CH648862A5

CH648862A5 - Stabilisierte plasmin-zusammensetzungen und verfahren zu deren herstellung.

Info

Publication number: CH648862A5
Application number: CH10/82A
Authority: CH
Inventors: Allan Diedrichsen; Marie Johannessen; Peter Tang
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1981-01-05
Filing date: 1982-01-04
Publication date: 1985-04-15
Also published as: US4462980A; IT8125932A0; IT1194135B; DE3200058A1; FR2500755A1; NL8200004A; BE891679A; DK982A; FR2500755B1

Description

Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die nützlich sind für die Herstellung von szintigraphischen Messsubstanzen, die das Radionucleid Technetium-99m enthalten. Ebenso betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der genannten Zusammensetzungen.

Speziell betrifft die Erfindung neue Zusammensetzungen, welche stabilisiertes Plasmin enthalten. Diese Zusammensetzungen sind gedacht als Träger für Technetium-99 m. Mit Technetium-99m markiertes Plasmin hat sich als sehr günstiges Medium erwiesen für die szintigraphische Erfassung von «deep vein thrombosis (DVT)» in Extremitäten von Patienten, speziell in den Beinen.

DVT ist eine potentiell ernsthafte Komplikation nach vielen chirurgischen und medizinischen Eingriffen. Sie kann dabei mit oder ohne Pulmonarembolie auftreten. DVT muss daher so rasch wie möglich diagnostiziert werden, um die geeigneten Behandlungen möglichst sofort einleiten zu können. Die Wahrscheinlichkeit von DVT ist gegeben unter traumatischen Bedingungen, wie denjenigen, die auftreten nach grösseren chirugischen Eingriffen oder Knochenfrakturen, speziell Frakturen der Halswirbel oder der Oberschenkelknochen. Ebenso ist bekannt, dass alle Bedingungen mit erzwungener Immobilität, d.h. vorgerücktes Alter, Obesität, Neoplasma und Herzversagen oder Infarkt, die Risiken des Eintretens von DVT erhöhen.

Die korrekte klinische Diagnosis von DVT wird erschwert und durch die Tatsache, dass die entsprechenden klinischen Symptome eher unspezifisch und oft unklar sind. Die klinische Diagnosis von DVT basiert auf Symptomen wie venöse Distension, Schmerzen, Erschlaffung und Anschwellen der befallenen Extremitäten mit erhöhter Hauttemperatur usw. Diese Symptome führen jedoch gelegentlich auch zu falschen positiven Resultaten. Im Gegensatz dazu ist auch bekannt, dass ausgedehnte DVT vorliegen kann, ohne auffällige physikalische Zeichen, vor allem dann, wenn die Hauptvenen nicht vollständig occludiert sind. Weiter ist bekannt, dass eine gewisse Anzahl DVT-Patienten überhaupt keine klinische Symptome des genannten Zustandes zeigen.

Die Ungenauigkeit der klinischen Untersuchungsmethoden hat zu Entwicklungen geführt, um zu objektiven diagnostischen Testmethoden für die Erfassung von DVT zu gelangen. In den letzten Jahren ist eine Anzahl solcher Untersuchungsmethoden vorgeschlagen worden.

Sie umfassen unter anderem die Röntgenstrahl-Phlebographie, Methoden zur Erfassung der Blutdurchflussmengen (beispielsweise mittels Doppler-Ultraschalltechnik oder Impedanz-Plethysmographie) sowie die Lokalisierung von Thrombi mittels Radiopharmazeutika. Die letzte Gruppe von Untersuchungsmethoden benutzt Radiopharmazeutika, welche in fibrinösen Klumpen akkumulieren und dadurch die Bestimmung der Anwesenheit solcher Klumpen erlauben. Die Bestimmung geschieht normalerweise mittels szintigraphi-scher Untersuchungsmethoden. Beispiele solcher radiopharmazeutischer Mittel sind radioiodiertes Fibrinogen und mit Technetium-99m markiertes Plasmin. Währenddem das markierte Fibrinogen sehr langsam in sich entwickelte Thrombi eingebaut wird, ist festgestellt worden, dass aktiv markiertes Plasmin schnell, sogar in schon gebildete fibrinöse Knollen aufgenommen wird.

Das Blut von Säugern enthält ein enzymatisches System, welches fibrinolytisches Enzymsystem genannt wird. Unter normalen Bedingungen wird dadurch ein dynamisches Gleichgewicht aufrechterhalten zwischen der Ablagerung von Fibrin und der lokalen Auflösung desselben, was eben durch das fibrinolytische Enzymsystem aktiviert wird. Endogene Aktivatoren, beispielsweise das sogenannte Plasminogenge-webeaktivator, setzen das umlaufende Plasminogen in das fibrinolytisch aktive Enyzm Plasmin um, welches eine hohe Aktivität gegenüber Fibrin zeigt. Unter die exogenen Aktivatoren des fibrinolytischen Enzymsystems fallen unter anderem die folgenden Verbindungen: Streptokinase, welche von bestimmten Stämmen von hämolytischen Streptococci gebildet wird, Urokinase, welche entweder aus menschlichem Urin gewonnen wird oder von bestimmten Gewebekulturen gebildet wird und Trypsin.

Gemäss seinem fibrinolytischen Effekt wurden Infusionen von exogenem Plasmin als Alternative zu anderen Methoden in der thrombolytischen Therapie verwendet. Um die Anforderungen hinsichtlich Reinheit für solche Therapien zu erfüllen, wurde das entsprechende Plasmin aus vorgereinigtem Plasminogen durch Aktivierung mittels Streptokinase, oder durch Aktivierung mittels Urokinase oder Trypsin gewonnen.

Zu diagnostischen Zwecken kann die Lokalisierung von Fibrin enthaltenden Thrombi mittels Injektion von kleinen Mengen von radiomarkiertem Plasmin geschehen. Wegen der

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schnell hergestellten Verbindung zwischen dem radiomarkierten Plasmin mit dem fibrinösen Knollen, speziell im Vergleich mit solchen Substanzen wie radioiodiertes Fibrinogen, hat der Technetium-99m-Plasmintest gezeigt, dass er ein sehr sensitives und anwendungsreiches Verfahren darstellt, das gut geeignet ist für relativ schnelle Routine-Untersuchungen von Patienten, die entweder DVT schon haben oder solche entwickeln (siehe dazu British Journal of Radiology, Vol. 53 [1980], S. 673, J.M. Deacon et al.).

In der genannten Veröffentlichung wird auch ein Techne-tium-99m-Plasmin-Untersuchungs-Kit beschrieben, in dem das Plasmin, zusammen mit Natriumchlorid, mit Zinn(II)-chlorid gemischt, wobei die letztere Verbindung die "Tcm-Pertechnat reduzierende Verbindung darstellt. Diese für die Markierung von Plasmin mit Technetium-99m geeignete Methode wurde zuerst durch R.B.R. Persson and L. Darte (Int. Journal of Applied Radiation and Isotopes, Vol. 28 [1977], S. 97) beschrieben.

Der genannte Technetium-99m-Plasmin-Kit umfasst eine lyophilisierte Mischung von Plasmin mit Zinn(II)chlorid. Der Untersuchungssatz wurde eine Zeitlang an Spitäler abgegeben zur Evaluation der Methode und des Materials für die schnelle Untersuchung auf Anwesenheit von DVT. Das Material wurde geliefert durch die Novo Industri A/S, Copenhagen, unter dem Namen «Lysofibrin Kit für "Tcm-Markierung. Lysofibrin ist eine registrierte Handelsmarke für hochreines Schweineplasmin.

Es ist jedoch festgestellt worden, dass das Plasmin im genannten Untersuchungsmaterial nicht genügend stabil ist für die angegebene Verwendung. Das Material zeigt zwar keine Abnahme der Aktivität, wenn es bei Temperaturen unter -20 °C gelagert wird. In normalen Kühlschränken, d.h. bei Temperaturen von ungefähr 5 °C, zeigt das Plasmin des genannten Untersuchungsmaterials jedoch eine etwa 5%ige Abnahme der Aktivität pro Monat. Da aber die proteolytische Aktivität des Plasmins allem Anschein nach die wichtigste Voraussetzung ist für dessen Affinität gegenüber Fibrin, muss das Instabilitätsproblem gelöst werden, bevor die Untersuchungsmethode für allgemeine klinische Verwendung vertrieben wird.

Es ist ein Ziel dieser Erfindung, Plasmin-Kompositionen zu schaffen, welche sich für die Markierung mit Technetium— 99m eignen, die die obengenannten Nachteile nicht aufweisen.

Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung solcher Plasmin-Zusammensetzungen zu schaffen, durch welches das Plasmin derart stabilisiert wird, dass die Zusammensetzung für die gedachte Verwendung geeignet ist, und zwar während langer Zeitperioden und unter Raumbedingungen.

Die genannten Ziele werden durch die Anwendung der Entdeckung erreicht, wonach gewisse Polyhydroxyverbindun-gen, wenn sie in die genannte Zusammensetzung eingebaut werden, eine überraschende stabilisierende Wirkung auf das Plasmin zeigen, ohne substantiell weder in die Ausbeute des Markierungsverfahrens mit Technetium-99m noch in die Reinheit des erhaltenen Produktes negativ einzugreifen.

Glycerin ist bekannt als Stabilisator für Plasmin in wässri-gen Lösungen. Normalerweise wird es verwendet in Konzentrationen von ungefähr 50% der Lösung, d.h. im grossen Überschuss, bezogen auf Plasmin hinsichtlich Gewichtsbasis. In der hier beschriebenen Erfindung werden flüssige Poly-hydroxyverbindungen jedoch nicht berücksichtigt. Dies vor allem wegen der notwendigen Anwesenheit von stark reduzierenden Mitteln, welche unter einer eventuellen Veränderung der flüssigen Phase leiten könnten. Daher liegt die stabilisierte Piasminzusammensetzung gemäss dieser Erfindung in fester Form vor. Zusätzlich ist darauf hinzuweisen, dass die

Stabilisatoren, welche für Markierungszwecke geeignet sind, im allgemeinen physiologisch akzeptabel sein sollten. Ebenso sollten sie unter den normalen Markierungsbedingungen sich nicht mit dem Radionucleid verbinden. In unserem Fall sollten die Stabilisatoren also nicht stören bei der Markierung von Plasmin.

Polyhydroxyverbindungen wie Zucker oder Zuckeralkohole sind bekannt als Stabilisatoren für proteolytische Enzyme, speziell in flüssigen Formulierungen derselben. Bei solchen flüssigen Formulierungen wird angenommen, dass die Inaktivierung der Enzyme hauptsächlich durch deren Autodigestion herbeigeführt wird. Dahingegen war das durch diese Erfindung zu lösende Problem ein anderes, vor allem deswegen, weil die Plasmin-Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung in fester Form vorliegt und dann,

weil die genannten Zusammensetzungen bei sauren Bedingungen sowohl hergestellt, wie auch verwendet werden,

wobei das Plasmin darin proteolytisch inaktiv ist. Die Inaktivierung des Plasmins in solchen Zusammensetzungen muss also auf andere Faktoren, nicht auf Autodigestion, zurückgeführt werden.

Wie weiter unten dargelegt werden wird, ist überraschenderweise gefunden worden, dass die erfindungsgemäss einzusetzenden Polyhydroxyverbindungen die Aggregation des Plasmins entweder vollständig verhüten oder zumindest verringern. Da solche Plasmin-Aggregate anscheinend den ersten Schritt bei der Denaturierung von Plasmin darstellen, ist die Anwesenheit solcher Aggregate in den Zusammensetzungen gemäss dieser Erfindung unerwünscht.

Gemäss einem ersten Asepkt der vorliegenden Erfindung wird eine Plasmin-Zusammensetzung in fester Form geschaffen, welche sich für die Markierung mit Technetium-99m eignet.

Die erfindungsgemässe Plasmin-Zusammensetzung ist im ' vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert.

Gemäss des zweiten Aspektes dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung der genannten Plasmin-Zusam-mensetzung in fester Form geschaffen. Das erfindungsgemässe Verfahren ist im vorangehenden Patentanspruch 9 charakterisiert.

Gemäss einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein szintigraphisch auswertbares Messmedium geschaffen, das die erfindungsgemässe Plasmin-Zusammensetzung, markiert mit Technetium-99m, enthält und für diagnostische Zwecke eingesetzt wird.

Es ist daraufhinzuweisen, dass der Ausdruck «Plasmin» in dieser Beschreibung sowohl die Verbindung selbst wie auch alle daraus mittels Fragmentation abgeleiteten Verbindungen umfasst, die ihre biologischen Eigenschaften beibehalten. Ein Beispiel solcher Verbindungen ist «Miniplasmin», welches fibrinolytisch aktiv ist. Siehe dazu U. Christensen et al. (Biochim. Biophys. Acta 567 [1979], S. 472 bis 481).

Die Art und Herkunft des in der erfindungsgemässen Zusammensetzung eingesetzten Plasmins sind nicht kritisch. Das Plasmin kann aus Blutplasma verschiedener Säuger stammen, inkl. von Menschen. Bevorzugt wird hier aber hoch reines Schweineplasmin. Ein vorgereinigtes Plasminogen kann zum Beispiel mittels der Methode von D.G. Deutsch und E.T. Metz (Science, Vol. 170 [1970], S. 1095 bis 1096) erhalten werden. Die Umsetzung von Plasminogen in Plasmin mittels Aktivierung durch Urokinase kann beispielsweise gemäss der Methode von B. Wiman und P. Wallén (Europ. J. Biochemistry, Vol. 36 [1973], S. 25 bis 31), durchgeführt werden. Die entsprechende Methode mit Trypsin hat K. Jacobsen (Acta. Chem. Scand., Vol. 7 [1953], S. 430 bis 434) beschrieben. Eine bevorzugte Methode zur Herstellung von Plasmin umfasst die Lyophilisierung einer sauren, wässri-gen Plasmin-Lösung mit einer Aktivität von mindestens 3

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Novo-Einheiten/mg. Die Einheitsaktivität von Plasmin ist definiert als diejenige Einheit, welche unter spezifischen Bedingungen (beispielsweise 35 °C und pH 7,5) im Laufe von 20 Minuten aus einer Standardcasein-Vorlage eine derartige Menge von Perchlorsäure löslichen Peptiden bildet, welche eine Erhöhung des Absorbierungsgrades bei 275 nm von 1 entspricht. Für weitere Erläuterungen siehe Pharmaceutical Enzymes, Herausgeber: R. Ruyssen und A. Lauwers,

E. Story: Scientia 1978, S. 123 ff.

Eine Anzahl Pertechnat-reduzierender Verbindungen, sowohl organische wie anorganische, sind bekannt. Hingewiesen werden kann in diesem Zusammenhang auf zweiwertige Zinn-, Eisen- und Chromsalze von anorganischen Säuren. Speziell bevorzugt sind darin die Salze der Salzsäure, der Schwefelsäure oder der Ascorbinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden als Pertechnat reduzierende Mittel zweiwertige Zinnsalze, bevorzugterweise Zinn(II)chlorid eingesetzt.

Die Menge des Pertechnat reduzierenden Mittels in der erfindungsgemässen Zusammensetzung sollte so eingestellt sein, dass, unter ansonsten optimalen Markierungsbedingungen, wie sie weiter unten erläutert werden, die höchst mögliche Markierungsausbeute an Radionucleid erreicht werden kann; in unserem Fall Technetium-99m in einer kleineren als der + 7-Wertigkeit. Die reduzierende Verbindung sollte in einer derartigen Menge vorliegen, dass der genannte Zweck erfüllt wird. Ebenso ist, aber wegen der allgemeinen Toxizität der zweiwertigen Zinn- oder Chromsalze, auf einem möglichst tiefen Gehalt der genannten Verbindungen zu achten.

Die Menge des in den erfindungsgemässen Zusammensetzungen vorliegenden Zinn(II)chlorids sollte im Bereich zwischen 0,8 und 16, bevorzugterweise zwischen 2 und 8 Gew.-%, bezogen auf Plasmin, liegen. Die Menge Plasmin wird dabei berechnet auf der Basis eines Produktes mit einer Aktivität von 3,5 NU (Novo-Einheiten) pro mg. Dies gilt für alle folgenden Angaben betreffend Plasmin-Gehalte.

Das Gewichtsverhältnis von Polyhydroxyverbindung zu Plasmin in den erfindungsgemässen Zusammensetzungen sollte normalerweise im Bereich von 0,1:1 bis 10:1, bevorzugterweise von 0,5:1 bis 5:1 liegen. Die äusseren Begrenzungen für die genannten Verhältnisse sind gegeben durch das Erreichen und Halten eines genügend hohen Plasminstabilisie-rungseffekts. Dieser Effekt sollte genügen für alle praktischen Zwecke, d.h. für Bedingungen, bei denen das Produkt aufbewahrt und gehandhabt wird. Es kann hier darauf hingewiesen werden, dass keine der in den erfindungsgemässen Zusammensetzungen verwendeten Polyhydroxy-Verbindungen einen negativen Effekt auf die enzymatische Aktivität von Plasmin zeigt. Dies gilt bis zu einer Menge von 10 mal derjenigen von Plasmin.

Ein Einsatz an Polyhydroxy-Verbindungen von mehr als 10 mal die Piasminmenge ist nicht empfehlenswert, da für solche Zusammensetzungen der Punkt der maximalen Stabilität im allgemeinen überschritten ist.

Bei der praktischen Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung der Piasminzusammensetzungen wird dasselbe, zusammen mit der Pertechnat reduzierenden Verbindung und der stabilisierenden Polyhydroxy-Verbin-dung in destilliertem Wasser gelöst. Das Wasser wird dabei dauernd abgekühlt und deoxygeniert mittels Durchleiten von Stickstoff. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Pertechnat reduzierende Mittel ein zweiwertiges Zinnsalz, der pH der Lösung wird auf 3 eingestellt, wonach, aliquote Teile, je beispielsweise 35 NU enthaltend (etwa 10 mg Plasmin) in sterile Glasphiolen abgefüllt werden. Diese werden dann schnell eingefroren und der Inhalt lyophilisiert.

Mit Zinn(II)chlorid als Pertechnat reduzierende Verbindung wird die Markierung normalerweise bei pH 2,0 bis 2,2

ausgeführt. Eingesetzt wird normalerweise eine Lösung mit 0,5 mCi (18,5 MBq) Pertechnat pro Aktivitätseinheit-Plasmin. Das Pertechnat kann dabei auf einem kommerziell erhältlichen Generator mittels isotonischer Natriumchloridlösung eluiert werden. Weitere Details betreffend eine heute übliche Markierungsmethode können der Literatur entnommen werden, beispielsweise der Veröffentlichung von J.M. Deacon et al. (siehe weiter oben) oder derjenigen von L. Darte und R.B.R. Persson (Journal of Liquid Chromatography, Vol. 2 [1979], S. 499).

Die in der zuletzt genannten Veröffentlichung beschriebenen Methode zur Qualitätskontrolle (vor allem hinsichtlich der Ausbeute der Markierung und der radiochemischen Reinheit des Produktes) von mit Technetium-99m markierten plas-minhaltigen Präparaten ist auch anwendbar für die Bestimmung der Markierungsausbeuten mit den erfindungsgemässen Zusammensetzungen. Die Gelchromatographie-Scan-ning-Methode, bei welcher das markierte Präparat mittels einer mit Sephadex G-25 gefüllten Kolonne chromatographisch getrennt wird, hat sich als ausserordentlich günstig für diesen Zweck erwiesen. Bei der genannten Methode werden, nach der Beladung der Kontrolle, die verschiedenen radioaktiven Konstituenten, welche entlang der Kolonne verteilt sind, mittels szintigraphischer Messmethoden bestimmt und ihre Anteile anschliessend aus dem Szintigramm berechnet.

Eine Anwendung dieses Testverfahrens (sowie eine Variante davon), in welcher die Gelchromatographie durch Dünnschichtchromatographie ersetzt wird (siehe dazu Darte und Persson, supra) ergab, angewendet auf Plasmin-Präparate, die in Anwesenheit von verschiedenen Polyhydroxy-Verbindungen markiert worden waren, die Resultate der folgenden Tabelle I:

Tabelle I

Stabilisie- "Tcm-Markie- "Tcm-Markierung von rende Ver- rung der sta- Plasmin/Plasminogen in bindung bilisierenden Anwesenheit von 2,5 Teilen

Verbindung der stabilisierenden Verbindung

Markie

Interferenzen

rungs-

aufgrund der

ausbeute stabilisierenden

(%)

Verbindung

Pentite

Xylit keine

81

nicht feststellbar

Ribit keine

79

Hexite

Sorbit*

keine

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feststellbar

Mannit*

keine

70

Hexosen

Glukose keine

78

nicht feststellbar

Mannose keine

80

Galaktose keine

80

Fruktose keine

82

Sorbose keine

79

Hexosen

Disaccharide

Saccharose keine

87

nicht feststellbar

Maltose keine

82

Laktose*

feststellbar

-

Inositol

meso-Inositol keine

85

nicht feststellbar

In der veröffentlichten GB-Patentanmeldung Nr. 2 016 198 ist angegeben, dass bei pH 4 Glukose mit Techne-

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tium-99m zu 80% markiert wird. Es ist daher äusserst erstaunlich, dass die Polyhydroxy-Verbindungen in der erfindungsgemässen Zusammensetzung bei den dabei bevorzugten pH-Werten, d.h. pH 2,0 bis 2,2, praktisch nicht markiert werden.

Die Bildung von Piasminaggregaten wurde untersucht, indem Plasmin-Zusammensetzungen (markierte oder nicht markierte) einer DISC-Elektrophorese über Polyacrylamid (7,5%) bei pH 4,5 und einer Pufferlösung mit 3M-Harnstoff unterzogen wurde. Das Verfahren ist beschrieben durch . R. Mauerer in Disk Elektrophorese, Walter de Gruyter, Berlin 1968.

Die Tatsache, dass die elektrophoretischen Untersuchungen von markierten und nicht markierten Piasminpräparaten die gleichen Resultate ergaben, zeigt, dass die Markierung keine Umformungen im ursprünglichen Plasmin bewirkt. Die gleiche Untersuchung zeigt daher, dass entsprechende Präparate gemäss dem Stand der Technik, d.h. natriumchloridhal-tige, nach der Markierung eine bedeutende Umformung des Plasmins aufweisen. Ein weiteres Muster von 20 |xl wurde der Hochdruckflüssigkeitschromatographie unterzogen. Der Messapparat enthielt dabei eine Proteinanalysenkolonne 1-125 der Walter Associates, Inc., Mass., USA. Die Eluierung wurde mit Phosphorsäure (0,2 M) und einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,25 ml pro Min. ausgeführt. Der maximale Druck betrug dabei etwa 14 bar. Gemessen wurde die Absorption bei 276 nm. Das Chromatogramm wies ebenfalls auf eine ausgedehnte Umformung des Plasmin zu hochmolekularen Verbindungen oder Aggregaten hin. Zudem zeigten die Szintigramme der einzelnen Fraktionen (je 125 |il) eine ausgedehnte Markierung des aggregierten Plasmin.

Die Anwendung der gleichen Analyse auf Plasmin-Zusammensetzungen gemäss der vorliegenden Erfindung wies jedesmal auf eine substantielle Verringerung der Aggregationsbildung hin. Zudem zeigte es sich, dass der genannte inhibitorische Effekt dann optimal auftrat, wenn die stabilisierenden Verbindungen in den bevorzugten Konzentrationsbereichen gemäss dieser Erfindung lagen. Die analytischen Daten zeigten auch, dass die Markierung der erfindungsgemässen Zusammensetzungen hauptsächlich am ursprünglichen Plasmin geschah, wodurch markierte Zusammensetzungen von substantiell höherer, radiochemischen Reinheit erhalten werden im Vergleich zu denjenigen gemäss dem Stand der Technik.

Die höchste radiochemische Reinheit wurde erhalten bei Einsatz von Mono- und Disacchariden. Daher stellt diejenige Ausführungsform der erfindungsgemässen Zusammensetzungen mit Mono- oder Disacchariden die bevorzugte dar. Eine noch weiter bevorzugte Zusammensetzung ist diejenige, bei der die Polyhydroxy-Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe: Fruktose, Saccharose und Maltose.

Die Signifikanz dieser Erfindung wird unterstrichen durch Resultate aus anderen Untersuchungen, aus denen folgt, dass natives Plasmin eine wesentlich höhere Affinität gegenüber Fibrin zeigt als aggregiertes Plasmin. Zudem liegen gewisse Indikationen vor, dass der Effekt von aggregiertem Plasmin gegenüber demjenigen von nativem Plasmin hinsichtlich seiner Biodistribution verschieden ist. Das erste reichert sich vor allem in der Leber an, währenddem die zweite Form sich eher gleichmässig zwischen Leber und Niere verteilt. Die Bildung von Piasminaggregaten ist also auch hinsichtlich der Dosimetrie der Zusammensetzungen unerwünscht.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele weiter detailliert.

Beispiel 1

Eine Plasmin-Zusammensetzung mit einem Gewichtsverhältnis zwischen stabilisierender Polyhydroxy-Verbindung und Plasmin von 2,5:1 wurde wie folgt zubereitet:

500 ml destilliertes Wasser wurden mit 100 |il N-Salzsäure angesäuert und dann zur Entfernung des Sauerstoffs 30 Minuten lang auf dem Siedepunkt gehalten. Das Wasser wurde dann in eiskaltem Wasser abgekühlt und weiter sauerstofffrei gehalten mittels Durchspülen mit Stickstoff. Der pH wurde durch Zugabe von weiterer N-Salzsäurelösung auf 3,0 eingestellt.

2,50 g lyophilisiertes Plasmin (oder Fibrinolysin) mit einer Aktivität von mindestens 3 Novo-Einheiten/mg (geliefert von der Firma Sigma Chemical Co., MO, USA), 6,25 g stabilisierende Verbindung und 113 mg Zinn(II)chlorid-Dihydrat wurden eingewogen und im obengenannten Wasser gelöst. Nachdem der pH der Lösung wieder, mittels Salzsäure oder Natriumhydroxid, auf 3 eingestellt worden war, wurden je 1,0 ml Aliquote der erhaltenen Lösung in 5 ml Phiolen gegeben, die mit einem Schnellgefrier-Verschluss versehen waren. Die Inhalte der Phiolen wurden dann in Trockeneis schnell eingefroren und anschliessend lyophilisiert. Die Phiolen wurden nun in einer Stickstoffatmosphäre geschlossen und dann sofort verkapselt.

Mit den so erhaltenen Phiolem wurden Stabilitätsuntersuchungen gemacht, indem dieselben einen Monat lang bei 35 °C gelagert wurden. Anschliessend wurden darin die verbleibenden Piasminaktivitäten gemessen und dieselben mit entsprechenden Proben verglichen, welche bei — 20 °C gelagert worden waren. Zusätzlich wurden Vergleichsuntersuchungen gemacht mit entsprechenden Zusammensetzungen gemäss dem Stand der Technik, d.h. mit solchen, in denen die Polyhydroxy-Verbindungen durch je 14,5 mg Natriumchlorid ersetzt waren. Die entsprechenden Resultate sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt:

Tabelle II

Stabilisierende Verbindung Durchschnittl. Restaktivität (%)

Pentite

Xylit 73

Ribit 75

Hexosen

Glukose 95

Mannose 93

Galaktose 88

Fruktose 93

Sorbose 96

Hexosen Disaccharide

Saccharose 99

Maltose 100

Inositole meso-Inositol 95

Zusammensetzung gemäss dem Stand der Technik (NaCl) 35

Beispiel 2

Es wurden verschiedene Plasmin-Zusammensetzungen zubereitet, in denen die Plasmin- und Zinn(II)chlorid-Gehalte konstant gehalten wurden. Verändert wurden jeweils die Gewichtsverhältnisse von stabilisierender Verbindung zu Plasmin. Das Vorgehen zur Herstellung dieser Zusammensetzungen war dasselbe, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist.

Die genannten Verbindungen wurden mit Fruktose, Saccharose und meso-Inositol als Stabilisierungsverbindungen hergestellt. Wiederum wurde der Stabilitätstest gemäss Beispiel 1 ausgeführt. Die entsprechenden Resultate sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt:

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Tabelle III

Stabilisierende

Gewichtsverhältnis

Durchschnittl.

Verbindung

Stabilisierende Ver

Restaktivität (%) nach

bindung zu Plasmin

1 Monat bei 35 °C

Saccharose

0,5

99

1,5

103

2,5

103

5

99

10

102

Fruktose

0,5

95

2,5

93

5

75

meso-Inositol

0,5

96

2,5

95

10

92

Zusammenset

zung gemäss dem

Stand der Technik

(NaCl, 14,5 mg)

-

35

Beispiel 3

Miniplasminogen wurde hergestellt aus Schweineplasmi-nogen gemäss der Methode von L. Sottrup-Jensen et al. (Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3 ; Herausgeber J.F. Davidson et al., Raven Press, New York 1978, S. 200 ff). Die einzige Modifikation zur genannten Methode war die folgende: die Lösung mit dem Schweineplasminogen wurde vor der Umsetzung mit Elastase 2,5 mal mit Ammoniumkarbonatpufferlösung verdünnt. Die Konzentration der Elastaselösung und des Pankreas-Trypsininhibitors wurden auf dem in der Veröffentlichung genannten Werte belassen.

Die Umsetzung von Miniplasmogen zu Miniplasmin wurde gemäss der folgenden Veröffentlichung ausgeführt: U. Christensen et al., Biochim. Biophys. Acta, siehe weiter oben. Dadurch wurde schliesslich ein Präparat erhalten, das eine Piasminaktivität von 6,2 Novo-Einheiten (NU) pro mg aufwies.

Zwei Serien von Miniplasmin-Zusammensetzungen, die eine mit Saccharose und die andere mit Natriumchlorid, wurden gemäss dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellt. Die Zusammensetzungen mit Natriumchlorid entsprechen dabei denjenigen des Standes der Technik. Jede Phiole enthielt 6,2 mg Miniplasmin, was 11 mg Plasmin entspricht (3,5 NU/mg). Die anderen Konstituenten waren die folgenden:

Zusammensetzung

Saccharose1

(NaCl)2

Zinn(II)chlorid (mg)

0,45

Stabilisator (mg)

25

-

Natriumchlorid (mg)

-

14,5

pH vor der Lyophilisierung

3,0

2,0

Mit den genannten Proben wurden nun Stabilitätsuntersu-io chungen gemacht gemäss dem Verfahren, das im Beispiel 1 beschrieben ist. Ebenso wurden mit den gleichen Proben Markierungsversuche mit Technetium-99m ausgeführt, und zwar nach der Methode wie sie im folgenden Beispiel 4 dargelegt ist. Die Markierungsausbeute an den Miniplasmin-Prä-15 paraten wurde szintigraphisch bestimmt, wie dies weiter oben beschrieben ist. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt :

Zusammensetzung

Durchschnittl.

Markierungsaus

Restaktivität (%) nach beute (%)

1 Monat bei 35 °C

1 Saccharose

98

72

2 NaCl

92

65

Beispiel 4

Die Markierungsmethode war immer dieselbe, unabhän-30 gig von der in den verschiedenen Zusammensetzungen eingesetzten stabilisierenden Polyhydroxyverbindungen. In jede Phiole wurden, unter aseptischen Bedingungen, sterile Lösungen der folgenden Verbindungen in der folgenden Reihenfolge zugegeben:

35 Salzsäure (0,30 ml; 0,1 N),

"Tcm-Pertechnatlösung (1,00 ml, entsprechend ungefähr 15 mCi (550 BMq), eluiert aus einem kommerziell erhältlichen Pertechnat-Generator der The Radiochemical Centre, Ltd., Amersham, England, mit 0,9% Natriumchlorid und, 40 Natriumchloridlösung (2,20 ml ; 0,9%ig).

Die Phiolen wurden dann bei Raumtemperatur 1 Stunde stehengelassen; nach dieser Zeit war die Markierung in etwa beendet.

Die Gesamtaktivität der Phioleninhalte wurde anschlies-45 send szintigraphisch bestimmt. Die dem Patienten zu verabreichende Dosierung (normalerweise 0,5 mCi oder 18,5 MBq) kann aus der totalen Aktivität unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Halbwertzeit für "Tcm 6 Stunden ist, berechnet werden.

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PATENTANSPRÜCHE

1. Plasmin-Zusammensetzung mit einer ein Pertechnat reduzierenden Verbindung in fester Form, geeignet für die Markierung mit Technetium-99m, gekennzeichnet durch den Gehalt an einer das Plasmin stabilisierenden Polyhydroxyver-bindung aus der Gruppe der Pentite Xylit und Ribit, des meso-Inositols, der Monosaccharide Glukose, Mannose, Galaktose, Fruktose und Sorbose und der Disaccharide Saccharose und Maltose.
2. Plasmin-Zusammensetzung gemäss Patentanspruch 1, in der das Plasmin ein Schweineplasmin ist.
3. Plasmin-Zusammensetzung gemäss Patentanspruch 1, in der die das Pertechnat reduzierende Verbindung Zinn(II)-chlorid ist.
4. Plasmin-Zusammensetzung gemäss Patentanspruch 3, in der das Zinn(II)chlorid zu 0,8 bis 16 Gew.-% - bezogen auf das Plasmingewicht - vorliegt, wobei die Piasminmenge auf der Basis eines entsprechenden Produktes mit einer Aktivität von 3,5 Novo Einheiten/mg berechnet wird.
5. Plasmin-Zusammensetzung gemäss Patentanspruch 4, in der das Zinn(II)chlorid zu 2 bis 8 Gew.-% vorliegt.
6. Plasmin-Zusammensetzung gemäss einem der vorangehenden Patentansprüche, in der das Gewichtsverhältnis

PolyhydroxyVerbindung zu Plasmin im Bereich von 0,1 :l bis 10:1 liegt.
7. Plasmin-Zusammensetzung gemäss Patentanspruch 6, in der das genannte Gewichtsverhältnis im Bereich von 0,5:1 bis 5:1 liegt.
8. Plasmin-Zusammensetzung gemäss einem der vorangehenden Patentansprüche, in der die Polyhydroxyverbindung ein Mono- oder Disaccharid ist, vorteilhafterweise eines aus der Gruppe bestehend aus Fruktose, Saccharose oder Maltose.
9. Verfahren zur Herstellung der Plasmin-Zusammenset-zung in fester Form gemäss Patentanspruch 1, gekennzeichnet durch die Mischung von Plasmin, das Pertechnat reduzierende Verbindung und mindestens einer Plasmin stabilisierenden Polyhydroxyverbindung aus der Gruppe der Pentite Xylit und Ribit, des meso-Inositols, der Monosaccharide Glukose, Mannose, Galaktose, Fruktose und Sorbose und der Disaccharide Saccharose und Maltose in destilliertem Wasser und durch das anschliessende Lyophylisieren der Mischung zu einer festen Substanz.

Î0. Szintigraphisches Untersuchungsagens für diagnostische Zwecke, mit einer Plasmin-Zusammensetzung gemäss Patentanspruch 1, markiert mit Technetium-99m.