CH651068A5

CH651068A5 - Methode de determination d'enzymes.

Info

Publication number: CH651068A5
Application number: CH4978/84A
Authority: CH
Inventors: Anthony Charles Richardson; Percy Francis George Praill; Robert Graham Price
Original assignee: Nat Res Dev
Priority date: 1977-11-01
Filing date: 1978-10-31
Publication date: 1985-08-30
Also published as: IT1109621B; DE2857145C2; DK484278A; JPS54500072A; IT7869517A0; CA1190223A; CA1181331A; WO1979000255A1; GB2008103A; NL7810846A; DE2858733C2; GB2008103B; JPH0238199B2; US4318986A; GB2079450B; CH651319A5; DE2857145T1; GB2079450A; BE871717A; EP0007372A1

Description

Cette invention se rapporte à une méthode pour la détermination d'enzymes.

La présence ou l'absence de certains enzymes dans des échantillons physiologiques tels que l'urine ou des échantillons de sérum de patients humains est un indicateur valable de maladie ou déficiences dans l'organisme concerné, par exemple de mauvais fonctionnements d'organes chez des patients humains. Par exemple, une augmentation dans la teneur de l'enzyme N-acétyl-P-D-glucosaminidase (NAG) excrété dans l'urine de patients à «rein transplanté» est un signe précoce d'un rejet imminent du rein transplanté, à part le fait d'être un indicateur général d'affections rénales et autres. Actuellement, le test clinique habituel pour le NAG implique l'incubation d'un échantillon d'urine avec le substrat d'enzyme méthyl-4 umbelliferyl glycoside qui interagit pour libérer l'umbellifêrone correspondante qui est contrôlée par fluori-métrie. Alternativement, un substrat nitrophényl glycoside, le p-nitrophényl acétamido-2 déoxy-2 ß-D-glucopyranoside, peut être utilisé, celui-ci interagissant avec l'enzyme pour libé-5 rer le p-nitrophénol qui est contrôlé par colorimétrie. Toutefois, ces deux tests exigent l'utilisation d'un appareillage spec-trophotométrique sophistiqué et sont donc seulement convenables à utiliser s'il y a accès aux facilités d'un laboratoire bien équipé.

10 De nouvelles méthodes de détermination d'enzymes ont été conçues qui, dans certains cas, peuvent être utilisées sans avoir recours à l'emploi d'un appareillage de contrôle compliqué.

Selon l'invention, la méthode de détermination d'enzyme 15 consiste en l'incubation d'un échantillon contenant l'enzyme avec un substrat capable d'interagir avec ledit enzyme pour donner lieu à la formation d'un composé pouvant être contrôlé, ladite méthode étant caractérisée en ce que le composé sus-mentionné est défini par la formule HX-A-Y-N02 dans 20 laquelle A représente un noyau aromatique, HX un groupe auxochrome et Y est un grupe capable de transmettre la résonance entre le noyau aromatique (A) et le substituant nitro (N02), ledit composé étant en outre capable de lui-même de produire un signal visuel facilement discernable à l'œil.

Typiquement, le substrat comprend une portion de substrat enzymatique et une autre portion libérale donnant lieu à la formation d'un composé de formule HX-A-Y-N02. D'habitude, le substrat selon l'invention comprend un groupe de formule X-A-Y-N02 ou un simple précurseur, en combinai-30 son avec la portion enzymatique et, par interaction avec l'enzyme, le substrat libère le composé ou le simple précurseur. Ainsi, le groupe X-A-Y-N02 ou le précurseur est habituellement attaché ou adjacent au côté intérieur du substrat enzymatique où se produit l'activité enzymatique. En prati-35 que, la portion de substrat enzymatique et la portion libérable sont convenablement liées par le groupe auxochrome X et la substance a la formule générale S'-X-A-Y-N02 où S'consiste en la portion de substrat enzymatique de la substance et X, A, Y sont selon la définition précédente; de tels substrats libèrent 40 le composé par interaction avec l'enzyme.

La méthode selon l'invention est largement applicable à la détermination des enzymes en général, la portion de substrat enzymatique de la substance étant variée conformément à 45 l'enzyme particulier que l'on désire déterminer. Toutefois et typiquement, les enzymes pouvant être déterminés par l'invention sont des enzymes cataboliques, tels que ceux qui jouent un rôle important dans la dégradation de macromolécules dans les tissus cellulaires. Par exemple, les enzymes qui peu-50 vent être déterminés comprennent des lipases et estérases de type carboxylate, des phosphatases acides et alcalines, des phoshodiestérases et sulphatases et ainsi des substrats correspondants peuvent contenir des groupes esters appropriés de type carboxylate, phosphate, diphosphate et sulphate. De 55 même, en particulier, l'invention est applicable à la détermination de glycosidases, cas dans lequel la portion S'de substrat est un substituant glycosyle d'hydrate de carbon correspondant comme un substituant a ou ß-glucopyranosyle, -ga-lactopyranosyle ou -manopyranosyle. Par exemple, l'inven-60 tion se trouve être particulièrement convenable dans l'application de la détermination du N-acétyl ß-D-glucosaminidase (NAG).

L'invention peut être employée pour détecter la présence, en général, d'enzymes et pour contrôler le niveau de concen-65 tration, par exemple, dans le diagnostic d'une insuffisance ou maladie correspondante. Par exemple, le contenu de l'urine en NAG peut être déterminé pour la détection précoce d'une affection rénale ou dans un cas spécifique comme indicateur

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avancé d'un rejet rénal chez des patients à «rein transplanté». Alternativement, l'invention peut être utilisée pour déterminer l'absence d'enzymes pouvant être, par exemple, indicateurs de certains désordres génétiques. De même, généralement, la méthode de l'invention peut apporter des outils commodes dans l'usage de la recherche biochimique et médicale.

De préférence, le composé HX-A-Y-N02 est capable de produire un changement de couleur facilement perceptible à l'œil et, sous ce dernier rapport, la couleur produite est typiquement substantiellement différente de la couleur de fond de l'échantillon. Par exemple, des sbustrats utilisables avec des échantillons d'urine, comme les substrats de détermination du NAG, libèrent typiquement des substances capables de produire des couleurs substantiellement différentes de la couleur de fond de l'urine. Préférentiellement, les substrats libèrent des composés qui sont capables de produire des couleurs distinctes, de préférence rouges ou bleues. Ainsi, des composés libérés convenables ont habituellement un X max sous des conditions alcalines dans la limite de 450 à environ 700, de préférence d'environ 500 à environ 600, surtout en combinaison avec un coefficient d'extinction élevé, à savoir un e plus grand qu'environ 20 000.

Il sera apprécié qu'à l'intérieur de la formule générale des composés HX-A-Y-NO2 il existe plusieurs composés colorés et colorants typiques et des composés convenables fournissant le signal visuel facilement perceptible qui sera apparent à des travailleurs compétents dans le domaine. De préférence, toutefois, le groupe A consiste en un noyau aromatique monocyclique, spécialement un noyau benzénique.

Le groupe Y peut aussi comprendre tout grupe insaturé convenable capable de transmettre la résonance élctronique entre A et le substituant N02 et peut inclure des systèmes contenant des hétéroatomes et/ou des systèmes annulaires. Ainsi, par exemple, le groupe A peut comprendre un noyau benzène qui est un cycle du noyau naphtalène l'autre cycle du noyau napthalène fournissant le groupe Y. Le Groupe Y peut aussi comprendre une insaturation acétylénique. Plus préférable-ment, toutefois, le groupe Y comprend une insaturation éthy-lénique qui est conjuguée par rapport au noyau aromatique A, à savoir un substituant éthényle, butadiényle, ou hexatrié-nyle. Ainsi, dans une mise en application préférée, le réactif de l'invention est capable d'interagir avec l'enzyme pour donner naissance à un composé de formule I

II

10

où R1, R2, R3 et R4 sont comme définis plus haut. Les composés de formule II manifestent en général des propriétés de couleur surprenantes et hautement désirables ce qui fait que les substrats générateurs de ces couleurs sont particulièrement commodes dans leur application à la détermination d'enzymes. Il a été trouvé que les composés de formule II sont typiquement de couleur rouge foncé sous des conditions alcalines par comparaison avec la couleur orange-jaune faible du p-ni-trophénol et aussi qu'ils ont des maxima d'absorbance (k max) qui sont de manière inattendue et de façon significative plus élevés que ceux du p-nitrophénol (~400 sous des conditions alcalines). On pense maintenant que ces propriétés de 25 couleur renforcées sont dues à la formation d'un ion radical résultant d'un processus d'oxydation, comme montré plus bas.

30

35

-NOl

L'existence de substituants donneurs d'électrons comme les groupes alkoxy, p.ex. méthoxy adjacent au substituant hy-droxyle paraît stabiliser la formation de cet ion radical, ce qui 4o est corroboré par les propriétés de couleur des analogues mé-thoxy-3 et spécialement diméthoxy-3,5-montrés plus bas sous les formules respectivement III et IV et sur lesquels, les substrats préférés sont basés.

m

IV

45

50

OMe

OMe où X est ce qui a été défini précédemment, n = 1,2 ou 3 et R1, R2, R3 et R4 = H, OMe, N02, CH3, -CH = CR'R" ou C02H.

Les groupes R' et R" du substituant-CH = CR'R"peuvent représenter OMe, CH3, C02H ou, de préférence, H, N02 ou une autre substitution conjuguée insaturée, à savoir de formule -CH=CR'R" où R' et R" représentent chacun H, OMe, N02, CH3 ou C02H.

En pratique, de manière particulièrement préférée, A consiste en un groupe styryle. Ainsi, des substrats particulièrement préférés selon l'invention sont ceux qui, par interaction avec l'enzyme donne lieu à la formation d'un composé hydro-xy-4ra-nitrostyrène, à savoir de formule II, plus bas,

Ainsi, le composé mono-méthoxy III et le composé dimé-thoxy IV ont des maxima d'absorbance (X max) de 506 et 530 avec des coefficients d'extinction (e) de 24 600 et 22 300 respectivement dans un milieu tampon de pH 8,8; ils manifestent 55 des colorations rouge écarlate satisfaisantes sous ces conditions.

Commodément, le résidu X du groupe auxochrome HX, p.ex. -OH, peut fournir le lien entre le groupe X-A-Y-N02 et la portion enzymatique du substrat, de telle manière que le 60 composé soit libéré lors de l'interaction avec l'enzyme. Ainsi, des exemples de réactifs selon l'invention sont donnés dessous par les formules A à E qui se réfèrent, dans un but de simplicité, seulement à des réactifs comprenant un substituant simple hydroxy-4ro -nitrostyryle. On appréciera, cependant, que 65 ce dernier substituant peut être remplacé par un substituant se rapportant aux composés HX-A-Y-N02 en général.

Ces substrats sont convenables pour la détermination d'estérases ou lipases (A), de phosphatases acides ou alcalines

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(B), de phosphodiestérases (C), d'arylsulphatases (D) et de glycosidases (E) respectivement. Rz dans la formule E exprime un substituant Hydrate de carbone de type a ou ß-gluco-pyranosyle, -galactopyranosyle ou -mannopyranosyle.

En accord avec l'invention, il a été trouvé que les réactifs préférés nitrostyryle substitués peuvent être préparés à partir de vanilline ou de produits similaires basés sur l'hydroxybenz-

CH 3—c aldéhyde ou salicylaldêhyde ou à partir du p-hydroxybenzal-déhyde, lui-même, par nitrométhylation du produit d'addition substrat-vanilline ou -composé similaire. On utilise, de préférence, des conditions alcalines douces durant la nitro-5 méthylation. Il y a des raisons de croire que des réactifs similaires se laissent préparer par des routes correspondantes semblables.

B.

0

II

KO—S

0

Les échantillons qui peuvent être déterminés sont commodément sous forme liquide et incluent des échantillons comprenant des liquides physiologiques, tels que le sérum ou l'urine. D'autres échantillons convenables peuvent aussi être déterminés comprenant des échantillons provenant d'homo-génats cellulaires commes ces échantillons utilisés communément dans l'étude de désordres génétiques.

Le substrat et l'échantillon sont uncubés ensemble; par exemple, l'échantillon et la solution contenant le substrat sont mélangés et on les laisse interagir sous des conditions appropriées pour une période de temps convenable. De préférence, la température utilisée durant l'incubation est plus élevée que

60

65

30° C, à savoir de 30 à 40° C et, sous ces conditions, une période d'incubation jusqu'à 30 minutes, à savoir de 10 à 15 jusqu'à 30 minutes, est habituellement satisfaisante. Comme alternative à l'utilisation du substrat en solution, on peut utiliser le réactif en association, à savoir absorbé avec un matériel à phase solide convenable comme des particules de cellulose, c'est-à-dire de la cellulose microcristalline, ce qui peut surmonter avantageusement des problèmes résultant de l'insolubilité ou de la faible solubilité du substrat. Ce dernier peut être utilisé également avec un matérial à supporter solide poreux, comme le papier, afin de fournir un papier test commode ou une tige de plongée pour un simple test d'immersion.

Lors de l'incubation, le substrat libère ou plus généralement donne lieu à la formation d'un composé qui peut, sans autre traitement, forunir le signal visuel, à savoir la couleur qui est révélatrice de la présence de l'enzyme dans l'échantillon. Souvent, toutefois, le composé nécessite un traitement ultérieur pour développer le signal visuel et un tel traitement comprend typiquement une activation pour développer le signal visuel inhérent du composé. Ce traitement ultérieur ne comprend pas d'étapes de chimie synthétique ou preparative comme les procédés de couplage diazonium utilisés antérieurement avec quelques réactifs donnés. Communément, le traitement comprend un traitement alcalin qui peut conduire à la formation de sel permettant la délocalisation de la charge électronique, par exemple, le traitement alcalin de substances préférées à chromophore insaturé conjugué donnant lieu avantageusement au développement de signaux visuels colorés. Le traitement alcalin peut comprendre l'addition d'alcali à une solution contenant le composé libéré ou, de préférence, une solution contenant le composé est mise en contact avec un réactif à phase solide, à savoir un absorbant qui présente simultanément un environnement alcalin au composé. Par exemple, la solution contenant le composé est mise en contract avec un matérial d'échange anionique qui est préférablement de couleur neutre, à savoir blanc ou légèrement coloré et qui se trouve dans sa forme base libre, p.ex. sous la forme hydroxyle (OH). Par exemple, le matériel d'échange anionique peut comprendre de la cellulose DEAE ou un matériel d'échange anionique similaire légèrement coloré sous forme de base libre. L'utilisation d'un matériel d'échange anionique absorbant peut être particulièrement avantageuse, par absorption et concentration de la substance libérée en une bande étroite augmentant la facilité de contrôle. L'usage de cellulose DEAE et matériels similaires est considéré comme nouveau de ce point de vue et l'utilisation de ces matériels en général, est inclue dans les limites du cadre de l'invention.

Dans une mise en application préférée, la méthode selon l'invention consiste en l'incubation de l'échantillon comprenant l'enzyme et le substrat associé avec le matériel à phase solide, à savoir un absorbant inerte ou un matériel à support poreux de manière à donner lieu à la formation d'un composé X-A-Y-NO2 et à mettre en contact la solution contenant le composé avec un réactif à phase solide présentant un environnement alcalin à la substance et produisant ainsi un changement de couleur ou autre signal visuel facilement perceptible à l'œil.

La méthode préférée est habituellement mise en œuvre à l'aide d'un dispositif à écoulement continu comprenant normalement deux compartiments, un compartiment d'incubation contenant le substrat associé avec un matériel à phase solide, p.ex. de la cellulose microcristalline, et un compartiment de visualisation contenant un réactif à phase solide qui présente un environnement alcalin à la substance, à savoir de la cellulose DEAE ou une substance similaire. Les compartiments sont typiquement interconnectables, à savoir par une voie de passage de raccordement convenable permettant l'écoulement du liquide contenant le composé libéré du compartiment d'incubation à celui de visualisation. De préférence, toutefois, les deux compartiments doivent pouvoir s'isoler l'un de l'autre pour permettre, par exemple, la rétention de l'échantillon dans le compartiment d'incubation pour la période d'incubation requise. La voie de passage entre les deux compartiments peut être équipée avec un robinet approprié ou autre barrière pouvant être commodément ouverte ou enlevée après la période d'incubation requise pour permettre au liquide de passer dans le compartiment de visualisation, à savoir de passer au travers de l'absorbant préféré i.e. la cellulose DEAE.

Par exemple, le dispositif à écoulement continu peut con5 651068

sister en deux compartiments attachés aux surfaces interfaciales par un pivot, les deux surfaces étant munies de sorties selon un rayon fixé à partir du pivot de telle manière que la rotation mutuelle des compartiments amène les sorties en coin-5 cidence l'une avec l'autre procurant une voie de passage entre les compartiments. Alternativement, la voie de passage entre les compartiments peut être bloquée par une barrière sans résistance qui peut se rompre selon le désir, par exemple, en mettant en contact les deux compartiments par une opération 10 de vissage.

La concentration de substrat utilisé, à savoir présent en association avec le matériel à phase solide inerte, peut être variée selon le désir, par exemple, en accord avec la concentration limite d'enzyme que l'on désire contrôler; l'augmentation 15 en concentration de réactif permet généralement la détection de concentrations d'enzyme de limite inférieure. De plus, l'utilisation d'un substrat à phase solide comme la cellulose DEAE pour visualiser la substance libérée permet avantageusement la détection de très petites quantités de substance libé-2orée, grâce à la concentration de la couleur produite dans une bande d'absorption étroite. De ce point de vue, il a été trouvé possible de détecter la présence de la substance méthoxy-2 (ß-nitroéthényl)-4 phénol à des concentrations de 1-2 x 10-6-molaire par contact de la solution avec de la cellulose DEAE. 25 II a aussi été trouvé, par exemple, que l'usage d'un glycoside de détection du NAG approprié (E) à 3% sur une phase solide inerte de cellulose en combinaison avec la visualisation à la cellulose DEAE est capable de détecter une concentration limite de NAG dans l'urine d'environ 40-50 n mol/ml après 30 incubation à 37° pour vingt minutes alors que l'utilisation de cellulose contenant 8% de glycoside dans le même système donne un seuil de détection d'environ 20-30 n mol/ml. Les deux systèmes donnent des bandes intenses larges pour des urines anonnales qui sont facilement discernables de celles 3s données par des urines normales. Il sera apprécié, en conséquence, par référence à l'effet de la concentration en substrat et la facilité de visualisation, que la méthode de l'invention peut être effectuée commodément par les patients eux-mêmes chez eux par usage d'un dispositif à écoulement continu pré-40 paré de façon convenable et exigeant des compétences analytiques minimales. Par exemple, le patient doit simplement ajouter une quantité fixe d'urine fraîche au compartiment d'incubation, à savoir jusqu'à un niveau fixé indiqué sur le côté du compartiment et, après une période standard d'incubation, « qui dépend habituellement de la température ambiante, mettre en relation les compartiments d'incubation et de visualisation permettant à l'urine incubée de couler au travers du réactif de visualisation à phase solide.

Le signal visuel, à savoir le changement de couleur, proso duit par la substance libérée procure avantageusement un moyen simple et rapide pour détecter la présence de l'enzyme dans l'échantillon par rapport aux méthodes utilisées précédemment qui reposent sur l'emploi d'un appareillage de contrôle sophistiqué. De même, l'intensité du signal visuel, à sa-55 voir de la couleur, produit peut être utilisée commodément comme indicateur visuel approché de la concentration d'enzyme présent dans l'échantillon. Si, toutefois, des mesures plus précises sont nécessaires, les réactifs de l'invention peuvent être contrôlés spectrophotométriquement de manière 60 conventionnelle, par exemple. Ainsi, la couleur produite peut être estimée par colorimétrie, d'habitude après ajustage du pH à 8,5 -9,5 avec un tampon approprié et, dans de telles méthodes, lesdits réactifs peuvent être plus convenables que des réactifs correspondants antérieurs comme les substrats p-ni-65 trophénolique et o-nitrophénolique.

L'invention est décrite plus en détail à l'aide d'illustration dans les exemples suivants; la description se rapporte aux diagrammes en annexe dans lesquels:

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6

La figure 1 représente une forme de dispositif à écoule- de reposer librement dans une orientation verticale. Les pâment continu pour la mise en œuvre de convention. rois des compartiments de visualisation inférieurs 2 sont faits

La figure 2 représente une forme alternative du dispositif à d'un matériel clair, comme du plastique clair, permettant écoulement continu. l'observation de la cellulose DEAE et toute bande colorée ab-

5 sorbée dessus.

Exemple Les compartiments d'incubation supérieurs I contiennent

Détermination du N-acétylglucosaminidase (NAG) dans une quantité appropriée de la substance glycoside (n'est pas l'urine montrée) soit dans un solvant convenable soit absorbée dans

100 mg de cellulose microcristalline contenant environ de la cellulose ou un autre absorbant convenable, p.ex. 100 3% d'(acétamido-2 déoxy-2P-D-glucopyranosyloxy)-4-méth- 10 mg de cellulose microcristalline («AVICELL») contenant 3% oxy-3e)-nitrostyrène, le substrat pour NAG, est traité, dans de glycoside. Les compartiments d'incubation 1 sont munis un petit tube à échantillons en plastique, avec de l'urine fraî- de capuchons filetés 8 et ont des parois épaisses de PVC ou de che (1 ml) à la température du corps ou de l'urine stockée pré- polystyrène 9 pour isoler l'urine durant l'incubation, les pa-chauffée à 35-38°. Les contenus du tube sont incubés pour rois 9 étant marquées avec une ligne 10 pour indiquer la quan-15-30 minutes à 30-35°, à savoir 20 minutes à 37° et on les 15 tité d'urine à introduire pour l'incubation.

laisse s'écouler à travers une colonne courte (environ 3 x 0,6 Dans le diagramme des figures 1 et 2, les compartiments cm) de cellulose fibreuse DEAE (Whatman DE 22) contenue supérieur et inférieur i et 2 sont montrés sans voie de passage dans une pipette Pasteur bouchée au fond avec de la ouate. La de liaison entre eux.

présence de NAG dans l'échantillon d'urine est indiquée par Avec référence à la figure 1, les compartiments 1 et 2 sont le développement d'une bande rouge pourpre environ 0,5 cm 20 tenus ensemble aux surfaces interfaciales par le pointeau d'un en-dessous du sommet de la colonne de cellulose DEAE. Par- pivot 11. La base du compartiment d'incubation l a une sor-fois, une bande large brune claire se forme au-dessus de la tie 12 située excentriquement et le sommet du compartiment bande rouge pourpre dûe à la présence d'urochrome dans l'u- de visualisation a une entrée 13 située excentriquement selon rine et chez quelques patients qui ont eu des transplantations le même rayon du pivot 11 que de la sortie 12. La rotation rénales, une bande brune-mauve se déplaçant rapidement est 25 mutuelle des compartiments supérieur 1 et inférieur 2 amène observée, probablement dûe aux médicaments que le patient la sortie 12 et l'entrée 13 en coïncidence l'une et l'autre réa-reçoit. De plus, pour les diabétiques ou les nourrissons qui lisant une voie de passage reliant les compartiments à travers ont une faible concentration en électrolyte dans leur urine, la laquelle l'urine incubée peut s'écouler. En usage, de l'urine bande rouge se forme à la surface d'interface sommitale de la fraîche est introduite dans le compartiment 1 jusqu'au niveau cellulose DEAE et est plus diffuse en nature. Ce dernier effet 30 de la marque 10, la sortie 12 et l'entrée 13 n'étant pas en coin-peut être surmonté par incorporation de quantités appro- cidence l'une avec l'autre. Le capuchon fileté 8 est vissé à sa priées d'élctrolytes dans le réactif. Dans tous les cas, cepen- place et l'urine est incubée pour une période dépendant de la dant, la largeur et l'intensité de la bande rouge est approxima- température, quoique, d'habitude, d'environ 15 à 20 minutes, tivement proportionnelle à la concentration de NAG dans Puis on fait tourner mutuellement les compartiments ce qui l'urine. 35 amène la sortie 12 et l'entrée 13 en regard l'une de l'autre et

En utilisant du glycoside à 3 % sur la cellulose, l'urine nor- l'urine incubée s'écoule du compartiment d'incubation 1 dans maie (environ 40-75 n mol/ml de NAG) donne une bande le compartiment de visualisation 2. Le méthoxy-2 (nitro-2 rouge faible compacte et étroite alors que les urines anormales (E)-éthényl)-4- phénol libéré par le substrat glycoside en con-( > 200 n mol/ml de NAG) donnent des bandes intenses plus séquence de la présence de NAG dans l'urine donne lieu à la larges qui se renforcent avec des concentrations croissantes de 40 formation d'une large bande rouge écarlate à environ 0,5 cm NAG. Sous les mêmes conditions de test, l'eau et de l'urine en-dessous du sommet de la colonne de cellulose DEAE 3. qui a été bouillie pour détruire le NAG donnèrent des résul- Avec référence à la figure 2, les compartiments 1 et2 sont tats négatifs. tenus ensemble par engagement fileté à l'aide du filetage de vis

Dans une modification de l'essai de base, on utilise une 16 autour du fond du compartiment I et du filetage de vis il cellulose à 8% en glycoside à la place du matériel à 3% en gly- 45 autour de l'intérieur de l'extension tabulaire 18 débordant du coside. On estime que ce nouveau matériel possède un seuil de sommet, du compartiment 2. Une voie de passage entre les détection du NAG d'environ 20-30 n mol/ml. Dans le pro- compartiments I et 2 est réalisée par l'extension tabulaire 14 cédé modifié, de l'urine normale donne des bandes plus inten- qui déborde du bas du compartiment L Avant l'usage, la voie ses que celles observées plus haut, ce qui indique comment il de passage 14 est fermée par son appui sur la section affaiblie est possible de choisir un seuil de détection par variation de la 5015 au sommet du compartiment 2. En usage, l'urine est intro-quantité de substrat glycoside utilisé tout en prêtant attention duite dans le compartiment 1 et incubée comme dans le dispo-à la température et au temps d'incubation. sitif de la figure 1. A la fin de l'incubation, toutefois, les com-

Description du dispositif à écoulement continu pour la mise partiments I et 2_sont vissés ensemble et l'extension tabulaire en œuvre de l'invention 14 ouvre la voie au travers de la section affaiblie L5 permet-

Avec référence aux figures 1 et 2, les (o-nitrostyrylglycosi- 55 tant à l'urine incubée de s'écouler dans le compartiment 2. La des, peuvent être incorporés dans des dispositifs à écoulement visualisation du phénol libéré par le substrat se fait comme continu. Les deux dispositifs comprennent un compartiment pour le dispositif de la figure 1.

cylindrique supérieur d'incubation let un compartiment de visuaisation inférieur 2; dans les deux cas, le compartiment de Les deux dispositifs procurent un moyen simple grâce au-visualisation inférieur 2èontient une quantité de cellulose 60 quel des patients à «rein transplanté» peuvent se contrôler DEAE fibreuse (Whatman DE 22) 3 intercalée entre des cou- eux-mêmes chez eux; de plus, des tests généraux d'examens ches supérieure 4 et inférieure 5 d'ouate ou d'une substance si- peuvent être réalisés facilement sans avoir recours à un appa-milaire. Les extrémités inférieures des compartiments de vi- reillage de contrôle sophistiqué. D'autres enzymes, à côté du sualisation 2 ont des sorties 6 pour l'écoulement du liquide et NAG, peuvent être déterminés par utilisation de techniques et sont munies de pans ou de pieds 7 permettant aux dispositifs 65 dispositifs similaires.

C

1 feuille dessins

Claims

651068 REVENDICATIONS

,1

N02

25

dans laquelle X dérive du groupe S'-X défini comme indiqué ci-dessus, n = 1,2 ou 3, R1, R2, R3 et R4 = H, OMe, N02, CH3, -CH = CR'R" ou C02H, les symboles R' et R" représentant chacun H, OMe, N02, CH3, C02H ou une substitution subséquente insaturé, de formule -CH=CR'R". R' et R" représentant chacun H, OMe, N02, CH3 ou C02H.

1. Méthode de détermination d'enzyme par incubation d'un échantillon contenant l'enzyme avec un substrat capable d'interagir avec ledit enzyme pour conduire à la formation d'un composé qui est contrôlé par colorimétrie, caractérisée en ce que ledit composé est défini par la formule HX-A-Y-N02 dans laquelle A représente un noyau aromatique, HX un groupe auxochrome et Y un groupe capable de transmettre la résonance électronique entre le noyau aromatique et le substituant nitro, ledit composé étant capable par lui-même de produire un signal visuel discernable à l'œil, soit directement soit suite à un traitement alcalin.
2. Méthode selon la revendication 1 pour la détermination de carboxylate estérase ou lipase, de phosphatase acide ou alcaline, de phosphodiestérase, de sulfatase ou de glycosidase, caractérisée en ce que le réactif comprend un substrat enzyma-tique de formule S'-X-A-Y-N02, dans laquelle A et Y sont définis comme indiqué ci-dessus et S'-X représente un radical carboxylate, phosphate, diphosphate, sulfate ou glycoside.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le composé HX-A-Y-N02 est un composé de formule
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'échantillon et le réactif sont incubés ensemble à une température d'au moins 30° pour une période allant jusqu'à 30 minutes.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le réactif est utilisé en association avec un matérial à phase solide convenable.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la solution contenant le composé de formule HX-A~Y-N02 est mise en contact avec un réactif à phase solide qui présente simultanément un environnement al câlin pour ledit composé.