the determination of urea. They are suitable for analysis methods that use conductivity measurements as well as for photometric analyzes. The determination of urea using the solutions described is based on the following reaction sequence
unabhängig davon, ob die Leitfähigkeit, die Änderungsgeschwindigkeit der Leitfähigkeit oder die Konzentration von Produkten (Ammoniak oder Kohlendioxid) gemessen wird. regardless of whether the conductivity, the rate of change in conductivity or the concentration of products (ammonia or carbon dioxide) is measured.
Die beschriebenen stabilisierten Urease-Lösungen können also für den enzymatischen Abbau von Harnstoff zu Produkten eingesetzt werden, deren Konzentration gemessen werden kann, wobei die Messresultate mit der Harnstoff konzentration in Beziehung gesetzt werden können. Sie eignen sich besonders für Hamstoffbestimmungen, die auf einer Messung der Änderungsgeschwindigkeit der Leiffähigkeit basieren. Wenn sie für Harnstoffbestimmungen verwendet werden sollen, die auf photometrischen Verfahren basieren, dann kann ihnen ein Farbstoff oder eine Verbindung zugesetzt werden, die Licht bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert. Für die Messung der Harnstoffkonzentration über eine Messung der Änderungsgeschwindigkeit der Leitfähigkeit können die Urease-Lösungen wie eingangs beschrieben eingesetzt werden. The stabilized urease solutions described can thus be used for the enzymatic breakdown of urea to products whose concentration can be measured, with the measurement results being able to be related to the urea concentration. They are particularly suitable for urea determinations based on a measurement of the rate of change in conductivity. If they are to be used for urea determinations based on photometric methods, then a dye or a compound that absorbs light at a certain wavelength can be added to them. To measure the urea concentration by measuring the rate of change in conductivity, the urease solutions can be used as described above.
In einer bevorzugten Anwendung können die beschriebenen stabilisierten Urease-Lösungen in Verbindung mit elektronischen Analysiergeräten eingesetzt werden, welche die Leitfähigkeit oder die Änderungsgeschwindigkeit der Leitfähigkeit messen und die gemessenen Grössen mit der Harnstoffkonzentration in der Probe in Beziehung setzen. Solche Geräte sind im Handel erhältlich, und die beschriebenen Lösungen eignen sich insbesondere auch für die Verwendung in solchen im Handel erhältlichen Geräten. Bevorzugte Geräte sind der BUN ANALYZER 2 und das Gerät ASTRA , die beide von der Beckman Instruments, Inc., hergestellt werden. In a preferred application, the stabilized urease solutions described can be used in conjunction with electronic analyzers which measure the conductivity or the rate of change in conductivity and relate the measured variables to the urea concentration in the sample. Such devices are commercially available, and the solutions described are also particularly suitable for use in such commercially available devices. Preferred devices are the BUN ANALYZER 2 and the ASTRA device, both manufactured by Beckman Instruments, Inc.
Sowohl das Gerät ASTRA als auch der BUN ANA LYZER 2 arbeiten mit Messungen der Änderungsgeschwindigkeit der Leitfähigkeit. Sie besitzen eine in die Probe eintauchende Leitfähigkeitselektrode und eine elektronische Einrichtung, welche die Geschwindigkeit der Zunahme der Leitfähigkeit misst, während ein genau bestimmtes Proben volumen durch eine Pipette in eine die Urease-Lösung enthaltende Reaktionsschale eingeführt wird. Wenn eine Probe in die die Urease-Lösung enthaltende Reaktionsschale eingeführt wird, dann wird der Harnstoff in der Probe gemäss vorstehendem Reaktionsablauf (5) zerlegt. Durch die Reak tion wird der nicht ionische Harnstoff in eine ionische Form, Ammoniumcarbonat, umgewandelt. Während der Reaktion ist die Geschwindigkeit der Zunahme der Leitfähigkeit der Lösung direkt proportional zur Harnstoffkonzentration, die dann in der Reaktionsschale vorhanden ist. Es ist gezeigt worden, dass die maximale beobachtete Geschwindigkeit, ge messen dreizehn Sekunden nach dem Zugeben der Probe, ein direktes Mass für die Harnstoffkonzentration ist, die ursprünglich, im Zeitpunkt des Zugebens in die Reaktions schale, in der Probe vorhanden war. Das Gerät misst und speichert diese Geschwindigkeit und liefert eine digitale Anzeige der Harnstoffkonzentration in der Probe (nach Eichung unter Verwendung einer Standardprobe mit be kannter Harnstoffkonzentration). Both the ASTRA device and the BUN ANA LYZER 2 work with measurements of the rate of change in conductivity. They have a conductivity electrode immersed in the sample and an electronic one Establishment showing the speed of the increase in Conductivity measures while a precisely determined sample volume is introduced through a pipette into a reaction bowl containing the urease solution. When a sample is introduced into the reaction dish containing the urease solution, the urea in the sample is broken down according to the above reaction sequence (5). The reaction converts the non-ionic urea into an ionic form, Ammonium carbonate. During the reaction, the rate of increase in conductivity is the Solution directly proportional to the urea concentration that is then present in the reaction dish. It has been shown that the maximum observed speed, measured thirteen seconds after adding the sample, is a direct measure of the urea concentration that was originally present in the sample at the time of addition to the reaction dish. The device measures and stores this speed and delivers a digital one Display of the urea concentration in the sample (according to Calibration using a standard sample with known urea concentration).
Die stabilisierte Enzym-Lösung kann in Form einer ge brauchsfertigen Lösung hergestellt werden, die nur noch mit der Probe, deren Harnstoffgehalt geprüft werden soll, zusammengebracht werden muss. Die stabilisierte Enzym-Lösung kann aber auch in einer konzentrierten Form hergestellt werden, die vom Benutzer vor der Durchführung einer Harnstoffbestimmung mit einer mitgelieferten Verdünnungslösung oder mit Wasser verdünnt werden kann. Wenn die stabilisierte Enzym-Lösung als Konzentrat geliefert wird, dann kann sie zweckmässig in Form einer Zubereitung, z.B. einer kombinierten Packung, an den Endverbraucher (d.h. das klinische Laboratorium) geliefert werden, welche die konzentrierte Enzym-Lösung und eine Verdünnungslösung enthält. The stabilized enzyme solution can be produced in the form of a ready-to-use solution that only needs to be brought together with the sample whose urea content is to be tested. The stabilized enzyme solution can also be produced in a concentrated form, which can be diluted by the user with a supplied dilution solution or with water before carrying out a urea determination. If the stabilized enzyme solution is supplied as a concentrate, it can conveniently be in the form of a preparation, e.g. a combined pack, delivered to the end user (i.e. the clinical laboratory), containing the concentrated enzyme solution and a diluting solution.
Die stabilisierte Urease-Lösung wird beispielsweise wie folgt hergestellt. N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure (nachstehend als HEPES bezeichnet) wird mit Wasser gemischt, welches zur Entfernung von Metallen und insbesondere Schwermetallen vorbehandelt worden ist, beispielsweise durch Destillation oder Entionisierung. Das verwendete Wasser soll im wesentlichen frei von solchen Metallionen sein, da Metallionen das Urease-Enzym vergiften können. Die HEPES wird in einer Menge eingesetzt, die etwa 0,5 bis etwa 5 Gew.-% des Wassers ausmacht. Es können auch Mengen von weniger als 0,5 Gew.-% oder von mehr als 5 Gew.-% eingesetzt werden, womit aber hinsichtlich der optimalen Lagerfähigkeit keine Vorteile erzielt werden können.HEPES ist als 4-(2-Hydroxyäthyl)-1-piperazin- -äthansulfonsäure (F.W. 238.31) im Handel erhältlich von der J.T. Baker Chemical Company. Für die vorliegenden Zwecke kann dieses im Handel erhältliche Produkt verwendet werden. The stabilized urease solution is prepared as follows, for example. N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (hereinafter referred to as HEPES) is mixed with water which has been pretreated to remove metals and in particular heavy metals, for example by distillation or deionization. The water used should be essentially free of such metal ions, since metal ions can poison the urease enzyme. The HEPES is used in an amount that makes up about 0.5 to about 5% by weight of the water. Quantities of less than 0.5% by weight or of more than 5% by weight can also be used, but with this no advantages can be achieved in terms of optimal storage life. HEPES is 4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazine- ethanesulfonic acid (FW 238.31) commercially available from JT Baker Chemical Company. For the present purposes, this commercially available product can be used.
Zu der Mischung wird dann ein bakteriostatisches Mittel gegeben, um die Lagerfähigkeit der herzustellenden Lösung zu verbessern. Das bakteriostatische Mittel verhindert das Wachstum von Bakterien, die das Urease-Enzym schädigen können. Die bevorzugten bakteriostatischen Mittel verhindern das Bakterienwachstum, ohne die Urease zu denaturieren. Alkohole können als bakteriostatische Mittel verwendet werden. Das bevorzugte bakteriostatische Mittel ist 2,4 Dichlorphenol. Die Verwendung von Phenol ist unerwünscht da dieses die Urease denaturieren kann. Das bakteriostatische Mittel wird in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, um das Bakterienwachstum zu verhindern. Für 2,4-Dichlorphenol beträgt die Menge etwa 0,1 bis etwa 1% des Gewichtes der fertigen Lösung.Es können auch kleinere Mengen eingesetzt werden, doch ist dann die Verhinderung des Bakterien wachstums nicht gleich gewährleistet wie bei einer Menge von 0,1 Gew.-%. Mengen von mehr als 1,0 Gew.-% sind ebenfalls möglich, bieten aber keine merklichen Vorteile im Vergleich zu Mengen von bis zu 1,0 Gew.-%. A bacteriostatic agent is then added to the mixture in order to improve the shelf life of the solution to be prepared. The bacteriostatic agent prevents the growth of bacteria that can damage the urease enzyme. The preferred bacteriostatic agents prevent bacterial growth without denaturing the urease. Alcohols can be used as bacteriostatic agents. The preferred bacteriostatic agent is 2,4 dichlorophenol. The use of phenol is undesirable because it can denature the urease. The bacteriostatic agent is added in an amount sufficient to prevent bacterial growth. For 2,4-dichlorophenol, the amount is about 0.1 to about 1% of the weight of the finished solution. Smaller amounts can also be used, but the prevention of bacterial growth is then not guaranteed as with an amount of 0.1 Wt%. Amounts of more than 1.0% by weight are also possible, but offer no noticeable advantages compared to amounts of up to 1.0% by weight.
Zu der entstehenden Mischung wird Äthylendiamintetraessigsäure hinzugefügt (nachstehend als EDTA bezeichnet). Ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter referred to as EDTA) is added to the resulting mixture.
Die EDTA kann als freie Säure oder als ein Salz der Säure zugesetzt werden, z.B. als das Di-Natriumsalz. Diese Formen von EDTA sind im Handel erhältlich, und für die vorliegenden Zwecke sind die im Handel erhältlichen Produkte geeignet. Die EDTA wird als Chelatbildner zugesetzt, um allfällige verbleibende Metallionen, insbesondere Schwermetallionen, die sich in der Lösung oder in der dieser zugesetzten Probe befinden können, zu komplexieren. Anstelle der EDTA können auch andere Chelatbildner verwendet werden. z.B. verschiedene Aminosäuren. Für die auf Leit fähigkeitsmessungen basierende Methode der Harnstoffanalyse sollten solche anderen Chelatbildner jedoch zuvor geprüft werden, um ihren Einfluss auf die Leitfähigkeit zu ermitteln und festzustellen, ob sie eine für das System geeignete Leitfähigkeit aufweisen.Der Chelatbildner wird in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, um mit den vorhandenen Metallionen Chelate zu bilden; die Menge beträgt im alge meinen bis zu etwa 1 Gew.-%. The EDTA can be added as the free acid or as a salt of the acid, e.g. than the disodium salt. These forms of EDTA are commercially available, and the commercially available products are suitable for the present purposes. The EDTA is added as a chelating agent in order to complex any remaining metal ions, in particular heavy metal ions, which may be in the solution or in the sample added to it. Other chelating agents can be used instead of EDTA. e.g. different amino acids. However, for the urea analysis method based on conductivity measurements, such other chelating agents should be tested beforehand in order to determine their influence on the conductivity and to determine whether they have a suitable conductivity for the system. The chelating agent is added in an amount sufficient to to chelate the metal ions present; the amount is generally up to about 1% by weight.
Triäthanolamin wird dann zu der Mischung hinzugefügt. Triethanolamine is then added to the mixture.
Auch Tris(hydroxymethyl)aminomethan kann als Puffersubstanz verwendet werden, doch wird Triäthanolamin bevorzugt, weil es weniger ionisch ist und die Leitfähigkeit nicht wesentlich beeinflusst. Das Triäthanolamin und HEPES werden in solchen Mengen eingesetzt, dass eine Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 5-9 und vorzugsweise 6-8 gebildet wird. Die Lösung sollte HEPES und Triäthanolamin in so grossen Mengen enthalten, dass das durch die Reaktion von Urease mit Harnstoff erzeugte Ammoniak den pH-Wert des Mediums nicht wesentlich ändert. Der pH Wert sollte vorzugsweise unter 7 liegen, um eine optimale Enzym-Aktivität zu ermöglichen. Bei einem pH-Wert von über 9 oder sogar schon von über 8 kann ein Teil des durch die Reaktion von Urease und Harnstoff erzeugten Ammoniaks frei aus der Lösung austreten. Tris (hydroxymethyl) aminomethane can also be used as a buffer substance, but triethanolamine is preferred because it is less ionic and does not significantly affect conductivity. The triethanolamine and HEPES are used in such amounts that a solution with a pH value in the range of 5-9 and preferably 6-8 is formed. The solution should contain HEPES and triethanolamine in such large quantities that the ammonia produced by the reaction of urease with urea does not significantly change the pH of the medium. The pH should preferably be below 7 in order to enable optimal enzyme activity. At a pH value above 9 or even above 8, some of the ammonia produced by the reaction of urease and urea can escape freely from the solution.
Dann wird zu der Mischung eine organische Polyhydroxy-Verbindung hinzugefügt, die die Stabilisierung des Urease-Enzyms unterstützt. Bevorzugte organische Polyrydroxy-Verbindungen sind Glycerin, Äthylenglykol, Sorbit und Propylenglykol. Die am meisten bevorzugte Polyhydroxy-Verbindung ist Glycerin. Im allgemeinen wird die Polyhydroxy-Verbindung in einer Menge von etwa 50% des Volumens der Lösung eingesetzt. An organic polyhydroxy compound is then added to the mixture, which helps stabilize the urease enzyme. Preferred organic polyhydroxy compounds are glycerol, ethylene glycol, sorbitol and propylene glycol. The most preferred polyhydroxy compound is glycerin. In general, the polyhydroxy compound is used in an amount of about 50% of the volume of the solution.
Dann wird das Urease-Enzym zu der Lösung hinzugefügt. Das Urease-Enzym stammt von der Fetischbohne und ist in gefriergetrockneter Form, als konzentriertes Salz oder als Glycerinsuspension im Handel erhältlich. Alle diese Formen können verwendet werden, die Salzform ist jedoch unerwünscht, wenn die Lösung für Analysen durch Leitfähigkeitsmessung verwendet werden soll, weil die Salzform die Leitfähigkeit beeinflussen kann. Die Urease wird in einer Menge zugesetzt, die in der Arbeitslösung, d.h. in der Lösung, die mit der zu untersuchenden Probe zusammengebracht wird, eine Aktivität von etwa 25'000 I.E. + 25% pro Liter ergibt. Die Menge der zugesetzten Urease hängt davon ab, ob die stabilisierte Lösung eine Arbeitslösung oder eine konzentrierte Lösung sein soll.Die Aktivität der Urease wird gemäss der GLDH-Methode ausgedrückt, in der eine Enzym Aktivität von einer I.E., gemessen in einem mit ADP aktivierten Prüfsystem bei 37"C und einem pH-Wert von 7,5, derjenigen Menge Urease entspricht, die unter den Prüfbedingungen lmMHarnstoff pro Minute verbraucht. Als allgemeine Daumenregel entspricht 1 Einheit nach der Nessler-Analyse etwa drei Einheiten gemäss der GLDH-Methode. Then the urease enzyme is added to the solution. The urease enzyme comes from the fetish bean and is commercially available in freeze-dried form, as a concentrated salt or as a glycerine suspension. All of these forms can be used, but the salt form is undesirable if the solution is to be used for analysis by conductivity measurement because the salt form can affect the conductivity. The urease is added in an amount that is sufficient in the working solution, i. in the solution that is brought into contact with the sample to be examined, an activity of about 25,000 I.U. + 25% per liter results. The amount of urease added depends on whether the stabilized solution is to be a working solution or a concentrated solution. The urease activity is expressed according to the GLDH method, in which an enzyme activity of one IU is measured in a test system activated with ADP at 37 "C and a pH of 7.5, which corresponds to the amount of urease that consumes 1mM urea per minute under the test conditions. As a general rule of thumb, 1 unit according to the Nessler analysis corresponds to about three units according to the GLDH method.
Die stabilisierte Urease-Lösung, als Konzentrat formuliert, hat eine mögliche Aufbewahrungsdauer von mehr als zwei Jahren bei 4"C. Die kombinierte oder verdünnte stabilisierte Urease-Lösung hat eine Lagerfähigkeit von vier bis sechs Wochen bei Zimmertemperatur, was etwa sechs Monaten bei 4"C entspricht. The stabilized urease solution, formulated as a concentrate, has a possible storage time of more than two years at 4 "C. The combined or diluted stabilized urease solution has a shelf life of four to six weeks at room temperature, which is about six months at 4" C corresponds to.
Die stabilisierte Urease-Lösung kann in Konzentrat-Form hergestellt werden, indem man mit Wasser Triäthanolamin, EDTA, HEPES, 2,4-Dichlorphenol, Glycerin und Urease in relativ grossen Mengen kombiniert, so dass die Konzentrat-Lösung dann verdünnt werden kann, um die gewünschte Aktivität von 25'000 I.E. + 25% pro Liter aufzuweisen. The stabilized urease solution can be produced in concentrate form by combining triethanolamine, EDTA, HEPES, 2,4-dichlorophenol, glycerine and urease in relatively large amounts with water, so that the concentrate solution can then be diluted to the desired activity of 25,000 IU + 25% per liter.
Als Verdünnungsflüssigkeit kann Wasser (im wesentlichen frei von Metall und Schwermetall) verwendet werden, das vom Benutzer zugegeben wird, oder stattdessen eine mitgelieferte Verdünnungslösung. Diese Verdünnungslösung kann eine 0,004%ige wässrige Lösung von 2,4-Dichlorphenol sein. Water (essentially free of metal and heavy metals), which is added by the user, can be used as the diluting liquid, or a diluting solution supplied can be used instead. This dilution solution can be a 0.004% aqueous solution of 2,4-dichlorophenol.
Diese Verdünnungslösung und die konzentrierte Enzym-Lösung können als fertige Zubereitung, z.B. in einer kombinierten Packung, an die klinischen Laboratorien geliefert und dort vor der Verwendung zusammengegeben werden. This dilution solution and the concentrated enzyme solution can be used as a ready-made preparation, e.g. in a combined pack, delivered to the clinical laboratories and combined there prior to use.
Beispiel 1 Eine stabilisierte Urease-Lösung zur Verwendung bei der Harnstoffanalyse nach dem Verfahren mit Messung der Änderungsgeschwindigkeit der Leitfähigkeit wurde hergestellt, indem zunächst 2,07 g HEPES in 240 ml destilliertes Wasser eingemischt wurde. Zu der Mischung wurden dann 2,5 g 2,4-Dichlorphenol und 1,4 g Di-Natriumsalz von EDTA hinzugefügt. Die Mischung wurde gründlich durchmischt, und dann wurden 0,9 ml Triäthanolamin dazugegeben. Der pH-Wert der Lösung wurde gemessen, er betrug 6,97. example 1 A stabilized urease solution for use in urea analysis by the conductivity rate measurement method was prepared by first mixing 2.07 g of HEPES into 240 ml of distilled water. 2.5 g of 2,4-dichlorophenol and 1.4 g of the disodium salt of EDTA were then added to the mixture. The mixture was mixed thoroughly and then 0.9 ml of triethanolamine was added. The pH of the solution was measured and found to be 6.97.
Glycerin wurde in einer Menge von 250 ml hinzugefügt. Das aus Fetischbohnen gewonnene Urease-Enzym, das eine Aktivität von 122 E./mg aufwies, wurde in einer Menge von 1,0 g, in 10 ml Wasser aufgelöst, zugesetzt. Die Mischung wurde gründlich durchmischt, um alle Stoffe aufzulösen. Glycerin was added in an amount of 250 ml. The urease enzyme obtained from fetish beans, which had an activity of 122 U./mg, was added in an amount of 1.0 g dissolved in 10 ml of water. The mixture was mixed thoroughly to dissolve all materials.
Die so gebildete Lösung stellte eine Enzym-Konzentrat Lösung dar, die im Verhältnis von einem Teil Enzym-Konzentrat-Lösung zu neuen Teilen Wasser verdünnt wurde. Die verdünnte Lösung hatte einen pH-Wert von 7,03 und eignete sich für die Bestimmung des Harnstoffgehaltes einer Probe in dem BUN ANALYZER 2 oder dem Gerät ASTRA der Firma Beckman. The solution thus formed was an enzyme concentrate solution which was diluted in the ratio of one part of enzyme concentrate solution to new parts of water. The diluted solution had a pH of 7.03 and was suitable for determining the urea content of a sample in the BUN ANALYZER 2 or the ASTRA device from Beckman.
Die Enzym-Konzentrat-Lösung und die daraus hergestellten verdünnten Lösungen zeigten gute Stabilität. The enzyme concentrate solution and the diluted solutions prepared therefrom showed good stability.
Beispiel 2 Das Vorgehen gemäss Beispiel 1 wurde in allen wesentlichen Einzelheiten wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Bestandteile in den folgenden Mengen eingesetzt wurden: 500 ml destilliertes H2O 4,14 g HEPES 1,0 g 2,4-Dichlorphenol 2,8 g Na2EDTA 1,88 ml Triäthanolamin was zu einem pH-Wert von 7,0 t 0,05 führte. Zu dieser Lösung wurden 500 ml Glycerin und 250'000 E. Urease (salzfrei) hinzugefügt. Example 2 The procedure according to Example 1 was repeated in all essential details, with the exception that the components were used in the following amounts: 500 ml of distilled H2O 4.14 g of HEPES 1.0 g of 2,4-dichlorophenol 2.8 g Na2EDTA 1.88 ml triethanolamine which led to a pH value of 7.0 to 0.05. 500 ml of glycerine and 250,000 U. urease (salt-free) were added to this solution.
Die so gebildete Lösung war eine stabilisierte Urease Konzentrat-Lösung, die im Verhältnis von 1:9 mit Wasser verdünnt wurde, um eine verdünnte stabilisierte Urease-Lösung zu bilden, die sich zur Verwendung im BUN ANA LYZER 2 für die Bestimmung von Harnstoff in einer Probe eignete. The resulting solution was a stabilized urease concentrate solution that was diluted with water in a ratio of 1: 9 to form a diluted stabilized urease solution that was suitable for use in the BUN ANA LYZER 2 for the determination of urea in a Sample suited.
Eine erste Menge verdünnter Lösung (1:9 mit Wasser) hatte eine gemessene Leitfähigkeit von36, entsprechend einer Leitfähigkeit von 47 für eine Lösung von 2 mM Nach, auf der linearen Skala des BUN ANALYZER 2 . Diese verdünnte Lösung stellt eine Standardlösung dar, die zum Einstellen der Skala des BUN ANALYZER 2 verwendet werden kann. A first amount of diluted solution (1: 9 with water) had a measured conductivity of 36, corresponding to a conductivity of 47 for a solution of 2 mM Nach, on the linear scale of the BUN ANALYZER 2. This diluted solution is a standard solution that can be used to set the scale of the BUN ANALYZER 2.
Eine zweite Menge verdünnter Lösung (1:9 mit Wasser) hatte eine gemessene Leitfähigkeit von 38, wie vorstehend angegeben gemessen. Diese verdünnte Lösung war ebenfalls als Standardlösung zum Eichen des BUN ANALYZER 2 verwendbar. A second amount of dilute solution (1: 9 with water) had a measured conductivity of 38 as measured above. This diluted solution could also be used as a standard solution for calibrating the BUN ANALYZER 2.
Die konzentrierte Lösung und die verdünnten Lösungen zeigten gute Lagerfähigkeit. The concentrated solution and the diluted solutions showed good storability.
Beispiel 3 Eine Primärlösung wurde hergestellt durch Mischen von 450 ml Triäthanolamin und 910 ml destilliertem Wasser. Example 3 A primary solution was prepared by mixing 450 ml of triethanolamine and 910 ml of distilled water.
Zu der Mischung wurden 29,22 g EDTA (freie Säure) hinzugefügt und aufgelöst. Dann wurden 47,66 g HEPES und 1 g 2,4-Dichlorphenol dazugegeben. Die so erhaltene Primärlösung wurde durch einen Glasfaserfilter filtriert, um allfällige grobe ungelöste Teilchen zu entfernen. To the mixture, 29.22 g of EDTA (free acid) was added and dissolved. Then 47.66 g of HEPES and 1 g of 2,4-dichlorophenol were added. The primary solution obtained in this way was filtered through a glass fiber filter in order to remove any coarse undissolved particles.
Eine stabilisierte Reagens-Konzentrat-Lösung wurde hergestellt durch Mischen von 100 ml der vorstehend beschriebenen Primärlösung mit 505 ml Glycerin. In die Mischung wurden 250'000 I.E. Urease gesprüht und durch Diffusion bei 2-8"C auflösen gelassen. Nachdem sich die Urease gelöst hatte, wurde die Lösung etwa eine Stunde lang leicht durchmischt, um eine homogene Lösung zu erhalten. A stabilized reagent concentrate solution was prepared by mixing 100 ml of the primary solution described above with 505 ml of glycerin. 250,000 I.U. Urease was sprayed and allowed to dissolve by diffusion at 2-8 "C. After the urease had dissolved, the solution was mixed gently for about an hour to obtain a homogeneous solution.
Die so gebildete stabilisierte Reagens-Konzentrat-Lösung wird im Verhältnis von einem Teil Konzentrat zu 10 Teilen Wasser verdünnt, um die gebrauchsfertige oder Arbeitslösung für die Verwendung im BUN ANALYZER 2 zu erhalten. The stabilized reagent concentrate solution thus formed is diluted in the ratio of one part concentrate to 10 parts water in order to obtain the ready-to-use or working solution for use in the BUN ANALYZER 2.
Beispiel 4 Das Vorgehen gemäss Beispiel 3 wurde in allen wesentlichen Einzelheiten wiederholt, mit der Ausnahme, dass die gebildete stabilisierte Reagens-Konzentrat-Lösung mit einer Verdünnungslösung verdünnt wurde, die 0,004 Gew.-% 2,4-Dichlorphenol enthielt. Diese 0,004%ige Verdünnungslösung wurde hergestellt durch Zugabe von 50 ml einer 0,4 gewichtsprozentigen wässrigen Lösung von 2,4-Dichlorphenol zu 1'765 ml destilliertem Wasser. Example 4 The procedure according to Example 3 was repeated in all essential details, with the exception that the stabilized reagent concentrate solution formed was diluted with a diluting solution which contained 0.004% by weight of 2,4-dichlorophenol. This 0.004% dilution solution was prepared by adding 50 ml of a 0.4 percent by weight aqueous solution of 2,4-dichlorophenol to 1,765 ml of distilled water.
Die Verdünnungslösung wird dann mit 200 ml der stabilisierten Enzym-Konzentrat-Lösung kombiniert, um eine verdünnte stabilisierte Urease-Lösung zu bilden, die für die Harnstoffanalyse im BUN ANALYZER 2 verwendet werden kann. The dilution solution is then combined with 200 ml of the stabilized enzyme concentrate solution to form a diluted stabilized urease solution that can be used for urea analysis in the BUN ANALYZER 2.
Die erhaltene verdünnte stabilisierte Urease-Lösung war einen Monat lang bei Zimmertemperatur stabil. The resulting dilute stabilized urease solution was stable for one month at room temperature.
Beispiel 5 Das Vorgehen gemäss Beispiel 1 wurde in allen wesentlichen Einzelheiten wiederholt, mit der Ausnahme, dass die stabilisierte Urease-Konzentrat-Lösung die folgende Zusammensetzung hatte: HEPES 18 mM + 5% EDTA 10 mM Urease 250 000 + 5% I.E. pro Liter Diese Konzentrat-Lösung wurde verdünnt durch Mischen von 1 ml des Konzentrats mit 9 ml entionisiertem Wasser. Example 5 The procedure according to Example 1 was repeated in all essential details, with the exception that the stabilized urease concentrate solution had the following composition: HEPES 18 mM + 5% EDTA 10 mM Urease 250,000 + 5% I.U. per liter This concentrate solution was diluted by mixing 1 ml of the concentrate with 9 ml of deionized water.
Die verdünnte stabilisierte Urease-Lösung hatte die folgende Zusammensetzung: HEPES 1,8 mM EDTA 1 mM Urease 25 000 I.E. pro Liter Die verdünnte stabilisierte Urease-Lösung war eine klare, saubere Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 + 0,2 bei 25"C. The diluted stabilized urease solution had the following composition: HEPES 1.8 mM EDTA 1 mM Urease 25,000 I.U. per liter The diluted stabilized urease solution was a clear, clean solution with a pH of 7.0 + 0.2 at 25 ° C.
Die Lösung zeigte eine Linearität von 2% bei 50 mg/dl und 5% bei 100 mg/dl (1 ml verdünnte Lösung + 10 Mikroliter Probe). Der dynamische Bereich für die verdünnte Lösung betrug 100 mg/dl. Die konzentrierte stabilisierte Urease-Lösung zeigte Stabilität während 72 Stunden bei 41"C. Die verdünnte stabilisierte Urease-Lösung zeigte Stabilität während vier Wochen bei Zimmertemperatur und während vier Monaten gekühlt ( 4-8"C). The solution showed a linearity of 2% at 50 mg / dl and 5% at 100 mg / dl (1 ml diluted solution + 10 microliter sample). The dynamic range for the diluted solution was 100 mg / dL. The concentrated stabilized urease solution showed stability for 72 hours at 41 "C. The diluted stabilized urease solution showed stability for four weeks at room temperature and for four months refrigerated (4-8" C).
Beispiel 6 Eine stabilisierte Urease-Lösung wurde hergestellt durch Mischen von 50,6 ml dreifach destilliertem Wasser und 61 mg Tris(hydroxymethyl)aminomethan. Zu der Mischung wurden 70 mg HEPES hinzugefügt und durchmischt. Dann wurden 200 mg 2,4-Dichlorphenol und 100 mg Na2EDTA dazugegeben. Wasserfreies Glycerin wurde in einer Menge von 50,6 ml zugesetzt, und dann wurde die Mischung etwa eine Stunde lang durchmischt. Example 6 A stabilized urease solution was prepared by mixing 50.6 ml of triple distilled water and 61 mg of tris (hydroxymethyl) aminomethane. 70 mg of HEPES was added to the mixture and mixed. Then 200 mg 2,4-dichlorophenol and 100 mg Na2EDTA were added. Anhydrous glycerin was added in an amount of 50.6 ml and then the mixture was mixed for about an hour.
Der pH-Wert wurde durch Zugabe von HEPES auf 7,60 + 0,02 eingestellt. The pH was adjusted to 7.60 + 0.02 by adding HEPES.
Dann wurde der Lösung, in der im Beispiel 3 beschriebenen Weise, Urease in einer Menge von 75'000 I.E. pro Liter zugesetzt. Die Urease hatte eine Aktivität von 58'424 I.E. pro Gramm. Die Urease-Menge betrug 128 mg. Die Diffusion erforderte etwa zwei bis drei Stunden, und nach dem Auflösen wurde die gebildete Lösung durch leichtes Rühren während etwa zwei bis drei Stunden gründlich durchmischt. Then, in the manner described in Example 3, urease in an amount of 75,000 I.U. added per liter. The urease had an activity of 58,424 I.U. per gram. The amount of urease was 128 mg. Diffusion took about two to three hours and, once dissolved, the resulting solution was thoroughly mixed by gently stirring for about two to three hours.
Beispiel 7 Das Vorgehen gemäss Beispiel 6 wurde in allen wesentlichen Einzelheiten wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Bestandteile in den folgenden Mengen vorlagen: Dreifach destilliertes H2O 200 ml Tris(hydroxymethyl)aminomethan 0,244 g HEPES 0,350 g EDTA 0,500 g Glycerin (wasserfrei) 200 ml Urease 0,640 g Es wurde gefunden, dass die beschriebenen stabilisierten Enzym-Lösungen, in der beschriebenen Weise hergestellt, eine für die genaue Bestimmung von Harnstoff ausreichende Aktivität aufweisen und beibehalten. Example 7 The procedure according to Example 6 was repeated in all essential details, with the exception that the components were present in the following amounts: Triple distilled H2O 200 ml Tris (hydroxymethyl) aminomethane 0.244 g HEPES 0.350 g EDTA 0.500 g Glycerin (anhydrous) 200 ml Urease 0.640 g It has been found that the stabilized enzyme solutions described, prepared in the manner described, have and retain an activity sufficient for the precise determination of urea.
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| CH648060A5 true CH648060A5 (en) | 1985-02-28 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0707074A1 (en) * | 1994-10-13 | 1996-04-17 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for determination of urea nitrogen |
-
1980
- 1980-12-12 CH CH9169/80A patent/CH648060A5/en not_active IP Right Cessation
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