CH650593A5 - Verfahren zur herstellung eines antigens und seine verwendung zur produktion eines antiserums. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung neuer Antigene, wobei die erhaltenen Antigene 25 zur Herstellung vonAntiseren nützlich sind. Diese Antiseren können für Schwangerschaftstests beim Menschen eingesetzt werden. Die Antiseren, die immunologisch mit Human-Cho-rion-Gonadotropin reagieren, weisen keine oder nur eine reduzierte immunologische Kreuzreaktivität mit Human-lu-30 teinisierendem-Hormon auf.

Human-Chorion-Gonadotropin (nachstehend als hCG bezeichnet), ist ein Hormon, welches durch die Placenta während der Schwangerschaft produziert wird. Die Gegenwart dieses Hormons im Serum und Urin bildet deshalb ein Indiz 35 für eine Schwangerschaft. Die Gégenwart dieses Hormons wurde bisher nachgewiesen mit Hilfe seiner Wirkung auf die Ovarien von Tieren und kürzlich durch Immunotests.

Da jedoch die bisher verwendeten Tests keine genügende Unterscheidung zwischen hCG und anderen Hormonen wie « luteinisierendem Hormon erlauben, kann die Gegenwart von hCG erst einige Wochen nach Befruchtung nachgewiesen werden, weil dann der Spiegel von hCG genügend hoch ist, so dass andere Hormone nicht mehr stören.

Die Verwendung von speziellen Verfahren wie Radioim-45 munotests war ebenfalls nicht von praktischem Wert, da die verwendeten Antisera zu hCG nicht nur reaktiv mit hCG sind, sondern ebenfalls mit anderen Hormonen, wie human-luteinisierendes Hormon (hLH), follikelstimulierendes Hormon und thyroidstimulierendes Hormon. Dies tritt deshalb so auf, weil die Isoimmunisierung mit hCG in der Produktion von Antikörpern resultiert, welche mit hLH, follikelstimulierendem Hormon und thyroidstimulierendem Hormon kreuzreagieren. Diese Hormone gleichen einander in der Weise, dass sie aus zwei nicht-kovalent gebundenen Untereinheiten 55 a und ß bestehen. Die a-Untereinheiten sind nahezu identisch und die ß-Untereinheit sind hormonspezifisch und strukturell verschieden. Die Verwendung der ß-Untereinheit von hCG (hCG-ß) als Antigen liefert ein Antiserum mit verbesserter Spezifität, welches jedoch immer noch deutliche Kreuzreakti-60 vität mit hLH aufweist. Die molekulare Basis für diese Kreuzreaktivität ist die Homologie in den Aminosäuresequenzen von hCG-ß und hLH-ß, insbesondere in den Amino-Termina-len 75% des Moleküls. Das Carboxy-Terminale 32-Restpeptid ist jedoch spezifisch für hCG-ß. Die Amino-Terminalen 75% 65 des Moleküls enthalten sechs intrakettige Disulfidbrücken, welche die Konformation des Moleküls aufrechterhalten. Diese Konformation scheint die Ursache zu sein für die antigenische Aktivität von hCG als auch für die immunologische

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Kreuzreaktivität mit hLH.

hCG ist neben seiner Indikatorfunktion für die Schwangerschaft notwendig für deren Aufrechterhaltung. Deshalb kann die Schwangerschaft beendet werden, wenn es gelingt das Hormon zu neutralisieren. Diese Neutralisation von hCG kann die Basis für ein kontrazeptives Vakzin bilden. Die Bildung von Antikörpern auf hCG beim Menschen weist jedoch zwei wichtige Probleme auf. hCG ist ein Human-Hormon und beim Menschen bilden sich normalerweise keine Antikörper auf ein Human-Hormon. Dieser Nachteil kann jedoch dadurch überwunden werden, dass hCG so modifiziert wird, dass es durch den menschlichen Körper nicht mehr als körpereigenes Hormon reagiert. Ein weiteres Problem besteht darin, dass der Antikörper auf hCG ebenfalls das luteinisierende Hormon aus dem Hypophysenvorderlappen neutralisieren würde, welches nötig ist für den normalen Reproduktionszyklus beim Menschen. Dieses zweite Problem kann teilweise überwunden werden durch Verwendung einer der beiden Komponenten des hCG-Moleküls, bezeichnet als ß-Untereinheit, dessen Antikörper vorzugsweise hCG neutralisieren würde. Dadurch wird jedoch die gewünschte Spezifität immer noch nicht erreicht.

Pappenhagen und Mitarb., US-PS 3 903 262 beschreiben die Modifikation von Serumglobulinen durch Reduzieren und Aufspalten von Disulfidbrücken und anschliessendes . Alkylieren der gespaltenen Disulfidbrücken um die antikomplementäre Aktivität solcher Globuline zu reduzieren. Pappenhagen gibt jedoch keine Hinweise auf die Modifikation von Serumglobulinen für die Herstellung von selektiven Antikörpern für ein bestimmtes Hormon und die Konjugation der Globuline mit anderen Proteinen ist in der genannten PS ebenfalls nicht enthalten.

Das Verfahren der Konjugation der ß-Untereinheit von Human-Chorion-Gonadotropin mit Tetanus-Toxoid, zur Reduktion der Kreuzreaktivität mit anderen Hormonen, inkl. follikelstimulierendes Hormon, thyroidstimulierendes Hormon und luteinisierendes Hormon wird beschrieben von Talwar, G.P., und Mitarb., Proc. Hatl. Acad. Sei. USA 1976 73 (1), 218-222. Hier findet sich jedoch kein Hinweis auf die Reduktion und Aufspaltung von Disulfidbrücken im Hormonmolekül.

Bahl, O.P. und Mitarb., Biochem. Biophys. Res. Comm. 70, 525-532 (1976) beschreiben die Modifikation der ß-Untereinheit von Human-Chorion-Gonadotropin durch Reduktion und Aufspaltung der Disulfidbrücken und Alkylierung der reduzierten und aufgespaltenen Disulfidbrücken. Diese Derivate von hCG-ß weisen reduzierte immunologische Reaktivität mit hCG auf, der Verlust in der immunologischen Kreuzreaktivität mit human-luteinisierendem Hormon ist jedoch grösser. Diejenigen Derivate, bei denen drei bis fünf der sechs intrakettigen Disulfidbrücken reduktiv gespalten und alkyliert wurden, bildeten Antikörper, reaktiv mit hCG. Das Derivat mit allen sechs Disulfidbrücken reduktiv aufgespalten und alkyliert war immunologisch inaktiv.

Ferner wird beschrieben, dass die Spezifität von hCG mit 3 Disulfidbrücken die S-alkyliert waren, durch die Konjugation mit Tetanus-Toxoid weiter verbessert werden konnte. Im Gegensatz zu Talwar und Mitarb. wird hier gesagt, dass die Konjugation des unmodifizierten hCG-ß mit Tetanus-Toxoid dessen immunologische Kreuzreaktivität mit human-luteinisierendem Hormon nicht reduziert.

Es besteht deshalb die Notwendigkeit für ein Derivat von Human-Chorion-Gonadotropin, weiches als Antigen die Bildung von spezifischen Antikörpern auf hCG stimuliert, wobei reduzierte oder eliminierte immunologische Kreuzreaktivität mit hLH besteht. Ein solches Derivat wäre nützlich sowohl für die Herstellung von Antisera für Schwangerschaftstests als auch für Vakzine zur Verhütung oder zum Abbruch einer

Schwangerschaft.

Es wurde gefunden, dass Antisera auf Human-Chorion-Gonadotropin mit reduzierter immunologischer Kreuzreaktivität mit luteinisierendem Hormon, welche zum Nachweis einer Schwangerschaft durch Immunotests dienen, durch Verwendung von Antigenen, enthaltend die ß-Untereinheit von Human-Chorion-Gonadotropin, welche durch reduktive Aufspaltung und Alkylierung der sechs intrakettigen Disulfidbrücken modifiziert wurde, erhalten werden können. Wahlweise können hCG-ß mit allen sechs Disulfidbrücken aufgespalten und alkyliert, ferner mit einem Protein oder Hapten konjugiert werden, wodurch die immunogenetische Spezifität vergrössert wird. In einer anderen Form besteht die vorliegende Erfindung aus einem Antigen, bestehend aus der ß-Untereinheit von Human-Chorion-Gonadotropin mit drei bis fünf der Disulfidbrücken reduktiv gespalten und alkyliert und konjugiert mit einem Protein oder Hapten zur Vergrösse-rung derimmunologischen Spezifität. Die ß-Untereinheit von hCG kann auch durch oxidative Aufspaltung der intrakettigen Disulfidbrücken modifiziert sein.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die im Anspruchsteil definierten Verfahren zur Herstellung von Antigenen und Antiseren.

Ein erfindungsgemäss erhaltenes Antiserum ist geeignet für Standard-Immunotestverfahren zum Nachweise der Gegenwart von Human-Chorion-Gonadotropin in Körperflüssigkeiten, wie Blut und Urin.

Die erfindungsgemäss hergestellten Antigene können zur Verhütung oder zum Abbruch einer Schwangerschaft verwendet werden, indem einer Frau ein solches Antigen verabreicht wird.

Zur Durchführung der erfindungsgemässen Verfahren, kann das Ausgangsmaterial, das Human-Chorin-Gonadotro-pin, in herkömmlicher Weise erhalten werden. Ein Material von relativ niedriger Reinheit ist im Handel erhältlich. Dieses hCG kann in herkömmlicher Weise gereinigt werden. Ein dafür geeignetes Reinigungsverfahren wird beschrieben von Bahl, O.P., J. Biol. Chem. 244:567,1969.

Nachfolgend wird ein Beispiel einer solchen Reinigung oder Aufarbeitung von hCG beschrieben:

Das Reinigungsverfahren umfasst drei Schritte von Säulenchromatographie, durchgeführt bei 4 °C. Das rohe hCG wird auf einer Säule, enthaltend DEAE-Sephadex A-50, äquilibriert in 0,04 M tris-Phosphatpuffer von pH 7,5, Chromatographien:. Die Elution der Säule erfolgt zu Beginn mit dem genannten Puffer, gefolgt von einer Reihe von Puffern mit zunehmendem NaCl-Gehalt mit diskontinuierlichem schrittweisem Gradient. Jede Fraktion wird durch Messen der Absorption bei 278 nm auf Protein untersucht und durch einen Radioimmunotest auf hormonale Wirkung untersucht. Die Fraktion mit der grössten Aktivität wird wiederum auf eine Säule mit DEAE-Sephadex A-50, äquilibriert mit 0,04 M tris-Phosphatpuffer von pH 7,5 und enthaltend 0,1 M NaCl, gegeben. Diese Säule wird anschliessend mit einem kontinuierlichen Gradienten von 0,1 M NaCl und 0,2 M NaCl in 0,04 M tris-Phosphatpuffer von pH 7,5 eluiert. Schliesslich wird die Fraktion mit dem Hauptanteil auf einer Säule mit Sepha-dex G-100, äquilibriert mit 0,04 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5, weiter gereinigt. Die Säule wird mit demselben Puffer eluiert. Die aktive Fraktion wird in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle konzentriert, dialysiert und lyophilisiert.

Die ß-Untereinheit von hCG kann dann isoliert werden durch Dissoziation der gereinigten hCG, gefolgt von aufeinanderfolgenden Chromatographien. Vorzugsweise wird ein schrittweises und nicht ein kontinuierliches Gradientenchro-matographierverfahren angewandt. Dieses Verfahren wird beschrieben von Swaminathan N., und Bahl, O.P., Biochem. Biophys. Res. Comm. 40:422, 1970; Bahl, O.P. in Hormonal

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Proteins and Peptides, C.H. Li, Ed., Acad. Press, p. 170, 1973.

Es können herkömmliche Ionenaustauschersäulen zur Isolation von Proteinfraktionen verwendet werden, wobei sie wahlweise Carboxymethylcellulose, Phosphocellulose, Car-boxymethylsephadex, Sulfo-propysephadex, Hydroxyappetit oder ähnliche Substanzen enthalten.

Für beste Ergebnisse wird eine schrittweise Elution angewandt. Das heisst die Salzkonzentration in der Pufferlösung zur Elution der hCG-ß wird schrittweise von 0,0 M bis ca. 3 oder 4 M erhöht.

Die Isolation der ß-Untereinheit kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:

Die Reinigung von hCG-ß umfasst die Dissoziation von hCG in 0,1 M Natriumacetatpuffer von pH 5,5 in Gegenwart von 8 M ultrareinem Harnstoff bei 40 °C während 1 h, gefolgt von der Abtrennung der dissoziierten Untereinheiten auf einer Säule mit DEAE-Sephadex. Vor dem Aufbringen der Probe wird diese Säule mit 0,04 M tris-Phosphatpuffer von pH 7,4 äquilibriert. Die Elution der Säule erfolgt zu Beginn mit demselben Puffer und anschliessend durch einen schrittweisen Gradienten mit Puffern von zunehmender Salzkonzentration im Bereich von 0,05 M bis 0,3 M von pH 7,4. Die a-Untereinheit wird mit dem ursprünglichen Puffer eluiert, während die ß-Untereinheit mit einem Puffer, enthaltend 0,1 bis 0,2 M NaCl eluiert wird. Die ß-Untereinheit-Fraktion wird weiter auf einer Säule mit Sephadex G-100 gereinigt, welches vorgängig äquilibriert mit 0,1 M Natriumacetatpuffer von pH 5,0 wurde, wobei derselbe Puffer zur Elution diente. Um die letzten Spuren von verunreinigenden hCG-a oder hCG aus der ß-Untereinheit zu entfernen, wird die Fraktion auf eine Säule mit einem Immuno-Adsorbens gegeben, hergestellt durch Behandeln von gesammeltem Anti-hCG-a-Serum eines Kaninchens mit Glutaraldehyd in herkömmlicher Weise.

Um die Entfernung von nicht-dissoziiertem hCG und von a-Untereinheit von hCG (hCG-a) zu bewirken, kann das gereinigte hCG-a mit einem Anti-hCG-a-Immuno-Adsorbens behandelt werden.

Verfahren zur Herstellung von Anti-hCG-a-Immunoad-sorbensien sind bekannt. Ein solches Verfahren wird beschrieben von Avromes und Mitarb., Immunochemistry, 6:53(1969).

Die Modifikation der Proteine durch Aufspaltung der Disulfidbrücken entweder durch Oxidation oder durch Reduktion zur Bildung zweier -SChH oder zweiter -SH-Gruppen anstelle einer Disulfidbrücke, erfolgt nach einem herkömmlichen Verfahren, welches jedoch bisher nicht auf ß-hCG angewandt wurde. Üblicherweise verwendete Oxida-tionsmittel sind Perameisensäure, Halogene, Wasserstoffperoxid, Luft und Natriumsulfid. Die Bedingungen für diese Oxidation sind dieselben wie sie üblicherweise für die Aufspaltung von Disulfidbrücken verwendet werden. Die Oxidation kann demzufolge in einem wässrigen Medium bei Temperaturen von 0-40 °C erfolgen, wobei jedoch niedrigere oder höhere Temperaturen ebenfalls möglich sind. Durch das Oxi-dationsverfahren werden die intrakettigen Disulfidgruppen in den Cystin-Resten und die Sulfidgruppen in den Methionin-Resten von hCG-ß oxidiert. Für die Herstellung eines spezifischen Antigens wird jedoch Reduktion und Alkylierung der Oxidation vorgezogen.

Geeignete Reduktionsmittel sind Dithiothreitol (DTT), Dithioärythritol (DTE), ß-Mercaptoäthanol und Natriumbor-hydrid oder ähnliche Stoffe. Bevorzugt werden DTT und DTE. Die Zahl der reduzierten und aufgespaltenen Disulfidbrücken wird durch Wahl entsprechender Reaktionsbedingungen bestimmt, insbesondere durch den Anteil des verwendeten Reduktionsmittels, die Konzentration des Proteins im Reaktionsgemisch, die Reaktionszeit, Temperatur und pH.

Vorzugsweise erfolgt die Reduktion unter milden Bedingungen, so dass die intrakettigen Disulfidbrücken in den Cystin-resten selektiv reduziert werden und dass eine minimale Reduktion der anderen Aminosäurereste des Proteins, d.h. der Tyrosyl-, Trysyl-, Hiptidyl- und Methionin-Reste stattfindet. Dies erfolgt durch entsprechende Kontrolle von Temperatur, pH und Reaktionszeit.

Die Reduktion kann bei Zimmertemperatur oder bei einer Temperatur oberhalb Zimmertemperatur, d.h. zwischen 0 und 40 °C erfolgen. Bevorzugte Reaktionstemperatur ist 37 °C.

Die Reduktion wird vorzugsweise bei schwach alkalischem pH durchgeführt, z.B. ca. 7,2-9, insbesondere ca.

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Das Reduktionsmittel kann als Lösung zu der Proteinlösung gegeben werden oder umgekehrt oder es kann als Feststoff zu der Proteinlösung gegeben werden. In einer Alternative kann das Protein in der reduzierenden Lösung aufgelöst werden oder das Reduktionsmittel und das Protein können in trockener Form gemischt werden und anschliessend zusammen im wässrigen Reaktionslösungsmittel bei der gewünschten Proteinkonzentration gelöst werden, z.B. mindestens ca. 1%, vorzugsweise ca. 5-18%.

Der Verlauf und das Ausmass der Reaktion kann durch Messen des Gehalts des Reduktionsmittels im Reaktionsgemisch erfolgen. Sobald dieser Gehalt stabil bleibt, ist die Reaktion beendet.

Die Reaktion kann an der Luft oder in inerter Atmosphäre, z.B. unter Stickstoff, durchgeführt werden. Bevorzugt wird die Durchführung der Reduktion in einer Stickstoffatmosphäre.

Die molare Konzentration des Reduktionsmittels ist teilweise abhängig von der Proteinkonzentration im Reaktionsgemisch, vom pH, von der Reaktionszeit, der Reaktionstemperatur und der Reaktionsatmosphäre. Zur Reduktion einer Disulfidbrücke pro Mol Protein und Produktion von 2 -SH-Gruppen wird mindestens ein molares Äquivalent Reduktionsmittel benötigt. Demzufolge beträgt der theoretische minimale Anteil von Reduktionsmittel mindestens 1 molares Äquivalent für jede zu reduzierende Disulfidbrücke. Mindestens ca. 3 molare Äquivalente Reduktionsmittel müssen verwendet werden bei der Herstellung des modifizierten hCG-ß nach der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt ist die Verwendung eines Überschusses von Reduktionsmittel im Bereich von 2-20mal dem theoretischen Anteil zur Reduktion und Aufspaltung der gewünschten Anzahl Disulfidbrücken. Im allgemeinen wird ein relativ grösserer molarer Überschuss von Reduktionsmittel verwendet, wenn eine grössere Anzähl z.B. 5 oder 6 Disulfidbrücken reduziert und aufgespalten werden müssen.

Das Protein liegt vorzugsweise in einer Konzentration von ca. 4x 10~5 molar bis 8x 10"5 molar vor. Deshalb beträgt die Konzentration des Reduktionsmittels, wenn die bevorzugten Dithiothreitol oder Dithioerythitol verwendet werden von ca. 5x 10-4 molar bis 9 x 10-3 molar.

Bei der experimentellen Bestimmung der benötigten Reaktionsbedingungen für Reduktion und Aufspaltung einer bestimmten Anzahl Disulfidbrücken, wird die Anzahl der reduzierten und aufgespaltenen Disulfidbrücken in einem bestimmten Experiment durch Aminosäureanalyse des modifizierten Proteins ermittelt. Diese Analyse erfolgt in herkömmlicher Weise. Jede aufgespaltene Disulfidbrücke resultiert in zwei Cystein- (Halbcystein-)-Resten. Die Anzahl aufgespaltene Disulfidbrücken in einem bestimmten Experiment beträgt deshalb die halbe Anzahl Mole Cystein, bezogen auf die Anzahl Mole Protein.

Die durch die Reduktion erhaltenen Sulfhydrylgruppen müssen geschützt werden, da sich sonst die Disulfidbrücken wieder bilden können. Diese Schutzwirkung kann erreicht

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werden durch Alkylieren der Sulfhydrylgruppen mit einem geeigneten Alkylierungsmittel. Als Alkylierungsmittel kann ein herkömmliches verwendet werden, vorausgesetzt, die resultierende Mercaptogruppe ist stabil und physiologisch unbedenklich.

In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck «Alkylierung» der Sulfhydrylgruppen, wie sie durch reduk-tive Aufspaltung der Disulfidgruppen entstehen, das Ersetzen des Wasserstoffatoms der Sulfhydrylgruppe durch eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe, wie Carboxymethyl, Carboxyamidomethyl oder Aminoäthyl. Dieses Vorgehen ist ein bekanntes Verfahren innerhalb der Proteinchemie und erfolgt nach bekannten Methoden.

Die Alkylierung wird in geeigneter Weise im selben Reak-tionsgefäss durchgeführt wie die reduktive Aufspaltung. Dabei wird eine genügende Menge Alkylierungsmittel eingesetzt um mit überschüssigem Reduktionsmittel zu reagieren und um alle freien -SH-Gruppen im reduzierten Produkt in alkylierte Mercaptogruppen überzuführen. Die Art des Alky-lierungsmittels ist nicht kritisch, vorausgesetzt die resultierenden alkylierten Mercaptogruppen sind stabil und physiologisch unbedenklich.

In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemässen Verfahrens haben die alkylierten Mercaptogruppen die Formel -S-CH2-R, worin R -H, -CH3, -COOH, -COOR', -CONH2, -CONHR', -CON(R')2, -C = N, -CH2C= N, CH2NH2, -COPh, -CH2OH oder -CH-OH

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bedeutet, worin R' Niederalkyl darstellt, d.h. enthaltend 1-4 C-Atome und worin Ph unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl mit 1-3 Substituenten wie z.B. Niederalkyl, Chlor, Brom, Nitro, Amido, Niederalkoxy, Niederalkoxycarbonyl und ähnliche. Beispiele für solche substituierte Phenylgruppen sind p-Tolyl, sym-Xylyl, p-Amidinophenyl, m-Chlorphenyl und p-Methoxyphenyl. Die alkylierten Mercaptogruppen können auch von der Formel

-S-CH~CH2-CON(R')-CO,

S-(NiederalkoxycarbonyI)R', z.B. Äthoxycarbonyläthylmer-capto und -S-(Carboxy)-R', z.B. Äthoxycarbonylmercapto oder eine andere Niederalkylmercaptogruppe mit einer funktionellen Gruppe am Kohlenstoffatom der Alkylgruppe, sein.

Die Reaktionsbedingungen bei der Alkylierung sind im wesentlichen dieselben wie im Reduktionsschritt. Dabei können längere Reaktionszeiten, z.B. 1-2 h angewendet werden.

Die Alkylierung der -SH-Gruppen, hergestellt durch reduktive Aufspaltung der Disulfidbrücken erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von Jodacetamid oder Jodessigsäure, wobei Paare von -SCH2CONH2 oder -SCH2COOH-Gruppen entstehen. Die -SH-Gruppen können jedoch auch durch Alkylieren des reduzierten hCG-ß mit anderen Alkylie-rungsmitteln blockiert werden, wobei man ein modifiziertes hCG-ß mit denselben physikalischen und biologischen Eigenschaften erhält, wie dasjenige, bei dem die reduzierten gespaltenen intrakettigen Disulfidbrücken ersetzt werden durch Paare von -SCH2CONH2-Gruppen.

Die Alkylierung der -SH-Gruppen zu -S-CH2-R-Grup-pen, worin R Wasserstoff oder Methyl darstellt, kann erfolgen durch Behandeln des reduzierten hCG-ß mit z.B. Methyloder Äthyljodid. Substituierte Alkylthioäther können ebenfalls gebildet werden durch Verwendung eines Halogenacet-amids wie Jodacetamid, N-Alkyl-halogenacetamid, oder N,N-Dialkyl-halogenacetamid, z.B. BrCH2CONHC3H7 oder BrCH2CON(C2Hs); Halogenessigsäure oder Niederalkylester davon z.B. Jodessigsäure, ICH2CO2C2H5 oder CICH2CO2C2H5, Halogenacetonitril, z.B. ICH2CN, Alkenyl-

nitril, z.B. Acrylonitril, Aralkylhalogenid, z.B. Benzylbromid, Alkylenoxid, z.B. Äthylenoxid, Phenacylhalogenid, z.B. Phe-nacylchlorid und Phenacylbromid, N-Alkylmaleimid, z.B. N-Äthylmaleimid, a-Halogen-niederalkansäuren mit 3-4 C-Atomen und Niederalkylester davon, z.B. Äthyl-a-brom-propionat und a-Brompropionsäure und Alkylenimine, z.B. Äthylimin. Die Alkylierungsreaktion wird unter milden alkalischen Bedingungen durchgeführt.

Die verwendeten Reaktionsbedingungen sind diejenigen, die normalerweise beim betreffenden Alkylierungsmittel verwendet werden. Bei den reaktiven Alkylierungsmitteln werden ca. 5-10molare Äquivalente verwendet, wobei dieser Anteil von Reaktionstemperatur und -zeit, von Konzentration des Proteins und des Alkylierungsmittels in der Lösung, von der Anzahl der freien -SH-Gruppen pro Molekül abhängig ist. Bei weniger reaktiven Alkylierungsmitteln, z.B. Äthylenoxid, wird ein grosser molarer Überschuss eingesetzt, um vollständige Alkylierung aller freien -SH-Gruppen zu erreichen.

Um das Produkt aus dem Reduktionsschritt vollständig zu alkylieren, werden mindestens zwei molare Äquivalente, bezogen auf die äquivalenten Reduktionsmittel beim Reduktionsschritt benötigt. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuss von 10% oder mehr verwendet, um vollständige Alkylierung des überschüssigen Reduktionsmittels und die Umsetzung aller -SH-Gruppen im Protein zu -S-CH2-R-Gruppen zu erreichen. So wird z.B. bei Verwendung von DTE in einer Konzentration von 8,4 x IO-4 M im Reaktionsgemisch das Alkylierungsmittel in einer Anfangskonzentration von 1,7 x IO-3 M verwendet. Bei Verwendung eines gasförmigen Alkylierungsmittels, z.B. Äthylenoxid, ist unter Umständen ein grösserer molarer Überschuss z.B. 10-50molare Äquivalente oder mehr notwendig, um alle freien -SH-Gruppen zu alkylieren. Grössere molare Überschüsse können auch verwendet werden, z.B. bis zu 20molaren Äquivalenten, da das überschüssige Alkylierungsmittel später vom alkylierten Produkt nach der Alkylierung abgetrennt wird z.B. durch Ausfällen des Proteins, durch Dialyse oder durch Entsalzen auf einer Sephadex-Säule.

Bevorzugt wird die Alkylierung mit Jodacetamid, Jodessigsäure oder Äthylenimin. Bei der Alkylierung mit Jodacetamid wird die Verwendung eines 4-25fachen Überschusses von Reagens bevorzugt. Die Reaktion wird vorzugsweise bei Ca. 37 °C und bei einem pH von ca. 8,5 während ca. 30 min durchgeführt. Bei der Alkylierung mit Jodessigsäure oder Äthylenimin wird vorzugsweise ein 50facher Überschuss des Reagens unter denselben Bedingungen eingesetzt. Bevorzugt ist die Verwendung eines Puffers wie tris-HCl-Puffer von 0,5 M um das gewünschte pH aufrechtzuerhalten. Bevorzugt wird die Verwendung eines Puffers, enthaltend 8 M Harnstoff und 2% Äthylendiamintetraessigsäuregruppen.

Die Konjugation oder die Vernetzung mit einem Protein kann in herkömmlicher Weise nach einem Standardverfahren erfolgen wie bei der Reaktion von hCG-ß oder seiner Derivate mit dem Protein in wässriger Lösung mit Glutaraldehyd gemäss Avarameas, S., Immunochemistry, 6:43, 1969 oder mit einem wasserlöslichen Carbodiimid gemäss Cutarcasas, P. und Anfinsen, C.B., Methods of Enzymology, XXII: 343, 1971. Andere Verfahren unter Verwendung von Reagenzien wie Äthylchloroformiat, bifunktionellen Arylhalogeniden, wie 1,3- oder 1,4-Difluor- oder -Dichlorbenzol, 2,4-Difluor-oder -Dichlortoluol, 4,4-Difluor- oder -Dichlor-bi-phenyl oder ähnliche, 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol, bifunktionellen Isocyanaten wie Toluol-2,4-diisocyanat, ToIuol-2,6-diisocy-anat, 4,4'-Diisocyanatodiphenylmethan, Hexan-1,6-diisocy-anat und ähnlichen und bifunktionellen Acylierungsmitteln wie Di-Säurehalogenid, Carbonsäuredianhydride, Dicarbon-säuren und Ester und Diamide und Imidoester, können ebenfalls angewandt werden.

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Konjugationsverfahren, unter Verwendung von Glutaral-dehyd oder eines wasserlöslichen Carbodiimids werden bevorzugt.

Im bevorzugten Konjugationsverfahren unter Verwendung von Glutaraldehyd wird das modifizierte hCG-ß oder ein Derivat davon und das Protein in einem wässrigen Phosphatpuffer (pH ca. 6,8) gemischt. Eine wässrige Glutaral-dehydlösung (ca. 1%), wird langsam unter Umrühren zugegeben und das Gemisch wird bei Zimmertemperatur während ca. 3 h stehengelassen. Die Lösung wird anschliessend dialy-siert, polymerisiertes Material wird abzentrifugiert (z.B. 50,000 g während 30 min) und die überstehende Lösung wird auf einer Säule chromatographiert (z.B. Sephadex G-150) um freies hCG-ß oder seine Derivate vom Konjugat abzutrennen.

Beim Carbodiimid-Verfahren wird hCG-ß oder die modifizierte Form davon mit dem Protein in wässriger Lösung von pH 4,75 mit einem 5fachen Überschuss des Carbodiimids behandelt. Das pH des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von 0,001 N HCl aufrechterhalten. Die Reaktion erfolgt bei 25 °C während 1 h, worauf das Reaktionsgemisch gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert wird.

Die Konjugation mit einem Hapten wie einem Adjuvans-peptid (Muramylalanylisoglutamin) wird wie folgt durchgeführt. Das Peptid wird aktiviert mit dem Carbodiimid bei einem pH von 4,75 bsi 25 °C während 15 min. Anschliessend wird hCG-ß oder das Derivat davon zum Reaktionsgemisch gegeben und die Reaktion wird während 1 h bei 25 °C weiter geführt. Das pH im Reaktionsgemisch wird durch Zugabe von 0,001 N HCl auf 4,75 gehalten. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch dialysiert und lyophilisiert.

Proteine, die mit hCG-ß oder seinen Derivat konjugiert werden können, sind Albumine wie Serumalbumin stammend von Bovinserum, Kaninchenserum, Humanserum oder ähnlichen, Ovalbumine, methyliertes Albumin, das irgendein Albumin sein kann, Hemocyaninthyroglobulin, Tetanusto-xoid. Die Konjugation erfolgt in gleicher Weise wie beschrieben für hCG-ß.

hCG-ß oder seine Derivate können durch Konjugation mit einem Hapten modifiziert werden. Haptene sind im wesentlichen solche Verbindungen, welche die funktionellen Gruppen eines Proteins, insbesondere die Aminogruppen modifizieren können. Die Anwesenheit eines Haptens auf dem Peptid vergrössert die immunologische Spezifität von hCG-ß. Die Haptene können ebenfalls als Schutzgruppen für den Aminoanteil des Proteins wirken. Geeignete Haptene sind herkömmliche monofunktionelle Alkylierungs- und Acy-lierungsmittel. Die geeigneten Alkylierungsmittel sind solche, wie sie zur Alkylierung der Sulfhydrylbrücken verwendet werden wie auch Verbindungen wie 2,4-DinitrofluorbenzoI,

Chlor- oder Fluorbenzol, Chlor- oder Fluortoluol, d.h. Aryl-halogenide und Alkylhalogenide. Acylierungsmittel sind Säureanhydride wie Essigsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, N-Carboxy-ct-aminoanhydride, O-Carbobenzoxy-tyrosyl-aminoanhydrid, O-Carbobenzoxy-L-tyrosin-N-car-boxy-a-aminoanhydrid und ähnliche, Säurehalogenide, Carbonsäuren und ihre Ester, Amide und ähnliche.

Ferner können Peptidhaptene, welche die Immunreaktion stimulieren wie Muramylalanylisoglutamin an hCG-ß gebunden werden. Bei den Peptidhaptenen ist die Verwendung eines herkömmlichen Konjugierungsmittels notwendig wie vorgängig beschrieben zur Bindung des Peptidhaptens an hCG-ß oder sein Derivat. Das vorgängig beschriebene Carbodiimid wird bevorzugt. Wenn das Hapten eine funktionelle Gruppe enthält, welche direkt mit hCG-ß oder seinem Derivat reagieren kann, wird jedoch kein Konjugierungsmittel benötigt.

Wenn das hCG-ß oder das Derivat davon mit einem Hapten von 1-10 Haptenmolekülen pro Mol hCG-ß oder seinem

Derivat auf dem Protein modifiziert wird, sind vorzugsweise 1-5 Haptenmoleküle, insbesondere 2-3 Haptenmoleküle pro Mol Protein vorhanden. Wenn hCG-ß oder sein Derivat entweder als kontrazeptives Vakzin oder als schwangerschaftsab-5 brechendes Mittel verwendet wird, wird die Anzahl der Tyro-sylreste im Protein verwendet wird, wird die Anzahl der Tyro-sylreste im Protein vorzugsweise limitiert. Vorzugsweise sind nicht mehr als 2 Tyrosylreste im hCG-ß oder seinem Derivat vorhanden. Wenn hCG-ß oder sein Derivat zur Herstellung io eines Antiserums verwendet wird, z.B. für Schwangerschaftstests, ist die Anzahl von Tyrosyleinheiten nicht kritisch und kann bis zu 10 betragen.

Vorzugsweise werden die Aminogruppen geschützt durch Anlagerung von O-Carbobenzoxy-tyrosyl-Resten. Dies erfolgt 15 vorzugsweise durch Umsetzen von hCG-ß oder seinem Derivat in einem wässrigen 0,05 M Phosphatpuffer von pH ca. 7,2 bei einer Konzentration von ca. 6,6 x 10~5 M mit einem 50fachen Überschuss von O-Carbobenzoxy-L-tyrosin-N-car-boxy-a-aminoanhydrid, gelöst in Dioxan in einer Konzentra-20 tion von ca. 5,0 x IO-2 M. Diese Reaktion erfolgt vorzugsweise bei 4 °C während 24 h, worauf das O-Carbobenzoxyty-rosyl-Derivat durch Entsalzen auf einer Sephadexsäule (z.B. G-25) isoliert werden kann.

hCG-ß oder sein Derivat kann auch durch Koppeln der 25 Carboxylgruppen mit einem Nukleophil, insbesondere mit einem Nukleophil, welches die Carboxylgruppe mit einer Aminogruppe blockieren kann, modifiziert werden. Geeignete Nukleophile sind Aminosäuren und ihre Ester, kleine Peptide, Proteine und ähnliche wie Glycinäthylester, Tyrosin-30 äthylester, Alanyläth'ylester, Glutamyldiäthylester, Aspartyl-diäthylester, Lysinäthylester, Histadinäthylester und ähnliche. Allgemein kann irgendeine Verbindung, enthaltend eine Aminogruppe, verwendet werden. Die Kopplung erfolgt durch Umsetzen einer wässrigen Lösung von hCG-ß oder seinem 35 Derivat mit einem Nukleophil, z.B. Glycinäthylesterhydro-chlorid in Gegenwart von Harnstoff. Die Reaktion wird eingeleitet durch die Zugabe eines Carbodiimids, z.B. 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid. Die Reaktion wird bei saurem pH von z.B. 4-6 und bei einer Temperatur von 40 0-50 °C durchgeführt. Das verwendete Reaktionsmedium ist dabei nicht von Bedeutung. Nachdem die Reaktion bis zu einem gewissen Ausmass abgelaufen ist, kann weiteres Carbodiimid zugegeben werden, um die Reaktion zu vervollständigen.

45 Bevorzugte Nukleophile sind Glycinäthylester und Tyrosinäthylester. Bevorzugt wird die Kopplung dieser Nukleophile an die Carboxylgruppen von hCG-ß oder von seinen Derivaten durch Zugabe zu einer wässrigen Lösung von hCG-ß oder seinem Derivat in einer Konzentration von ca. so 6 x IO-5 M einer einmolaren Lösung des Nukleophils wie des Hydrochloridsalzes und einer 7,5moIaren Lösung von Harnstoff. Die Reaktion wird eingeleitet durch Zugabe von l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlo-rid bis zu einer Konzentration von ca. 0,07molar. Das pH 55 wird durch Zugabe von 0,1 N wässriger Salzsäure während der Reaktion auf 4,75 gehalten. Nach ca. 60 min wird ein gleicher Anteil des Carbodiimids zugegeben, wodurch die Endkonzentration auf ca. 0,14molar gebracht wird. Die Reaktion wird während weiterer 60 min durchgeführt, worauf festes 60 Ammoniumcarbonat zugegeben wird, wodurch die Reaktion gestoppt wird.

Die wie oben beschrieben hergestellten Antigene können dann zur Herstellung von Antikörpern auf hCG entweder in Tieren, wobei ein Antiserum, welches für die Durchführung 65 von Schwangerschaftstests beim Menschen geeignet ist, erhalten wird, oder beim Menschen, wobei eine Schwangerschaft verhütet oder abgebrochen wird, verwendet werden.

Das Antiserum wird in herkömmlicher Weise erhalten,

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wie dies üblich ist bei der Herstellung anderer Typen von Antikörpersera. Dabei wird ein Wirttier wie ein Pferd, eine Ziege, ein Schaf, ein Kaninchen, ein Affe, ein Schwein oder ein anderes Tier mit dem Antigen geimpft, bis das Blut des Tiers die gewünschte Konzentration der Antikörper enthält. Der zeitliche Ablauf der Injektionen ist dabei nicht kritisch und in der Praxis haben sich Injektionen alle zwei Wochen befriedigend bewährt. Längere oder kürzere Zeitperioden zwischen einzelnen Injektionen sind ebenfalls möglich. Die Dosis des Antigens ist selbstverständlich proportional zum Gewicht des Wirttiers. Die minimale Dosis ist diejenige, welche zur Induzierung einer Antikörperreaktion im Wirttier benötigt wird, während die maximale Dosis diejenige ist, bei der keine störenden Nebenreaktionen auftreten. Im allgemeinen liegen diese Dosen zwischen ca. 2 ug/kg bis ca. 50 ug/kg Körpergewicht, während die bevorzugten Dosen zwischen ca. 5-50 ug/kg Körpergewicht liegen.

Die Injektionen werden fortgesetzt, bis der gewünschte Antiserumspiegel im Blutserum erreicht wird. Im allgemeinen ist ein Antiserumtiter von 1:5000 bis 1:10 000 befriedigend.

Wenn der gewünschte Titer erreicht ist, wird ein bestimmtes Volumen Blut beim Wirttier entnommen. Der Serumanteil des Bluts wird anschliessend isoliert. Die Menge des entnommenen Bluts ist abhängig vom totalen Blutvolumen im Wirttier. Im allgemeinen können bis zu 12 Volumen-% des Bluts entnommen werden, ohne dass das Wirttier unangenehmen Nebenerscheinungen unterworfen wird.

Bei einem Kaninchen bedeutet dies, dass ca. 20-40 ml Blut entnommen werden können.

Das Serum wird gewonnen durch Koagulierenlassen des Blutes und anschliessendes Dekantieren des Blutserums. Das Antiserum kann wahlweise aus dem Blutserum isoliert werden, dies ist jedoch nicht in jedem Fall notwendig.

Wahlweise können die Antisera aus dem Blutserum durch Zugabe einer Ammoniumsulfatlösung ausgefällt werden. Man erhält dadurch stärker konzentrierte Antisera. Ferner können weitere herkömmliche Reinigungsverfahren angewandt werden.

Der Antiserumspiegel im Blutserum des Wirttiers wird durch Zugabe weiterer Injektionen des Antigens auf der gewünschten Konzentration gehalten. Dem Wirttier können weitere Antisera entnommen werden in dafür geeigneten Intervallen.

Ein typisches Immunisierungsverfahren unter Verwendung von Kaninchen ist das folgende: 100 ug des Derivats in 0,5 ml Kochsalzlösung wird mit einem gleichen Volumen Freunds-Komplettadjuvans zu einer Emulsion gemischt. Die Emulsion wird an 10-20 Stellen intradermal und subkutan injiziert. Die Injektion wird jede zweite Woche wiederholt unter Verwendung der Hälfte des ursprünglichen Anteils des Derivats, und zwar an zwei Stellen subkutan oder intramuskulär. Die Serumproben werden jede zweite Woche aus der Ohrvene entnommen und werden unter Verwendung von 125-I-hCG und ,25-I-hLH getestet.

Ein bevorzugtes Nährmedium für den Antikörper wird beschrieben in Avrameas, S., und Ternynch, T., Immunoche-mistry 6:53, 1969.

Das auf diese Weise hergestellte Antiserum kann in irgendeinem Immunotestverfahren eingesetzt werden zum Nachweis der Gegenwart von hCG in Körperflüssigkeiten, welche bei einer Schwangerschaft hCG enthalten, wie Serum und Urin.

Die Körperflüssigkeit wird auf die Gegenwart von hCG getestet unter Verwendung des Antiserums, hergestellt wie oben beschrieben in einem Immunotestverfahren. Dafür kommen Ausfällungsreaktionen, Immunodiffusion, Komplement-fixation, Hämagglutinationshemmung oder Radioimmunotests (RIA) zum Nachweis der Gegenwart von hCG in Frage.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäss erhaltene Antiserum im Radioimmunoassay (RIA) eingesetzt, da dieser eine hohe Empfindlichkeit aufweist. Bei diesem Verfahren wird ein radioaktives Hormon, z.B. hCG-ß, welches unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens, wie des Chloramin-T-Verfahrens beschrieben in Bellisario, R. und Bahl, O.P. J.

Biol. Chem., 250: 3837,1975, mit Na125I jodiert worden war, mit einem Antikörper auf hCG-ß inkubiert, bis alle Koordinationsstellen des Antikörpers durch radioaktives hCG-ß(125I-hCG-ß) besetzt sind. Die auf Gegenwart von hCG zu untersuchende Testlösung wird anschliessend mit dem 125I-hCG-ß-anti-hCG-ß-Komplex inkubiert. In der Testlösung vorhandenes und nachzuweisendes hCG ersetzt einige der radioaktiven 125I-hCG-ß im Komplex. Nach der Inkubation wird der feste Komplex aus der Lösung z.B. durch Filtration abgetrennt. Falls in der Testlösung hCG vorhanden war, wird man in der abgetrennten Lösung I23I-hCG-ß nachweisen können, und die nachgewiesene Menge ist direkt proportional zur Menge hCG in der Testlösung. Die vorhandene Menge hCG in der Testlösung kann anschliessend aus dem Anteil von ersetztem 125I-hCG-ß berechnet werden. Ein geeignetes Verfahren für RIA wird beschrieben in Tomoda, Y, und Mitarb., Amer. J. Obst. Gynae. 100: 118, 1962.

Ein Festphasenradioimmunotest kann ebenfalls durchgeführt werden. Dieses Testverfahren wird wegen seiner Einfachheit bevorzugt. Die Technik ist gut bekannt und die erfin-dungsgemässen Antisera können direkt in diesen bekannten und herkömmlichen Testverfahren eingesetzt werden. So wird z.B. ein geeignet verdünnter Antikörper in der Weise auf Polystyrolschläuche beschichtet, dass das Antiserum während 30 min bei Zimmertemperatur in den Polystyrolschläuchen gehalten wird. Die Schläuche werden anschliessend entleert und dreimal mit Kochsalzlösung gewaschen. Anschliessend werden sie mit 10%igem männlichem Normalserum während 16 min behandelt. Die so vorbereiteten Antikörperbeschichteten Schläuche werden anschliessend für den Radioimmunotest verwendet. In einen Satz der Testschläuche werden seriell verdünnte Proben von hCG in Konzentrationen von 4 ng bis 2000 ng/Schlauch in Boratpuffer zugegeben. Die Proben von Serum oder Urin in Borat werden ein zweites Mal in eine zweite Serie von Schläuchen gegeben. Nach Zugabe von 125I-hCG (50 000 cpm) in jeden Schlauch werden diese während 15 min bei 37 °C inkubiert, worauf sie entleert, dreimal mit normaler Kochsalzlösung gewaschen und anschliessend in einem y-Zähler gezählt werden.

Die Verwendung der Antisera in Immunotestverfahren, insbesondere in Radioimmunotestverfahren erlaubt den Nachweis von hCG sogar in Gegenwart von LH (luteinisierendem Hormon). Es ist deshalb möglich, eine Schwangerschaft zu extrem frühem Stadium nachzuweisen. Da der Spiegel von hCG im Frühstadium einer Schwangerschaft geometrisch ansteigt, kann die Überwachung des hCG-Spiegels eine frühe Warnung bei einer abnormalen Schwangerschaft liefern. So stellt z.B. ein arithmetisch ansteigender oder sogar fallender hCG-Spiegel einen Hinweis auf eine abnormale Schwangerschaft dar. Dieser frühe Hinweis auf eine abnormale Schwangerschaft ist von grossem Wert insbesondere bei ektopischen Schwangerschaften. Ein früher Nachweis bei ektopischen Schwangerschaften erlaubt, beim Patienten eine Salpingotomie zu vermeiden. Eine Beeinträchtigung oder Beschädigung der fallopischen Tuben kann dadurch vermieden oder eingeschränkt werden.

Die Untersuchung auf hCG kann ebenfalls für die Diagnose und Überwachung der Chemotherapie bei hCG-sekre-tierenden Tumoren wie Choriokarzinom eingesetzt werden. Das Testverfahren ist dasselbe wie bei Schwangerschaftstests. Die Gegenwart von hCG bei einer nichtschwangeren Frau bildet einen Hinweis auf einen Tumor mit hCG-Sekretion.

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5

10

15

20

25

30

35

40

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60

65

9

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Der Verlauf der Behandlung kann durch Überwachung des hCG-Spiegels verfolgt werden. Wenn dieser Spiegel auf 0 zurückfällt, bewirkte die Behandlung offensichtlich ein Stoppen des Tumorwachstums.

Bei Verwendung der erfindungsgemäss hergestellten Antigene zur Verhütung oder zum Abbruch einer Schwangerschaft werden die Antigene bei der Frau verabreicht, um die Bildung von Antikörpern zu provozieren, welche hCG neutralisieren. Eine effektive Dosis des Antigens wird dabei durch Injektion, vorzugsweise durch intravenöse Injektion, verabreicht. Die totale Dosis, welche in einer oder mehreren Injektionen verabreicht werden muss, ist abhängig vom Körpergewicht des Patienten. Die totale Dosis beträgt im allgemeinen einige Mikrogramm pro Kilogramm oder weniger. Das heisst, die Menge verabreichtes Antigen ist genügend gross, um die benötigte Antikörperreaktion zu induzieren, jedoch ungenügend, um unerwünschte Nebenerscheinungen zu verursachen. Die Dosis beträgt normalerweise von ca. 2-50 ug/kg Körpergewicht, vorzugsweise von 2.-^10 ug/kg Körpergewicht. Eine typische Dosis liegt deshalb im Bereich zwischen 100-500 ,ug. Im allgemeinen wird die Dosis mehrmals wiederholt verabreicht, um die benötigte Reaktion zu verursachen. Diese wiederholte Verabreichung erfolgt normalerweise zwei- bis viermal. Das Antigen kann in Form einer Lösung, wie sie im Handel erhältlich ist, verabreicht werden, wie z.B. in isotonischer Kochsalzlösung.

Es ist ebenfalls möglich das Antigen oral durch Kombination mit Lipiden zu verabreichen. In diesem Fall wird es aus dem Darm ins Blut übertreten.

Die Verfahren zum Abbruch einer Schwangerschaft oder zur Verhütung einer Schwangerschaft sind im wesentlichen gleich. Das Antigen wird mit einem Träger zusammen in der genannten Weise verabrreicht. Bei der Verabreichung zur Verhütung einer Schwangerschaft erfolgt diese Verabreichung periodisch, um den notwendigen antikörperspiegel aufrechtzuerhalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge-mässen Verfahrens, wird zur Herstellung eines Antiserums ein Antigen verwendet, das erhalten wird, indem die ß-Unter-einheit von Human-Chorion-Gonadotropin isoliert wird,

sechs der intrakettigen Disulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und gespalten werden, die so reduzierten intrakettigen Disulfidbrücken alkyliert werden und das dabei hergestellte Antigen isoliert wird. Dieses Antigen wird wiederholt einem Wirttier verabreicht, wobei jede dieser verabreichten Einzeldosen nicht genügend gross ist, um eine signifikante Antikörperreaktion auszulösen, und folglich diese Verabreichung so oft wiederholt wird, bis das Tier eine Antikörperreaktion auf das Antigen aufweist, worauf das Antiserum dem Tier entnommen wird.

Für eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfin-dungsgemässen Verfahrens zur Herstellung eines Antiserums, welches selektiv in seiner Reaktivität bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin ist in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, wird das Antigen hergestellt durch Isolieren der ß-Untereinheit von Human-Chorion-Gonadotropin, durch Reduktion und Aufspaltung von fünf der intrakettigen Disulfidbrücken der ß-Untereinheit, durch Alkylieren der so reduzierten intrakettigen Disulfidbrücken und Isolieren des dabei hergestellten Antigens. Dieses Antigen wird dem Wirttier verabreicht, worauf demselbén Tier ein zweites in gleicher Weise hergestelltes Antigen verabreicht wird, bei dem jedoch sechs der intrakettigen Disulfidbrücken gespalten und alkyliert worden sind.

Ein bevorzugtes Antigen, welches bei Verabreichung bei einem Wirttier eine Antikörperreaktion auslöst, welche selektiv ist bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, wird erfindungsgemäss hergestellt, indem eine ß-Untereinheit aus Human-Chorion-Gonadotropin isoliert wird, welche in der Weise reduziert wird, dass sechs der intrakettigen Disulfidbrücken gespalten werden, worauf diese gespaltenen Disul-5 fidbrücken alkyliert und die ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten konjugiert wird, um die Antikörperreaktion auf das Antigen bei Verabreichung beim Wirttier zu verstärken.

Ferner erfolgt auch innerhalb der vorliegenden Erfindung die Modifikation des Antigens durch Reaktion seiner termi-io nalen Carboxylgruppe mit einem Nucleophil, vorzugsweise Tyrosinäthylester oder Glycinäthylester.

Ein weiteres bevorzugtes Antigen, welches bei Verabreichung bei einem Wirttier eine Antikörperreaktion auslöst, welche selektiv ist bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin 15 in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, wird erfindungsgemäss hergestellt, indem die ß-Untereinheit aus Human-Chorion-Gonadotropin isoliert und in der Weise reduziert wird, dass fünf der intrakettigen Disulfidbrücken gespalten werden, die gespaltenen Disulfidbrücken alkyliert 20 werden und die Untereinheit weiter mit einem Protein oder Hapten konjugiert wird, um die Antikörperreaktion auf das Antigen bei Verabreichung dieses Antigens bei einem Wirttier zu erhöhen. Bevorzugte verwendete Proteine und Haptene sind Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-25 alanylisoglutamin.

Ein weiters bevorzugtes Antigen, welches bei Verabreichung bei einem Wirttier eine Antikörperreaktion auslöst, welche selektiv ist bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, 30 wird erfindungsgemäss erhalten, indem die ß-Untereinheit von Human-Chorion-Gonadotropin isoliert wird und in der Weise reduziert wird, dass vier der intrakettigen Disulfidbrük-ken gespalten werden, worauf die gespaltenen Disulfidbrük-ken alkyliert und die Untereinheit mit einem Protein oder 35 Hapten konjugiert wird, um die Antikörperreaktion auf das Antigen bei Verabreichung desselben bei einem Wirttier zu vergrössern. Bevorzugte verwendete Proteine und Haptene sind Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramylalanylisoglutamin.

40 Ein weiteres bevorzugtes Antigen, welches bei Verabreichung bei einem Wirttier einen Antikörper induziert, welcher selektiv ist bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, wird erfindungsgemäss erhalten, indem eine ß-Untereinheit 43 von Human-Chorion-Gonadotropin isoliert und in der Weise reduziert wird, dass drei der intrakettigen Disulfidbrücken gespalten werden, die gespaltenen Disulfidbrücken alkyliert und die Untereinheit mit einem Protein oder Hapten konjugiert werden, um die Antikörperreaktion auf das Antigen bei 50 Verabreichung desselben bei einem Wirttier zu vergrössern. Bevorzugte verwendete Proteine und Haptene sind Albumin, Hemocyanin, Tyroglobulin und Muramylalanylisoglutamin.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegenden Erfindungen näher erläutern, ohne sie jedoch in irgendeiner 55 Weise einzuschränken.

In den folgenden Beispielen bedeutet «DEAE-Sephadex» eine Markenbezeichnung für ein im Handel erhältliches chromatographisches Material auf Dextranbasis mit Diäthylami-noäthyl-Gruppen und «Sephadex» ist eine Markenbezeich-60 nung für ein vernetztes Polydextrane für die Gelchromatogra-phie.

Beispiel 1

Dieses Beispiel illustriert die Herstellung verschiedener 65 Antigene gemäss der vorliegenden Erfindung.

Herstellung von hCG und dessen Untereinheiten

Human-Chorion-Gonadotropin (12,000 Iu/mg) wurden

650593

10

io aus einem handelsüblichen Präparat mit einer Konzentration von 4100 Iu/mg nach dem Reinigungsverfahren von Bahl,

O.P., J. Biol. Chem. 244: 567,1969, hergestellt, wobei jedoch während des ganzen Reinigungsverfahrens ein pH von 7,4 aufrechterhalten wurde.

Die ß-Untereinheit von hCG wurde hergestellt durch Dissoziation von hCG mit 10 M Harnstoff, gefolgt von Chromatographie auf Säulen mit vernetzten Polysacchariden (DEAE-Sephadex) unter Verwendung eines Schrittgradienten anstelle eines kontinuierlichen Gradienten und Sephadex G-100, nach dem Verfahren von Swaminathan, N., und Bahl, O.P., Biochem. Biophys. Res. Comm. 40: 422, 1970. Behandlung von hCG-ß mit Anti-hCG-a-Immunoadsorbensien.

Um die Entfernung von Spuren von hCG-a oder hCG zu erreichen, wird hCG-ß mit einem Anti-hCG-a-Immunoadsor-bens behandelt. Dieses Immunoadsorbens wurde hergestellt aus gesammeltem Serum von Anti-hCG-a nach dem Verfahren von Avrameas, S., und Ternynck, T., Immunochemistry 6:

53, 1959, und auf Wirkung geprüft durch das Verfahren von Bahl und Mitarb., Biochem. Biophys. Res. Comm. 70: 525,

1976. 2 mg hochgereinigtes hCG-ß in 5 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) wurden mit 10 g (Feuchtgewicht) des Immunoadsorbens während 2 h bei 25 °C behandelt. Das Adsorbens wurde abzentrifugiert und das Sediment wurde mit 10 ml PBS gewaschen. Die überstehende Lösung wurde

Tabelle 1

Bedingungen für die Reduktion und S-Carboxamidomethylierung durch Lyophilisation eingeengt und auf Sephadex G-25 entsalzt.

Radioligand-Rezeptor-Test hCG-ß-Präparate wurden mit Hilfe des RadioliganRezep-tor-Versuchs (RRA) auf Verunreinigungen mit hCG untersucht. Der Test erfolgte unter Verwendung von Rattentestes-Homogenat wie beschrieben in Bellisario, R., und Bahl, O.P., J. Biol. Chem. 250:3837,1975.

Modifikation der Disulfidbrücken durch graduierte Reduktion von hCG-ß und Carboxamidomethylierung.

Zu 0,2 jimol hCG-ß in 3-5 ml 0,5 M tris-HCl-Puffer und pH 8,5, enthaltend 8 M Harnstoff und 2% Äthylendiaminte-traessigsäure wurden 2-25 umol Dithioerythritol gegeben. 15 Das Reaktionsgemisch wurde bei 37 °C während 30 min unter Stickstoff inkubiert, wie beschrieben in Carlsen, R.B., Bahl, O.P., und Swaminathan, W., J. Biol. Chem. 248: 6810, 1973. Nach Zugabe von 5-60 umol Jodacetamid wurde die Inkubation während weiterer 30 min fortgesetzt. Die reduzier-2o ten S-Carboxamidomethyl-Derivate von hCG-ß wurden auf einer Sephadex G-25-Säule entsalzt und die Fraktionen innerhalb des Protein-Peak wurden gesammelt und lyophilisiert. Tabelle 1 illustriert die experimentellen Bedingungen für verschiedene Grade der Bindungsspaltung und Alkylierung. 25 Modifikation von Disulfidbrücken durch Reduktion und

Anteil

Volumen des Anteil von

Anteil von

Anzahl von 1

hCG-ß

Reaktions

Diäthioery-

Jodacetamid S-Carboxy-

(jxmol)

gemisches thritol

(jimol)

amidomethyl-

(ml)

(jimol)

cystein-Resten

0,09

2

1,5

3,0

4,6

0,09

2

1,0

2,4

6,3

0,22

5

2,5

7,5

4,9

0,35

5

4,2

8,4

8,4

0,35

5

21,8

48,6

9,4

0,35

5

42,3

83,8

12,2

1 Bestimmt durch Aminosäureanalyse

S-Carboxymethylierung oder S-Aminoäthylierung von hCG-ß.

Die Reduktion der Disulfidbrücken in hCG-ß erfolgte wie oben beschrieben. Die so gebildeten Sulfhydrylgruppen wurden mit einem 50fachen Überschuss von Jodessigsäure für die S-Carboxymethylierung oder Äthylenimin für die S-Aminoäthylierung nach dem Verfahren von Carlsen und Mitarb. umgesetzt. Die Derivate wurden anschliessend auf einer Sephadex-G-25-Säule entsalzt.

Schutz der Aminogruppen durch O-Carbobenzoxytyrosyl-Reste.

Zu 1,5 ml einer Lösung von 0,1 |imol DS3-hCG-ß in 0,05 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,2 wurden 5 (xmol O-CBZ-L-Tyrosin-N-carboxy-a-aminoanhydrid, gelöst in 0,1 ml Dioxan gegeben. Die Reaktion wurde bei 4 °C während 24 h durchgeführt, worauf das gebildete Derivat O-CBZ-Tyr-hCG-ß durch Entsalzen des Gemisches auf einer Sephadex-G-25-Säule isoliert wurde.

Nach demselben Verfahren wurde auch DSs-Tyrs-hCG-ß hergestellt.

Konjugation von hCG-ß oder seinen Derivaten mit Proteinen.

Die Konjugation von hCG-ß oder seinen Derivaten mit Proteinen erfolgte unter Verwendung des bifunktionellen Reagens Glutaraldehyd nach dem Verfahren von Avrameas,

S., Immunochemistry, 6:43, 1969. In einem typischen Experi-45 ment wurden 4,0 mg hCG-ß mit 4,0 mg Tetanus-toxoid (TT) in 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) vermischt. Wässriger Glutaraldehyd (1%, 0,2 ml) wurde langsam unter Umrühren zugegeben und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 3 h stehengelassen. Nach der Dialyse wurde das 50 polymerisierte Material durch Zentrifugation bei 50 000 g während 30 min abgetrennt und die überstehende Lösung wurde auf einer Säule mit Sephadex G-150 chromatogra-phiert, um freies hCG-ß oder seine Derivate vom TT-Konju-gat TT-hCG-ß abzutrennen. Der relative Anteil von hCG-ß im 55 Konjugat wurde bestimmt durch Subtraktion des Anteils hCG-ß nach der Reaktion von totalem Anteil, verwendet für die Konjugation.

Konjugation von hCG-ß oder seinen Derivaten mit Kaninchen-Albumin, unter Verwendung von Glutaraldehyd. 60 Zu 5,8 mg hCG-ß oder seinen Derivaten und 10 mg Kaninchen-Albumin in 1,0 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH 6,8 wurden 100 ml 1% Glutaraldehyd in kleinen Portionen zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Zimmertemperatur während 3 h stehengelassen, worauf unlösliches 65 polymerisiertes Material durch Zentrifugation bei 15 000 rpm während 15 min entfernt wurde. Nicht umgesetzter Glutaraldehyd und andere Verunreinigungen wurden durch Chromatographieren auf einer Sephadex-G-25-Säule entfernt. Für die

I

11

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Konjugation mit anderen Proteinen wie Hemocyanin und Thyroglobulin kann dasselbe Verfahren verwendet werden.

Konjugation von hCG-ß oder seinen Derivaten mit Hemocyanin, unter Verwendung von Carbodiimid.

5 mg hCG-ß oder ein Derivat davon, 10 mg Hemocyanin und Carbodiimid (1 jimol) wurden in I ml Wasser gelöst. Das pH der resultierenden Lösung wurde mit 0,001 N HCl auf 4,75 gebracht. Die Reaktion erfolgte bei Zimmertemperatur während 60 min. Der Hemocyanin-hCG-ß-Komplex wurde auf einer Sephadex-G-100-Säule, welche mit 0,1 M Ammonium-bicarbonat eluiert wurde, vom freien hCG-ß getrennt.

Modifikation der Carboxylgruppen von hCG-ß durch Koppeln mit Glycin und Tyrosinäthylestern.

Zu 3,5 ml einer wässrigen Lösung von hCG-ß (0,2 ,umol) wurden Glycinäthylester-hydrochlorid oder Tyrosinäthyl-ester-hydrochlorid (1 M) und 7,5 M Harnstoff gegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von l-Äthyl-3-(3-dimethylami-nopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC) in einer Konzentration von 0,07 M, gestartet. Das pH wurde während der Reaktion durch Zugabe von 0,1 N HCl auf 4,75 gehalten. Nach 60 min wurde ein gleicher Anteil Carbodiimid zugegeben, wodurch die Endkonzentration auf 0,14 M anstieg. Die Reaktion wurde während weiterer 60 min durchgeführt, worauf sie durch Zugabe von festem Ammoniumcarbonat beendigt wurde.

Bestimmung des Ausmasses der Modifikation durch Aminosäureanalyse.

Um das Ausmass der Modifikation von hCG-ß-Derivaten zu bestimmen, wurden 50-150 |ig davon für Aminosäureanalyse hydrolysiert mit 0,5-1 ml 5,7 N HCl in evakuierten verschmolzenen Röhrchen bei 110 °C während 24 h. Nach Entfernen der Säure im Rotationsverdampfer wurde das Hydro-lysat auf einem automatischen Aminosäure-Analysator Spin-col Modell 120C mit Bereichsexpander in der Schreibeinrichtung analysiert. Der Proteingehalt der Proben wurde berechnet aus den Anteilen von Asparaginsäure oder Glutaminsäure, erhalten aus der Aminosäureanalyse und aus der Anzahl Reste, wie sie gemäss der Aminosäuresequenz von hCG-ß bekannt ist.

Multiple Modifikationen von hCG-ß.

hCG-ß wurde zuerst nach einem der genannten Verfahren modifiziert. Die resultierenden einfach-modifizierten hCG-ß-Derivate wurden unter Verwendung anderer Blockierungsmittel unter den geeigneten Bedingungen weiter modifiziert. Die dabei erhaltenen Derivate mit 2facher Modifikation wurden anschliessend mit Tetanus-toxoid oder anderen Proteinen, unter Verwendung von Glutaraldehyd, konjugiert. Alle diese Derivate wurden zu jedem Stadium durch Aminosäureanalyse charakterisiert.

Beispiel 2

Dieses Beispiel illustriert die Bestimmung der immunolo-5 gischen Aktivität der modifizierten ß-Untereinheit von Human-Chorion-Gonadotropin.

Herstellung der Antisera

Antisera auf hCG-a, hCG-ß, hCG und hLH wurden in io männlichen Neuseeland-Kaninchen hergestellt. Die Immunisierung erfolgte gemäss Avrameas und Ternynck um einen hohen Titer und einen hochaffinen Antikörper zu erhalten. Für RIA wurden die Antisera von mehr als einem Kaninchen verwendet. Der Antikörper-Titer wurde gemessen durch Verls wendung von l25I-markierten Hormonen.

Radioimmunotests für hCG, hCG-ß und hLH. hCG, hCG-ß und seine Analogen für hLH wurden mit Na125I jodiert, nach dem Chloramin-T-Verfahren, beschrieben in Bellisario und Mitarb. Die Durchführung der Radio-2o immunotests (RIA) erfolgte wie beschrieben in Tomoda, Y. und Hreschchyshyn, M.M., Amer. J. Obst. Gynae., 100: 118, 1962, wobei jedoch die Inkubationszeit entweder 16 h bei 25 °C oder 2 h bei 37 °C, gefolgt von 16 h bei 4 °C, betrug. Die freien und die antikörpergebundenen Hormone wurden 25 durch äthanolische Ammoniumacetatlösung oder nach der Doppelantikörpertechnik unter Verwendung von Schaf-Anti-Kaninchen-y-Globulin wie beschrieben in Vaitukaitis, J. L, und Mitarb., Amer. J. Obst. Gynae. 113: 751, 1972, getrennt. Die relativen Aktivitäten von hCG-ß oder seinen Derivaten 30 wurden in dem hCG-ß-Anti-hCG-ß-System (hCG-ß-System) durch Messen ihres Vermögens zum Ersetzen von 50% von 125I-hCG-ß ermittelt. In einigen Fällen wurde das hCG-Anti-hCG-System ebenfalls verwendet. Zur Bestimmung der Kreuzreaktivität der hCG-ß-Derivate mit hLH wurde das l25I-35 hLH-Anti-hLH-System (hLH-System) verwendet.

Die Ergebnisse der Bestimmung der Reduktionswirkung und Alkylierung auf die Disulfidbrücken sind in Tabelle 2 wiedergegeben. In Tabelle 2 sind die einzelnen Modifikationen von hCG durch vorangestellte Buchstabengruppen iden-40 tifiziert. Dabei bedeutet DS3-, dass drei Disulfidbrücken gespalten und mit Carboxamidomethyl-Gruppen alkyliert wurden; DS4-Cm- bedeutet, dass vier Disulfidbrücken aufgespalten und mit Carboxymethylgruppen alkyliert wurden; DSs-Ae- bedeutet, dass fünf Disulfidbrücken gespalten und « mit Äthylenimin alkyliert wurden. Die erhaltenen Ergebnisse bei oxidativer Spaltung der Disulfidbrücken werden wiedergegeben unter DSs-Sul-hCG-ß, wobei 5 der Disulfidbrücken in S03H-Gruppen gespalten wurde.

Tabelle 2

Wirkung von Reduktion von Alkylierung der Disulfidbrücken auf die immunologische Aktivität von hCG-ß

hCG-ß/Derivat

Anzahl gespaltener Disulfidbrücken

Alkylierungsmittel prozentuale Aktivität hCG-ß-System hLH-System

Verhältnis hCG-ß/hLH

hCG-ß

0,0

-

100

100 (4,5)

1,0

DS3-hCG-ß'

2,9

Jodacetamid

35,0 1,8

16 0,5 (0,72)

2,0

DS4-hCG-ß

4,2

Jodacetamid

8,0 1,0

0,2 0,05 (0,01)

40,0

DSs-hCG-ß

4,9

Jodacetamid

6,5 0,1

0

CO

DSö-hCG-ß

6,0

Jodacetamid

0

0

_

DS4-Cm-hCG-ß

4,5

Jodessigsäure

42,8

5,6 (0,25)

7,6

DSö-Cm-hCG-ß

6,0

Jodessigsäure

0

0

-

DSs-Ae-hCG-ß

5,2

Äthylenimin

6,6

2,0 (0,09)

3,3

DSs-Sul-hCG-ß

4,8

Perameisensäure

0,3

0,03 (0,001)

10,0

(Oxidationsmittel)

1 Die in Klammern wiedergegebenen Zahlen stellen die Anzahl modifizierter Disulfidgruppen dar, berechnet aus den S-Car-boxymethylcystein-, S-Aminoäthylcystein- und Cysteinsäureresten, erhalten bei der Aminosäureanalyse.

2 Die in Klammern wiedergegebenen Zahlen stellen die Werte der LH-Aktivität von hCG-ß oder seinen Derivaten in einem ,25IhLH-Anti-hLH-System dar, wobei hLH in diesem System eine Aktivität von 100 zugeordnet wird.

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12

Tabelle 3 zeigt Wirkung von mehrfachen Modifikationen auf die immunologische Aktivität von hCG-ß. In dieser Tabelle wiedergegebene vorangestellte Buchstaben haben dieselbe Bedeutung wie in Tabelle 2 und Tyr stellt einen O-Car-

bobenzoxytyrosyl-Substituenten dar. Gee bedeutet Glycin-äthylestergruppe, Tee bedeutet eine Tyrosinäthylestergruppe und alb bedeutet Konjugation mit Albumin.

Tabelle 3

Wirkung mehrfacher Modifikationen auf die immunologische Aktivität von hCG-ß

hCG-ß/Derivat Anzahl gespaltene Anzahl modifizierter Amino- Prozentuale Aktivität Verhältnis

Disulfidbrücken oder Carboxylgruppen hCG-ß-System hLH-System hCG-ß/hLH

-NHi -COOH

hCG-ß

0

-

-

100

100 (4,5)

1

DSj-Tyrs-hCG-ß1

2,9

5,2

-

4,50

0,10(0,004)

45

DSj-Tyrs-TTi-hCG-ß

2,9

5,2

1,0

1,80 ±0,1

0

OO

Gee2o-DS3-TT,-hCG-ß

3,1

1,0

20,0

1,60 + 0,1

0,80 (0,003)

20

Tee5-DS4-TT.-hCG-ß

3,7

1,2

5,2

0,28 + 0,003

0,01 (0,0004)

28

DSs-Tees-TT.-hCG-ß

5,0

u

5,2

0,17 + 0,05

0

OO

DS5-hCG-ß-Hemocyanin

5,0

-

-

18,0

-

OO

DS>TTi-hCG-2

3,1

-

-

51,0

22,0

2,3

DSa-Tyrs-TTihCG-ß

3,1

5,2

-

32,0

-

OO

Gee2o-DS3-TT,-hCG-ß

3,1

-

20,0

32,0

7,0

4,6

DSs-hCG-ß-alb.

6,0

-

-

18,0

-

CO

DSe-hCG-ß-Hemocyanin

6,0

-

-

8,0

-

OO

DS6-hCG-2-thyroglobulin

6,0

-

-

8,0

-

OO

1 Die Derivate werden abgekürzt bezeichnend gemäss der Reihenfolge der Modifikation. Als Indizes gegebene Zahlen stellen die Anzahl der modifizierten oder konjugierten Gruppen dar.

2 Die in Klammern wiedergegebenen Zahlen haben die gleiche Bedeutung wie in Tabelle 2.

Beispiel 3

Dieses Beispiel illustriert das Verfahren zur Herstellung eines Antiserums durch sukzessive Verabreichung von zwei verschiedenen Antigenen.

Ein Antiserum wurde hergestellt durch Verabreichung bei einem männlichen Neuseeland-Kaninchen eines ersten Antigens, hergestellt durch Isolieren der ß-Untereinheit von hCG, Reduzieren und Aufspalten von fünf der intrakettigen Disulfidbrücken der ß-Untereinheit, Alkylieren der so reduzierten intrakettigen Disulfidgruppen und Isolieren des dabei produzierten Antigens (DSs-hCG-ß), oder durch Verabreichung von DSs-hCG-ß, konjugiert mit einem Protein oder Hapten, worauf bei demselben Tier ein zweites Antigen verabreicht wird, welches in gleicher Weise wie das erste hergestellt wurde, bei dem jedoch sechs der intrakettigen Disulfidgruppen reduziert und aufgespalten wurden. Das aus dem Tier entnommene Antiserum wurde nach dem Radioimmunotestverfahren getestet und zeigte 22%ige Bindung im ,25I-hCG-ß-System und keine Bindung im 125I-hLH-System. Das hCG-ß/hLH-Bin-dungsverhältnis betrug deshalb oo.

Immunotestverfahren

Feste Radioimmunotest-Schläuche wurden wie folgt hergestellt:

1. Polystyrolschläuche wurden mit Puffer plus Antikörper-, das Antiserum - stammend aus Kaninchen, immunisiert mit dem modifizierten erfindungsgemässen hCG-ß, beschichtet.

2. Nach einer halben Stunde wurden die Schläuche geleert und dreimal mit normaler Kochsalzlösung gewaschen.

3. 10 ml von 10%igem männlichem Normalserum in Boratpuffer wurden während 10 min in die Schläuche gebracht. Diese Schläuche können unter der Voraussetzung, dass sie gekühlt werden, in der Nacht vorher hergestellt werden.

4.10 Standardschläuche wurden hergestellt mit 0,6 ml Boratpuffer in jedem Schlauch. Anschliessend wurden 0,6 ml hCG-Standardlösung (2 ug/ml) zum ersten Schlauch gegeben und mit abnehmender Verdünnung auf die weiteren Schläuche verteilt, so dass Konzentrationen von 2000 ng von hCG 35 bis 4 ng hCG und 0 hCG im letzten Schlauch vorlagen.

5. 0,1 ml männliches Normalserum wurde in jeden Schlauch gegeben, um das Volumen auszugleichen.

6. Das Serum oder der Urin des Patienten wurde jeweils in ein Paar Schläuche gebracht. Dabei wurden 0,1 ml des

40 Serums des Patienten in jedem von zwei Schläuchen gegeben.

7. Zugabe von 0,2 ml 125I-hCG (50 000 cpm).

8. Inkubation der Schläuche während 90 min bei 37 ° C. Nach Entleeren der Schläuche und dreimaligem Waschen mit normaler Kochsalzlösung wurden sie in einem y-Zähler

45 gezählt.

Dieser Test wurde mit 544 Proben durchgeführt, wobei 184 Tests positiv und 360 Tests negativ waren.

Von den 184 Patienten mit positivem Test hatten 65 Patienten ihre Schwangerschaft abgebrochen. 29 hatten einen so spontanen Abort und bei 7 wurde eine ektopische Schwangerschaft festgestellt. 80 Patienten wurden entweder entbunden oder setzten ihre Schwangerschaft fort. Bei den verbleibenden 3 positiven Tests ist die weitere Entwicklung unbekannt.

Von den positiven Ergebnissen war keines falsch, wäh-55 rend bei den negativen Testergebnissen 3 nicht richtig waren. Diese waren spontane Aborte, die innerhalb 48 h vor oder nach dem negativen hCG-Test auftraten. Wir nehmen an,

dass diese Aborte vor den hCG-Tests auftraten und dass die Placenta deshalb kein hCG mehr produzierte. Auch mit die-60 sen 3 falschen negativen Ergebnissen erweist sich im Test eine Genauigkeit von 99,5%.

Dieser hCG-Test erlaubte die Voraussage von 17 der 29 spontanen Aborte durch die gemessenen niedrigen Werte von hCG. Niedere Werte wurden gefunden bei 4 der 7 ektopi-65 sehen Schwangerschaften. Von diesen 4 wurden 3 operiert, und die Patienten vermieden eine Salpingektomie. In zwei Fällen wurde eine Salpingostomie durchgeführt, und die fal-lopischen Tuben wurden mit nur einer oder zwei Nähten

13

650593

behandelt. In einem Fall wurde der Keimling aus dem verwachsenen Ende des Eileiters abgesogen, und der Eileiter wurde nicht verletzt. Die übrigen ektopischen Schwangerschaften waren zum Zeitpunkt der Operation alle abgebrochen.

Gleiche Resultate können mit den folgenden modifizierten hCG-ß-Proteinen (Tabelle 3) erhalttlen werden:

DS5-hCG-ß-hHemocyanin DSs-hCG-ß-thyroglobulin DSs-hCG-ß-anti-hLH DSe-hCG-ß-hemocyanin 5 DSs-hCG-ß-thyroglobulin DSö-hCG-ß-adjuvans-peptid.

G

Claims (42)

1. 650 593

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Herstellung eines Antigens, welches bei Verabreichung bei einem Wirttier eine Antikörperreaktion verursacht, welche bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv ist, in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass die Beta-Untereinheit von Human-Chorion-Gonadotropin isoliert wird, drei bis sechs der intrakettigen Disulfid-Brücken der Beta-Unter-einheit reduktiv gespalten werden, die aus der Spaltung der Disulfid-Gruppen resultierenden Mercaptogruppen zur Einführung einer gegebenenfalls substituierten Alkylgruppe entsprechend alkyliert werden, das erhaltene Produkt, vor oder nach der reduktiven Spaltung der Disulfid-Brücken und Alkylierung der Mercaptogruppen, mit einem Protein oder Hapten konjugiert wird, wodurch die immunogenetische Potenz vergrössert wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, worin sechs der intrakettigen Disulfid-Brücken reduktiv gespalten werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, worin fünf der intrakettigen Disulfid-Brücken reduktiv gespalten werden.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, worin vier der intrakettigen Disulfid-Brücken reduktiv gespalten werden.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, worin drei der intrakettigen Disulfid-Brücken reduktiv gespalten werden.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Protein oder Hapten Albumin, Hämocyanin, Thyroglobulin oder Muramylalanylisoglutamin ist.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Beta-Untereinheit in der Weise isoliert wird, dass Human-Chorion-Gonadotropin mit einer zehn molaren wässrigen Harnstofflösung in Alpha- und Beta-Untereinheiten disso-ziert wird, dass die so disozierten Human-Chorion-Gonado-tropin-Fraktionen nacheinander aus Säulen mit vernetztem modifiziertem Polysaccharid unter Verwendung eines Stufengradienten und auf einer Säule mit vernetztem Polydextran chromatographiert werden, wobei die genannte Beta-Unter-einheit isoliert und mit einem Imunoadsorbens, welches die Alpha-Untereinheit adsorbiert, behandelt wird.
8. 8. Antigen, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-7.
9. 9. Verfahren zur Herstellung eines Antigens mit einer blockierten terminalen Carboxygruppe, welches bei Verabreichung bei einem Wirttier eine Antikörperreaktion verursacht, welche bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv ist in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Antigen gemäss einem der Ansprüche 1-7 herstellt und das erhaltene Antigen durch Reaktion der terminalen Carboxygruppe mit einem Nucleo-phil modifiziert wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Nucleophil Tyrosinäthylester oder Glycinäthylester ist.
11. 11. Antigen hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 9 oder 10.
12. 12. Verfahren zur Herstellung eines Antigens, welches bei Verabreichung bei einem Wirttier eine Antikörperreaktion induziert, welche bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv ist in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass die Beta-Unter-einheit von Human-Chorion-Gonadotropin isoliert wird, sechs der intrakettigen Disulfid-Brücken der Beta-Untereinheit reduzierend aufgespalten werden und die durch die Aufspaltung resultierenden Mercaptogruppen zur Einführung einer gegebenenfalls substituierten Alkylgruppe entsprechend alkyliert werden.
13. 13. Antigen hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 12.
14. 14. Verfahren zur Herstellung eines Antigens mit einer blockierten terminalen Carboxygruppe, welches bei Verabreichung bei einem Wirttier eine Antikörperreaktion verursacht, welche bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv ist in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass das nach dem Verfahren 5 gemäss Anspruch 12 erhaltene Antigen durch Reaktion der terminalen Carboxygruppe mit einem Nucleophil modifiziert wird.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Nucleophil Tyrosinäthylester oder Glycinäthylester ist.

    io 16. Antigen hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 14 oder 15.
16. 17. Verfahren zur Herstellung eines Antigens, welches bei Verabreichung bei einem Wirttier eine Antikörperreaktion verursacht, welche bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin 15 selektiv ist, in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass die Beta-Unter-einheit vom Human-Chorion-Gonadotropin isoliert wird, drei bis sechs der intrakettigen Disulfid-Brücken der Beta-Untereinheit oxidativ gespalten werden.

    20 18. Verfahren zur Herstellung eines Antigens, welches bei Verabreichung bei einem Wirttier eine Antikörperreaktion verursacht, welche bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv ist, in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass die Beta-Unter-25 einheit von Human-Chorion-Gonadotropin isoliert wird, drei bis sechs der intrakettigen Disulfid-Brücken der Beta-Untereinheit oxidativ gespalten werden und die Beta-Untereinheit anschliessend mit einem Protein oder Hapten konjugiert wird, wodurch die Antikörperreaktion bezüglich des Antigens 30 bei Verabreichung desselben an ein Wirttier, vergrössert wird.
17. 19. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums, welches bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv reagiert in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass das nach dem Verfahren

    35 gemäss Anspruch 12 erhaltene Antigen wiederholt einem Wirttier verabreicht wird, in Dosierungen, welche keine signifikante Antikörperreaktion hervorrufen und die wiederholte Verabreichung so oft wiederholt wird, bis das Wirttier eine Antikörperreaktion bezüglich des Antigens aufweist, und 40 worauf das Antiserum dem Wirttier entnommen wird.
18. 20. Antiserum erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 19.
19. 21. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums, welches bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv reagiert in

    45 unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 2 erhaltene Antigen wiederholt einem Wirttier verabreicht wird, in Dosierungen, welche keine signifikante Antikörperreaktion hervorrufen, und die wiederholte so Verabreichung so oft weitergeführt wird, bis das Wirttier eine Antikörperreaktion bezüglich des Antigens aufweist, und worauf das Antiserum dem Wirttier entnommen wird.
20. 22. Verfahren nach Anspruch 21, worin das Antigen konjugiert ist mit einem Protein oder Hapten, ausgewählt aus der

    55 Gruppe Albumin, Hämocyanin, Thyroglobulin und Muramylalanylisoglutamin.
21. 23. Antiserum erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 21 oder 22.
22. 24. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums, welches 60 bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv reagiert in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass ein erstes Antigen einem Wirttier verabreicht wird, wobei dieses erste Antigen durch Isolieren der Beta-Untereinheit von Human-Chorion-Gonadotro-65 pin, reduktive Aufspaltung von fünf der intrakettigen Disulfid-Gruppen der Beta-Untereinheit und Alkylierung der durch die Aufspaltung resultierenden Mercaptogruppen erhalten wird, worauf dem gleichen Wirttier als zweites Anti-

    3

    650593

    gen das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 12 erhaltene Antigen verabreicht wird, worauf ein Antiserum des ersten und zweiten Antigens produziert wird, das dem Wirttier entnommen wird.
23. 25. Antiserum erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 24.
24. 26. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums, welches bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv reagiert in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 3,4 oder 5 erhaltene Antigen einem Wirttier verabreicht wird, wobei dieses Wirttier eine Antikörperreaktion bezüglich des entsprechenden Antigens produziert und das Antiserum dem Wirttier entnommen wird.
25. 27. Verfahren nach Anspruch 26, worin das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 3 erhaltene Antigen verwendet wird.
26. 28. Verfahren nach Anspruch 27, worin das Antigen konjugiert ist mit einem Protein oder Hapten, ausgewählt aus der Gruppe Albumin, Hämocyanin, Thyroglobulin und Muramylalanylisoglutamin.
27. 29. Verfahren nach Anspruch 26, worin das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 4 erhaltene Antigen verwendet wird.
28. 30. Verfahren nach Anspruch 29, worin das Antigen konjugiert ist mit einem Protein oder Hapten, ausgewählt aus der Gruppe Albumin, Hämocyanin, Thyroglobulin und Muramylalanylisoglutamin.
29. 31. Verfahren nach Anspruch 26, worin das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 5 erhaltene Antigen verwendet wird.
30. 32. Verfahren nach Anspruch 31, worin das Antigen konjugiert ist mit einem Protein oder Hapten, ausgewählt aus der Gruppe Albumin, Hämocyanin, Thyroglobulin und Muramylalanylisoglutamin.
31. 33. Antiserum erhalten nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 26-32.
32. 34. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums, welches bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv reagiert in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 14 erhaltene Antigen wiederholt einem Wirttier verabreicht wird, in Dosierungen, welche keine signifikante Antikörperreaktion hervorrufen, und die wiederholte Verabreichung weitergeführt wird, bis das Wirttier eine Antikörperreaktion bezüglich des Antiserums aufweist, und worauf das genannte Antiserum dem Wirttier entnommen wird.
33. 35. Verfahren nach Anspruch 34, worin das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 15 erhaltene Antigen verwendet wird.
34. 36. Antiserum erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 34 oder 35.
35. 37. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums, welches bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv reagiert in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass ein nach dem Verfahren gemäss Anspruch 3,4 oder 5 erhaltenes Antigen durch Reaktion der terminalen Carboxygruppe mit einem Nucleophil umgesetzt wird, und das erhaltene an der terminalen Carboxygruppe blockierte Antigen einem Wirttier verabreicht wird, wobei dieses Wirttier eine Antikörperreaktion bezüglich des Antigens erzeugt, und das Antiserum dem Wirttier entnommen wird.
36. 38. Verfahren nach Anspruch 37, worin das Nucleophil Tyrosinäthylester oder Glycinäthylester ist.
37. 39. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, worin das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 3 erhaltene Antigen verwendet wird.
38. 40. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, worin das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 4 erhaltene Antigen verwendet wird.
39. 41. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, worin das nach

    5 dem Verfahren gemäss Anspruch 5 erhaltene Antigen verwendet wird.
40. 42. Antiserum erhalten nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 37-41.
41. 43. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums, welches io bezüglich Human-Chorion-Gonadotropin selektiv reagiert in unterscheidbarem Ausmass von luteinisierendem Hormon, dadurch gekennzeichnet, dass das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 17 oder 18 erhaltene Antigen einem Wirttier verabreicht wird, wobei das Wirttier einen Antikörper auf 15 das Antigen produziert und, worauf das Antiserum, das die Antikörper enthält, dem Wirttier entnommen wird.
42. 44. Antiserum erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 43.