CH648414A5 - Antienzym-homogen-kompetitivbindungs-test. - Google Patents

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CH648414A5
CH648414A5 CH7673/78A CH767378A CH648414A5 CH 648414 A5 CH648414 A5 CH 648414A5 CH 7673/78 A CH7673/78 A CH 7673/78A CH 767378 A CH767378 A CH 767378A CH 648414 A5 CH648414 A5 CH 648414A5
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ligand
inhibitor
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receptor
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CH7673/78A
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Robert A Yoshida
Edward T Maggio
Robert F Zuk
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Syva Co
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0005—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring the nitrogen atom being directly linked to the cyclopenta(a)hydro phenanthrene skeleton
    • C07J41/0016—Oximes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching

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Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das im Anspruch 1 geschriebene Verfahren. Es ist ein kompetitives Protein-Bindungs-Verfahren für die Bestimmung eines Analyten, welcher Glied eines immunologischen Paars ist (Ligand und Rezeptor). Das Verfahren basiert auf der Bildung eines Komplexes zwischen mindestens einem, normalerweise mehr als einem Glied des immunologischen Paars, d.h. enzymgebunden entweder an Ligand (enzymgebundener Ligand) oder Rezeptor (enzymgebundener Rezeptor). Die Bildung des Komplexes hindert die Annäherung des Enzym-Inhibitors. Wo das Enzymkonjugat dasselbe Glied des immunologischen Paars wie der Analyt ist, wird das andere Glied des immunologischen Paars als Reagenz zugegeben, dies ist jedoch nicht notwendig, wenn das Enzymkonjugat das reziproke Glied des immunologischen Paars zum Analyten darstellt. Der Test wird in einem gepufferten wässrigen Medium durchgeführt,
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wobei die einzelnen Komponenten entweder nacheinander oder miteinander zugegeben werden. Die enzymatische Aktivität kann durch Zugage von Enzymsubstraten zum Testgemisch bestimmt werden. Bei Vergleich der enzymatischen Aktivität in der unbekannten Probe mit derjenigen in einer Probe mit bekanntem Anteil des Analyteri|kann der Anteil des Analyten in der unbekannten Probe seriii-quantitativ oder quantitativ bestimmt werden.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls eip Reagenziensatz zur Durchführung des Verfahrens, welcher Enzymkonjugat und Enzym-Inhibitor und, wenn der Analyt und das im Enzymkonjugat konjugierte Glied das gleiche Glied des immunologischen Paars darstellen, das reziproke Glied des immunologischen Paars zum Analyten enthält. Weitere Komponenten sind beispielsweise Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Puffer.
Es werden empfindliche und genaue kompetitive Protein-Bindungs-Tests beschrieben, unter Verwendung einer Enzym-Markierung, worin die enzymatische Aktivität im Testgemisch bezogen wird auf den Anteil des Analyten im Testgemisch. Das Verfahren verwendet ein Konjugat eines Enzyms und ein Glied eines immunologischen Paars, worin das Enzym-Konjugat einen wesentlichen Anteil seiner enzymatischen Aktivität beibehält, bis zu 100% der Aktivität des Enzym-Konjugats, wenn ein Komplex gebildet wird aus den Gliedern des immunologischen Paars, enthaltend mindestens ein Enzym-Konjugat. Ein Enzym-Inhibitor wird verwendet, welcher die Enzym-Aktivität wesentlich reduziert. Im vorliegenden Verfahren wird die Annäherung des Enzym-Inhibi-tors an das Enzym durch den Komplex behindert. Bei Ligand-Tests mit enzymgebundenem Ligand wird der Anteil des Anti-Liganden, welcher an den enzymgebundenen Liganden gebunden ist, durch den Anteil des im Testmedium vorhandenen Liganden bestimmt, während bei Anti-Ligand-Tests mit enzymgebundenem Liganden, der Anteil des Anti-Liganden im Testmedium direkt bezogen wird auf dessen Anteil in der unbekannten Probe. Bei Ligand-Tests mit enzymgebundenem Anti-Liganden, ist der Anteil von enzymgebundenem Ligand, gebunden an Ligand direkt abhängig vom Anteil des Liganden in der Probe, während bei Anti-Ligand-Tests der Anteil von enzymgebundenem Anti-Ligand, gebunden an Ligand durch den Anteil des Anti-Liganden im Test-Medium bestimmt ist. Geeigneterweise kann der Enzym-Inhibitor ein Antikörper zum Enzym sein, welcher dieses bei Bindung an das Enzym hemmt. Der enzymgebundene Ligand oder Ligand weist eine genügende Anzahl von epitopischen Bereichen auf, um die Annäherung des Enzym-Inhibitors zu verhindern, wenn diese Bereiche mit Anti-Ligand bzw. enzymgebundenem Anti-Ligand besetzt sind.
Definition
Analyt: Zu bestimmende Verbindung, welche mono- oder polyepitopisch, antigenisch oder haptenisch ist, eine einzelne Verbindung oder eine Mehrzahl von Verbindungen mit mindestens einem gleichen epitopischen Bereich eines Rezeptors.
Ligand: Irgendeine organische Verbindung, für die ein natürlicher Rezeptor existiert oder hergestellt werden kann.
Ligandanalog: Ein modifizierter Ligand, welcher kompe-titiv mit dem analogen Ligand für den Rezeptor wirkt; die Modifikation bewirkt, dass der Ligandanalog an ein Enzym oder ein anderes Molekül gebunden werden kann.
Rezeptor: Irgendeine Verbindung, die befähigt ist, einen bestimmten räumlichen oder polaren Bereich eines Moleküls, d.h. einen epitopischen Bereich zu erkennen und die normalerweise polyvalent ist, d.h. mindestens zwei Bindungsstellen aufweist. Beispiele für Rezeptoren sind natürlich vorkommende Rezeptoren, Antikörper, Enzyme, Lectine, Fab-Frag-mente und ähnliche. Für einen bestimmten Liganden wird der entsprechende Rezeptor mit Anti-Ligand bezeichnet, z.B. ein Antikörper für ein Enzym wird mit Anti-Enzym bezeichnet. Der Rezeptor und sein reziproker Ligand bilden ein immunologisches Paar.
Enzymgebundener Ligand: Ein Konjugat mit mindestens einem Enzym-Molekül, kovalent gebunden an mindestens einen Ligand-Analogen, wobei das Enzym den weentlichen Teil seiner enzymatischen Aktivität beibehält, wenn der Anti-Ligand die verfügbaren epitopischen Stellen sättigt und diese Bindung von Anti-Ligand an die epitopischen Stellen die Bindung von Enzym-Inhibitoren behindert.
Enzymgebundener Anti-Ligand: Ein Konjugat mit mindestens einem Enzym-Molekül, kovalent gebunden an mindestens einen Rezeptor, wobei das Enzym den wesentlichen Teil seiner Aktivität beibehält, wenn das Konjugat die verfügbaren epitopischen Stellen des Liganden sättigt und die Bindung von Enzym-Anti-Ligand-Konjugat die Bindung von Enzym-Inhibitoren behindert.
Komplex: Die nicht kovalente Bindung von mindestens einem der Glieder eines immunologischen Paars. In der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Komplex normalerweise mindestens ein Enzym-Molekül, kovalent konjugiert mit einem der Glieder des immunologischen Paars. Der Komplex kann zweidimensional oder dreidimensional aufgebaut sein, in Analogie zu den Polymeren, nichtkreuzvernetzt oder kreuzvernetzt.
Enzym-Inhibitor: Ein Makromolekül, das die enzymatische Aktivität hemmen kann, wenn es an ein Enzym gebunden ist, wobei die Inhibitorwirkung entweder reversibel oder irreversibel ist und das in seiner Inhibitorwirkung gehindert ist, wenn der Rezeptor an den enzymgebundenen Liganden oder der enzymgebundene Anti-Ligand an einen Liganden gebunden ist. In geeigneter Weise kann der Enzym-Inhibitor ein Antikörper sein, welcher spezifisch auf ein Enzym wirksam wird und bei Bindung an dasselbe dessen enzymatische Aktivität reduziert, oder ein Substrat, welches an das Enzym gebunden wird und die gemessene enzymatische Aktivität verkleinert.
Test
Das erfindungsgemässe Testverfahren wird in einer wässrigen Phase in der Regel bei nicht extremem pH durchgeführt, im allgemeinen im pH-Bereich, in dem optimale Reaktionsbedingungen bestehen. Die Testphase zur Bestimmung des Analyten wird unter Verwendung einer geeignet gepufferten wässrigen Lösung hergestellt, wobei die unbekannte Probe, welche vorgängig behandelt worden sein kann, das Enzym-Konjugat, den Enzym-Inhibitor, das reziproke Glied des immunologischen Paars und Enzym-Substrate enthält. Die Testphase ist im allgemeinen homogen.
Das wässrige Medium kann weitere polare Lösungsmittel, normalerweise sauerstoffhaltige organische Lösungsmittel mit 1 bis 6, insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Alkohole, Äther und ähnliche enthalten. Normalerweise werden diese Lösungsmittel in Anteilen von weniger als etwa 20 Gewichtsprozenten, insbesondere weniger als 10 Gewichtsprozenten vorliegen.
Das pH für das Medium liegt normalerweise im Bereich von 5 bis 10, vorzugsweise von 7 bis 9 und insbesondere von 7 bis 8,5. Zur Einstellung des pH können die verschiedensten Puffer verwendet werden, wie Borat-, Phosphat-, Karbonat-, Tris-, Barbital- und ähnliche -puffer. Die Wahl des geeigneten Puffers ist nicht kritisch, in individuellen Versuchen kann jedoch der am besten geeignete Puffer ermittelt werden.
Die Tests werden normalerweise bei mässigen Temperaturen durchgeführt und die Temperatur wird während dem ganzen Test konstant gehalten. Diese Temperaturen liegen nor5
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malerweise im Bereich von etwa 10 bis 50 °C, vorzugsweise von 15 bis 40 °C.
Die Konzentration des zu messenden Enzymen liegt im allgemeinen zwischen 10~4 bis 1~15M, inbesondere zwischen IO-6 und 10_UM. Die Konzentration der weiteren Reagenzien ist davon abhängig, ob der Test qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ durchgeführt wird, sie ist ferner abhängig vom verwendeten Enzym und der Bestimmungsmethode der enzymatischen Aktivität sowie von der Konzentration des Analyten. Bei kompetitiven Verfahren, bei denen Reagenzien kompetitiv wirksam sind bezüglich eines sterischen Bereichs, ist die relative Konzentration der einzelnen Komponenten ziemlich wichtig. Andererseits sind die relativen Konzentrationen der Reagenzien bezüglich der Konzentration des Enzym-Inhibitors weniger von Bedeutung, wenn diese zuerst zugegeben werden und eine Gleichgewichtseinstellung abgewartet wird.
In der vorliegenden Erfindung wird die Bildung eines Komplexes zwischen reziproken Gliedern eines immunologischen Paars ausgenützt, um die Anlagerung eines Enzym-Inhibitors an das Enzym zu verhindern, welches mit einem dieser Glieder kovalent konjugiert ist. Das Enzym kann mit irgendeinem Glied des immunologischen Paars konjugiert sein. Aufgrund dieser Tatsache kann das erfindungs-gemässe Verfahren in zwei Kategorien eingeteilt werden: (1) Tests mit enzymgebundenen Liganden; und (2) Tests mit enzymgebundenem Rezeptor. Im folgenden soll die erste Kategorie besprochen werden, d.h. Tests mit enzymgebundenem Ligand.
In dieser ersten Kategorie wird der verwendete Anteil des Anti-Liganden normalerweise berechnet mit Bezug auf die Rezeptor-Stellen und sie wird mit der Konzentration des enzymgebundenen Liganden mit dem Verhältnis von Ligand zu Enzym im enzymgebundenen Liganden und der Affinität des Rezeptors für den Liganden variieren. Normalerweise wird mindestens eine aktive Rezeptorstelle pro Molekül des enzymgebundenen Liganden bestehen und weniger als etwa 20 aktive Stellen pro epitopischen Bereich des Liganden als enzymgebundenen Liganden, das Verhältnis von Rezeptor zu Ligand-epitopischen Bereichen kann jedoch bis zu 100:1 betragen, je nach Typ des Tests und Affinität des Rezeptors. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis von Rezeptor-Bindungsstellen zu epitopischen Bereichen des Liganden als enzymgebundenen Liganden mindestens 1, insbesondere mindestens 2 und nicht mehr als etwa 5:1.
Das Verhältnis von Enzym zu Ligand im enzymgebundenen Ligand ist je nach Enzym in einem weiten Bereich variabel und ist insbesondere vom Molekulargewicht des Enzyms und verfügbaren Bindungsstellen und vom Molekulargewicht des Liganden abhängig. Für haptenische Liganden mit Molekulargewichten unter 2000, insbesondere unter 1200, wird im Mittel mindestens ein Ligand pro Enzym vorliegen, normalerweise nicht mehr als etwa einer pro 2000 Molekulargewicht des Enzyms und normalerweise nicht mehr als einer pro 5000 Molekulargewicht des Enzyms, insbesondere für Enzyme unterhalb 50000 Molekulargewicht. Für antigenische Liganden, mit Molekulargewichten über 2000, insbesondere über 5000 besteht die Möglichkeit einer Bindung von mehreren Enzymen an einen Liganden. Das Gewichtsverhältnis von Enzym zu Ligand kann variieren von ca. 10-6-102:l, normalerweise von ca. 10~2-102:1. Da als Ligand auch ein Virus oder eine Zelle in Frage kommt, kann die Zahl der gebundenen Enzyme an einen so grossen Ligand sehr gross werden, während das Molverhältnis und das Gewichtsverhältnis sehr klein wird. Liganden von Molekulargewicht im Bereich von 10000 bis 600000 wird im Durchschnitt mindestens ein Enzym pro Ligand vorliegen und nicht mehr als ein Enzym pro 5000 Molekulargewicht des Liganden.
Die Konzentrationen des enzymgebundenen Liganden und des Rezeptors (basierend auf Bindungsstellen) kann in weitem Bereich variieren, im allgemeinen von ca. 10~4 bis 10~I4M, insbesondere von 10~6 zu 10~12M. Das molare Verhältnis von enzymgebundenem Ligand zur maximalen Konzentration beträgt im allgemeinen etwa 10-4—10:1, insbesondere von etwa 10~3 bis 1:1.
Das Äquivalenzverhältnis von Enzym-Inhibitor zu Enzym, basierend auf aktiven Stellen beträgt normalerweise mindestens 0,1, insbesondere mindestens 1 und kann in molarem Überschuss bis 100 oder mehr betragen.
Für einen bestimmten Test werden die verschiedensten Anteile der Reagenzien getestet, um eine optimale Empfindlichkeit zu erreichen. Diese Mischungsverhältnisse variieren je nach verwendetem Ligand, Enzym, dem Verhältnis von Enzym zu Ligand im enzymgebundenen Ligand, dem gewünschten Konzentrationsbereich und anderem.
Das Vorgehen bei der Durchführung der erfindungsge-mässen Tests kann in weitem Bereich variieren, je nach Art der verwendeten Reagenzien, der gewünschten Empfindlichkeit und der verwendeten Apparatur. Es kann entweder ein kompetitives oder Gleichgewichts-Verfahren verwendet werden. Beim kompetitiven Verfahren wirken Anti-Ligand und Enzym-Inhibitor kompetitiv auf den enzymgebundenen Liganden. Im Gleichgewichts-Verfahren wird eine Gleichgewichtseinstellung bei der Reaktion des Anti-Liganden mit dem enzymgebundenen Liganden abgewartet, worauf der Enzym-Inhibitor zugegeben werden kann. Der Enzym-Inhibitor kann dann nur mit dem Enzym reagieren, das nicht durch Gegenwart des Anti-Liganden sterisch gehindert ist.
Beim kompetitiven Verfahren können Anti-Ligand und Enzym-Inhibitor in geeigneter Weise als einzelnes Reagenz zum Testmedium, enthaltend die Enzym-Substrate, gegeben werden, und die enzymatische Aktivität wird dann zu zwei verschiedenen gemessenen Zeiten nach Zugabe dieses Reagenz gemessen. Die Differenz in diesen beiden gemessenen Werten kann verglichen werden mit Werten, wie sie mit bekannten Anteilen des Liganden erhalten werden. Andererseits können die Substrate auch nach der Zugabe der Reagenzien zum Testgemisch gegeben werden, und die Zeit kann nach Zugabe der Reagenzien berechnet werden. Zwischen Zugabe der Reagenzien und Messung der Aktivität können verschiedene Inkubationszeiten liegen.
Beim Gleichgewichts-Verfahren für den Liganden, wird der Anti-Ligand zusammen mit dem enzymgebundenen Liganden zum Ligand gegeben oder der Anti-Ligand wird nach beendigter Zugabe des enzymgebundenen Liganden zum Testgemisch gegeben. In der ersten Variante kann das Testgemisch nach Zugabe von Anti-Ligand und enzymgebundenem Ligand bis zur Gleichgewichtseinstellung inkubiert werden, worauf Enzym-Inhibitor zugegeben wird. Das Medium kann dann ein zweites Mal inkubiert werden, worauf die Messung der enzymatischen Aktivität erfolgt. Andererseits kann der Anti-Ligand zu der Probe gegeben werden, worauf diese inkubiert wird, worauf nach Zugabe des enzymgebundenen Liganden ein zweites Mal inkubiert wird und worauf schliesslich nach Zugabe des Enzym-Inhibitors wahlweise ein drittes Mal inkubiert wird. Obschon eine Messung genügen würde, wird vorzugsweise zweimal in einem definierten Zeitintervall die enzymatische Aktivität bestimmt und die Differenz der beiden gemessenen Werte berechnet. Für bestimmte Tests können auch vom oben beschriebenen Vorgehen abweichende Verfahren verwendet werden.
Die Inkubationszeiten können in weitem Bereich variieren und sie können weniger als etwa 0,5 Minuten und normalerweise nicht mehr als 24 Stunden betragen, vorzugsweise nicht mehr als 6 Stunden und insbesondere nicht mehr als etwa 30 Minuten. Da optimale Resultate abhängig sein werden von
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Resultaten wie sie mit Standards, die in gleicher Weise behandelt werden, erhalten werden, ist es nicht entscheidend, wie die Tests im einzelnen durchgeführt werden, solange signifikante und reproduzierbare Unterscheidungen bei wechelnden Konzentrationen des Analyten möglich sind.
Je nach Wahl des Testverfahrens, der verwendeten Geräte und der Konzentration des Analyten, können die Testvolumen so klein sein wie ca. 1 jxl, normalerweise jedoch mindestens 25 ,ul und nicht mehr als 5 ml, insbesondere nicht mehr als etwa 2 ml.
In besonderen Fällen kann der Enzym-Inhibitor ein Fab-Fragment eines Anti-Enzyms sein. Hier ist es von Vorteil, den enzymgebundenen Liganden an das Fab-Anti-Enzym-Frag-ment zu einem einzelnen Reagenz zu kombinieren, so dass Reagenzien mit vorbestimmtem Verhältnis hergestellt werden können. Bei Herstellung solcher Mischungen in grösserer Menge wird das Risiko von Messfehlern vermindert.
Bei der Bestimmung des Anti-Liganden ist das Vorgehen im wesentlichen gleich wie beschrieben, mit der Ausnahme, dass der enzymgebundene Ligand vorher zu der Probe gegeben werden kann, worauf diese inkubiert wird und worauf der Enzym-Inhibitor zugegeben wird.
Im folgenden soll nun der Test mit enzymgebundenen Anti-Ligand beschrieben werden.
Normalerweise wird für polyepitopische Ligand-Analyten die Konzentration des totalen Anti-Liganden, basierend auf den Bindungsstellen etwa l-50fach der minimalen oder maximalen Konzentration basierend auf epitopischen Stellen, normalerweise etwa l-10fach und insbesondere l-3fach die maximale Konzentration betragen. Für monoepitopische Ligand-Analyten und Rezeptor-Analyten betragen die entsprechenden Konzentrationen von Poly(Ligandanalog: und markiertem Anti-Ligand, bezogen auf Bindungsstellen etwa gleichviel wie die minimale Konzentration von Interesse, normalerweise nicht mehr als die maximale Konzentration von Interesse, im allgemeinen nicht weniger als 10~4, insbesondere nicht weniger als 10~2mal die minimale Konzentration von Interesse. Der Konzentrationsbereich von Interesse liegt im allgemeinen zwischen etwa 10"4 und 10~15g/ml. Für monoepitopische Analyten und Rezeptor-Analyten beträgt die totale Konzentration des Anti-Liganden, der nicht Analyt ist, normalerweise bis zu 50mal der Konzentration von Poly(Ligandanalog) oder Ligand, vorzugsweise bis zu lOmal, insbesondere bis zu 3mal.
Die Konzentration des Enzym-Inhibitors variiert in weitem Massstab je nach Natur des Inhibitors, seiner Wirksamkeit bei der Hemmung des Enzyms und ähnlichem. Im allgemeinen können Überschüsse von Inhibitor verwendet werden, damit die Hemmung rasch erfolgt und die Konzentration keinen limitierenden Charakter auf die Reaktion aufweist. Demzufolge ist der Enzym-Inhibitor in einer Mindestkonzentration anwesend, die mindestens etwa 30% Hemmung und vorzugsweise 50% Hemmung oder mehr bewirkt. D.h., dass in Abwesenheit des Analyten eine mindestens 30%ige Reduktion der Enzymaktivität beobachtet werden kann.
Die Reihenfolge der Verwendung der einzelnen Reagenzien ist variabel. Normalerweise wird die unbekannte Probe und der markierte Rezeptor in einem geeigneten Medium vermischt, bevor der Inhibitor zugegeben wird. Das Enzym-Substrat kann entweder zusammen mit oder nach dem Enzym-Inhibitor zugegeben werden. Nach der Kombination des unbekannten mit dem markierten Rezeptor und, je nach dem, des Liganden oder Poly(Ligandanalog) kann das Testmedium zur Bildung der Komplexe inkubiert werden.
Die Zeiten zwischen den einzelnen Zugaben für die Testkomponenten und für die immunologischen Reaktionen sind in weitem Bereich variable, je nach den verwendeten Komponenten, der Art der Zugabe, der Konzentrationen, der Bindungskonstanten der Rezeptoren und ähnlichem. Normalerweise betragen diese Zeiten zwischen den einzelnen Zugaben zwischen einigen Sekunden bis zu mehreren Stunden, üblicherweise jedoch nicht über 12 Stunden und vorzugsweise nicht über 6 Stunden. Nach der Zugabe jeder einzelnen Komponente zum Testgemisch wird dieses jeweils während einer bestimmten Zeit inkubiert, bevor die nächste Komponente zugegeben wird, oder bevor eine Messung erfolgt. Da die gewünschten Resultate abhängig sind von Messungen, wie sie mit gleich behandelten Standardlösungen erhalten werden, ist der zeitliche Ablauf des Tests nicht kritisch, solange reproduzierbare Unterschiede mit wechselnden Konzentrationen des Analyten erhalten werden.
Je nach Art des Tests, der verwendeten Apparatur und der Konzentration des Analyten können Testvolumen von mindestens 1 (il, vorzugsweise mindestens 25 u.1 und maximal 5 ml, vorzugsweise maximal etwa 2 ml verwendet werden.
Bei der Bestimmung des Anti(Ligand) ist das Vorgehen das gleiche, die erhaltenen Resultate jedoch können eine Ver-grösserung oder eine Verkleinerung des Signals sein, je nach den relativen Proportionen der einzelnen Komponenten. D.h. der Anti(Ligand) kann das Enzym-Anti-Ligand-Konjugat aus dem Komplex ersetzen oder die Komplexbildung fördern. Vorzugsweise wird ein Vorgehen gewählt, bei dem der Anti-Ligand das Enzym-Anti-Ligand-Konjugat ersetzt.
Die wichtigsten Komponenten im erfindungsgemässen Test für den Analyten sind: der Analyt, der enzymgebundene Ligand oder der enzymgebundene Rezeptor, der Enzym-Inhibitor und Enzym-Substrate.
Analyt
Die Ligand-Analyten sind dadurch charakterisiert, dass sie monoepitopisch oder polyepitopisch sind. Die polyepito-pischen Ligand-Analyten sind normalerweise Poly-Amino-säuren, d.h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und Kombination davon. Solche Kombination oder Zusammenlagerungen umfassen Bakterien, Viren, Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Zellkerne, Zellmembranen und ähnliches.
In den meisten Fällen weisen die polyepitopischen Ligand-Analyten der vorliegenden Erfindung ein Molekulargewicht von mindestens etwa 5000 auf, vorzugsweise von mindestens etwa 10 000. Bei den Poly-Aminosäuren beträgt das Molekulargewicht von etwa 5000 bis 5 000 000, üblicherweise von etwa 20 000 bis 1 000 000; bei den Proteinen beträgt es von etwa 5000 bis 600 000, inklusive Albumine und Globuline; bei den Hormonen beträgt das Molekulargewicht im allgemeinen von etwa 5000 bis 60 000.
Die grosse Zahl verschiedener Proteine kann gruppiert werden entsprechend ähnlicher struktureller Art, je nach spezifischer biologischer Funktion, je nach Verwandtschaft zu spezifischen Mikroorganismen, insbesondere Krankheitserregern usw.
Die folgenden sind Klassen von Proteinen mit ähnlicher Struktur:
Protamine
Histone
Albumine
Globuline
Scleroproteine
Phosphorproteine
Mucoproteine
Chromoproteine
Lipoproteine
Nucleoproteine unklassifizierte Proteine, z.B. Somatotropin, Prolactin, Insulin, Pepsin.
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Eine Anzahl von Proteinen, die im menschlichen Plasma gefunden werden, sind klinisch wichtig und umfassen
Prealbumin Albumin ai-Lipoprotein ai -Säure-glycoprotein cu-Antitrypsin ai-Glycoprotein Transcortin 4.6S-Postalbumin Tryptophan-armes ai-Glycoprotein aiX-Glycoprotein Thyroxin-bindendes Globulin Inter-a-trypsin-Inhibitor Gc-globulin (GC 1-1)
(GC 2-1)
(GC 2-2)
Haptoglobin (Hp 1-1)
(Hp 2-1)
(Hp 2-2)
Ceruloplasmin Cholinesterase a2-Lipoprotein(e)
ct2-MacrogobuIin ci2-HS-glycoprotein Zn-a2-glycoprotein a2-Neuramino-glycoprotein Erythropoietin ß-Lipoprotein Transferrin Haemopexin Fibrinogen Plasminogen ß2-Glycoprotein I ß2-Glycoprotein II
Immunoglobulin G (IgG) oder yG-globulin Mol. Formel : y2K2 oder yiki Immunoglobulin A (IgA) oder yA-globulin Mol. Formel: (a2K2)n oder (cuta)"
Immunoglobulin M (IgM) oder yM-globulin Mol. Formel: (ii2K2)s oder (pta)5 Immunoglobulin D (IgD) oder yD-Globulin (yD) Mol. Formel: (82K2) oder (82^2)
Immunoglobulin E (IgE) oder yE-Globulin (yE) Mol. Formel: (S2iC2) oder (eiXz)
Freies K und y leichte Ketten Komplement-Faktoren :
C'l C'lr C'ls C'2 C'3 ßiA (X2D C'4 C'5 C'6 C'l C'8 C'9
Wichtige Blutgerinnungsfaktoren sind:
Tabelle VII Blutgerinnungsfaktoren
Internationale Name Bezeichnung
I Fibrinogen
II Prothrombin IIa Thrombin
III Gewebe-thromboplastin
V und VI Proaccelerin, Accelerator-Globulin
VII Proconvertin
VIII Antihämophilisches Globulin (AHG)
IX Christmas-faktor, Plasma Thromboplastin Komponente (PTC)
X Stuart-Prower-faktor, Autoprothrombin III
XI Plasma thromboplastin-antecedent (PTA)
XII Hagemann-faktor
XIII Fibrin-stabilisierungsfaktor
Wichtige Protein-Hormone sind:
Peptide und Protein-Hormone
Parathyroid-hormon (parathromon)
Thyrocalcitonin
Insulin
Glucagon
Relaxin
Erythropoietin
Melanotropin (melanocyte-stimulierendes Hormon; inter-medin)
Somatotropin (Wachstums-hormon)
Corticotropin (adrenocorticotropes Hormon)
Thyrotropin
Follikelstimulierendes Hormon
Luteinisierendes Hormon (interstitielles zellstimulierendes Hormon)
Luteomammotropisches Hormon (luteotropin, prolactin) Gonadotropin (chorio-gonadotropin)
Gewebs-Hormone Secretin Gastrin
Angiotensin I und II Bradykinin Placental-lactogen Peptid-Hormone aus der Neurohypophysis Oxytocin Vasopressin
Releasing-faktoren (RF) CRF, LRF, TRF, Somatotropin-RF, GRF, FSH-FR, PIF, MIF
Weitere polymere Materialien von Interesse sind Muco-polysaccharide und Polysaccharide.
Illustrative Antigen-Polysaccharide aus Mikroorganismen sind die folgenden:
Species des Mikroorganismus Haemosensitin gefunden in
Streptococcus pyogenes Polysaccharid
Diplococcus pneumoniae Polysaccharid
Neisseria meningitidis Polysaccharid
Neisseria gonorrhoeae Polysaccharid
Corynebacterium diphtheriae Polysaccharid
Actinobacillus mallei; Roher Extrakt
Actinobacillus whitemori
Francisella tularensis Lipopolysaccharid,
Polysaccharid
Pasteurella pestis
Pasteurella pestis Polysaccharid
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Species des Mikroorganismus Haemosensitin gefunden in
Pasteurella multocida Brucella abortus Haemophilus influenzae Haemophilus pertussis Treponema reiteri Veillonella Erysipelothrix Listeria monocytogenes Chromobacterium Mycobacterium tuberculosis
Klebsiella aerogenes Klebsiella cloacae Salmonella typhosa
Salmonella typhi-murium; Salmonella derby Salmonella pullorum Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella sonnei Rickettsiae Candida albicans
Capsular-antigen Roher Extrakt Polysaccharid Roh
Polysaccharid
Lipopolysaccharid
Polysaccharid
Polysaccharid
Lipopolysaccharid
Salinen-Extrakt von 90%
phenol-extrahierte mycobacteria und polysaccharid-fraktion von
Zellen und Tuberculin
Polysaccharid
Polysaccharid
Lipopolysaccharid,
Polysaccharid
Polysaccharid
Polysaccharid
Roh, Polysaccharid Roher Extrakt Polysaccharid Roher Extrakt
Das coliforme Bacterium
Die Salmonellae
Pseudomonas aeruginoa Alcaligenes faecalis Vibrio cholerae Haemophilus- Bordetella-gruppe
Haemophilus influenza
H. ducreyi H. hemophilus H. aegypticus H. paraiufluenzae
Die Mikroorganismen, auf die getestet wird, können intakt, lysiert, gemahlen oder auf andere Weise fragmentiert sein und die resultierenden Gemische können z.B. nach Extraktion untersucht werden. Mikroorganismen von Interesse sind:
Corynebacteria
Corynebacterium diptheriae Pneumococci
Diplococcus pneumoniae Streptococci
Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarus Staphylococci
Staphylococcus aureaus Staphylococcus albus Neisseriae
Neisseria meningitidis Neisseria gonorrheae Enterobacteriaciae Escherichia coli Aerobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Salmonella typhosa
Salmonella choleraesuis Salmonella typhimurium Shigella dysenteriae Die Shigellae Shigella schmitzii Shigella arabinotarda Shigella flexneri Shigella boydii Shigella Sonnei Andere enterische Bacillen Proteus-species Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morgani io Bordetella pertussis Pasteurellae
Pasteurella pestis Pasteurella tulareusis Brucellae 15 Brucella melitensis Brucella abortus Brucella suis Anerobe sporenbildende Bacilli Bacillus anthracis 20 Bacillus subtilis
Bacillus megaterium Bacillus cereus Anaerobe sporenbildende Bacilli Clostridium botulinum 25 Clostridium tetani
Clostridium perfringens Clostridium novyi Clostridium septicum Clostridium histolyticum 30 Clostridium tertium
Clostridium bifermentans Clostridium sporogenes Mycobacteria
Mycobacterium tuberculosis hominis 35 Mycobacterium bovis Mycobacterium avium Mycobacterium leprae Mycobacterium paratuberculosis Actinomycetes (fungusähnliche Bacterien) « Actinomyces israelii Actinomyces bovis Actinomyces naeslundii Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis « Die Spirochetes
Treponema pallidum Treponema pertenue Streptobacillus moniliformis Treponema carateum so Borrelia recurrentis
Leptospira icterohemorrhagiae Leptospira canicola Macoplasmas
Mycoplasma pneumoniae 55 Andere Pathogene
Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopathiae Streptobacillus moniliformis Donvania granulomatis 60 Bartonella bacilliformis
Rickettsiae (bakterienähnliche Parasiten) Rickettsia prowazekii Rickettsia mooseri Rickettsia rickettsii 65 Rickettsia conori Rickettsia australis Rickettsia sibiricus Rickettsia akari
Spirillum minus
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8
Rickettsia tsutsugamushi Rickettsia burnetti Rickettsia quintana Chlamydia (unklassierbare Parasiten bakteriell/viral Chlamy-dia-Agentien (Benennung unsicher)
Fungi
Cryptococcus neoformans Blastomyces dermatidis Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Paracoccidioides brasiliensis Candida albicans Aspergillus fumigatus Mucro corymbifer (Absidia corymbifera)
Rhizopus oryzae Phycomycetes
Rhizopus arrhizus Rhizopus nigricans Sporotrichum schenkii Fonsecaea pedrosoi Fonsecaea compacta Fonsecaea dermatitidis Cladosprium carrionii Phialophora verrucosa Aspergillus nidulans Madurella mycetomi Madurella grisea Allescheria boydii Phialosphora jeanselmei Microsporum gypseum Trichophyton mentagrophytes Keratinomynces ajelloi Microsporum canis Trichlophyton rubrum Microsporum andouini Viren
Adenoviren Herpes-Viren
Herpes simplex Varicella (Chicken pox)
Herpes Zoster (Shingles)
Virus B
Cytomegalovirus Pocken-Viren
Variola (smallpox)
Vaccinia Poxvirus bovis Paraveaccinia Molluscum contagiosum Picornaviren Poliovirus Coxsackievirus Echoviruses Rhinoviruses Myxoviren
Influenza (A, B, und C)
Parainfluenza (1-4)
Mumps-Virus Newcastle-Disease-Virus Masern-Virus Rinderpest-Virus Canine-Distemper-Virus Respiratory-Syncytial-Virus Rubella-Virus Arboviren
Eastern-Equine-Eucephalitis-Virus Western-Equine-Eucephalitis-Virus Sindbis-Virus Chikugunya-Virus
Semliki-Forest-Virus Mayora-Virus
St.-Louis-Encephalitis-Virus California-Encephalitis-Virus Colorado-Tick-Fever-Virus Gelbfieber-Virus Dengue-Virus Reoviren
Reovirus-Typen 1-3 Hepatitis
Hepatitis- A-Virus Hepatitis-B-Virus Tumor-Viren
Rauscher-Leukaemia-Virus Gross-Virus
Maloney-Leukaemia-Virus
Die monoepitopischen Ligandanalyten haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 2000, vorzugsweise von 125 bis 1000. Als solche Analyten kommen in Frage Drogen, Metaboliten, Pestizide, Polluanzien und ähnliche. Bei den Drogen von Interesse finden wir die Alkaloide und unter diesen insbesondere die Morphinalkaloide, wie Morphin, Codein, Heroin, Dextromethorphan, ihre Derivate und Metaboliten; Kokainalkaloide, wie Kokain und Benzoylecgo-nin, ihre Derivate und Metaboliten; Ergot-Alkaloide, wie das Diäthylamid von Lysergsäure; Steroidalkaloide; Iminazoylal-kaloide; Chinazolinalkaloide; Isochinolinalkaloide; Chinoli-nalkaloide, wie Chinin und Chinidin; Diterpenalkaloide, ihre Derivate und Metaboliten.
Eine nächste Gruppe von Drogen umfasst Steroide, wie Östrogene, Gestrogene, Androgene, Andrenocorticoide, Gallensäuren, cardiotonische Glycoside und Aglycone, wie Digoxin und Digoxingenin, Saponine und Sapogenine, ihre Derivate und Metaboliten. Ebenfalls umfasst werden die steroid-mimetischen Substanzen, wie Diäthyl-stilbestrol.
Die nächste Gruppe von Drogen umfasst cyclische Lac-tame mit 5- bis ógliedrigen Ringen, inklusive Barbiturate, Diphenylhydantoin und ihre Metaboliten.
Die nächste Gruppe von Drogen umfasst die Aminoalkyl-benzole, mit Alkyl von 2-3 C-Atomen, inklusive Amphetamine, Catecholamine, mit Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin, Narcein, Papaverin, ihre Metaboliten und Derivate.
Eine weitere Gruppe von Drogen sind die Benzheterocy-clen, inklusive Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin, ihre Derivate und Metaboliten, wobei die heterocycli-schen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sein können.
Eine weitere Gruppe von Drogen sind Purine, inklusive Theophyllin, Koffein, ihre Metaboliten und Derivate.
Eine weitere Gruppe von Drogen bilden die von Marijuana derivierten Stoffe, inklusive Cannabinol und Tetra-hydrocannabinol.
Die nächste Gruppe von Drogen sind Vitamine wie A, B, C, D, E und K.
Die nächste Gruppe bilden die Prostaglandine, die nach Grad und Ort von Hydroxylierung und ungesättigten Stellen variieren können.
Die nächste Gruppe bilden die Antibiotika, inklusive Penicillin, Chlormycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terra-mycin, ihre Metaboliten und Derivate.
Die nächste Gruppe bilden die Nukleoside und Nukleotide, inklusive ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thy-midin, und Cytidin mit den entsprechenden Zucker- und Phosphat-Substituenten.
Die nächste Gruppe von Drogen umfasst verschiedene Einzeldrogen, inklusive Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procain-
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amid, Acetylprocainamid, Propanolol, Griseolfulvin, Butyro-phenone, Antihistamine, anticholinergische Drogen wie Atro-pin, ihre Metaboliten und Derivate.
Eine weitere Gruppe von Verbindungen bilden die Aminosäuren und kleine Peptide, inklusive Thyroxin, Trijodothy-ronin, Oxytocin, ACTH, Angiotensin, Gentamycin, Meta-und Leu-Encephalin, ihre Metaboliten und Derivate.
Metaboliten in Zusammenhang mit Erkrankungszuständen umfassen Spermin, Galactose, Phenylbrenntraubensäure und Porphyrin Typ 1.
Unter den Pestiziden von Interesse befindet sich polyha-logenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carba-mate, polyhalogenierte Sulfonamide, ihre Metaboliten und Derivate.
Beim Rezeptoranalyten beträgt das Molekulargewicht im allgemeinen von 10 000 bis 2 x 106, insbesondere von 10 000 bis 106. Bei den Immunglobulinen IgA, IgG, IgE und IgM beträgt das Molekulargewicht im allgemeinen von etwa 160 000 bis etwa 106. Enzyme bewegen sich normalerweise im Bereich von etwa 10 000 bis 600 000 Molekulargewicht. Natürliche Rezeptoren weisen breite Variation auf, im allgemeinen mindestens 25 000 und bis zu 106 oder höherem Molekulargewicht, inklusive Stoffe wie Avidin, Thyroxin bindendes Globulin, Thyroxin bindendes Präalbumin, Transcortin usw.
Enzym-gebundener Ligand oder -Rezeptor
Das Enzymkonjugat wird hergestellt durch Konjugieren eines Enzyms mit einem Glied des immunologischen Paars, entweder unter Verwendung eines difunktionellen Reagens oder durch Bildung von kovalenten Bildungen zwischen natürlich vorhandenen funktionellen Gruppen im Glied oder im Enzym oder durch Modifikation des Glieds des immunologischen Paars oder des Enzyms.
Die Anzahl Enzyme pro Glied des immunologischen Paars ist im breiten Bereich variabel, je nach Grösse und Natur des Glieds des immunologischen Paars. Enzym-gebundene Liganden, enthalten Haptene, haben im allgemeinen mindestens ein Hapten pro Enzym, üblicherweise mindestens 2 und können bis zu einer Zahl Haptene aufweisen, die dem Quotienten aus Molekulargewicht des Enzyms und 1500 entspricht. Wo der Enzym-gebundene Ligand Antigene enthält, (grösser als 5000 mg) kann das Verhältnis Enzym zu Ligand im weiten Bereich variieren, im allgemeinen von 0,01-100:1. Wo das Enzym an den Rezeptor gebunden ist, beträgt das Molverhältnis normalerweise von etwa 0,1-10:1.
Die Konjugation von Proteinen, inkl. Enzyme, mit einer grossen Zahl verschiedener Stoffe, wie Proteine z.B. Antikörper, Polysaccharide, Nuleinsäuren und ähnlichen, wird in der Literatur eingehend beschrieben. Eine grosse Zahl verschiedener Bindungsgruppen und Bindungsfunktionalitäten können verwendet werden. Beispiele dafür sind Nonoxocarbonyl, Oxocarbonyl, Diazo, Sulfonyl, Oximino, Imido und Thiono, wobei mit Oxocarbonyl vorzugsweise reduktive Alkylierung erfolgt. Die Bindungsgruppe zwischen zwei Funktionalitäten kann eine Bindung sein, im allgemeinen jedoch mindestens ein C-Atom, üblicherweise mindestens 2 C-Atome und nicht mehr als etwa 20 C-Atome, vorzugsweise nicht mehr als etwa 12 C-Atome. Verfahren zur Konjugation von Enzymen an Proteine können in US-PS 3 791 932 und 3 839 153 gefunden werden.
Verfahren zur Konjugation von monoepitopischen Liganden können in US-PS 3 817 837 gefunden werden, insbesondere in den Kolonnen 31-34 und in den Beispielen.
Bei der Herstellung der Enzymkonjugate ist es wünschbar, dass ein wesentlicher Teil der Aktivität des Enzymkonjugats aufrechterhalten bleibt, wenn ein Überschuss von Rezeptor, basierend auf Bindungsstellen, vorhanden ist, wo das Enzym im Komplex, gebunden an irgendein Glied des Komplexes, einen wesentlichen Teil seiner Aktivität beibehält. Üblicherweise wird mindestens etwa 20% der ursprünglichen Aktivität des Enzymkonjugats aufrechterhalten, vorzugsweise mindestens etwa 30% und insbesondere mindestens etwa 50%. Es ist deshalb wünschbar, dass Enzyme verwendet werden und Enzymkonjugate hergestellt werden solcherart, dass die Deaktivierung des Enzyms durch Bindung von Antiligand an Ligand verhindert wird. Im allgemeinen kann irgendein Enzym verwendet werden, in den meisten Fällen werden jedoch ganz bestimmte Enzyme bevorzugt. Bei der Wahl eines Enzyms ist entscheidend, dass das Enzym nach der Konjugation eine hohe Aktivität beibehält und dass es ohne Verlust seiner Aktivität während längerer Zeit aufbewahrt werden kann, dass ein einfacher Test für dieses Enzym möglich ist, mit spektrophotometrischen Bestimmung und dass das pH für die optimale Wirksamkeit des Enzyms in vernünftiger Nähe des optimalen pHs liegt für die Bindung von Antiligand an Ligand. Natürlich musst zur Durchführung des erfin-dungsgemässen Verfahrens ebenfalls ein makromolekularer Enzyminhibitor vorhanden sein, welcher in der Annäherung an das Enzym behindert wird, bei Bindung von Antiligand an Ligand. Ebenfalls wünschbar ist, dass das Enzym Substrate zur Verfügung hat, welche in der Annäherung an die aktive Stelle des Enzyms nicht behindert werden. Normalerweise haben diese Substrate Molekulargewichte unterhalb 5000, üblicherweise unterhalb etwa 2000 und vorzugsweise unterhalb etwa 1000.
Die nachfolgende Tabelle nennt Enzyme von besonderem Interesse für das vorliegende Verfahren, wobei die Liste nach den Kriterien der I.U.B.-Klassifikation aufgebaut ist.
1. Oxidoreduktasen
1.1 Wirkung auf die CH-OH-Gruppe von Donatoren
1.1.1 Mit NAD oder NADP als Akzeptor
1. Alkoholdehydrogenase 6. Glycerol-dehydrogenase
26. Glyoxylate-reduktase
27. L-Lactate-dehydrogenase 37. Malat-dehydrogenase
49. Glucose-6-phosphat-dehydrogenase 17. Mannitol-1 -posphat-dehydrogenase
1.1.2 Mit Cytochrom als Akzeptor
3. L-Lactat-dehydrogenase
1.1.3 Mit O2 als Akzeptor
4. Glucoseoxidase 9. Galactoseoxidase
1.2 Wirkung auf die CH-NH2-Gruppe von Donatoren 1.4.3 Mit O2 als Akzeptor
2. L-Aminosäure-oxidase .
3. D-Aminosäure-oxidase
1.6 Wirkung auf reduziertes NAD oder NADP als Donator 1.6.9 Mit anderen Akzeptoren Diaphorase
1.10 Wirkung auf Diphenole und verwandte Stoffe als Donatoren
1.10.3 mit O2 als Akzeptor
1. Polyphenol-oxidase 3. Ascorbat-oxidase
1.11 Wirkung auf H2O2 als Akzeptor 1.11.1
6. Katalase
7. Peroxidase 3. Hydrolasen
3.1 Wirkung auf Esterbindungen 3.1.1. Carbonsäureester-hydrolasen
7. Cholinesterase 3.1.3 Phosphorsäure-monoester-hydrolasen 1. alkalische Phosphatase
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4.1.2
4.2 4.2.1
4.3 4.3.1
Phosphorsäure-diester-hydrolasen
3. Phospholipase C
Wirkung auf Glycosyl-Verbindungen Glycosid-hydrolasen 1. a-Amylase
4. Cellulase 17. Lysozym
23. ß-Galacotsidase 27. Amyloglucosidase 31. ß-Glucuronidase Wirkung auf Peptidbindungen Peptidyl-aminosäure-hydrolyse
1. Carboxypeptidase A Peptidyl-peptid-Hydrolase
5. a-Chymotrypsin 10. Papain
Wirkung auf C-N-Bindungen (ohne Peptidbindungen) in linearen Amiden 5. Urease
Wirkung auf Säureanhydrid-Bindungen In Phosphoryl-enthaltenden anhydriden
1. anorganische Pyrophosphatase Lyasen
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen Aldehydlyasen 7. Aldolase
Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen Hydrolasen
1. Kohlensäureanhydrase Kohlenstoff-Stickstoff-Lyasen Ammoniaklyasen 3. Histidase
Enzym
Inhibitor y-Cystahionase
Alanin-racemase
10
Tryptophanase Tryptophan-synthase (ß2) und
(«2)
Lactat-oxidase 15 Monoamin-oxidase
Plasma-amin-oxidase
ß-Cystathionase
Aspartat-aminotransferase y-Aminobuttersäure-a-keto-3o glutarat-transaminase Formylglycinamid-ribo-nucleotid-amidotransferase
Enzyminhibitor
Der Enzyminhibitor ist ein makromolekulares Molekül, welcher das Enzym interaktiv oder durch Reaktion hemmt, so dass seine Aktivität vorzugsweise auf 0 zurückgeht. Der Enzyminhibitor erreicht diese Wirkung entweder physikalisch oder chemisch.
Die physikalische Inhibitorwirkung erfolgt auf zwei verschiedene Arten. In der einen Art behindert die Form oder Grösse des Inhibitors die Annäherung des Substrats an das Enzym. Im anderen Fall bewirkt die Bindung des Enzyminhi-bitori an das Enzym eine Konformationsänderung, die die Enzymaktivität beeinflusst. In einigen Fällen sind beide Arten von Hemmung vorhanden. In den meisten Fällen sind die physikalischen Inhibitoren Antikörper, welche mit dem Enzym eine Bindung eingehen (Antienzym). Entweder wird der ganze Antikörper oder Fab-Fragmente verwendet. Eine Anzahl von Antikörpern, welche hemmende Wirkung auf Enzyme aufweisen sind im Handel erhältlich und einzelne Enzyme können verwendet werden als Antigene für die Herstellung von hemmenden Antienzymen.
Die andere Art der Hemmung des Enzyms erfolgt durch chemische Reaktion zwischen Inhibitor und Enzym. Insbesondere können Inhibitoren verwendet werden, die mit dem Enzym reagieren und auf diese Weise die enzymatische Aktivität vermindern oder zerstören. Eine grosse Zahl von irreversiblen Inhibitoren (Inaktivatoren) die spezifisch für ein bestimmtes Enzym wirksam sind, sind bekannt und können in Überschuss verwendet werden, wobei sie zu markromolekula-ren Hub-Molekülen derivativiert werden und ihre Inhibitorwirkung beibehalten.
Die folgende Tabelle nennt eine Anzahl von bekannten Inhibitoren und die entsprechenden Enzyme auf die sie wirken.
Traspeptidase (membran gebunden)
B6-gebundene Enzyme
Serin-protease Glutamin-synthetase
Nucleotid-benötigende « Enzyme z.B. Malat
Dehydrogenase und Lactat dehydrogenase
Peroxidase
2-Amino-4-pentinoinsäure (I)
2-Amino-4-chlor-4-pentenoin-säure (II)
3-3-Dichloralanin (III) 3,3,3-Trichloralanin (IV)
(IV)
D-Cycloserin
(IV)
(IV)
2-Hydroxyl-3-butinoinsäure
N,N-Trimethyl-2-propinyl-
amin-ß-aminopropionitril
2-Bromäthylamin
2-Propinylamin
2-Chlorallylamin
Phenylglycin p-Nitrophenyl-glycin-amino-
acetonitril
(IV)
2-Amino-3-hydroxypropyl-l 3'-Carboxy-3'-amino-l'-prope-nyl-l-äther
L-2-Amino-4-methoxy-trans-
3-butinoinsäure Äthanolamin-O-sulfat
Albiziin Azaserin
Diazooxonorleucin
Diazooxonoanorvalin
6-Aminopenicillansäure
A3-7-Aminocephalosporin-
säure
Mimosin
Physostigim
Methionin-sulfoximin
Wildfire-toxin
Blue-Dextran o-Dianisidin-dextran
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65
Während kompetitive reversible Inhibitoren verwendet werden können, werden diese nicht bevorzugt, da sie mit dem Substrat für das Enzym kompetitiv wirken, wobei der Grad der Effektivität bei der Reduktion der enzymatischen Rate von Enzymen in ungebundenem Enzym-markiertem-Rezeptor variabel ist.
Neben den spezifischen Enzymen in der oben genannten Tabelle gibt es eine grosse Zahl weiterer Enzyme, welche durch dieselben irreversiblen Inhibitoren inaktiviert werden können. Ebenfalls können viele Derivate der genannten nichtkompetitiven Inhibitoren hergestellt werden, welche durch Retention des aktiven Teils des Moleküls hemmend wirken.
Wo der Inhibitor kein Makromolekül ist, d.h. ein Molekül von mindestens 2000 Molekulargewicht, normalerweise mindestens 5000, wird der Inhibitor konjugiert sein mit einem Hub-Nukleus, um die nötige Grösse zu haben und damit die Annäherung an den Komplex zu verhindern. Bei der Konjugation des Inhibitors an einen Hub-Nukleus wird eine Bin-
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dungssteile gewählt, welche genügenden Abstand aufweist von der Stelle des Inhibitors, von der die hemmende Wirkung ausgeht. Es werden deshalb bevorzugt Inhibitoren verwendet, welche Bindungsstellen aufweisen, die bezüglich der Inhibitorwirkung nicht kritisch sind und welche mit Enzymen reagieren, die nicht allzu spezifisch bezüglich der strukturellen Erfordernisse für Substrate sind. Die folgenden Beispiele illustrieren Inhibitoren, konjugiert an Proteinmoleküle und Enzyme, die gehemmt werden.
Protein-pyruvat-dehydrogenase
Protein
Thymidylat-synthetase
OH
a=o, nh, cm
P= PO2H
Zur Bindung des Inhibitors an eine makromolekulare Species dienen herkömmliche Methoden. Die Art der Bindung ist abhängig vom spezifischen Inhibitor und von der Natur des Hub-Nukleus. In einigen Fällen ist es nützlich eine nichtkovalente Bindung des Inhibitors an eine makromolekulare Species zu haben, wenn starke spezifische oder nichtspezifische Bindung an den Hub-Nukleus vorliegt, was immer noch eine Hemmung ermöglicht.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne dass sie einschränkenden Charakter haben.
Experimentelles
(Alle Temperaturangaben erfolgen, soweit nicht anders erwähnt, in Celsiusgraden. Alle Prozent- und Teilangaben sind, so weit nicht anders erwähnt, bezogen auf das Gewicht, mit Ausnahme von Gemischen von Flüssigkeiten, wo Volumenprozente angegeben werden. Soweit nicht anders erwähnt, sind die einzelnen in den Beispielen verwendeten Materialien im Handel erhältlich. Die folgenden Abkürzungen haben die genannten Bedeutungen: DMF-Dimethylform-amid; THF-Tetrahydrofuran; G-6-PDH-Glucose-6-phosphat-dehydrogenase; BSA-Bovin-serumalbumin; RSA-Kaninchenserumalbumin; HRP-Horseradish-peroxidase; T-3-Triiodothyronin)
Beispiel 1
Konjugation von Trijodothyronin, amidiert mit N-Methyl-N,N-dicarboxymethyl-amin-anhydrid mit G-6-PDH (L. Mesenteroide)
A. Die Reaktion erfolgte in einem 25-ml-Rundkolben, geschützt durch eine Folie, mit Magnetrührer und unter Argonatmosphäre. Eine Lösung von 0,591 g T3-Methyl-ester-hydrochlorid wurde mit 2 ml DMF und 2 ml THF hergestellt. Zu dieser Lösung wurden 146 jil (1,25 aeq) Triäthylamin gegeben und während 15 min gerührt. Anschliessend wurden 0,13 g (1,20 aeq) N-Methyliminodiessigsäureanhydrid (MEMIDA-Anhydrid) in einem Teil zugegeben. Wenn die Dünnschichtchromatographie (TLC) auf sìo2 vollständige Reaktion anzeigte (Laufmittel für TLC-Analyse: AcOH/ MeOH/CHCh: 5:10:85), wurde das Lösungsmittel auf dem Rotationsverdampfer zuerst am Wasserstrahlvakuum und anschliessend mit einer mechanischen Vakuumpumpe entfernt. Die Wasserbadtemperatur überstieg nicht 30°. Der Rückstand wurde in 8,5 ml trockenem THF gelöst, zu der Lösung wurden 76 ml Äthylacetat gegeben und das Gemisch kräftig geschüttelt. Die erhaltene Suspension wurde filtriert und das Filtrat im Scheidetrichter mit 10 ml Wasser, mit 20 ml
Wasser und anschliessend zweimal mit 15 ml einer gesättigten Salzlösung gewaschen. Anschliessend wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und schliesslich das Lösungsmittel im 25 Vakuum entfernt und der Rückstand in Chloroform suspendiert. Zu der Suspension wurde Petroläther gegeben, worauf nach Filtrieren der feste Rückstand getrocknet wurde. Man erhielt 0,346 g eines weissen Pulvers von T-3-MEMIDA!
B. In 1 ml THF wurden 2,21 x 10~2 g N-Hydroxysuccin-30 imid gelöst und in 1 ml trockenem THF wurden 3,61 x 10~2 g
Dicyclohexylcarbodiimid gelöst. Ein Reaktionsgefäss wurde beschickt mit 7 mg des wie oben beschrieben hergestellten Tî-MEMIDA gegeben, 344 jj.1 trockenes THF wurden zugefügt und das Reaktionsgemisch im Eisbad abgekühlt, gefolgt 35 von der Zugabe von 45 jllI der NHS-Lösung und 55jil der DCC-Lösung. Das Reaktionsgemisch wurde von Licht geschützt und bei 2° während etwa 27 h geschüttelt. Die Lösung wurde im Vakuum nach Filtrieren durch Glaswolle zur Trockene eingeengt und der erhaltene weisse Feststoff in 40 etwa 1 ml 20% n-Hexan in CH2CI2 gelöst und auf einer Cellu-losepulversäule von 0,6 x 4,5 cm in demselben Lösungsmittel chromatographiert und mit demselben Lösungsmittel eluiert. Etwa 2 Säulenvolumen der Entwicklungslösung wurde verwendet und etwa 0,25-ml-Fraktionen wurden aufgefangen. 45 Die Fraktionen 2-5 wurden vereinigt, zur Trockene eingeengt und der trockene Rückstand wurde in trockenem Diglym gelöst.
C. In 2 ml kalten 0,05M Carbonat-Puffer von pH 9 wurden 12,1 mg lyophilisierte G-6-PDH (L. mesenteroides) gelöst
50 und die Lösung mit 350 ml desselben Puffers dialysiert. Der Rückstand im Dialysierschlauch wurde mit dem Dialysat auf 3 ml gebracht.
Die Lösung wurde mit demselben Puffer auf eine Konzentration von 2,16 mg/ml eingestellt und 3 ml der Lösung 55 wurden in ein Reaktionsgefäss mit Rührer gebracht und das ganze im Eisbad abgekühlt. Unter Abkühlen des Gemisches wurde 1 ml DMF in einer Rate von 150 jo.1 pro Minute zugegeben und anschliessend wurde 1 ml entnommen. Zu den verbliebenen 3 ml wurden entsprechend dem nachfolgenden 60 Schema T3-MEMIDA-NHS-Ester in einer Konzentration von 0,385 Äquivalenten pro Mikroliter gegeben. Es wurden 2 Zugaben von 10 jj.1, eine Zugabe von 20 jj,1, 2 Zugaben von 30 (j.1, jeweils in Abständen von 20 min gemacht. Nach jeder Zugabe wurde die Enzymaktivität in Gegenwart und Abwe-65 senheit von Anti-(T-3) gemessen. Das Reaktionsgemisch wurde in einen Spectrapor-Dialysierschlauch (Ausschlussgrenze: 25 000 Molekulargewicht) von 23 mm gegeben und zweimal gegen 500 ml 0,05M tris-HCl, 0,1 M KCl und 1 mM
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NaN3 von pH 8,0 dialysiert. Diese Dialyse wurde wiederholt. Nach Zentrifugieren des Dialysierriickstands bei 15 000 U/ min bei 2° während 10 min, wurde die überstehende Lösung auf einer G-50M-Säule von 0,9 x 98,5 cm chromatographiert in 0,05M tris-HCl, 0,1 M KCL NaN3, pH 8,0 und eluiert mit demselben Puffer mit einer Durchflussrate von 4 Tropfen/ min, wobei jeweils Fraktionen von 20 Tropfen aufgefangen wurden. Die Fraktionen 29-33 wurden vereinigt und während 10 min bei 1 °C bei 17 000 U/min zentrifugiert.
In ein kaltes Pierce-Reaktionsgefäss mit Rührer wurden 3 ml der genannten Lösung und 1 ml kaltes neutralisiertes 4M Hydroxylamin in Wasser während 5 min unter Umrühren zugegeben. Nach 10 min bei Eisbadtemperatur wurde die Reaktion während weiterer 90 min bei Zimmertemperatur durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde anschliessend auf einer Sephadex G-50-m-Säule im beschriebenen tris-Puf-fer chromatographiert und mit demselben Puffer bei Zimmertemperatur eluiert, unter Verwendung einer 0,9 x 98-cm-Säule mit einer Durchflussrate von 4 Tropfen/min, wobei Fraktionen von jeweils 20 Tropfen aufgefangen wurden. Die Fraktionen 29-34 wurden vereinigt und mit Hilfe eines Kollodion-schlauches, der Moleküle oberhalb 25 000 zurückhält, konzentriert. Der Rückstand wurde mit tris-HCl-Puffer auf 2 ml ergänzt. Ein aliquoter Teil von 1 ml wurde zweimal mit 250 ml kaltem 50mM Carbonatpuffer bei pH 9,05 dialysiert.
Basierend auf einer Lowry-Proteinbestimmung und einer Radioaktivitätsmessung (MEMIDA war markiert mit 14C), konnte die Anzahl von T3-Gruppen pro Enzym zu etwa 16 bestimmt werden.
Beispiel 2
Herstellung des Konjugats von Digoxin und G-6-PDH
A. Eine klare Lösung von 228 mg (0,59 mMol) 3-Ketodi-goxigenin, 140 mg (0,64 mMol) Carboxymethoxylamin-hydrochlorid und 294 mg (3,6 mMol) Natriumacetat in 18 ml Methanol (getrocknet über Molekularsieb 3A) wurde bei Zimmertemperatur unter Stickstoff während 3 h gerührt. Die TLC (Dünnschichtchromatographie) eines aliquoten Teils zeigte die vollständige Bildung des Oxim-Derivats (Rf 0,33 ; 0,5:l:10/HOAcMeOH-CHCh, Silicagelplatte). Das Reaktionsprodukt wurde an der Luft getrocknet, der Rückstand in 32ml 5% NaHCCb bei 5-10 °C gelöst und dreimal mit 20 ml Chloroform extrahiert. Die Bicarbonatphase wurde bei
5-10 °C mit 28 ml IN Salzsäure auf pH 2-3 gebracht und zehnmal mit 25 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat-extrakte wurden mit gesättigter wässriger Lösung von Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum erhielt man einen Feststoff, der aus einem Gemisch von Methanol-Äthylacetat-Hexan umkristallisiert wurde, wobei man 188 mg eines weissen Feststoffs vom Smp. 202-220 °C (Zers.) erhielt.
B. In ein trockenes Gefäss, ausgerüstet mit Serumstopper und Trockenrohr wurden 23,05 mg (0,05 mMol) des Oxims und 250 ul DMF (getrocknet über 4 À-Molekularsieben) und 1,7^.1 (0,052 mMol) trockenes Triäthylamin mit Hilfe einer Injektionsspritze durch den Serumstopper gegeben, wobei umgerührt wurde. Nach Abkühlen des Gemisches auf -14 °C, wurden 9,34 |_il (0,05 mMol) des Carbito-Chloroformiats unter die Oberfläche der Lösung gegeben und das Gemisch während 30 min gerührt.
In einem weiteren Gefäss wurden zu 2 ml Glucose-
6-phosphat-dehydrogenase (G-6-PDH) in einer Konzentration von etwa 1-2 mg/ml in 0,055 M tris-Puffer von pH 8,1 unter Umrühren 20 mg Glucose-6-phosphat-dinatriumsalz und 40 mg NADH gegeben. Während der Reaktion wurden aliquote Teile entnommen und die Enzymaktivität wurde bestimmt durch Verdünnen eines 5 ul-Aliquot der verdünnten
Enzymlösung und Verdünnen mit 1 ml Puffer und 50 ul Sub-trat, durch Transferieren dieser Lösung in ein Teströhrchen von 1,5 ml und Verwendung einer Durchflusszelle, wobei die Enzymaktivität während 60 s in einem Gilford-Spektrophoto-meter gemessen wurde. Das Gemisch wurde auf 0° abgekühlt und unter Umrühren wurden 1,08 ml Carbitol mit einer Injektionsspritze langsam unter die Oberfläche der Lösung gegeben. Nach Stehenlassen während 30 min wurde während 4 min mit einer Brinkman-Zentrifuge zentrifugiert und die überstehende Lösung wurde isoliert und mit IN NaOH auf pH 9,0 gebracht. Dann wurde die Enzymaktivität bestimmt.
Zu einer gerührten Lösung des Enzyms wurden 1 p.1 Aliquote des oben hergestellten gemischten Anhydrids gegeben in einer Rate von etwa 1 p.1 pro min. Nach Zugabe von 10 u.1 des gemischten Anhydrids wurde die prozentuale Hemmung und die prozentuale Dekativierung bestimmt. Die prozentuale Hemmung wurde bestimmt durch Verwendung von etwa 5 jil Antidigoxin im genannten Test. Etwa 35-45 p.1 des gemischten Anhydrids wurden zugegeben, um eine Hemmung von etwa 50% und eine Deaktivierung von etwa 36% zu erreichen. Wenn die gewünschte Hemmung und Deaktivierung erreicht wurde, wurde das Enzymkonjugat durch Dialyse gegen 0,055M tris-HCl-Puffer von pH 8,1, enthaltend 0,05% NaN3 und 0,005% Thimerosal, gereinigt.
Nach dem oben beschriebenen Verfahren wurden in einer ersten Reaktion ein Enzymkonjugat erhalten, mit 5 Digoxinen konjugiert an das Enzym, welches zu 36% deaktiviert und zu 50% gehemmt war, während in einer zweiten Reaktionssequenz, ein Enzymkonjugat erhalten wurde mit 9,2 Digoxinen, welches zu 48% deaktiviert und zu 62% gehemmt war.
Beispiel 3
Konjugation von menschlichem y-Globulin (hlgG) an HRP
A. 10,95 g lyophilisiertes HRP wurden in 0,5 ml von 0,3M NaHC03-Puffer (pH 8,6) gelöst und die Lösung in einen Dia-Iysierschlauch gegeben und gegen 500 ml eisgekühlten Puffer (siehe oben) während 3 h dialysiert. Das pH wurde auf 8,1 gebracht und die Lösung anschliessend während weiterer 4 h dialysiert. Die HRP-Lösung wurde mit Dialysat auf 2 ml ergänzt und spektrophotometrisch analysiert, wobei sich eine Konzentration von 3,46 mg/ml ergab.
B. Zu 1,5 ml der genannten Lösung wurden unter Umrühren bei Zimmertemperatur 100 ^1 einer l%igen Lösung von Fluordinitrobenzol in 95% Äthanol gegeben und das Gemisch unter Ausschluss von direktem Licht während 1 h gerührt.
1 ml (40 mM) Natriumperiodat wurden zugegeben und das Gemisch während 0,5 h unter denselben Bedingungen gerührt, worauf die Zugabe von 0,5 ml 0,34 M Äthylenglykol erfolgte. Nach Umrühren während einer weiteren Stunde unter denselben Bedingungen wurde das Reaktionsgemisch in einen Dialysierschlauch gegeben und dreimal gegen 900 ml lOmM NaHC03-Puffer (pH9,5) dialysiert.
C. 9,7 mg lyophilisiertes hILgG (Miles Laboratories, lyophilisiert und behandelt lmit DEAE-Cellulose, Los Nr. 24) wurden in 0,5 ml lOmM NaHC03-Puffer (pH 9,5) gelöst und zweimal gegen 500 ml eisgekühlten Puffer (siehe oben) dialysiert. Die Lösung wurde mit Dialysat auf 1,2 ml ergänzt und während 4 min bei 2-4 °C in einer Brinkman-Mikrozentrifuge zentrifugiert und anschliessend spektrophotometrisch analysiert, wobei sich eine Konzentration von 5,28 mg/ml ergab.
D. Zum dialysierten Rückstand des HRP-Dialdehyds (5,2 mg HLRP, 1,3 x 10"1 uMol) wurden unter Umrühren bei 2-4 °C 0,95 ml des hlgG-dialysierten Rückstands (5 mg,
3,1 x 10~2 uMol) gegeben und das Gemisch während 45 min gerührt. Zu diesem Gemisch wurden dann 5 mg (1,32 x 10~4 mol) NaBH4 gegeben, während 4,5 h bei 2-4 °C gerührt und anschliessend zweimal gegen 300 ml PBS (lOmM Na2HP04, 0,15M NaCl, pH 7,0) dialysiert. Der Rückstand aus der Dia5
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lyse wurde mit einem Kollodionschlauch (Durchtrittsgrenze: 25 000 Molekulargewicht) weiter auf etwa 1 ml konzentriert und während 2 min in einer Brinkman-Mikrozentrifuge zentrifugiert, worauf die überstehende Lösung auf einer 1,5 x 89 cm Sephadex-G-200-Säule (Gel in PBS) chromatographiert 5 wurde und mit demselben PBS-Puffer eluiert wurde. Die Durchflussrate betrug 1 Tropfen pro 30 s und es wurden Fraktionen von jeweils 20 Tropfen aufgefangen. Der Arbeitsdruck betrug 15 cm und die Chromatographie erfolgte bei Zimmertemperatur. 10
Die verschiedenen Fraktionen wurden spektrophotometrisch und auf Enzymaktivität analysiert und Fraktion 48 zeigte 1,65 x 10~6M HRP und 1,32 x 10 ~6M hlgG, entsprechend einem Verhältnis von hlgG zu HRP von 0,80. Der Enzymtest wird nachfolgend beschrieben. 15
Beispiel 4
Konjugation von hlgG und G-6-PDH
A. In ein eisgekühltes Reaktionsgefäss wurden 0,42 jiMole (I4C)-hIgG in 0,5M NaHCCb-Puffer, von pH 10 gegeben, 20 gefolgt von der Zugabe von 0,52 g (4,2 x 10~3M) Äthylacetimi-dat in 3 ml entionisiertem Wasser auf pH 10 eingestellt mit Natriumhydroxid. Nach 5minütigem Rühren bei etwa 4°
wurde das Gemisch bei Zimmertemperatur während weiterer
25 min gerührt. Eine weitere Zugabe des gleichen Anteils von 25 Äthylacetimidat erfolgt unter den gleichen Bedingungen wie beschrieben, worauf die Reaktionslösung in einen Dialysier-schlauch gegeben wurde und dreimal mit 1400 ml 0,5M K2HPO4 bei 2° dialysiert wurde. Nach Einstellen des pH auf 7,8 mit konzentrierter Salzsäure wurde die Lösung im Dialy- 30 sierschlauch in zwei Teile geteilt und während 30 min bei 12K bei 2 ml in einer Sorval-Zentrifuge zentrifugiert. Die Lösung wurde anschliessend in einem Kollodionschlauch gegen PBS von pH 7,8 konzentriert.
Eine Sephadex-G-200-Säule wurde hergestellt durch Auf- 35 quellen des Sephadex-G-200 in PBS von pH 6,7, durch Erhitzen im Wasserbad während 9 h. Eine Säule von 2 x 89 cm wurde hergestellt und ein Teil der oben genannten Lösung wurde auf die Säule gegeben. Die Fraktionen wurden eluiert mit PBS von pH 7,0, enthaltend 0,02% NaN3. Die Fraktionen 40 113-145 wurden vereinigt und einmal gegen 1200 ml, zweimal gegen 1000 ml lOOmM Natriumphosphat von pH 8,0 dialysiert, wobei das Anfangsvolumen 38 ml und das Endvolumen 35 ml betrug. Die Lösung wurde anschliessend mit Hilfe eines Kollodionschlauches auf 6,2 ml konzentriert, was eine 45
Lösung von 2,36 mg/ml hlgG ergab.
B. Zu 1 ml der genannten Lösung (1,48 x 10~8 Mol hlgG) wurden 1 ml von 0,06M Natriumperiodat (6 x 10~5 Mol) in Wasser bei pH 8,1 gegeben und das Gemisch während 3,5 h bei Zimmertemperatur gerührt. Zum Gemisch wurden 1 ml 50 0,16M Äthylenglykol in Wasser gegeben und während 1,5 h bei Zimmertemperatur gerührt. Das Raktionsgemisch wurde anschliessend in ein Dialysierschlauch gegeben und dreimal gegen 500 ml 50mM NaHCCb-Puffer von pH 9 dialysiert,
worauf einmal gegen 500 ml 200mM NaHCCb-Puffer von pH 55 8,8 dialysiert wurde.
C. Etwa 3,5 ml G-6-PDH (L. Mesenteroide, Los Nr. 6A053-402) wurden erschöpfend mit 200 ml 200mM NaHCCb-Puffer von pH 8,8 dialysiert.
Die hIgG-(2,27 mg, 1,42 x 10"8 Mol) und G-6-PDH-(8,82 60 mg, 8,48 x 10~8 Mol) Lösungen wurden vereinigt, wobei ein Endvolumen von 6,6 ml erhalten wurde, das unter Abkühlen im Eisbad gerührt wurde. Das Gemisch wurde anschliessend auf Zimmertemperatur erwärmt und während weiterer 4 h gerührt, worauf nach Abkühlen im Eisbad 5 mg NaBH4 zuge- 65 geben wurden und das Gemisch im Eisbad während 3,5 h gehalten wurde. Die Lösung wurde anschliessend in einen Dialysierschlauch gegeben und erschöpfend bei 2-4° gegen eine Pufferlösung, lOmM K2HPO4, enthaltend 0,15M NaCl, vom pH 9 dialysiert. Das Reaktionsgemisch wurde anschliessend in einem Kollodionschlauch gegen PBS von pH 7,0 auf ein Volumen von 2,4 ml konzentriert.
Eine Chromatographiersäule von 2 x 84 cm wurde mit Sephadex-G-200 in PBS von pH 7,0 hergestellt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die Säule gegeben und mit PBS von pH 7,0 bei Zimmertemperatur eluiert, wobei Fraktionen von 40 Tropfen aufgefangen wurden. Die Durchflussrate betrug 5 Tropfen/min, unter Verwendung eines Arbeitsdrucks von etwa 18 cm. Die Fraktionen wurden getestet auf Enzymaktivität und auf Radioaktivität. Die Enzymtestmethode wird im folgenden beschrieben werden.
Beispiel 5
Konjugation von o-Dianisidin an Dextran 10
Zu 0,5 g Dextran 10 in 2 ml H2O, gekühlt auf 4 °C wurden 250 {xl 100 mg/ml CNBr in H2O bei 4°C gegeben und das pH durch kontinuierliche Zugabe von IN NaOH auf 11 gehalten. Nach 5 min wurde ein aliquoter Teil von 200 ul entnommen, 2 ml Aceton wurden zugegeben und die Lösung bei 10K während 5 min bei 4°C zentrifugiert und der Niederschlag isoliert. Dieser Niederschlag wurde in einem Gemisch von DMF/0,1M Bicarbonat-Puffer von pH 9 gelöst und ein 20 mg/ml Lösung von o-Dianisidin in demselben Gemisch wurde zugegeben, um ein Molverhätlnis von 1:10 des Dextran 10 zum o-Dianisidin zu erreichen. Das pH wurde auf 9 eingestellt und die Reaktion wurde unter leichtem Umrühren über Nacht durchgeführt.
Zum Gemisch wurden anschliessen 100 |il von IM l-Amino-2-propanol gegeben und das pH mit IN HCl auf 9 eingestellt, worauf das Gemisch bei Zimmertemperatur im Dunkeln während 3 h stehengelassen wurde. Das pH wurde auf 7 eingestellt, während 5 min bei 10K und 4° C zentrifugiert und die überstehende Lösung isoliert.
Auf eine Sephadex-G-25-Säule von 2 x 40 cm wurde die genannte Lösung in 0,0IM PO4, 0,2M NaCl gegeben und das Produkt mit demselben Puffer in einer Rate von 35 ml/h eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 80 Tropfen aufgefangen wurden und wobei die Säule im Dunkeln gehalten wurde. Fraktionen 21-25 wurden gesammelt und vereinigt.
Beispiel 6
Konjugation von Horseradish-peroxidase (HRP) an Anti(human IgG) [Anti(hlgG)]
In einen Dialysierschlauch wurden 4 ml 8,5 mg/ml Anti(hIgG, Fc spezifisch) (Dako Los Nr. 015, Titer 600 jj.g/ml und dialysiert gegen 3 x 350 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puf-fer (pH 7,5) (2-4 °C), gegeben. Der Rückstand wurde mit 5,1 ml des Dialysats verdünnt und während 10 min bei 15 000 U/ min bei 2-4 °C zentrifugiert.
In ein 10 ml RB-Gefäss wurden 5 ml (32,3 mg) 6,45 mg/ml Anti(hlgG) gegeben, im Eisbad abgekühlt und 15 jil 1,5 x 10_2M (14C)-Essigsäure-anhydrid-Benzol-Lösung wurden unter Umrühren zugegeben. Nach 2,75 h wurde die Reaktion durch Zugabe einer wässrigen Lösung von 2M Hydrox-ylamin und 2M NaCl gestoppt, das Eisbad wurde entfernt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 1 h gerührt. Nach Dialysieren gegen 350 ml 0,1 M Natriumphosphat und 0,1M Natriumsulfat (pH 7,1) wurde der Rückstand auf einer G-25M-Säule von 2 x 44 cm chromatographiert und mit dem Dialyse-Puffer eluiert. Die Durchflussrate betrug 10 Tropfen/ min, 36 ml/h und es wurden Fraktionen von 2,4 ml gesammelt. Die Fraktionen mit Radioaktivität wurden vereinigt, zu einem Totalvolumen von 23 ml, enthalten 31,5 mg Anti(hlgG). Ein Anteil von 22,5 ml (30,8 mg) des Anti(hlgG) wurde in einen Dialysierschlauch gegeben und dreimal gegen
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14
1000 ml eisgekühlte 50% gesättigte Ammoniumsulfatlösung dialysiert.
Horseradish-peroxidase (Sigma VI, Los Nr. 65C9530) wurde in gesättigter Ammoniumsulfatlösung gelöst, wobei eine Lösung enthaltend 6,5 mg/ml erhalten wurde und worauf ein aliquoter Teil von 1 ml während 4 min zentrifugiert wurde, die überstehende Lösung verworfen wurde und der Rückstand in 5 ml eisgekühltem 0,3 M Natriumbicarbonat (pH 8,5) gelöst wurde und dreimal gegen 400 ml 0,3M Natri-umbicarbonat-Puffer (pH 8,5) dialysiert wurde.
Das dialysierte Anti(hlgG) wurde mit Dialysat auf 17 ml ergänzt, wobei eine Konzentration von 1,81 mg/ml erhalten wurde. Ein aliquoter Teil von 3 ml (5,4 mg) dieser Lösung in 50% gesättigtem Ammoniumsulfat wurde während 5 min bei 10 000 U/min bei 2-4 °C zentrifugiert, die überstehende Lösung wurde verworfen und der Niederschlag in 0,5 ml lOmM Natriumbicarbonat-Natriumcarbonat-Puffer (pH 9,5) gelöst und dreimal gegen 350 ml desselben Puffers dialysiert. Der Horseradish-Peroxidase-Rückstand wurde mit dem Dialysat auf 1,1 ml verdünnt. UV-Analyse eines aliquoten Teils ergab eine Konzentration von 6,31 mg/ml.
Zu 0,8 ml der genannten HRP-Lösung wurden 0,2 ml des Natriumbicarbonat-Puffers gegeben, was ein Totalvolumen von 1 ml ergab, worauf 100 ji.1 1% 2,4-Dinitrofluorbenzol in 95% Äthanol unter Umrühren zum Gemisch gegeben wurden, worauf dieses während 1 weiteren Stunde bei Zimmertemperatur unter Ausschluss von Licht gerührt wurde. Zum Gemisch wurden anschliessend tropfenweise 1 ml einer wässrigen 30,2mM Natriumperjodatlösung gegeben und das Gemisch während 0,5 h unter Ausschluss von Licht gerührt, gefolgt von einer Zugabe von 1 ml einer wässrigen 0,35M Äthylenglykollösung, worauf das Gemisch während 0,75 h gerührt wurde und schliesslich zweimal gegen 350 ml eisgekühlten lOmM Natriumbicarbonat-Natriumcarbonat-Puffer (pH 9,5) dialysiert wurde.
Ein Reaktionsgefäss wurde mit 1 ml 4,5 mg/ml Anti(hlgG) in Natriumbicarbonat-Natriumcarbonat-Puffer, beschickt, worauf die Horseradish-Peroxidase-Periodat-Reaktionslösung zugegeben wurde. Das HRP/Anti(hIgG)M-Verhältnis betrug 4,2. Nach Umrühren während 0,5 h wurden 5,05 mg Natriumborhydrid zugegeben, das Gemisch im Eisbad während 5,5 h gerührt, worauf einmal gegen 350 ml 0,1 M Natriumphosphat und 0,1M Natriumsulfat (pH 7,1) und anschliessend gegen gesättigte wässrige Lösung von Ammoniumsulfat dialysiert wurde. Der Rückstand wurde während 4 min zentrifugiert, die überstehende Lösung wurde verworfen und der Niederschlag wurde in 0,4 ml Phosphat-Sulfat-Puffer gelöst. Die Lösung wurde auf einer G-200-Säule von 1,5 x 88 cm chromatographiert und mit demselben Puffer eluiert. Die Durchflussrate betrug 2 Tropfen pro min, wobei Fraktionen von jeweils 20 Tropfen aufgefangen wurden. Die Fraktionen mit UV-Absorption bei 403 nm und 280 nm wurden vereinigt und gegen gesättigtes Ammoniumsulfat dialysiert, der Rückstand wurde während 5 min bei 2-4 °C bei 15 000 U/min zentrifugiert, die überstehende Lösung verworfen und der Niederschlag in 0,4 ml Phosphat-Sulfat-Puffer gelöst. Diese Lösung wurde auf einer G-200-Säule von 1,5 x 88 cm chromatographiert und mit demselben Puffer eluiert, wobei bei einer Durchflussrate von 2 Tropfen/min Fraktionen von 20 Tropfen aufgefangen wurden. Diejenigen Fraktionen, in denen durch UV-Absorption die Gegenwart des gewünschten Kon-jugats nachgewiesen werden konnte, wurden vereinigt und auf HRP getestet. Jeder der drei Fraktionen wurde auf 1% in Ovalbumin gebracht, um das Protein zu stabilisieren. Fraktion I betrug 4,18 x 10-7M in Anti(hlgG), 5,25 x 10~7M in HRP und hatte eine spezifische Aktivität von 119 IU/mg; Fraktion II enthielt 1,08 x 10~6M in Anti(hlgG), 4,6 x 10~7N in HRP und hatte eine spezifische Aktivität von 309 IU/mg;
und Fraktion III enthielt 5,1 x 10~7M in Anti(hlgG),
7,56 x 10~7M in HRP und hatte eine spezifische Aktivität von
684 IU/mg.
Zur Erläuterung der Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung wurde eine Anzahl Tests durchgeführt. Hier muss erwähnt werden, dass in vielen Fällen die verwendeten Materialien nicht optimal waren, um eine maximale Empfindlichkeit der Teste zu erreichen. Mitbestimmend war eine unkomplizierte Synthese, eine leichte Erhältlichkeit der verwendeten Komponenten und das frühe Stadium bei der Durchführung der Tests.
Im ersten zu beschreibenden Test wurde das T-3-Konju-gat zur Glucose-6-phosphat-dehydrogenase verwendet. Zu 5 |il einer Verdünnung von 1:10 des Produkts aus Beispiel 1 in 50 mM tris-HCl und 0,1% RSA (pH 7,9) wurde das folgende gegeben: 1,8 ml einer wässrigen Lösung 50mM in Tris-HCl, 0,1% RSA, pH 7,9, 50 ^1 0,1M-NAD, pH 5,0 und 25 jj Anti-T3-Serum. Die Lösung wurde während 20 min bei 30 °C inkubiert und anschliessend wurden 100 jj.1 0,66M G-6-P in Puffer ohne RSA und 2 [xl Anti-G-6-PDH in 25 j_il Puffer zugegeben und bei 340 nm bei 30 °C gemessen. Die Rate wurde während 4 min verfolgt. Der Test wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von 25 ji.1 Puffer anstelle von 25 (il Anti-T3. Nach 4 min betrug die Absorption bei 340 nm in Abwesenheit von Anti-T3 0,012, während in Gegenwart von Anti-T3 0,020 gemessen wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Anteil von Antiligand, in diesem Fall Anti-T3, mit Hilfe des erfindungsgemässen Tests bestimmt werden konnte. Ferner muss erwähnt werden, dass das Enzymkonjugat nur 5,7% der ursprünglichen Enzymaktivität aufwies und eine Hapten-Zahl von etwa 16 hatte. Die Gegenwart der grossen Zahl von Hapten pro Enzym sowohl als auch die niedere Aktivität bewirkt eine wesentliche Verminderung der Empfindlichkeit des Tests.
Der nächste durchgeführte Test erfolgte auf Digoxin,
unter Verwendung des Produkts aus Beispiel 2.
Bei der Durchführung dieses Tests wurden 5,57 x 10~3 g (7,13 x 10~6 Mol) Digoxin in 10 ml trockenem DMF gelöst und eine Reihe von Verdünnungen wurden mit aliquoten Teilen aus dieser DMF-Lösung hergestellt. Der Test wurde durchgeführt durch Verdünnen von 25 [il des Digoxin-G-6-PDH-Konjugats mit 1 ml Puffer. (Der Puffer wurde hergestellt durch Äuflösen von 0,25 g Ovalbumin in 250 ml einer wässrigen Lösung von 50 mM in tris-HCl und ImM NaN3 (pH 7,8), was eine Lösung von 0,1% Ovalbumin von pH 7,8 ergab). Zu der Lösung wurde ein präinkubiertes Gemisch von 25 jj.1 Antidigoxin (1 |il Antidigoxin verdünnt mit Puffer), 1 ml Testpuffer und 2 (il der Digoxinlösung gegeben. Nach Inkubieren während 10 min bei 30 °C wurden 50 jj.1 von 80 mM ß-NAD (pH 5,1) bei 30 °C zugegeben und das Gemisch während 0,5 min bei 340 nm und 30 °C gemessen, worauf nach Zugabe von 5 (il Anti-G-6-PDH während weiterer 5,5 min bei 340nm gemessen wurde. Die folgende Tabelle enthält die gemessenen Resultate.
Tabelle I
Probe* Nr.
Digoxin M x 6,77 (im Versuch)
yt*
v2*
1
0
36,5 ±0,5
38,8 ±0,7
2
1 x 10"9
43,0 ±0,5
33,0 + 0,3
3
lxlO"8
56,0 ±0,5
19,3±k0,7
4
1 x 10~7
59,5 ±0,5
15,0 ±1,0
*v' ist die Differenz in der Absorption während der ersten 0,5 min.
v2 ist die Differenz in der Absorption während der nächsten 5,5 min.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
15
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Die Ergebnisse stellen den Durchschnitt von zwei Messungen dar und sind korrigiert.
+ Konzentration in der Testlösung Digoxin*-G-6-PDH-Konjugat 4,3 x 10~,0M
Anti(digoxin) 4,0 x 10~8M
Die Resultate unter v2 zeigen, dass die Konzentration von Digoxin über einen Bereich von 104 und bis hinunter zu etwa 10~8 bis 10~9M Digoxin bestimmt werden kann.
Der nächste Test illustriert die Verwendung des erfin-dungsgemässen Tests zur Bestimmung von Antigenen, im Vergleich zu den genannten Haptenen. Dabei wurden 2 jj.1 des HRP-hlgG-Konjugats mit 200 ul Puffer verdünnt, worauf 20 (il hlgG und 2 jj.1 Anti-hlgG zugegeben wurden. Das Gemisch wurde während 0,5 h bei 30 °C inkubiert, worauf 4 ul anti-HRP zugegeben wurden und worauf während weiterer 0,5 h inkubiert wurde. Zum Gemisch wurden anschliessend 1,8 ml Puffer, enthaltend 0,22 mM o-Dianisidin und 22 mM Wasserstoffperoxid, gegeben und die Änderung in der Absorption bei 460 nm bei 30 °C während 1 min nach Beginn der Reaktion wurde gemessen. Die Endkonzentrationen betrugen 1,3 x 10~9M für das HRP-hlgG-Konjugat, 3,7 x 10~8M für Anti-hlgG und 4,6 x 10~8M für Anti-HRP- Der verwendete Puffer war 0,0IM Natriumphosphat, 0,05M Natriumsulfat, 0,1% Ovalbumin und 4,0% Polyäthylenglykol 6000, pH 7,0.
Die folgende Tabelle gibt die erhaltenen Ergebnisse für verschiedene Konzentrationen von hlgG wieder.
Tabelle II
Probe Nr.
hlgG, M (im Versuch)
Rate in O D/min
1
0
144, 144
2
lxlO"7
96, 84
3
lxlO"8
93, 87
4
1 xl0~9
123, 126
5
1 x IO"10
135, 138
6
1 x IO"11
138, 138
Aus diesen Ergebnissen ist evident, dass der beschriebene Test empfindlich ist für menschliches y-Globulin, wobei Konzentrationen bis zu 10"IOM bestimmt werden können. Ferner kann die Bestimmung nach einigen einfachen Manipulationen in einer Zeit von etwa 0,5 h rasch erfolgen. Die Aktivitätsmessung kann mit einer einfachen spektrophotometischen Ausrüstung für den sichtbaren Bereich erfolgen.
Der nächste Test war auch für hlgG unter Verwendung des Konjugats aus Beispiel 4 und des Enzyms G-6-PDH. Fraktion 42 dieses Präparats wurde verwendet. Der Test wurde in der Weise durchgeführt, dass ein Gemisch von 0,2 ml von Fraktion 42 in 0,2 ml einer 3,68 x 10~5M Lösung von Anti-hlgG in Puffer, 10 mM Natriumphosphat und 50 mM Natriumsulfat, ph 7,48, hergestellt wurde. Die Konzentration von hlgG in Fraktion 42 betrug 2,54 x 10"2 mg/ml, während die Konzentration von G-6-PDH 1,58 x 10~2 mg/ml betrug. Das Gemisch wurde während 30 min bei 30 °C inkubiert.
Eine Lösung wurde hergestellt aus 1,6 ml Puffer, 00,05 ml G-6-P und 0,05 ml NAD und in einer Küvette bei 30 °C während 3 min inkubiert. Der Puffer war 50mM tris-HCl, enthaltend 0,1% RSA und 1 mM NaN3, ph 7,8. Die G-6-P-Lösung war 140mM in Puffer ohne RSA und die NAD-Lösung war 80mM in entionisiertem Wasser, pH 5. In die Küvette wurden anschliessend 0,05 ml des kombinierten Konjugats und Anti-hlgG gegeben, das präinkubiert war, die Lösungen wurden durch Inversion gemischt und bei 340 nm während 2,5 min gemessen. Die Messung wurde unterbrochen, 1 ,ul Anti-G-6-PDH wurde zugegeben um einen Überschuss von Anti-G-6-PDH im Testmedium zu erhalten, die Lösung wurde gemischt durch Inversion und während weiterer 5 min bei 340 nm gemessen. Dieses Vorgehen wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von 0,2 ml PBS vom pH 7 anstelle von 0,2 ml Anti-hlgG.
Die gemessene Rate zwischen der ersten und zweiten Minute in der Änderung der Milliabsorption/min in Abwesenheit von Anti-G-6-PDH betrug 51,8 und zwischen der 5. und 4. Minute der 5-min Periode betrug 22,2 in Gegenwart von Anti-G-6-PDH, wenn Anti(hlgG) vorhanden war. In der Abwesenheit von Anti(hlgG) betrugen die Ergebnisse 52,4 und 2,3.
Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Gegenwart von Anti-hlgG bei extrem tiefen Konzentrationen erfolgen kann. Ferner kann aus den Resultaten hlgG weiter bestimmt werden, da die Gegenwart von hlgG im Testmedium die Wirkung hat, dass der Anteil von Anti-hlgG, wie es verfügbar ist für die Bildung von hIgG-G-6-PDH-Konjugat, vermindert wird.
Der nachfolgende letzte Test erfolgt ebenfalls unter Verwendung von hlgG als Beispiel für ein Antigen und zeigt die Wirkung von zugegebenem Antikörper und die Kombination von Antikörper und Antigen. Der Test zeigt auch die Nützlichkeit eines Enzyminhibitor-Substrates, das das Enzym deaktiviert, so dass ein stabiler Messwert in kurzer Zeit nach Vereinigung der Reagenzien erreicht wird.
Das Vorgehen war wie folgt: 0,5 ml Dextran-10-o-dianisi-din aus Beispiel 5 wurden 1:1 verdünnt mit demselben Puffer wie verwendet für HRP, ein genügender Anteil von HRP-hlgG-Konjugat wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 1,4 x 10~8M zu erreichen und je nachdem wurden 20 jj.1 wässriges Anti-hlgG (Miles Labs, Los 20, 8,6 mg/ml) und hlgG (Endkonzentration 10~6), gefolgt von Inkubation während 20 min bei Zimmertemperatur. Zum Gemisch wurden dann 5 jj.1 22mM H2O2 gegeben und die Änderung der Absorption bei 460nm bei 30 °C während 1 min wurde bestimmt. Eine zweite Messung erfolgte nach 10 min, wobei keine weitere signifikante Änderung der Absorption beobachtet wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse stehen in folgender Tabelle:
Tabelle III
Ab(hlgG)
hlgG
mOD 1 min
10 min
362, 302
390, 365
+
+ -
230,217
295, 295
+
+
328, 334
365, 365
Die Zugabe von Anti(hlgG) reduziert den Anteil von 0-Dianisidin wesentlich, welcher während einer vorbestimmten Zeitdauer umgesetzt wird. Die Zugabe von Anti(hlgG) und hlgG reduziert das verfügbare Anti(hlgG) für die Bindung an das Enzymkonjugat und erlaubt eine grössere Umsetzung, bevor verfügbares Enzym im wesentlichen deaktiviert wird. Bei einem solchen Vorgehen muss die Zeit zwischen den einzelnen Messungen der Absorption nicht so genau bestimmt werden, da nach einigen Minuten die Messwerte während relativ längerer Zeit stabil bleiben.
Aus den oben stehenden Ergebnissen ist klar ersichtlich, dass es sich dabei um eine Methode handelt, die geeignet ist, extrem niedrige Konzentrationen von Liganden zu erfassen, und zwar sowohl von haptenischen als auch von antigenischen Liganden. Ferner hat die vorliegende Erfindung die wünschbare Eigenschaft, dass Enzyme leicht markiert werden können, um so einen wesentlichen Teil ihrer urspünglichen Aktivität beizubehalten, sowohl nach Konjugation und wenn Antiligand an das Konjugat gebunden ist. Ferner wird die
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Gegenwart von nativem Enzym im Testmedium behindert, wodurch eine Bestimmung der Enzymaktivität in der Probe unnötig wird. Das Vorgehen für die erfindungsgemässen Tests ist einfach und die benötigten Spektrophotometer können ebenfalls einfach aufgebaut sein und werden in den meisten Fällen vorhanden sein. Die Durchführung der Tests läuft letzten Endes auf eine Enzymbestimmung hinaus, eine Methode die weit verbreitet ist und allgemein bekannt ist.
Obwohl die vorliegende Erfindung durch die gegebenen Beispiele im einzelnen beschrieben und illustriert wurde, ist 5 es klar, dass diese Beispiele keinen Einschränkenden Charakter haben.
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Claims (9)

  1. 648 414
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    PATENTANSPRÜCHE
    1. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines Analy-ten in einer Probe, der ein Glied eines immunologischen Paars ist, bestehend aus den reziproken Gliedern Ligand und Ligand-Rezeptor, dadurch gekennzeichnet, dass in einem wässrigen Medium kombiniert werden:
    (A) die genannte Probe mit dem Analyten;
    (B) Enzymkonjugat, worin das Enzym konjungiert ist mit einem der genannten Glieder des genannten immunologischen Paars und worin das genannte Enzym einen wesentlichen Teil seiner Aktivität beibehält, wenn das genannte Enzymkonjugat mit dem reziproken Glied des genannten immunologischen Paars einen Komplex bildet;
    (C) Enzym-Inhibitor, wobei der genannte Inhibitor in seiner Inhibitorwirkung auf das genannte Enzym behindert ist, wenn das genannte Enzym im genannten Komplex vorliegt; und
    (D) wenn das im genannten Enzymkonjugat konjugierte Glied und der genannte Analyt dasselbe Glied des genannten immunologischen Paars darstellen, das reziproke Glied des genannten immunologischen Paars;
    unter der Voraussetzung, dass wenn der genannte Ligand monoepitopisch ist und das genannte Enzym mit einem Anti-ligand konjugiert ist, ein Poly-Ligandanalog im genannten Testgemisch enthalten ist; und worauf die enzymatische Aktivität im genannten Medium bestimmt wird und diese mit der enzymatischen Aktivität in einem Medium mit bekanntem Anteil des Analyten verglichen wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der genannte Enzym-Inhibitor ein Anti-Enzym ist.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der genannte Enzym-Inhibitor ein irreversibler Inhibitor ist.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der genannte Enzym-Inhibitor ein reversibler Inhibitor ist.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, worin das genannte wässrige Medium bei einem pH von 5 bis 10 und einer Temperatur von 10 bis 50 °C vorliegt und worin der genannte Enzym-Inhibitor nach Kombinieren der Komponenten (A), (B) und (D) zugegeben wird.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, worin das Enzymkonjugat ein enzymgebundener Ligand ist.
  7. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 3 und 6, worin der genannte irreversible Inhibitor ein Substrat für das Enzym des genannten enzymgebundenen Liganden darstellt.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Analyt ein Ligand ist, das Enzymkonjugat ein enzymgebundener Ligand ist und der Enzym-Inhibitor ein Enzym-Substrat ist, das mit dem genannten Enzym reagiert und es auf diese Weise hemmt und welches in der Reaktion mit dem genannten Enzym gehindert ist, wenn der Ligand-Rezeptor an den genannten enzymgebundenen Liganden gebunden ist.
  9. 9. Reagenziensatz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend Enzym-Konjugat; das reziproke Glied des genannten immunologischen Paars, wenn der genannte Analyt und das im genannten Enzymkonjugat konjugierte Glied beide das gleiche Glied des genannten immunologischen Paars darstellen und Enzyminhibitor.
    Es besteht heute ein steigendes Interesse daran, eine grosse Zahl der verschiedensten organischen Verbindungen nachweisen und bestimmen zu können. Zu diesen Verbindungen von Interesse gehören Drogen, wie sie verwendet werden für die Behandlung von Erkrankungen, missbräuchlich verwendete Drogen, natürlich vorkommende Verbindungen, die an Körperfunktionen beteiligt sind, Polluanten, Verunreinigungen in Spuren und ähnliche. Die Konzentrationen der meisten dieser Verbindungen betragen im allgemeinen 1 ug/ml oder weniger. In vielen Fällen liegen die genannten Verbindungen in Gemischen vor, welche eine oder mehrere Verbindungen mit sehr ähnlicher Struktur aufweisen, welche voneinander unterschieden werden müssen.
    Die dafür geeigneten Verfahren sind z.B. die sogenannten kompetitiven Protein-Bindungs-Tests. Diese Tests basieren auf der Fähigkeit des Rezeptors, normalerweise eines Anti-Körpers, spezifisch zu reagieren mit einer bestimmten räumlichen und ladungsmässigen Konformation. Die Bindung des Rezeptors an einen Liganden erlaubt eine Unterscheidung nach gebundenem und ungebundenem Ligand. Bei Verwendung eines markierten Liganden und kompetitiver Wirkung dieses markierten Liganden mit dem Liganden im unbekannten Gemisch erhält man eine Verteilung des Rezeptors zwischen markiertem und unmarkiertem Liganden. Bei Verwendung geeigneter Markierungen kann zwischen gebundenem markiertem Ligand und ungebundenem markierten Ligand unterschieden werden, und das beobachtete Verhältnis kann auf den unbekannten Liganden übertragen werden. Wenn ein Rezeptor bestimmt werden soll, wird im wesentlichen dasselbe Verfahren verwendet, wobei jedoch kein zusätzlicher Rezeptor und nicht markierter Ligand zugegeben werden.
    Bei der Entwicklung von kompetitiven Protein-Bindungs-Tests müssen eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden. Eine unkomplizierte Zubereitung der verschiedenen Reagenzien ist eine wichtige Forderung. Die einzelnen Manipulationen bei der Durchführung des Tests müssen ebenfalls auf das Notwendigste beschränkt werden, um Fehler möglichst aus-zuschliessen. Ferner ist eine Stabilität der Reagenzien wichtig wie auch die Kompatibilität mit anderen bestehenden Tests. Eine wichtige Forderung ist ferner die Genauigkeit und die Empfindlichkeit des verwendeten Testverfahrens.
    US-PS 3 817 837 beschreibt einen homogenen Enzym-Immunotest. US-PS 3 654 090,3 791 932,3 850 752 und 3 839 153 beschreiben heterogene Enzym-Immunotests. In der Agenda für das Ninth Annual Symposium on Advanced Analytical Concepts for the Clinical Laboratory, March 17 and 18, 1977, Oakridge National Laboratory erschien ein Artikel mit dem Titel: «Phospholipase C-Labeled Antihuman IgG: inhibition of enzyme activity by human IgG» von R. Wei und S. Reib. US-PS 3 935 074 and 3 998 943 enthalten Immunotest-Verfahren, basierend auf der sterischen Hinderung zwischen zwei verschiedenen Rezeptoren für verschiedene epitopische Bereiche. Carneo et al. Anal. Biochem. 72, 271 (1976) und Schröder et al. ibid. 72,283 (1976) beschrieben kompetitive Protein-Bindungs-Tests, worin eine Markierung an ein Hapten gebunden wird, wobei diese Markierung nach enzymatischer Transformation ein Signal liefert. Antikörperbindung an das Hapten hindert die Annäherung des Enzyms an die Markierung.
CH7673/78A 1977-07-14 1978-07-14 Antienzym-homogen-kompetitivbindungs-test. CH648414A5 (de)

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