CH650528A5 - Procedimento per la produzione di uricasi. - Google Patents
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Description
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la produzione dell'enzima uricasi (EC 1.7.3.3.) altamente attivo, e utilizzabile in diagnostica clinica per la determinazione di acido urico nel siero o nelle urine.
L'uricasi è un enzima che catalizza l'ossidazione dell'acido urico ad allantoina e non è presente nei tessuti dei mammiferi superiori tra cui l'uomo; è invece presente nei tessuti, specialmente degli organi interni, di mammiferi inferiori e in quantità più o meno elevata in alcuni microorganismi. È stato ora trovato, e ciò costituisce un primo oggetto della presente invenzione, che l'uricasi può essere prodotta dal Micrococcus roseus, microorganismo fino ad ora non noto come produttore di detto enzima e che inoltre possiede, rispetto agli altri microorganismi noti, il vantaggio di produrre elevate quantità di uricasi in terreni contenenti basse concentrazioni di acido urico. È stato inoltre sorprendentemente osservato che l'optimum di attività del-l'uricasi prodotta dal M. roseus NRRL B 12196 è, a differenza della uricasi prodotta da altri batteri, vicino ai valori di pH dei liquidi fisiologici; ciò rappresenta un vantaggio in quanto non è necessario modificare il pH del campione biologico in cui si vuole determinare l'acido urico, eliminando così possibili rischi di alterazione chimica del campione in esame. Questo microorganismo è stato isolato da terreno agrario nei pressi di Monterotondo (Roma) e possiede le seguenti caratteristiche morfologiche e biochimiche.
Morfologia microscopica
Sfere di 1-1,25 [Jtm di diametro, immobili e Gram positive, formano, dividendosi su più di un piano, dei pacchetti cubici o raggruppamenti irregolari; talvolta appaiono a coppie oppure isolate.
Morfologia macroscopica
— Colonie su agar nutriente: sollevate, margine intiero, color rosa, superficie liscia, 1-2 mm di diametro
— slant di agar nutriente: patina di color rosa pallido, liscia, lucida.
Caratteristiche biochimiche
— Crescita in glucose broth: leggera torbidità con deposito mucoide lievemente roseo, pH = 6,5
— Cresce a 10°C, non a 45°C, ottimo tra 25 e 35°C.
— Cresce con glucose broth contenente NaCl al 5 e al 10%, non al 15%
— Non cresce in Simmons citrate agar
— Produzione aerobica di acidità da zuccheri in Purple broth base (DIFCO): xilosio, glicerolo, mannitolo, lattosio,
maltosio, sorbosio, ribosio, arabinosio, raffinosio, cellobo-sio, negativi; glucosio, saccarosio, fruttosio leggera acidificazione ritardata (7-10 giorni).
— Idrolisi arginina negativa s — Idrolisi amido positiva
— Idrolisi gelatina negativa
— Ureasi positiva
— H2S: negativo
—■ catalisi: positiva io — nitratasi: positiva
— indolo: negativo
— acetoina: negativa
— Rosso metile: negativo
— lecitinasi: negativo i5 — lipasi (burro e olio d'oliva): negativo.
Confrontando queste caratteristiche con le descrizioni del Bergey's Manual of Determinative Bacteriology Vili Ed. il microorganismo secondo la presente invenzione appartiene alla famiglia delle Micrococcacee, genere Micro-20 coccus, specie roseus. Esso è stato depositato il 20.6.1980 presso il «Northern Regional Research Center» di Peoria (Illinois, USA) dove ha assunto la sigla NRRL B-12196.
La coltivazione del Micrococcus roseus NRRL B-12196 può essere eseguita in condizioni aerobiche con qualsiasi 25 metodo noto: p. es. in colture di superficie, o, preferibilmente, in coltura sommersa usando fermentatori agitati. Il terreno di coltura, che può essere solido o liquido, contiene una fonte di carbonio assimilabile, una fonte di azoto, di fosforo, nonché sali minerali e vitamine.
30 Le colture possono essere ottenute a temperature comprese tra i 10°C e i 40°C preferibilmente tra 25 e 35°C in un tempo tra 10 e 48 ore, preferibilmente tra 20 e 30 ore ad un pH tra 6 e 9, preferibilmente 7 8.
Come fonti di carbonio possono essere utilizzati ad esem-35 pio: glucosio, lattato, acetato, saccarosio, fumarato, acido urico, corn steep liquor, glicerina.
Come fonti di azoto possono essere utilizzati ad esempio: idrolizzati di carne, di caseina, o soia, sali ammoniacali, urea, nitrati, acido urico.
« L'estrazione, ed eventualmente la purificazione, della uricasi dalla pasta batterica viene effettuata con i comuni metodi usati in enzimologia. L'uricasi estratta da Micrococcus roseus NRRL B-12196 può essere vantaggiosamente immobilizzata in matrice polimeriche mediante formazione 45 di legami chimici con la matrice, oppure legami di tipo ionico, oppure mediante semplice immobilizzazione fisica. Gli esempi che seguono evidenziano altre modalità operative concernenti la presente invenzione, ma non solo limitanti di essa.
50
Esempio 1
Si prepara un brodo di coltura avente la seguente composizione:
estratto di lievito 15 g/1
55 acido urico 2 gì
Il pH veniva aggiustato a 7,2 con NaOH ed il terreno distribuito in porzioni da 200 mi in beute da 500 mi. Dopo sterilizzazione a 116°C per 30', le beute venivano inoculate con una coltura del ceppo NRRL B-12196 la slant conte-60 nente lo stesso terreno con il 2% di agar e incubate per 24 ore a 30°C sotto agitazione orbitale (220 rpm). Le cellule venivano quindi raccolte per centrifugazione; da 200 mi di brodo si ottenevano 3 g di pasta (peso umido). La pasta cellulare così ottenuta veniva sospesa in 60 mi di tampone «s fosfato 0,1 M pH = 8,5 e passata alla French Pressure Celi Press, fino a completa rottura delle cellule. Nell'estratto così ottenuto veniva determinata l'attività enzimatica: 1 g di cellule umide conteneva 100 unità uricasiche.
3
650528
Dosaggio dell'uricasi.
L'attività uricasica veniva determinata per via spettrofotometrica seguendo la scomparsa di acido urico a 283 nm secondo il metodo descritto da Mahler et al. (J. Biol. Chem. 1955, 216, 625) modificato come di seguito riportato: 7 mi di una soluzione contenente 20 mg di acido urico in 100 mi di tampone fosfato 0,1 M pH 8,5 venivano messi in una beutina da 50 mi e posti a incubare a 30°C in un bagno ad acqua agitato. La reazione aveva inizio con l'aggiunta di una. appropriata quantità di estratto enzimatico. Subito dopo l'aggiunta dell'estratto così come dopo 10' di reazione venivano prelevati 0,5 mi di miscela di reazione e addizionati a 4 mi di HCl 0,1 M. L'assorbanza delle soluzioni così ottenute veniva letta a 283 nm. Viene definita unità uricasica la quantità di enzima capace di degradare 1 [xmole di acido urico per minuto nelle condizioni del saggio sopradescritte.
Esempio 2
Veniva preparato un estratto di cellule di M. roseus NRRL B-12196 come descritto nell'esempio 1.
L'estratto grezzo veniva centrifugato e sul sovranatante veniva determinata l'attività uricasica come sopra descritto, utilizzando acido urico disciolto in soluzioni di fosfati a 0,1 M a diversi pH, come miscela di reazione. Venivano anche determinate in parallelo le attività di estratti enzimatici
5 ottenuti da colture di Bacillus fastidiosus nelle stesse condizioni sperimentali adottate per il M. roseus. I risultati ottenuti sono riportati in tabella 1 dove sono state riportate uguali a 100 le attività a pH 9 degli estratti dei due microorganismi.
io
TABELLA 1
Attività uricasiche relative in funzione del pH in estratti di B. fastidiosus e M. Roseus i5 pH miscela Estratto di Estratto di di reazione M Roseus B. fastidiosus
6,5
71
13,5
7,0
94
35
7,5
103
57
2o 8,0
106
85
8,5
103
95
9,0
100
100
v
Claims (5)
1. Procedimento per la produzione di uricasi consistente nel coltivare il microorganismo Micrococcus roseus NRRL B-12196 in condizioni aerobiche in presenza di un terreno di coltura contenente una fonte di carbonio assimilabile, una fonte di azoto, una fonte di fosforo e sali minerali.
2. Procedimento per la produzione di uricasi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la temperatura della coltura è compresa tra 10 e 40°C.
2
RIVENDICAZIONI
3. Procedimento per la produzione di uricasi secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che la temperatura della coltura è preferibilmente compresa tra 25 e 35°C.
4. Procedimento per la produzione di uricasi secondo le rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il pH del mezzo di coltura è compreso tra 6 e 9.
5. Procedimento per la produzione di uricasi secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che il pH del mezzo di coltura è preferibilmente compreso tra 7
e 8.
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