CH648330A5

CH648330A5 - Tumor-spezifische glykoproteine und verfahren zu deren herstellung.

Info

Publication number: CH648330A5
Application number: CH1725/78A
Authority: CH
Inventors: Eugene A Davidson; Sally Delong Bolmer
Original assignee: Research Corp
Priority date: 1977-02-18
Filing date: 1978-02-16
Publication date: 1985-03-15
Also published as: FR2381058A1; GB1591561A; JPS6129464B2; CH658317A5; CA1087979A; DE2806146C2; DE2806146A1; JPS6218869B2; IT1102384B; IT7848072A0; FR2381058B1; JPS53127822A; US4146603A; JPS60155975A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Tumor-spezifische Glykoproteine, die aus den Blutseren von menschlichen Patienten isoliert werden können, und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Untersuchungen in einer Reihe von Laboratorien, haben gezeigt, dass Tierzellen in Gewebekulturen unter Bedingungen gezüchtet werden können, die es ihnen ermöglichen, charakteristische Eigenschaften, die typisch für das Gewebe sind, aus dem sie stammen, beizubehalten. In anderen Worten bedeutet dies, dass z.B. Knorpelzellen in Gewebekulturen gezüchtet werden können und dabei typ;sche Produkte der Knorpelmatrix produzieren, Hypophysenzellen würden Hypophysenhormone erzeugen usw. Zu den Produkten, denen im Labor besonderes Interesse gewidmet wurde, zählen eine Gruppe von komplexen Sacchariden, die normalerweise als Sekretionsprodukte der Zellen angesehen werden, indem sie in der extra-zellulären Matrix, in der sich faserartige und zelluläre Elemente befinden, aufgefunden werden. Diese Verbindungsklasse hat etwa 6 Vertreter mit gewissen gemeinsamen Merkmalen, insbesondere hinsichtlich ihres Molekulargewichtes und einer hohen negativen Ladung. Die zuletzt genannte Eigenschaft dient häufig dazu, diese spezielle Gruppe zu isolieren und zu identifizieren.

Es wurde dann eine Untersuchung durchgeführt, wobei ein direkter Vergleich zwischen einer normalen Zell-Linie und der gleichen Zell-Linie nach Infektion mit einem viralen Agens, das die Zelle tumorigen machte, gezogen werden konnte. Über diese Arbeit wurde in Proc. Nat. Acad. Sei., USA, Band 70, No. 1, Seiten 53-56, Januar 1973, berichtet.

Es wurde festgestellt, dass kein qualitativer Unterschied zwischen den Saccharidprodukten bestand, wohl aber ein quantitativer Unterschied durch die Virustransformation einsetzte, und zwar insbesondere was die Synthese eines der charakteristischen Saccharide betraf. Diese quantitative Veränderung ist bei Untersuchungen in Zellkultursystemen nützlich, könnte jedoch niemals bei Tierversuchen angewandt werden, da das spezielle Produkt normalerweise in den meisten Geweben des Körpers gefunden wird, nicht-antigen ist und unter keinen Umständen als charakteristisch für eine Tumorzelle angesehen werden kann. Nichtsdestoweniger 5 waren qualitative Unterschiede von Interesse, die jedoch ganz allgemeiner Art waren.

Es konnte die Folgerung gezogen werden, dass die Umwandlung einer Zell-Linie durch Virustransformation zumindest eine Veränderung bei der Synthese der komplexen jo Saccharide mit sich brachte.

Wie in Biochemistry (1974) Band 13, S. 1233, berichtet, wurde in unterem Labor eine ähnliche Versuchsserie mit B16 Melanoma-Zellen von Mäusen und einer Kontroll-Population von normalen Melanocyten, die aus der Iris von Mäu-15 sen erhalten wurden, durchgeführt. Die beobachteten Unterschiede zwischen den Melanom-Zellen und der Kontrollzüchtung waren etwas stärker ausgeprägt, als bei den Versuchen mit den oben beschriebenen normalen und Virustransformierten Paaren. Diese Unterschiede können kurz 20 wie folgt zusammengefasst werden:

1. Beim Vergleich der Tumorzellen mit den normalen Zellen lag sowohl ein qualitativer als auch ein quantitativer Unterschied in der Produktion von komplexen Sacchariden vor.

25 2. Insbesondere wurde ein wesentliches Produkt der normalen Zellen, Hyaluronsäure, von der tumorigenen Linie überhaupt nicht erzeugt.

3. Von der Tumorlinie wurde ein sulfatiertes Polysaccharid mit ungewöhnlich hohem Molekulargewicht produziert, 30 welches bei den normalen Zellen nicht auftrat.

Bezüglich des sulfatierten Polysaccharides ist es wesentlich darauf hinzuweisen, dass sich diese Verbindung von den normalen Komponenten des Gewebes einzig in ihrer Molekulargrösse und nicht in ihrer molekularen Architektur 35 unterscheidet. Das heisst, die Struktur des Saccharides war mit den Strukturen identisch, die normalerweise in Geweben gefunden werden, lediglich ihr Molekulargewicht war etwas höher. Es wird nochmals daraufhin gewiesen, dass diese Versuche geeignet sind für Studien bei Zellkulturb edingun-40 gen; als eine diagnostische Methode sind sie jedoch weitgehend unbrauchbar, da die in Frage kommende Verbindung durch eine Vielzahl von Zellen in den Wirtstieren schnell metabolisiert wird. Sobald eine solche Verbindung im Kreislauf aufträte, würde sie schnell wieder herausge-45 filtert und von Leberzellen, Zellen der Niere, Fibroblasten usw. abgebaut. Aus diesem Grunde bietet die Anwesenheit oder die Produktion dieses Saccharides durch die Tumorzellen keine Anwendungsmöglichkeit, und zwar sowohl aus den obengenannten Gründen als auch aufgrund der Tat-50 sache, dass die Verbindung selbst nicht-antigen ist.

In einer Veröffentlichung in Cancer Research, 36, 424-431, Februar 1976, (E.A. Davidson) wurde über die Ergebnisse einer Untersuchung des komplexes Saccharides menschlicher Zellen berichtet, die in vieler Hinsicht ähnlich den 55 bei Mäusen erhaltenen Ergebnissen sind. Die menschlichen Melanomzellen produzieren weniger Hyaluronsäure als die Kontrollmelanocyten und ein hochmolekulares sulfatiertes Polysaccharid, ähnlich dem, wie es in den Mauszellen produziert wird.

6o Weitere Untersuchungen mit Mäusen brachten die Anwesenheit eines ungewöhnlichen Glykoproteins zutage. Aus diese m Grunde war man bemüht, die Art des Glykoproteins in Mäusen näher kennenzulernen und zwar insoweit als dessen Eigenschaften, strukturelle Chemie und biolo-65 gische Funktion bestimmt werden konnten. Viele der chemischen Eigenschaften des Moleküls werden in der Veröffentlichung von E.A. Davidson in &Biochemical and Bio-physical Research Communications», Bd. 70, No. 1, Mai

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1976 beschrieben. Die Anwesenheit eines ungewöhnlichen Glykoproteins in menschlichen Melanomzellen oder dessen Produktion durch dieselben wird in dieser Veröffentlichung nicht angesprochen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein tumorspezifisches Glykoprotein und dessen Herstellung. Das Glykoprotein wird von menschlichen Krebszellen produziert. Es wird von Normalzellen nicht produziert. Dieses Phänomen ist in der Diagnose und der Behandlung von Krebs nützlich.

Es wurde eine neue Art bzw. Klasse von Glykoproteinen gefunden, die von bösartigen Tumorzellen produziert wird, während sei von gesunden oder normalen Zellen nicht produziert wird. Diese einmalige Art oder Klasse eines Tumorspezifischen Glykoproteins (im folgenden manchmal als «TSGP» bezeichnet) ist im Tumor anwesend, wird von den Tumorzellen produziert, abgesondert und erscheint im Kreislauf des Wirts, bei Tieren sowie bei Menschen, und zwar etwa zu der Zeit, als eine fühlbare Tumormasse nachgewiesen werden kann. Das TSGP kann auch in einem beliebigen früheren Stadium auftreten.

Das TSGP wird von den Tumorzellen gebildet, ohne Rücksicht um welchen Tumor es sich dabei handelt, und erscheint im Kreislaufsystem von Menschen, die an Lungen-, Brust-, Dickdarm-, Uterus- und Magenkarzinomen, Melanomen und ähnlichen leiden. Leukämien und andere Blutkrankheiten stellen einen Defekt in der Reifekontrolle dar, wodurch eine abnorme Zahl von Zellen auftritt, wie man sie normalerweise in den metabolen Bildungsschritten findet. Aus diesem Grunde .wird bei vielen oder den meisten dieser Blutkrankheiten kein TSGP produziert, da die Zellen selbst nicht tumorigen sind. Ausserdem ist es gut möglich, Leukämien durch mikroskopische Untersuchung einer Blutprobe nachzuweisen, so dass Leukämien vom diagnostischen Standpunkt kein Problem darstellen.

Das spezifische Glykoprotein, das von einem Wirtstier mit einer bösartigen Tumorerkrankung produziert wird, kann sich je nach Charakter und Art des Tumors sowie auch hinsichtlich des betroffenen Wirts unterscheiden, jedoch ungeachtet, um welchen Tumortyp es sich handelt, wird ein Produkt der Art und Klasse von Tumor-Glykoproteinen (TSGP), die gemäss der Erfindung aufgefunden, isoliert und charakterisiert wurden, angehören.

Es wird daraufhingewiesen, dass die Wachstumscharakteristiken und andere Eigenschaften von Tumoren mit unterschiedlichem zellulären Ursprung (und von verschiedenen Personen) nicht gleich sein werden. Jedoch scheint es, dass der hier beschriebene Glykoprotein-Typ charakteristischerweise von einer grossen Anzahl von Tumoren produziert wird. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften von TSGP eines beliebigen Tumortyps sind einander genügend ähnlich, um durchwegs die Anwendung von Standard-Isolationsmethoden zu erlauben.

Die im nachfolgenden beschriebenen Merkmale hinsichtlich der Eigenschaften, chemischen Struktur und biologischen Funktion sind für TSGP charakteristisch und dienen dazu, es von den normalerweise im Serum gefundenen Glykoproteinen zu unterscheiden:

(a) Löslichkeit in Perchlorsäure (0,6M) bei 0°C oder in Trichloressigsäure (5%) bei 0°C.

(b) Sialinsäure- oder N-Acetyln euraminsäure- (im folgenden manchmal als «NANA» bezeichnet) Gehalt mit 30 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht von Glu-cosamin, Galactosamin und Sialsäure (bzw. Sialinsäure genannt).

(c) Affinität für Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-25 (Pharmacia Co., Uppsala, Schweden) und Eluierung mit Pyridinacetatpuffer, pH 5,2, bei einer Konzentration von ungefähr 0,4M.

(d) Einschluss an Sephadex G-150 (Pharmacia Co., Uppsala, Schweden) in 0,1M Pyridinacetat, pH 5,2. Eluierung bei 1,5 X dem Ausschlussvolumen, kalibriert mit Dextranblau.

5 (e) Affinität für ein konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin, immobilisiert an einen Sepharoseträger, wie z.B. eine Weizenkeim-Sepharose-Säule in 0,05: M Natrium- oder Kaliumchlorid. Es können andere künstliche Träger für das Weizenkeim-Lektin verwendet werden. Eluie-10 rung von der Säule erfolgt spezifisch mit N-Acetyl-

glucosamin (0,1 M in Wasser ist optimal). Andere Lektine, die für TSGP eine Affinität besitzen, jedoch nicht derart spezifisch sind, umfassen limulus-polyphemus-(Krebs) Lektin und nach Entfernung von Sialsäure-resten Ricinus-Communis-II-Lektin.

(f) Diese Affinität für das Weizenkeim-Agglutinin wird bei Behandlung mit Sialidase (gereinigt durch Affinitätschromatographie, um es von Protease freizumachen) von einer der verschiedenen Quellen verloren. Ein wesentliches Kriterium bei dieser Analyse ist es, dass es nicht notwendig ist, die Sialsäure vom TSGP vollständig zu entfernen, um die Affinität für Weizenkeim-Agglutinin zu zerstören.

(g) Die Sialsäure in TSGP ist an Galactose gebunden und kann auch an N-Acetylgalactosamin gebunden sein.

(h) Elektrophorese von TSGP in 6% Polyacrylamid-Gel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (0,1%) und Anfärben des Gels auf Protein und Kohlenhydrat zeigt, dass TSGP ein Molekulargewicht von etwa 50 000 bis 70 000, wahrscheinlich etwa 60 000 besitzt. Diese Zahl ist nicht genau anzugeben, da Glykoproteine im allgemeinen nach dieser Methode anomale Molekulargewichtswerte ergeben. Das Glykoprotein tritt jedoch in ein 6%iges vernetztes Gel ein und wandert in demselben. Nach Einwirkung von Pronase reduziert sich das Molekulargewicht auf etwa 10 000 bis 15 000. Dies stellt einen Protease-resistenten Kern dar und lässt die Annahme zu, dass die Sialsäurereste und die Saccharid-substituenten auf dem Polypeptidkern angeordnet sind, bzw. sich um diesen herum zusammenballen.

(i) Durch isoelektrische Fokussierung in Gelen oder in Lösung wird TSGP deutlich von irgendwelchen kontaminierenden Serumkomponenten (wie a-l-saures Glykoprotein) abgetrennt. TSGP hat einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und kann aufgrund geringfügiger Unterschiede im Sialsäuregehalt mehrere eng beisammenliegende Bande aufzeigen.

(j) TSGP enthält ebenfalls eine neutrale Hexose, hauptsächlich Galactose; es ist keine Glucose anwesend. Nachweis ist möglich durch Analyse auf neutrale Zuk-ker [z.B. mittels der Methode von Dubois et al, Anal. Chem, 28, 350 (1966)].

(k) TSGP kann als ein Produkt menschlicher Tumorzellen in vitro in monoschichtiger Kultur nachgewiesen werden.

(1) Der Hauptanteil an Kohlenhydrat von TSGP, der die Hauptmenge an Sialsäure enthält, ist mit der Poly-peptidkomponente über eine O-glykosidische Bindung verknüpft und zwar von einem einzelnen N-Acetyl-galactosaminyl-Rest zur Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin (als Partialsequenz kann angesehen werden: Galactosyl-N-Acetylgalactosamin, jeweils in den 3- und 6-Stellungen mit Sialsäureresten substituiert).

Cm) Die gesamte Sacharid-Kette kann von dem Polypeptid durch Behandeln mit 0,01 N Natriumhydroxid, 16 Stunden bei 20°C, abgespalten werden. Die sich ergebende Saccharid-Kette kann auf einer G25-Sephadex-Säule (1,2 X 60 cm) abgetrennt werden und wird bei

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1,15 X dem Ausschlussvolumen (kalibriert mit Dex-tranblau) eluiert.

(n) Die Aminosäurezusammensetzung der TSGP-Fraktion nach Chromatographie auf DEAE-Sephadex A-25 ergibt Glutaminsäure, Prolin, Asparaginsäure, Threonin und Leucin als hauptsächliche Aminosäuren.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die charakteristischen Unterscheidungsmerkmale Tumor-spezifischer Glykoproteine, die aus den Blutseren von Krebs-infizier-ten Menschen isoliert werden können, folgende sind: Löslichkeit in 0,6 m Perchlorsäure, ein Pronase-resistenter Kern, der die Hauptmasse an Kohlenhydrat enthält, Affinität für Weizenkeim-Agglutinin, in Abhängigkeit von der Sialsäure, besondere elektrophoretische und chromatographische Mobilität, ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 50 000 bis 70 000 und ein isoelektrischer Punkt von etwa 4,2 bis 4,6. Besonders charakteristische Eigenschaften des Tumor-spezi-fischen Glykoproteins, die sich für diagnostische Zwecke eignen, um letzteres von anderen Glykoproteinen in den Seren normaler Patienten zu unterscheiden, bestehen darin, dass TSGP einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 hat.

Eine Anzahl der verwendeten Produkte ist im Handel erhältlich. «Sephadex»-Produkte werden von Pharmacia Fine Chemicals A.B., Uppsala, Schweden hergestellt und vertrieben. Es handelt sich um vernetzte Dextrane mit unterschiedlicher Porosität oder Substituenten. «Sepharose» ist ein in kugelförmigen Partikeln geformtes Agarose-Gel. «DEAE-Sephadex A25 oder A50» wird aus Sephadex G25 oder G50 durch chemische Substituierung von Diäthylaminoäthyl-Gruppen hergestellt. Letztere sind schwach basische Anio-nenaustauscher. Sie haben einen Kugeldurchmesser von 40 bis 120 Mikron und quellen zu einem Säulenvolumen von 89 (15-35) ml pro Gramm Trockengel. Sephadex G150 hat einen Kugeldurchmesser von 40 bis 120 Mikron, einen Fraktionierungsbereich von 5 bis 150 000 Molekulargewicht und ein Säulenvolumen (bed volume) von 20 bis 30 ml pro Gramm Trockengel. Sepharose 4B weist eine Agarose-Kon-zentration von 4% und einen Nasskugeldurchmesser von 40 bis 190 Mikron auf.

Es wird daraufhingewiesen, dass TSGP von carcino-embryonischem Antigen, wie in US-PS 3 663 684 beschrieben, u.a. unterschieden werden kann durch Einschluss von TSGP auf Sephadex G150 (wie oben unter (d) beschrieben), die Affinität von TSGP für ein konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin, immobilisiert auf einem Sepharose-Träger (wie oben unter (e) beschrieben), sowie durch das Molekulargewicht (wie oben unter (h) beschrieben). Carcinoembryoni-sches Antigen weist keine dieser Eigenschaften auf.

Die Feststellung dass diese einzigartige Art bzw. Klasse von Glykoproteinen in Tumoren anwesend ist, von Tumorzellen produziert und abgesondert wird, und im Kreislauf des Wirts, einschliesslich eines menschlichen Wirts erscheint, sowie die Identifizierung und Charakterisierung von TSGP erlaubt folgende Anwendungsmöglichkeiten:

I. Frühdiagnose von Personen mit irgendeiner Art von bösartiger Tumorerkrankung.

II. Nachweis oder Analyse des in seiner Art einzigartigen TSGP in einer menschlichen Blutprobe mittels radioimmunologischer oder anderer Nachweismethoden als ein Mittel für die Diagnose und Behandlung von Krebs.

III. Iindividualisierte Therapie durch Isolierung von TSGP von Patienten mit fortgeschrittenem Krebs in grösseren Mengen durch Plasmapherese oder eine andere Methode, •Verwendung dieses Materials zur direkten Antikörperherstellung in einem Wirtstier oder dem Patienten und Verwendung dieses Antikörpers zur direkten Immunotherapie. Eine

Kopplung dieses Antikörpers mit Agenzien, die auf die Krebszellen toxisch wirken, würde eine gezielte Einführung von lethalen Agenzien in Krebszellen ermöglichen.

IV. Verwendung des von einem Krebspatienten isolierten TSGP zur Herstellung von Antikörper, die die Oberfläche der Tumorzelle angreifen können, wodurch eine von Antikörper vermittelte Lyse durch das normale Immunsystem des Wirts möglich ist, bzw. Änderungen auf der Oberfläche der Tumorzellen hervorgerufen werden, wodurch übliche therapeutische Agenzien wirksamer angreifen könnten.

V. Bestimmung des Glykoproteinspiegels im Serum eines Patienten und Auswertung dieser Information als direkter Index für eine therapeutische Behandlung.

I. Frühdiagnose von Personen mit irgendeiner Art von bösartiger Erkrankimg:

Es wurde festgestellt, dass die Anwesenheit von TSGP in menschlichen Seren eine direkte Indikation für das Vorliegen eines bösartigen Tumors (nicht eingeschlossen sind Bluterkrankungen) des untersuchten Patienten sein kann. Es wurde eine einfache, jedoch genaue Methode zum Nachweis der An- oder Abwesenheit von TSGP in menschlichen Seren entwickelt. Auf diese Weise entstand eine allgemein anwendbare diagnostische Nachweismethode, die weder angreifend noch zerstörend wirkt, und die als Teil einer routi-nemässig durchgeführten ärztlichen Untersuchung von Patienten in der risikoreichen Altersgruppe, d.h. Frauen über 40, Männer in bestimmten Berufen usw., angewandt werden kann. Ausgehend von einer einzigen Blutprobe kann die Methode als Teil einer Routinenuntersuchung für Personen aller Altersgruppen angewandt werden.

Der ursprüngliche analytische Nachweis für TSGP basiert auf den folgenden Eigenschaften desselben:

1. Das Glykoprotein hat eine sehr hohe negative Ladung.

2. Die negative Ladung ist in der Hauptsache, wenn nicht ausschliesslich, auf die Anwesenheit von N-Acetylneura-minsäure zurückzuführen.

3. Die N-Acetylneuraminsäure war auf den Saccharid-Ket-ten angeordnet, die die Tendenz zeigen, sich zusammenzuballen und eine Kernstruktur auszubilden, die gegenüber Proteolyse resistent ist.

4. Das stark saure Gebilde war in einer geeigneten Konzentration von Perchlorsäure oder Trichloressigsäure oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel löslich.

5. Das Glykoprotein weist eine Affinität für Weizenkeim-Agglutinin, welches an Sepharose immobilisiert ist, auf.

6. Das Glykoprotein kann aufgrund seiner hohen negativen Ladung an einer Vielzahl von anionischen Austauschern fraktioniert werden, einschliesslich Diäthylaminoäthyl-Cellulose, Diäthylaminoäthyl-Sephadex, Ecteola-Cellulose, und starken und schwachen Anionenaustauschharzen, wie Dowex 1 oder Dowex 2.

7. Der hohe Kohlenhydratgehalt des Glykoproteins und seine Ladung erlauben eine Identifizierung durch Polyacrylamid- oder andere Gel-Elektrophorese-Methoden, so wie Anfärben entweder durch übliche Proteinfarbstoffe oder durch Farbstoffe für die Kohlenhydratkomponente unter Verwendung von Perjodsäure-Schiff-Reagens oder andere Reagenzien.

Kurz zusammengefasst basiert die diagnostische Nachweismethode auf den generalisierten und allgemeinen Strukturmerkmalen des Glykoproteins, d.h. den hohen Sialsäure-gehalt, den Pronase-beständigen Kern, die Affinität für Wei-zen-Agglutinin und die charakteristische elektrophoretische und chromatographische Mobilität.

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Die allgemein anwendbare Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von TSGP im menschlichen Blutserum umfasst die Beschaffung einer Serumprobe von einem menschlichen Patienten, Behandeln der Serumprobe mit einem TSGP-Lö-sungsmittel, wie Perchlorsäure, Trichloressigsäure oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel, Entfernung des gebildeten Niederschlages durch eine geeignete Methode zur Fest-Flüssig-Trennung, wie Dekantierung, Filtration oder Zentri-fugation; Neutralisierung der löslichen Fraktion mit einem alkalischen Material, wie Kaliumhydroxid, Analysieren des löslichen Anteiles auf den Gehalt an N-Acetylneuramin-säure und Protein, und Vergleich der gefundenen Werte für N-Acetylneuraminsäure und Protein mit Grundlinien-Para-metern, aufgestellt für Normal- und Krebsseren.

Die Analyse auf NANA kann durch eine der üblichen bekannten Methoden erfolgen, einschliesslich der Perjodat-Resorcinol-Thiobarbitursäure oder der direkten Ehrlich Methode. [G.W. Jourdian et al, 7. Biol. Chem., 246, 431 1971); L. Warren, J. Biol. Chem. 234, 1971 (1959); und I. Werner et al, Acta Med. Soc. Uppsala, 57, 230 (1952)].

Die Proteinbestimmungen können z.B. durch ein modifiziertes Coomasie-Blau-G-Verfahren oder durch die Methode nach Lowry oder durch Bestimmung der Absorption bei 280 nm erfolgen [O.H. Lowry et al, J. Biol. Chem., 193, 265 (1951) und M. M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 (1976)].

Auf der Grundlage der zusammengestellten Daten von 370 menschlichen Serumproben wurden die folgenden Parameter zur Feststellung des Vorliegens von bösartigen Tumoren bei Menschen festgelegt (basierend auf der Analyse der Perchlorsäure-löslichen Fraktion, bezogen auf das Volumen der ursprünglichen Serumprobe):

(1) Ein Sialsäuregehalt (NANA) von über etwa 0,065 mg/ml weist auf die Möglichkeit eines Tumors hin; ein Sialsäuregehalt von über etwa 0,080 mg/ml indiziert einen wahrscheinlichen Tumor.

(2) Ein Proteingehalt von über etwa 0,35 mg/ml weist auf einen möglichen Tumor, ein Proteingehalt von über etwa 0,4 mg/ml auf das wahrscheinliche Vorliegen eines Tumors hin.

Es wurde eine Ausgangsuntersuchung mit 59 Proben durchgeführt, wobei die Perjodat-Resorcinol-Methode und die direkte Ehrlich-Methode für N-Acetylneuraminsäure-Spiegel und das Lowry-Verfahren für Protein-Spiegel angewandt wurden. Es wurde festgestellt, dass zwischen 30 Krebspatienten und 29 Normalkontrollen eine vollständige Unterscheidung im Gehalt der Sialsäure bestand. Das heisst, der höchste Normalspiegel war immer noch niedriger als der niedrigste Spiegel, der bei einem Patienten mit diagnostizierter bösartiger Erkrankung festgestellt wurde. Diese Ausgangsuntersuchung schloss eine Anzahl von Erkrankungen verschiedener Art, Lungen-, Brust-, Dickdarm-, Lymphom-und Melanom-Patienten ein, davon ausgehend, dass die Produktion eines Perchlorsäure-löslichen Glykoproteins eine allgemeine Eigenschaft einer Anzahl von Tumoren darstellt. Die statistische Analyse dieser Werte zeigte, dass die Zufallswahrscheinlichkeit dieser Ergebnisse geringer als 1 in 1000 ist.

Unter Auswertung der in der vorangehend beschriebenen Untersuchung erhaltenen Spiegel als parametrische Kriterien, wurde eine viel grössere Untersuchung mit etwa 311 Patienten durchgeführt, die sowohl an bösartigen Erkrankungen und einer Reihe von nicht-malignen Beschwerden litten sowie einer Anzahl von normalen Kontrollpersonen. Lediglich basierend auf die Gehalte an Protein und Sialsäure (N-Acetyl-neuraminsäure) wurde eine über 95% ige Unterscheidung zwischen Normalpersonen und nicht-bösartig erkrankten Personen einerseits und Patienten mit Tumor andererseits erhalten. Ausserdem bestand kein signifikanter Unterschied zwischen normal- und nicht-bösartig erkrankten Personen oder zwischen Männern und Frauen. Es wurde eine Reihe anderer statistischer Tests durchgeführt, wobei die Daten von dieser Gruppe stammen. Es sei hier nur angeführt, dass die Zufallswahrscheinlichkeit zur Unterscheidung zwischen der Krebsgruppe und der anderen Gruppe geringer ist als 1 in 1000. Es besteht auch eine deutliche Korrelation mit dem Fortschritt der Erkrankung. So haben Personen mit ausgestreuter, verbreiteter metastatischer Erkrankimg höhere Spiegel an zirkulierendem TSGP als solche mit lokalisierter Erkrankung; Personen, die sich in Remission befinden, bzw. Personen nach einer chirurgischen und/ oder chemotherapeutischen oder Strahlungsbehandlung tendieren dazu, niedrigere Spiegel an zirkulierendem Glykoprotein zu haben.

Diese Ergebnisse führten zu einer Reihe von weiteren Untersuchungen. Zuerst wurde das Augenmerk auf die wenigen falschen positiven Bestimmungen, die sich in dieser Gruppe zeigten, gerichtet. Es zeigte sich, dass mehrere derselben von asthmatischen Patienten herrührten und können in der Tat auf einen Faktor, der mit dieser Krankheit assoziiert ist, bezogen werden.

Dementsprechend wurde eine weitere Untersuchung mit den falschen Positiven, mit Normalproben und verschiedenen Patienten mit diagnostiziertem Krebs durchgeführt, um festzustellen, ob die gefundenen qualitativen Unterschiede im Zellkultursystem auch in der Serumprobe wiederholt werden konnten. Statt nur einfach die Spiegel an N-Acetyl-neuraminsäure in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion zu berücksichtigen, wurde das Perchlorsäure-lösliche Material einer Gel-Elektrophorese unterzogen (wie insbes. im nachfolgenden Beispiel 2 beschrieben) zum Nachweis des charakteristischen Tumor-Glykoproteins (TSGP). Das Tumor-spezifische Glykoprotein hat einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und ein Molekulargewicht von etwa 50 000 bis 70 000, allgemein etwa 60 000.

Nach Durchführung dieser zweiten Untersuchung reduzierte sich die Anzahl an falschen Positiven auf Null; lediglich Patienten mit diagnostiziertem Tumor zeigten eine charakteristische Glykoprotein-Bande auf der Gel-Elektro-phorese. Obwohl einige wenige der Personen mit Erkrankungen (insbes. Leukmämien) N-Acetyl-neuraminsäure-Spiegel aufwiesen, die nicht in die anormale Gruppe fielen, traten keine Normalen oder nicht-bösartig erkrankten Normalen in der positiven Gruppe nach der zweiten Untersuchung auf. Darüber hinaus konnte die Anwesenheit des charakteristi-schne Glykoproteins bei solchen Personen mit bösartiger Erkrankung gezeigt werden, die niedrigere Spiegel an N-Ace-tyl-neuraminsäure aufwiesen.

Zusammengefasst zeigt die entwickelte Nachweismethode folgendes:

1. Es besteht ein ungewöhnlich hoher Wahrscheinlichkeitsgrad in der Voraussage des Vorliegens eines Tumors sowie des Erkrankungsstadiums, basierend lediglich auf der Messung der N-Acetyl-neuraminsäure- und Protein-Spiegel in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion des Serums.

2. Die sehr kleine Anzahl von falschen Positiven kann vollständig durch eine zweite Untersuchung, die eine Gel-Elektrophorese und Untersuchung der Gele auf das Vorliegen des charakteristischen Tumor-spezifischen Glykoproteins umfasst, eliminiert werden.

3. Der Voraussagewert dieser Methode ist mindestens ebenso gut oder besser als irgendeine der gegenwärtigen oder früher beschriebenen Methoden, einschliesslich dem carcino-embryonischen Antigen, wie es in der US-PS 3 683 684 beschrieben wird.

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4. Obwohl TSGP nicht für sämtliche Tumore oder in der Tat sogar z.B. für sämtliche Lungencarcinome identisch sein mag, besitzt es doch eine ausreichende Identität aufgrund struktureller Charakteristiken, um eine verallgemeinerte diagnostische Nachweismethode zu erlauben. Wichtig ist die Feststellung, dass zwei verschiedene Personen mit der gleichen anatomischen Diagnose dennoch Tumore mit unterschiedlichen Charakteristiken in bezug auf Metastasegeschwindigkeit, Wachstumsgeschwindigkeit sowie charakteristischer Produkte aufweisen können. Es besteht die Möglichkeit, dass jeder Tumor eine unterschiedliche biologische Einheit und eine unterschiedliche Krankheit darstellt, und dass keine zwei identisch sind, wenn man charakteristische Zellprodukte in Betracht zieht. Aus diesem Grunde besteht eine dringende Notwendigkeit für eine verallgemeinerte Identifikationsmethode und eine allgemein anwendbare therapeutische Strategie, bevor ein vernünftiger Fortschritt in bezug auf Früherkennung oder therapeutische Behandlung mit weitem Anwendungsbereich erwartet werden kann.

Die Tatsache, dass ein Tumor-spezifisches Glykoprotein in menschlichen Seren anwesend ist, welches ein Produkt des Tumorwachstums darstellt, stellt ein allgemeines diagnostisches Mittel dar.

Die folgenden Beispiele beschreiben praktische Ausführungsformen gemäss der Erfindung.

Beispiel 1

Reinigung und Isolierung des Tumor-spezifischen Glykoproteins

Serumproben von Patienten mit diagnostizierten festen Tumoren (Lungen-, Magen- und Brustkarzinom und Melanom wurden verwendet, die jeweils eine ähnliche chromato-graphische und elektrophoretische Mobilität zeigten) wurden wie folgt behandelt:

70 Mikroliter einer 60% igen Perchlorsäure wurden pro ml Serum zugegeben und die Lösung gemischt. Zu dieser Lösung werden 0,93 ml 0,6 M Perchlorsäure pro ml Serum zugegeben. Diese Lösung wird gut gemischt und eine Stunde (45 bis 90 Min. sind ausreichend) bei 0°C stehengelassen. Das Gemisch wird dann bei 8000 g 10 Min. lang (6 bis 12 Min.) zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch Dekantieren vom Niederschlag getrennt.

Die erhaltene überstehende Lösung wird mit 1,2 M Kaliumhydroxid auf pH 6 bis 7 eingestellt und 10 Min. bei 0°C stehengelassen. Das Kaliumperchlorat wird wie oben durch Zentrifugation (Filtration ist ausre-'chend) abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit 24 Stunden lang (16 bis 36 Stunden sind ausreichend) gegen 10"3 M Pyridinacetat, pH 5,2, dialysiert.

Eine DEAE-Sephadex-A-25-Säule (1,5 X 40 cm) wird entsprechend den Anweisungen des Herstellers bereitet und mit 0,1 M Pyridinacetat, pH 5,2, äquilibriert.

Die Probe des dialysierten Perchlorsäure-Überstandes wird (vorzugsweise) durch Lyophilisation oder Ultrafiltration auf etwa das Zehnfache konzentriert. Ein Aliquot mit bis zu 5 mg Sialsäure und bis zu 30 mg Protein wird auf die Säule aufgebracht und diese daraufhin mit einem linearen Gradienten aus 0,01 M bis 1,0 M Pyridinacetat, pH 5,2, (das gesamte Gradientenvolumen beträgt 600 ml) eluiert.

Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde werden Fraktionen gesammelt (5 bis. 6 ml Fraktionen). Diese Fraktionen werden dann auf ihren Protein- und Sialsäuregehalt nach Lowry et al und mittels der Perjodat-Re-sorzinol-Methode analysiert. Die Sialsäure-positiven Fraktionen, die den Hauptanteil dieser Säure enthalten, und bei einer Gradientkonzentration von etwa 0,4 M eluiert werden, werden vereinigt, bei 0°C 24 Stunden lang gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisation konzentriert. Diese Fraktion enthält das Tumor-spezifische Glykoprotein und kann etwas a-1-saures Glykoprotein, eine normale Serumkomponente, enthalten.

5 Eine weitere Reinigung des Tumor-spezifischen Glykoproteins kann durch isoelektrische Fokussierung oder Chromatographie über DEAE-Sephadex A-50 erreicht werden.

Die nach der oben beschriebenen Chromatographie erhaltene Fraktion, die die Sialsäure enthält, wird auf eine io 1,2 X 50 cm Säure aus DEAE-Sephadex A-50 aufgebracht und die Säule mit einem linearen Pyridin-Acetat-Gradienten (0,01 M bis 0,5 M, pH 5,2, 400 ml) eluiert. Es werden zwei Sialsäure-positive Fraktionen erhalten, die jeweils bei den Gradientenkonzentrationen 0,42 und 0,46 M eluiert werden. 15 Die zweite Fraktion enthält das Tumor-Glykoprotein und ist im wesentlichen frei von anderen Verunreinigungen.

Diese Fraktion wird durch 24 Stunden lange Dialyse gegen destilliertes Wasser bei 0°C entsalzt und durch Lyophilisation konzentriert.

20 Alternativ wird die Fraktion mit dem Tumor-spezifischen Glykoprotein, wie sie von der DEAE-Sephadex-A-25-Säule erhalten wird, einer Gel-isoelektrischen Fokussierung in einem pH 3,5 bis 7,0 Ampholin-Gradienten mit Hilfe eines LKB-Multiphor-gerätes von LKB Instruments, Inc., unter-25 worfen. Kontaminierende saure Glykoproteine weisen isoelektrische Punkte von 3,5 bis 3,8 auf und werden deutlich von dem Tumor-spezifischen Glykoprotein getrennt, das einen isoelektrischen Punkt bei 4,4 (4,2 bis 4,6) besitzt.

Nach demselben Prinzip kann präparativ gearbeitet werden, 30 indem eine 110 ml Ampholin-Säule (LKB) und der oben beschriebene pH -Gradient verwendet wird. Der Bereich zwischen pH 4,2 und 4,6 wird gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisation konzentriert. Das Produkt kann in 0,01 M Natrium- oder Kaliumchlorid, 35 das 0,005 M Phosphatpuffer, pH 6,5 enthält, gelöst werden.

Eine letzte Reinigung sowie eine Prüfung auf Verunreinigungen kann durch Affinitätschromatographie des Glykoproteins auf einer Weizenkeim-Agglutinin-Sepharosesäule 40 erreicht werden.

Die Glykoproteinlösung (in Natriumchlorid/Phosphat 0,01 M/0,005 M pH 6,5) wird auf eine IX 10 cm Säule mit Sepharose 4 B, das mit Weizenkeim-Agglutinin konjugiert ist, und die mit der gleichen Lösung äquilibriert wurde, 45 gegeben. Die Säule wird mit 3 bis 5 Volumen des äquili-brierenden Puffers gewaschen (von dem Tumor-Glykoprotein sollte dabei nichts von der Säule eluiert werden). Das Tumor-Glykoprotein kann mit einem scharfen, symmetrischen Peak mit 0,01 M N-Acetylglucosamin eluiert werden. 50 Der Zucker wird durch Dialyse gegen destilliertes Wasser entfernt und das Glykoprotein durch Lyophilisation konzentriert.

Beispiel 2

55 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

Lösung A wird durch Vermischen von 0,24 g Acrylamid (erhältlich von Eastman Organic DPI und zweimal in Aceton umkristallisiert) mit 0,73 g N,N'-Methylenbisacrylamid 60 und 100 ml Wasser hergestellt. Lösung B bereitet man durch Auflösen von 150 mg Kalium- oder Ammoniumpersulfat in 100 ml Wasser. Lösung C enthält 7,7 g NaH2P04 . H20, 38,6 g Na,HP04 . 7H20, 4 g Natriumdodecylsulfat und 1,15 ml N,N,N',N'-Tetramethyläthylendiamin (Eastman 65 DPI) pro Liter. Das Gel wird hergestellt durch Mischen von einem Teil der Lösung A mit zwei Teilen der Losung B und einf m Teil der Lösung C. Das Gemisch wird sofort in ein 5 X 75 mm Gel-Röhrchen mit einer Höhe von 55 mm gege-

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ben. Das Gel wird 10 mm mit H20 überschichtet und das auf diese Weise hergestellte Röhrchen eine Stunde lang bei 25 °C stehengelassen. Das Röhrchen wird daraufhin in ein Reservoir eingegeben. Eine Probe, 10 bis 25 (il, die 5 bis 20 (ig Glykoprotein enthält, wird auf das obere Ende der Geloberfläche überschichtet und ein Elektrophoreselauf bei 70 V zwei Stunden lang durchgeführt. Das Gel wird herausgenommen und mit 10%iger Trichloressigsäure 3 Min.

lang fixiert und dann mit 0,3%igem Coomassie Brilliantblau R in 10% Essigsäure / 45% Methanol / 45% H20 zwei Stunden lang bei 40°C gefärbt. Das Material wird daraufhin mit 7% Essigsäure / 30% Methanol / 63% Wasser fünfmal 5 zwei Stunden lang bei 40°C (oder bei 25°C entsprechend länger) entfärbt. Die Färbemethode für Glykoprotein entspricht der von Zacharius et al, Anal. Biochem., 30, 148 (1969), beschriebenen.

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Claims

648330 2 PATENTANSPRÜCHE

1. Aus dem Blutserum krebskranker Menschen isolierbares tumorspezifisches Glykoprotein, gekennzeichnet durch eine Löslichkeit in 0,6 M Perchlorsäure; einen pronase-resistenten Kern enthaltend den Hauptanteil der Kohlenhydrate, wobei dieser Kohlenhydrat-anteil, der die Hauptmenge der Sialinsäure enthält, über eine O-glykosidische Bindung von einem einzelnen N-Acetylgalactosaminyl-Rest an die Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin mit der Polypeptidkomponente gebunden ist; durch eine sialinsäure-abhängige Affinität für Weizenkeim-Agglutinin; eine Affinität für Diäthylaminoäthyl-Sephadex Ä-25 und Eluier-barkeit mit Pyridin-Acetat-Puffer vom pH 5,2 und einer Konzentration von etwa 0,4 M; einen Einschluss auf Sepha-dex G-150 in 0,1 M Pyridin-Acetat-Puffer vom pH 5,2;

eine Molekularmasse im Bereich von 50 000 bis 70 000; einen isoelektrischen Punkt von 4,2 bis 4,6; und eine Aminosäurezusammensetzung, die als hauptsächlich vorliegende Aminosäuren Glutaminsäure, Prolin, Asparaginsäure, Threo-non und Leucin umfasst.

2. Verfahren zur Herstellung von gereinigtem tumor-spez:fischem Glykoprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Blutserum eines von Tumor befallenen Menschen mit Perchlorsäure oder Trichloressigsäure mischt, Unlösliches abtrennt, die säurelösliche Fraktion neutralisiert, das durch Neutralisieren gebildete Salz abtrennt, das Lösliche dialysiert, das Dialysat aufkonzentriert und daraus das Glykoprotein gewinnt.