CH650273A5 - Plasminogenpraeparat und verfahren zu seiner herstellung. - Google Patents

Plasminogenpraeparat und verfahren zu seiner herstellung. Download PDF

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CH650273A5
CH650273A5 CH370/81A CH37081A CH650273A5 CH 650273 A5 CH650273 A5 CH 650273A5 CH 370/81 A CH370/81 A CH 370/81A CH 37081 A CH37081 A CH 37081A CH 650273 A5 CH650273 A5 CH 650273A5
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salt
plasminogen
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lysine
physiologically compatible
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Yahiro Uemura
Katsuhiro Uriyu
Satoshi Funakoshi
Ryozo Watanabe
Mitsuomi Ohgaki
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Description

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Plasminogen-präparate zu entwickeln, die eine verbesserte Beständigkeit gegen Inaktivierung aufweisen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, dass bestimmte Verbindungen als Stabilisatoren für Plasminogen wirken, und dass derart stabilisierte Plasminogenpräparate auch einer Wärmebehandlung oder Gefriertrocknung widerstehen.
Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Als Plasminogen enthaltende wässrige Lösungen können die verschiedensten Lösungen verwendet werden, beispielsweise Lösungen, die bei den verschiedenen bekannten Reinigungsverfahren aus plasminogenhaltigen Fraktionen anfallen, z.B. der Fraktion III, die bei der Alkoholfraktionierung bei niedriger Temperatur nach Cohn von Blutplasmaprotein anfällt, die allgemein zur Herstellung wichtiger biologischer Präparate, wie Serum, Plasma und Ascites menschlichen und tierischen Ursprungs anfallen, ferner z.B. Fibrinogen, Gammaglobulin und Albumin im Blutplasma. Das Plasminogen-Trockenpulver umfasst die Trockenpulver aus den vorstehend beschriebenen wässrigen Lösungen, insbesondere gefriergetrocknete Pulver.
Typische Beispiele für Verfahren zur Reinigung von rohem Plasminogen sind Verfahren unter Verwendung eines fixierten Plasminogenstabilisators (JP-OS 153 592/1980) und die Verwendung von Lysin-Sepharose; vgl. Science, Bd. 170, (1970), S. 1095.
Als Plasminogenstabilisatoren werden erfindungsgemäss physiologisch verträgliche anorganische Salze, Lysin und dessen Salze, Phenylmethansulfonylfluorid, Aprotinin und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor verwendet. Diese Stabilisatoren können allein oder in Kombination verwendet werden.
Erfindungsgemäss kann jedes anorganische Salz verwendet werden, sofern es physiologisch verträglich ist. Spezielle Beispiele sind Alkalimetallsalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie Magnesium- und Calciums-alze und Ammoniumsalze von Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Borsäuren (Orthoborsäure, Metaborsäure und Tetraborsäure) und Phosphorsäuren (Pyrophosphorsäure, Orthophosphorsäure und Meta-phosphorsäure). Bevorzugte Beispiele für verwendbare Salze sind NaCl, KCl, MgCh, (NHO2SO4, Na2S04, Na2B407, KH2HPO4, K2HPO4, NaH2PC>4 und Na2HPC>4.
Erfindungsgemäss können auch Lysinsalze verwendet werden, sofern sie physiologisch verträglich sind, beispielsweise Alkalimetallsalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, und Erdalkalimetallsalze, wie Magnesium- und Calciumsalze.
Die wirksame Menge des zuzusetzenden Plasminogenstabilisators hängt von der Menge des Plasmins im Plasminogen-
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präparat und der Art des Stabilisators ab. Die stabilisierende Wirkung nimmt im Falle von Lysin mit ansteigenden Mengen zu. Die Menge des Stabilisators hängt jedoch vom beabsichtigten Verwendungszweck des Plasminogenpräparats ab. Zur Untersuchung der Fibrinolyse ist die Konzentration des Stabilisators vorzugsweise niedriger als der niedrigste Wert, bei dem Fibrinolyse bewirkt wird. Für medizinische Zwecke, d.h. zur Verwendung als Arzneistoff, bei dem das Plasminogenpräparat energischen Behandlungen ausgesetzt wird, beispielsweise einem lOstündigen Erhitzen auf 60 °C zur Inakti-vierung von Viren, wird eine grosse Menge des Stabilisators zugesetzt, und nach der Behandlung des Präparats wird der Stabilisator durch Dialyse oder andere geeignete Methoden abgetrennt. Bei Verwendung von PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid), Aprotinin oder Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor wird deren Menge derart bemessen, dass als Verunreinigung vorliegendes Plasmin vollständig gehemmt wird.
Die speziellen Konzentrationen der erfindungsgemäss verwendeten Stabilisatoren sind nachstehend angegeben. Für wässrige Lösungen von Plasminogen wird ein physiologisch verträgliches anorganisches Salz in einer Endkonzentration von 0,002 bis 0,4 M, vorzugsweise 0,01 bis 0,3 M und insbesondere von 0,05 bis 0,2 M, Lysin in einer Konzentration von 0,001 bis 5 Gew.-%/Vol.-%, PMSF in einer Konzentration von 0,01 bis 100 mMol, Aprotinin in einer Konzentration von 0,1 bis 1000 KIU/ml und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in einer Konzentration von 1 bis 1000 BAEEU/ml verwendet. Für Plasminogen-Trockenpulverpräparate wird das physiologisch verträgliche anorganische Salz in einer Endkonzentration von 0,01 bis 10 Gew.-%, Lysin in einer Endkonzentration von 0,01 bis 10 Gew.-%, PMSF in einer Endkonzentration von 0,01 bis 10 Gew.-%, Aprotinin in einer Endkonzentration von 0,01 bis 1000 KIU/mg und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in einer Endkonzentration von 0,1 bis 1000 BAEEU/mg verwendet.
Plasminogen wird leicht bei seiner Herstellung inaktiviert, insbesondere beim Erhitzen oder Gefriertrocknen. Deshalb wird das erfindungsgemässe Verfahren zum Stabilisieren von Plasminogen vorzugsweise nicht nur bei der Wärmebehandlung einer Plasminogen enthaltenden wässrigen Lösung oder beim Gefriertrocknen dieser wässrigen Lösung angewendet, sondern bei allen Herstellungsstufen. Im Falle einer Wärmebehandlung einer plasminogenhaltigen wässrigen Lösung zur Inaktivierung von Viren, beispielsweise beim lOstündigen Erhitzen auf 60 °C, wird die Wärmebehandlung nach Zusatz des Stabilisators und einer Einwirkungs- bzw. Behandlungsdauer von 20 bis 60 Minuten bei 4 bis 37 °C und einem pH-Wert von 2 bis 4 durchgeführt.
Die erfindungsgemäss verwendeten Stabilisatoren können nach der Behandlung in den Präparaten verbleiben. Dies trägt zur Erhöhung der Stabilität des Plasminogens beim Stehen bei.
Es liegt auf der Hand, dass das erfindungsgemässe Verfahren nicht nur bei der Herstellung von Plasminogenpräpa-raten, sondern auch in anderen Fällen brauchbar ist, bei denen es auf die Stabilisierung von Plasminogen ankommt. Durch das erfindungsgemässe Verfahren gelingt es, die Stabilität von Plasminogen auf seinen verschiedenen Produktionsstufen, einschliesslich der Wärmebehandlung, Gefriertrocknung und anderen Arbeitsgängen zu erhöhen und auf diese Weise den Verlust an Plasminogen auf ein Mindestmass zu beschränken. Die erfindungsgemäss erhaltenen Plasminogen-präparate zeichnen sich durch eine hohe Lagerstabilität aus.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wird die Aktivität von Plasminogen durch die Casein-Einheit (CU; Vox Sang., Bd. 5 (1960), S. 357 bis 376) die Aprotinin-Aktivität durch die KIU-Einheiten (vgl. E.K. Frey, H. Kraut und E. Werle, Kallikrein (Padutil), 1950, Enke Verlag, Stuttgart) und die Aktivität von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor durch die BAEEU-Einheiten (vgl. M. Laskowski, Method in Enzymology, Bd. 2, S. 37, herausgegeben von S.P. Colowick und N.O. Kaplan, New York, Academic Press, Inc.) ausgedrückt.
Dabei bedeutet 1 KIU-Einheit die Menge Aprotinin, die nötig ist, um die Aktivität von zwei Einheiten Kallidinoge-nase (Kallikrein) bei einem pH-Wert von 8 und bei Raumtemperatur während zwei Stunden auf eine einhalb Mal so grosse Menge zu verringern.
I BAEEU-Einheit bedeutet die Menge von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, um eine BAE-Einheit Trypsin zu inhibitie-ren, während eine BAE-Einheit die Menge Trypsin angibt, die nötig ist, um 1 Mikromol Alpha-Benzoyl-L-Alginin-Äthyl-Ester bei 25 °C und bei einem pH-Wert von 7,6 während einer Minute zu zersetzen.
Beispiel 1
Stabilisierung einer Plasminogenlösung
Verschiedene Inhibitoren werden einer wässrigen Lösung von 100 CU/ml Plasminogen in Tris-HCl-Puffer (pH 7,8) zugesetzt. Die Lösungen werden in einem Thermostat bei 37 °C stehengelassen, um die Stabilität zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst.
Tabelle I
Inhibitor
Endkonzen
Restliche Aktivität nach
tration
24stündigem Stehen bei 37 °C, %
Lysin
0,1%'
95
Lysin
1,0%
96
PMSF
0,1 mM
98
PMSF
1 mM
98
Aprotinin
1 KIU/ml
89
Aprotinin
10 KIU/ml
95
Sojabohnen-
Trypsin-Inhibitor
10 BAEEU/ml
88
Sojabohnen-
Trypsin-Inhibitor
100 BAEEU/ml
92
kein Zusatz
-
43
Beispiel 2
Stabilisierung von gefriergetrocknetem Plasminogen
Die gemäss Beispiel 1 hergestellten Lösungen mit den verschiedenen Inhibitoren werden gefriergetrocknet. Die erhaltenen gefriergetrockneten Präparate werden 1 Monat in einem Thermostat bei 50 °C oder 3 Monate bei Raumtemperatur aufbewahrt, um die Stabilität zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst.
Tabelle II
Inhibitor Restliche Aktivität bei Restliche Aktivität nach
1 monatigem Stehen bei 3monatigem Stehen bei 50 0 C, % Raumtemperatur, %
Lysin 97 96
PMSF 94 93
Aprotinin 91 90
Sojabohnen-
Trypsin-Inhibitor 93 91
kein Zusatz 32 25
Beispiel 3
Die nach der Fraktionierungsmethode von Cohn mit kaltem Äthanol erhaltene Fraktion III wird in einer wässrigen Lösung suspendiert, die 1 Gew.-%/Vol.-% Natriumchlorid
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10
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4
enthält. Danach wird die Suspension einige Zeit gerührt. Hierauf wird der Überstand zentrifugiert. Nach der Methode von D.G. Deutsch u. Mitarb., Science, Bd. 170 (1970), S. 1095, wird der Überstand auf eine Lysin-Sepharose-Säule gegeben, um das Plasminogen zu adsorbieren. Sodann werden als Verunreinigungen vorliegende Proteine mit physiologischer Kochsalzlösung ausgewaschen. Hierauf wird das adsorbierte Plasminogen mit einer wässrigen Lösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,002 M c-Aminocapronsäure und 1% Natriumchlorid enthält.
Nach dem Dialysieren gegen destilliertes Wasser wird die gereinigte Plasminogenlösung in zahlreiche Proben unterteilt, die ihrerseits in vier Gruppen unterteilt wurden. Diese Gruppen wurden unter folgenden Bedingungen behandelt:
Bedingung Den Proben dieser Gruppe werden verschiedene D Stabilisatoren einverleibt, und die erhaltenen
Lösungen werden 10 Stunden auf 60 °C erhitzt. Bedingung Den Proben dieser Gruppe werden verschiedene B Stabilisatoren einverleibt. Die erhaltenen
Lösungen werden 30 Minuten bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 3,0 stehengelassen. Hierauf werden die Proben 10 Stunden auf 60 °C erhitzt.
Bedingung Die Proben dieser Gruppe werden 30 Minuten C bei einem pH-Wert von 3,0 stehengelassen.
Sodann werden die Proben mit Stabilisatoren versetzt und die erhaltenen Lösungen werden 10 5 Stunden auf 60 ° C erhitzt.
Bedingung Die Proben dieser Gruppe werden mit A verschiedenen Stabilisatoren versetzt, jedoch keiner weiteren Behandlung unterworfen.
io Danach wird die restliche Aktivität der Proben bestimmt.
Die Überstände der unter den Bedingungen D, B, C und A erhaltenen Proben werden auf einen pH-Wert von 7,0 ± 0,2 eingestellt. Sodann wird die restliche Aktivität dieser Überstände bestimmt.
15 Die Proben der unter der Bedingung B erhaltenen Lösungen werden gefriergetrocknet (Bedingung E) und die restliche Aktivität wird bestimmt.
Die Proben der Bedingung E werden nach 6monatiger Lagerung bei 4 °C (Bedingung F) untersucht. 20 Die Aktivitätsbestimmung erfolgt nach der Casein-Spal-tungsmethode gemäss Sgouris u. Mitarb., Vox Sang., Bd. 5 (1960), S. 357. In Tabelle III ist die restliche Aktivität der verschiedenen Proben zusammengefasst, die bei der Behandlung unter den sechs Bedingungen erhalten werden. Die restliche 25 Aktivität wird in % bezogen auf die Aktivität eines nicht erhitzten, keine Zusatzstoffe enthaltenden Plasminogenpräpa-rats ausgedrückt.
Tabelle III
Restliche Aktivität in % nach Behandlung unter verschiedenen Bedingungen
Zusatzstoff Konzentration Bedingung A Bedingung B Bedingung C Bedingung D Bedingung E Bedingung F
kein Zusatz
100
27
27
20
-
NaCl
(0,05 M)
100
72
25
23
-
NaCl
(0,10 M)
100
90
30
35
9!
90
NaCl
(0,15 M)
100
95
24
25
94
93
KCl
(0,10 M)
97
88
32
25
88
87
(NH4>SC>4
(0,02 M)
97
80
33
35
81
80
(NH4>S04
(0,05 M)
95
95
25
27
93
94
(NH4)2S04
(0,10 M)
100
95
25
20
94
93
Na2SC>4
(0,02 M)
98
77
17
23
76
77
Na2SC>4
(0,05 M)
100
85
17
26
84
83
Na2SC>4
(0,20 M)
100
90
20
' 30
91
90
Na2B4C>7
(0,10 M)
99
92
20
27
90
89
KH2PO4
(0,02 M)
95
85
25
24
83
84
KH2PO4
(0,05 M)
97
96
25
31
94
93
KH2PO4
(0,15 M)
95
96
27
35
94
94
Lysin
(0,003 M)
95
89
28
25
87
86
CHaCOONa
(0,10 M)
97
40
12
30
-
-
Glucose
(0,10 M)
98
15
11
27
-
-
Glycin
(0,10 M)
95
17
10
25
-
-
Mannit
(0,10 M)
98
15
25
25
-
-
Na-citrat
60,50 M)
-
22
10
15
-
-
Na-caprylat
(0,10%)
-
17
10
20
-
-
Polyäthylen-
glykol-400
(2,0%)
35
30
25
-
-
Aus Tabelle III lässt sich folgendes entnehmen: Plasminogenlösungen kurz nach Zusatz des Stabilisators zeigen eine Aktivität von 95 bis 100%, d.h. praktisch weder eine Aktivitätszunahme noch eine Aktivitätsabnahme (Bedingung A).
Plasminogenlösungen mit den Stabilisatoren der Erfindung, die 30 Minuten bei einem pH-Wert von 3,0 behandelt und 10 Stunden auf 60 °C erhitzt worden waren, behalten die Aktivität praktisch bei, auch wenn der pH-Wert auf den Neutralbereich wieder eingestellt wird. Demgegenüber werden bei 65 Plasminogenlösungen, die in gleicher Weise behandelt worden waren, jedoch keinen Zusatzstoff oder nur Essigsäure Glucose, Glycin, Natriumeitrat, Natriumcaprylat oder Poly-äthylenglykol-4000 enthielten, nach der pH-Werteinstellung
5
650 273
auf Neutralbereich grosse Mengen an unlöslichen Substanzen und die Aktivität der Überstände ist sehr niedrig (Bedingung B).
Plasminogenlösungen, die vor dem Zusatz des Stabilisators 30 Minuten bei einem pH-Wert von 3,0 behandelt worden waren, liefern grosse Mengen an unlöslichen Substanzen nach dem Erhitzen oder nach der pH-Wert-Einstellung auf den Neutralbereich, selbst wenn sie mit der gleichen Menge an Stabilisator versetzt worden sind, wie bei der Bedingung B und die restliche Aktivität der Überstände ist niedrig (Bedingung C).
Beim lOstündigen Erhitzen auf 60 °C unmittelbar nach Zusatz des Stabilisators bilden sich grosse Mengen an unlöslichen Substanzen, wenn der pH-Wert der Lösung auf den Neutralbereich zurückgestellt wird, und die restliche Aktivität des Überstands ist niedrig (Bedingung D).
Aus den vorstehend mitgeteilten Ergebnissen ist ersichtlich, dass vor dem lOstündigen Erhitzen auf 60 °C die Plasmi-
nogen-Stabilisatorlösung einer 20- bis 60minütigen Behandlung bei 4 bis 37 °C und einem pH-Wert von 2 bis 4 unterworfen werden soll.
Die restliche Aktivität der erhaltenen Präparate, die durch 5 Gefriertrocknen der unter der Bedingung B behandelten Plasminogenlösungen erhalten worden sind, ist nahezu unverändert, d.h. es wird keine Inaktivierung bei der Gefriertrocknung beobachtet (Bedingung E).
Die gefriergetrockneten Präparate sind auch nach 6mona-lo tiger Lagerung bei 4 °C stabil und zeigen keine Änderung der Aktivität (Bedingung F).
Die gefriergetrockneten Präparate zeigen keinen Aktivitätsverlust nach dem Auflösen in destilliertem Wasser für Injektionszwecke. Jeweils 1 ml der Lösung wird Mäusen mit 15 einem Körpergewicht von 20 + 2 g injiziert, und die Mäuse werden 7 Tage beobachtet. Während dieser Zeit sind keine anormalen Symptome festzustellen.
G

Claims (13)

650 273
1. Plasminogenpräparat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Plasminogen sowie an mindestens einem physiologisch verträglichen anorganischen Salz, Lysin oder dessen Salz, Phenylmethansulfonylfluorid, Aprotinin oder Sojaboh-nen-Trypsin-Inhibitor als Stabilisatoren.
2. Plasminogenpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das physiologisch verträgliche anorganische Salz ein Alkali- oder Erdalkalimetallsalz oder ein Ammoniumsalz der Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Borsäuren oder Phosphorsäuren ist.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Plasminogenpräparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das physiologisch verträgliche anorganische Salz NaCl, KCl, MgCh, (NH^SO-t, Na2SC>4, Na2B407, KH2PO4, K2HPO4, NatLPCh oder Na2HP04 ist.
4. Plasminogenpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lysinsalz ein Alkali- oder Erdalkalimetallsalz ist.
5. Plasminogenpräparat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalimetallsalz das Natrium- oder Kaliumsalz und das Erdalkalimetallsalz das Magnesiumoder Calciumsalz ist.
6. Plasminogenpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat in Form einer wässrigen Lösung vorliegt und die physiologisch verträglichen anorganischen Salze eine Konzentration von 0,002 bis 0,4, Lysin oder dessen Salze eine Konzentration von 0,001 bis 5 Gew.-%/Vol.-%, Phenylmethansulfonylfluorid eine Konzentration von 0,01 bis 100 mMol, Aprotinin eine Konzentration von 0,1 bis 1000 KIU/ml und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor eine Konzentration von 1 bis 1000 BAEEU/ml aufweisen.
7. Plasminogenpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat in Form eines Trockenpulvers vorliegt und die Konzentrationen der physiologisch verträglichen anorganischen Salze 0,01 bis 10 Gew.-%, von Lysin 0,01 bis 10 Gew.-%, von Phenylmethansulfonylfluorid 0,01 bis 10 Gew.-%, von Aprotinin 0,01 bis 1000 KIU/mg und von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor 0,1 bis 1000 BAEEU/mg betragen.
8. Verfahren zur Herstellung eines Plasminogenpräparats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Plasminogenlösung mit mindestens einem physiologisch verträglichen anorganischen Salz, Lysin oder dessen Salz, Phenylmethansulfonylfluorid, Aprotinin oder Sojaboh-nen-Trypsin-Inhibitor als Stabilisatoren versetzt, die erhaltene Lösung während 20 bis 60 Minuten bei einer Temperatur von 4 bis 37 °C und einem pH-Wert von 2 bis 4 behandelt und sodann 10 Stunden auf 60 °C erhitzt und die erhaltene Lösung gefriertrocknet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als physiologisch verträgliches anorganisches Salz ein Alkali- oder Erdalkalimetallsalz oder ein Ammoniumsalz der Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Borsäuren oder Phosphorsäuren verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als physiologisch verträgliches anorganisches Salz NaCl, KCl, MgCh, (NH4)iS04, NazSCh, Na2B4Cb, KH2PO4, K2HPO4, NaH2PC>4 oder Na2HP04 verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als Lysinsalz ein Alkali- oder Erdalkalimetallsalz verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als Alkalimetallsalz das Natrium- oder Kaliumsalz und als Erdalkalimetallsalz das Magnesium- oder Calciumsalz verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das physiologisch verträgliche anorganische Salz, eine Konzentration von 0,002 bis 0,4, Lysin oder dessen Salz eine
Konzentration von 0,001 bis 5 Gew.-%/Vol.-%, Phenylmethansulfonylfluorid eine Konzentration von 0,01 bis 100 mMol, Aprotinin eine Konzentration von 0,1 bis 1000 KIU/ml und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor eine Konzentration von 1 bis 1000 BAEEU/ml aufweisen.
Plasminogen wird durch Urokinase oder durch Streptokinase aktiviert und in Plasmin überführt. Plasmin bewirkt die Proteolyse des Fibrins zu löslichen Substanzen, d.h. es wird Fibrinolyse bewirkt. Plasminogen wird zusammen mit Urokinase und mit Streptokinase als Arzneistoff zur Behandlung von Thrombosen eingesetzt. Es ist bekannt, dass Plasminogen unter bestimmten Bedingungen inaktiviert wird, beispielsweise durch Wärmebehandlung oder Gefriertrocknung oder bei längerer Lagerung.
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