CH651841A5 - Resina polialchilenamminica reticolata, procedimento per la sua preparazione e la sua utilizzazione. - Google Patents
Resina polialchilenamminica reticolata, procedimento per la sua preparazione e la sua utilizzazione. Download PDFInfo
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Description
La presente invenzione riguarda resine polialchilenamminiche reticolate con un reticolante di tipo diisocianato. Queste resine reticolate sono preparate per fare reagire resine polialchilenamminiche con diisocianati.
Queste resine polialchilenamminiche reticolate sono utilizzate nella separazione selettiva di un singolo componente mucopolisaccaridico da una miscela di glucosàmminoglicani. Preferibilmente questi prodotti sono utilizzati nella separazione selettiva di eparina da soluzioni che la contengono da sola o in miscela con altri glicosamminoglicani.
Il problema della separazione dell'eparina (HEP) da altri glicosamminoglicani (GAG), denominati anche mucopolisacca-ridi, poliamminosaccaridi o polisaccaridi amminati, che vengono estratti da tessuti animali sotto forma di miscele, viene comunemente affrontato mediante trattamento con sali di ammonio quaternario in presenza di sali inorganici in concentrazioni opportune, il che provoca la precipitazione frazionata dei complessi dei GAG [E. J. Scott, Methods Biochem. Anal. 8, 145 (I960)]. Quale procedimento alternativo, l'eparina in particolare può essere precipitata preferenzialmente con acetato di potassio (Brev. britannico 1 221 784).
Un altro metodo per l'isolamento dell'eparina consiste nella filtrazione su appositi gel (ad esempio di destrano reticolato), sfruttando la penetrazione dell'eparina nei pori del reticolo e il conseguente adsorbimento. Un ulteriore approccio per l'isolamento dell'eparina è basato sull'impiego di resine a scambio anionico, generalmente derivati di polistirene o di cellulosa o altri polisaccaridi reticolati funzionalizzati con gruppi ammollici quaternari: avendo densità di carica nettamente maggiore rispetto agli altri GAG, l'eparina viene preferenzialmente trattenuta da dette resine.
Nessuno dei suddetti metodi è tuttavia risultato soddisfacente, poiché sono normalmente necessari diversi stadi di trattamento per il recupero quantitativo dell'eparina. Ciò è dovuto principalmente al fatto che tali metodi sfruttano generalmente reazioni di equilibrio, per cui accanto al prodotto che si desidera isolare, si ottengono anche quantità minori, ma pur sempre importanti, di altri componenti che possono essere considerati come impurezze. Così, ad esempio, il meccanismo di separazione sfruttato nella tecnica di filtrazione su gel è basato sul fatto che le molecole di dimensioni inferiori a quelle dei pori del reticolo polimerico vi penetrano, mentre quelle più grandi ne vengono escluse. È evidente pertanto l'importanza e la criticità della calibrazione del supporto, cioè la caratterizzazione della sua porosità, ed evidente altresì che la tecnica di eluizione impiegata in tale metodo comporta dal canto suo le difficoltà connesse con i coefficienti di ripartizione.
Un altro fattore che rende difficoltosa la separazione della eparina è dato dalla competizione, conseguente alla struttura chimica analoga, degli altri poliamminosaccaridi, i quali interferiscono dal punto di vista chimico-fisico nelle reazioni di separazione.
Il meccanismo di separazione dell'eparina mediante le comuni resine a scambio anionico può essere considerato un tipo particolare di adsorbimento il quale sfrutta la maggiore probabilità che i siti anionici -SOf e -COO- dell'eparina, più numerosi che non negli altri GAG, vengano attratti dai siti cationici della resina. Tuttavia, data la distribuzione generalmente irregolare di tali siti nelle resine, questo processo sfrutta soltanto un numero limitato dei gruppi anionici presenti nel polisaccaride.
Una efficienza di «adsorbimento» nettamente maggiore potrebbe essere conseguita qualora una serie di gruppi basici della resina fosse accessibile ad una serie complementare di gruppi acidi appartenenti ad una stessa catena di eparina, particolarmente se i gruppi besici della resina fossero distanziati fra loro quanto i gruppi acidi del poliamminosaccaride. Questo principio di complementarietà è all'origine della notevole stabilità dei complessi polielettrolitici, nei quali l'effetto di attrazione del poliacido da parte della polibase è amplificato rispetto a quello che si avrebbe se i siti basici e quelli acidi non facessero parte di strutture macromolecolari.
L'oggetto della presente invenzione è una resina polialchilenamminica reticolata che è caratterizzata dal fatto che i legami trasversali del reticolante sono di tipo diisocianico.
La resina secóndo la presente invenzione è costituita da una polialchilenammina reticolata con diisocianati.
La resina polialchilenamminica reticolata è preferibilmente una resina polietilenamminica reticolata. La polietilenammina è denominata anche polietilenimmina, PEI. Il reticolante di tipo diisocianico è preferibilmente esametilendiisocianato (HMDC).
Un altro oggetto della invenzione è un procedimento per la preparazione di resine polialchilenamminiche reticolate secondo
5
io
15
20
25
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45
50
55
60
65
3
651 841
la invenzione. Questo procedimento è caratterizzato dal fatto che resine polialchilenamminiche sono fatte reagire in presenza di un solvente organico con un agente reticolante di tipo diisocianico.
In questo procedimento si può usare come resine polialchilenamminiche le resine polietilenamminiche. In preferenza l'agente reticolante è esametilendiisocianato e il detto solvente è cloroformio.
Un altro oggetto della presente invenzione è l'utilizzazione
I
H I
ch.
SCHEMA A
N
ch„
ch. cu.
5 I 1 h - (ch2)2-nh2+ocn-(ch2)6-hco+h2h-(ch2)2- n ch. 'ch.
I 2 |
ch. ch.
I
I
n I
ch. I ^
1 ch.
di resine polialchilenamminiche reticolate secondo la invenzione io j* nella separazione selettiva di un singolo componente mucopolisaccaridico da una miscela di glucosamminoglicani in soluzione acquosa. Questo procedimento è caratterizzato, dal fatto che la detta resina polialchilenamminica reticolante è posta in contatto sotto agitazione con detta soluzione di glucosamminoglicani.
Le resine polialchilenamminiche secondo la invenzione hanno preferibilmente un peso molecolare medio compreso fra circa 150 e 120'000.
La reticolazione delle catene di PEI può essere effettuata sia 201 2 per insolubilizzare il polimero sia per ottenere, grazie ai legami j1 trasversali del reticolante, interstizi accessibili al solvente e alle molecole di eparina, sia per limitare opportunamente le sequen- ^ ze di siti basici atti a legarsi con l'eparina. h
I
n
Î"2
h - (ch2)2-nh-00-nh-(ch3)(.-nii-c0-nh-(ch;}):)- n h
ch-
2'6
2 2
ch.
I 2 fa
N I
SCHEMA B
La reticolazione delle catene di polietilenammina è realizza- 25
ta mediante un alchilen-diisocianato, con formazione di legami trasversali di tipo carbammico. In particolare la reticolazione con esametilendiisocianato della PEI nella sua forma più comune, estesamente ramificata, avviene secondo lo schema
A) per la parte remificata, e secondo lo schema
B) per la parte non ramificata:
ch.
I 2
imi Clù
ocw-(ch2)6-nco
I
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h.c
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h.c /
h-n \
ILO
—>
n-c0-nh(ch2)6nh-c0-n
30 i
CH.
h.c
21
h I
• 9 • ' ' 9 !.
n— c — c-nh—c —nh-(ch2j -nh-c-nh -c~ c-n
35 in modo da dare origine ad una struttuia tridimensionale ipotizzabile nel modo seguente:
'0 9 I
n—c — c— nh—c-nh-(ch2)-nh-c-nh-c - g~n
Mn irei n=l r=h ppi ( 1.33 2 h
(CH2)r
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chr ch-,
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n|c—c- nm-c-nh-(ch2)6-nh-c—nh-c lL
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c
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La quantità di alchjlen-diisocianato utilizzato per là reticolazione, espressa come rapporto molare del diisocianato considerato monofunzionale rispetto alla unità monomerica costituente la polialchilenammina, è compresa fra circa 10 e 15 millimoli per 100 moli di polimero (sulla base dell'unità monomerica). Così, ad esempio 12 millimoli di esametilendiisocianato (su base monofunzionale) aggiunte a 120 moli di polietilenimmina (sulla base dell'unità monomerica) producono una resina reticolata insolubile in acqua e in solventi organici. Lo HMDC e la PEI . sono di solito usati sotto forma di soluzione in solvente organico (preferibilmente cloroformio) al 5%, in rapporti volumetrici pari circa a 1:5. Mentre il rapporto preferito fra la resina e l'agente reticolante è quello indicato, anche altri rapporti fra i due reattivi forniscono ugualmente resine insolubili a diverso grado di reticolazione, le rese corrispondenti essendo relativamente basse per i più bassi gradi di reticolazione. Va rilevato a questo proposito che partendo da PEI a peso molecolare relativamente basso (ad esempio circa 600, corrispondente a un grado di polimerizzazione di circa 14) i gruppi NH2 terminali reagiscono verosimilmente in modo preferenziale con lo HMDC; in tali condizioni e per rapporti molari di circa 1:10 fra gruppi -NCO e gruppi NH + NH2, si ritiene che si formino sequenze sufficientemente lunghe di unità (CH2-CH2-NH)n, dove cioè n = 8-14, per avere un effetto cooperativo nell'associazione con polianioni.
La presente invenzione sarà ora illustrata più in particolare sulla base di alcuni esempi realizzativi, riportati unicamente a scopo illustrativo e non limitativo.
Esempio 1
Preparazione di polietilenimmina reticolata.
A 20 mi di una soluzione al 5% (p/v) di esametilendiisocianato in cloroformio a temperatura ambientale vengono aggiunti lentamente e sotto agitazione 100 mi di una soluzione clorofor-mica al 5% (p/v) di polietilenammina a peso molecolare medio 1800. Dopo circa 15 minuti si forma un precipitato bianco voluminoso di resina polietilenamminica a grado di reticolazione 0,1, il quale viene separato per decantazione e quindi lavato tre volte con 10 mi di cloroformio ciascuna. Il precipitato ancora umido di cloroformio viene quindi lavato di nuovo tre volte con 10 mi di acqua distillata ciascuna, e conservato sotto acqua.
La resa calcolata del prodotto secco è pari a 75-80%.
Esempio 2 ■
Si procede come indicato per l'esempio 1, con la differenza che in luogo di polietilenimmina viene usata polipropilenimmi-na a peso molecolare medio di 1000-1500, ottenendosi una resina polipropilenimminica a grado di reticolazione 0,05, con una resa di prodotto, calcolata sul secco, pari al 90%.
La fig. 1 riporta uno spettro infrarosso tipico di resine ottenute secondo gli esempi 1 e 2. L'esame della spettro I.R. consente, oltre alla identificazione delle resine, anche una valutazione semiquantitativa del rapporto fra agente reticolante e catena poliimminica nonché la verifica che lo HMDC ha reagito in modo bifunzionale.
Con l'espressione «grado di reticolazione» qui usata, si intende indicare il numero di unità monomeriche comprendenti i gruppi NH (e/o NH2) implicate nella reticolazione, calcolato in base al rapporto molecolare fra diisocianato espresso come base monofunzionale e poliammina espressa su base monomerica. Il grado di reticolazione è scelto in modo da impegnare nella reticolazione non più di un quarto dei gruppi amminici della polialchilenammina.
Prove di trattamento con la resina reticolata di soluzioni acquose di eparina ed altri glucosamminoglicani hanno dimostrato che l'eparina presenta una notevole affinità per la resina.
L'intervallo di concentrazioni in eparina di soluzioni acquose comprendenti anche altri poliamminosaccaridi entro il quale l'azione della resina reticolata secondo la presente invenzione permette di isolare quantitativamente l'eparina è compreso fra lo 0,1% e l'l% in peso come risulta dai seguenti esempi.
L'eparina adsorbita sulla resina può essere recuperata, e la resina rigenerata per un successivo reimpiego, trattando la resina contenente l'eparina con una opportuna soluzione salina, ad esempio una soluzione acquosa di NaCl da 1,5 a 2,5 M circa.
Esempio 3 Separazione selettiva di eparina.
20 mi di una soluzione acquosa allo 0,2% in peso di una miscela di glucosamminoglicani estratti da duodeno suino contenente il 20% di eparina, il 30% di eparansolfato, il 20% di con-droitinsolfato e dermatansolfato nonché il 10% di acido ialuro-nico sono stati posti in contatto con 2 g di resina polietilenim-minica a grado di reticolazione 0,1 ottenuta secondo l'esempio 1, precondizionata per 30' a pH 3,5 (in presenza di HCl) e quindi lavata per due volte con 10 mi d'acqua.
Dopo 2 h di contatto sotto agitazione, l'eparina risulta quantitativamente e selettivamente adsorbita dalla resina, come è dimostrato dall'analisi elettroforetica il cui diagramma è riportato in fig. 2.
Come si può rilevare da tale diagramma, in cui il tracciato superiore si riferisce alla soluzione dei glicosamminoglicani prima del trattamento e il tracciato inferiore riguarda la stessa soluzione dopo il trattamento con la PEI reticolata, l'eparina (HEP) risulta completamente scomparsa dalla soluzione sottoposta a trattamento, mentre permangono i picchi relativi ad acido ialuronico (HA), eparansolfato (HS) e condroitinsolfato più dermatansolfato (Chs + DeS).
Esempio 4
20 mi di una soluzione acquosa contenente una frazione mucopolisaccaridica costituita da eparansolfato (85%) ed eparina (15%) sono posti in contatto per 2 h con 4 g di resina polie-tilenimminica a grado di reticolazione 0,05, preventivamente condizionata per 30' a pH 3,5 (mediante HCl) e successivamente lavata per due volte con 10 mi d'acqua. Al termine del periodo di contatto sotto agitazione, l'analisi elettroforetica del so-vranatante dimostra la completa scomparsa dell'eparina.
L'eparansolfato in soluzione viene recuperato semplicemente per evaporazione della soluzione con una resa del 95%.
Esempio 5
10 mi di una soluzione acquosa di eparina allo 0,1% (corrispondente a 10 mg di mucopolisaccaride) sono trattati per 2 h con 800 mg di PEI reticolata secondo la presente invenzione. Al termine del trattamento, l'eparina risulta adsorbita quantitativamente dalla resina, come dimostrato da prove colorimetriche al blu di toluidina ed al carbazolo in presenza di borati effettuate sul liquido residuo.
Esempio 6
Una soluzione acquosa di una miscela di glucosamminoglicani comprendente il 18% di eparina è trattata con PEI reticolata secondo le modalità descritte nell'esempio 3. L'analisi elettroforetica quantitativa dimostra che l'eparina è adsorbita quantitativamente e selettivamente.
Esempio 7 Recupero dell'eparina da PEI reticolata.
2 g di resina polietilenamminica contenenti 8 mg di eparina adsorbita secondo l'esempio 3 vengono sottoposti ad estrazione
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per cinque volte trattandoli ogni volta per 30' sotto agitazione con 20 mi di NaCl 2M. Gli estratti riuniti contengono il 95-96% dell'eparina originariamente adsorbita dalla resina come risulta da una analisi colorimetrica al carbazolo, con riferimento ad una curva.di taratura in NaCl 2M. L'eparina viene isolata dalla s soluzione di estrazione mediante dissalazione operata per dialisi oppure mediante precipitazione con sali di ammonio, quaternario.
Sebbene la presente invenzione sia stata illustrata sulla base di alcuni esempi con particolare riferimento alla separazione io dell'eparina da miscele che la contengono, si è trovato che l'affinità della poliammina reticolata secondo la presente invenzione per altri componenti poliamminosaccaridici di tali miscele può essere variata e adattata ai singoli casi modificando opportunamente sia il grado di reticolazione della resina sia il pH e la 15 forza della soluzione di contatto. Le poliammine reticolate secondo la presente invenzione possono infatti essere ottenute con granulosità diversa e differente porosità a seconda del numero dei legami trasversali, ossia della percentuale di diisocianato.
Così, poliammine con pochi legami trasversali aumentano il lo- 20 ro volume in soluzione acquosa fino a molte volte quello del prodotto secco, mentre le poliammine ad alto grado di reticolazione, cioè con molti legami trasversali, presentano una piccola variazione di volume. In queste ultime, la trama è assai più rigida e permette pertanto la penetrazione soltanto a molecole di 25 peso relativamente basso, mentre contemporaneamente lo scambio ionico è assai più lento per l'accresciuta resistenza al movimento dei controioni idratati provenienti dalla resina. Una maggiore porosità conferische alla poliammina secondo la presente invenzione una più facile accessibilità a molecole di maggiore ingombro che pertanto possono essere separate da specie molecolari più piccole.
Oltre agli effetti descritti, il grado di reticolazione determina il numero di gruppi NH (e NH2) in sequenza disponibili per l'interazione complementare con il polianone che è penetrato nel reticolo tridimensionale. D'altra parte, sfruttando il pH e la forza ionica, viene variato, a parità di numero di tali gruppi NH (e NH2), il rapporto fra quelli che portano effettivamente una carica positiva e possono pertanto aumentare le forze di adsorbimento grazie alla formazione di legami ionici con i gruppi anionici del polisaccaride, e quelli privi di carica.
La poliammina reticolata secondo la presente invenzione può pertanto essere usata sia per l'isolamento del GAG desiderato, in particolare l'eparina, sia per eliminare da una miscela di GAG in soluzione il componente indesiderato, ad esempio l'eparina qualora si desideri ottenere una preparazione priva di proprietà anticoagulanti.
Sebbene la presente invenzione sia stata descritta con riferimento ad alcuni esempi realizzativi preferiti e con particolare attenzione alla eparina, risulterà ovvio agli esperti del ramo che variazioni e/o medifiche potranno esservi apportate senza uscire dall'ambito di protezione dell'invenzione stessa. Come reticolanti potranno così essere impiegati altri reattivi bifunzionali, come arilendiisocianati, oppure dialdeidi od anche composti eterociclici come la triclorotiazina, mentre come solvente, particolarmente nel caso delle dialdeidi, potrà essere usata l'acqua.
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1 foglio disegni
Claims (10)
1. Resina polialcliilenamminica reticolata caratterizzata dal fatto che i legami trasversali del reticolante sono di tipo diiso-cianico.
2. Resina polialchilenamminica reticolata secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che dette resine polialchilenamminiche sono resine polietilenamminiche reticolate con esametilendiisocianato. •
2
RIVENDICAZIONI
3. Resina polialchilenamminica reticolata secondo la rivendicazione 2, caratterizzata dal fatto che il grado di reticolazione di detta resina polietilenamminica, calcolato dal rapporto molare fra esametilendiisocianato considerato monofunzionale e resina polietilenamminica considerata su base monomerica, è compresa fra 0,1 e 1,0.
4. Procedimento per la preparazione di resine polialchilen-amminiche reticolate secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che resine polialchilenamminiche sono fatte reagire in presenza di un solvente organico con un agente reticolante di tipo diisocianico.
5 . Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che dette resine polialchilenamminiche sono resine polietilenamminiche.
6. Procedimento secondo una delle rivendicazioni 4 o 5, caratterizzato dal fatto che il detto agente reticolante è esametilendiisocianato e il detto solvente è cloroformio.
7. Utilizzazione di resine polialchilenamminiche reticolate secondo la rivendicazione 3 nella separazione selettiva di un singolo componente mucopolisaccaridico da una miscela di glucos-amminoglicani in soluzione acquosa, caratterizzata dal fatto che la detta resina polialchilenamminica reticolata è posta in contatto sotto agitazione con detta soluzione di glucosammino-glicani. ,
8. Utilizzazione di resine polialchilenamminiche secondo la rivendicazione 7, caratterizzata dal fatto che la lunghezza media, la struttura e la polarità delle catene comprese fra i punti di reticolazione di dette resine polialchilenamminiche reticolate sono sostanzialmente complementari a quelle di porzioni polari proprie del componente mucopolisaccaridico da adsorbire.
9. Utilizzazione di resine polialchilenamminiche reticolate secondo una delle rivendicazioni 7 o 8, caratterizzata ulteriórmente dal fatto che una detta resina polialchilenamminica reticolata contenente il detto componente mucopolisaccaridico è rigenerata nella forma originaria trattandola ripetutamente con una soluzione di NaCl da 1,5 a 2,5 M e il componente mucopolisaccaridico libero presente nella soluzione ottenuta è quindi isolato mediante dialisi per precipitazione con sali di ammonio quaternario.
10. Utilizzazione di resine polialchilenamminiche reticolate secondo la rivendicazione 8, caratterizzata dal fatto che il detto componente mucopolisaccaridico è eparina.
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