CH652409A5

CH652409A5 - Peptide.

Info

Publication number: CH652409A5
Application number: CH1978/83A
Authority: CH
Inventors: Teresa L K Low; Allan L Goldstein
Original assignee: Univ George Washington
Priority date: 1982-05-14
Filing date: 1983-04-13
Publication date: 1985-11-15
Also published as: FR2526791B1; GB8313215D0; GB2120256B; DE3316933A1; IT1169412B; IT8321093A1; US4395404A; FR2526791A1; JPS5989648A; GB2120256A; DE3316933C2; IT8321093A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptide der Formel

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R^Gly-Glu-Ser-R2

I

25

30

35

40

In den letzten Jahren wurden verschiedene Peptide, die in der Thymusdrüse vorkommen, mit der Entwicklung und Aufrechterhaltung der immunologischen Kompetenz bei Mensch und Tier in Verbindung gebracht. Die Bedeutung des Immunsystems bei der Abwehr von Krebs- und Tumor-Zellen ist heutzutage weitgehend anerkannt. In den vergangenen Jahren wurden einige Polypeptide, von denen gezeigt werden konnte, dass sie die Reifung, Differenzierung und Funktion von T-Zellen stimulieren, aus Rinder-Thymus isoliert. Unterihnen wurde das saure Peptid Thymosin cti besonders intensiv untersucht. Seine Struktur und Aktivität ist beispielsweise in U.S.P. 4079127 beschrieben.

Darüber hinaus beschrieben Goldstein et al. (J. of Reticuloen-dothelial Society 23,253 [1978]) teilweise gereinigtes Thymosin ß, und ß4 als Bestandteile der teilweise gereinigten Thymosin-fraktion 5. Low und Goldstein haben gezeigt (Yearin Hemato-logy 1978, Siberetal. ed. [Plenum Pubi. Co. 1978], S. 281), dass teilweise gereinigtes Thymosin ß3 und ß4TdT-positive (TdT = terminale Deoxynucleotidyltransferase) Zellen in T-Zell-Popu-lationen anregen. Es ist ferner berichtet worden, dass Thymosin worin R1 Q, Q'-Ala-, Q'-Gln-Ala-, Q-Lys-Gln-Ala-, Q-Glu-Lys-Gln-Ala-, Q-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-, Q-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-, Q'-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-, Q-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-, Q-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-oder Q-Gln-Sar- darstellt; Q Wasserstoff oder Acyl ist; Q' Wasserstoff oder Acyl ist, aber Acyl, sofern R2 Hydroxy bedeutet; R2 Hydroxy, -A-C oder -A-B-C; A Asp oder Asn; B Glu-Ile-Thr und C Ala-Lys-Thr-OH darstellen und deren pharmazeutisch verträgliche Additionssalze mit Säuren oder Basen.

Die Formel I umfasst Peptide mit den folgenden Aminosäuresequenzen:

H-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-AIa-Gly-Glu-Ser-OH II H-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH III H-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH IV

H-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH V

H-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH VI

H-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH VII

H-Gly-Glu-Ser-OH VIII

H-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-Asp-Ala-Lys-Thr-OH IX

H-Gln-Ala-GIy-Glu-Ser-Asn-Ala-Lys-Thr-OH X

H3C-CO-Gln-Sar-Gly-Glu-Ser-Asp-Ala-Lys-Thr-OH XI H3C-CO-Gln-Sar-Gly-Glu-Ser-Asn-Ala-Lys-Thr-OH XII H-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-Asp-Glu-Ile-Thr-Ala-Lys-Thr-OH 5 XIII

Die erfindungsgemässen Peptide können verwendet werden zur Stimulation der Produktion TdT-positiver Prothymocyten.

Der Ausdruck «Acyl», derim Zusammenhang mit der Definition des Substituenten R1 verwendet wurde, bezieht sich auf Reste von bekannten aliphatischen Säuren mit 1-7 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise auf Acetyl.

Die Verbindungen der Formel I können in an sich bekannter Weise, d. h. in flüssiger Phase oder nach der Festphasen-Methode, hergestellt werden.

55 Nach der Flüssigphasen-Methode können die Verbindungen der Formel I entweder durch sukzessiven Aufbau der Aminosäurekette erhalten werden oder durch ein Verfahren, bei dem zunächst bestimmte Peptidfragmente synthetisiert werden, die dann zu dem gewünschten Peptid zusammengefügt werden. Der 60 konventionell letzte Schritt bei dieser Methode besteht in der Abspaltung der Schutzgruppen des geschützten Peptids.

Die Festphasen-Synthese wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, beispielsweise wie von Merrifield oder Barany et al. beschrieben (J. Am. Chem. Soc. 85,2149-2154 [1963] ; The 65 Peptides, Analysis, Synthèsis and Biology, Vol. 2,1-284 [1980]).

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen II-VIII nach der Festphasen-Synthese hergestellt. Kommerziell erhältliches Chlormethylpolystyrolharz wird mit NH-

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Boc-O-Benzyl-L-serin in Gegenwart von Dicyclohexyl-Carbodii-mid (DCC) acyliert zu Na-Boc-0-Benzyl-L-seryl-Harz. Das acy-lierte Harz wird in das Reaktionsgefäss einer nach der Festpha-sen-Synthese automatisch arbeitenden Apparatur gegeben.

Diese wird dann so programmiert, dass die folgenden geschützten Aminosäuren in der angegebenen Reihenfolge eingesetzt werden:

(1) Boc-Glu(OBzl)-OH

(2) Boc-Gly-OH

(3) Boc-Ala-OH

(4) Boc-Gln-ONp

(5) Boc-Lys(Z)-OH

(6) Boc-Glu(OBzl)-OH

(7) Boc-Gln-ONp

(8) Boc-Glu(OBzl)-OH

(9) Boc-Ile-OH

(10) Boc-Thr(Bzl)-OH

(Stop für Synthese des Tripeptids VIII)

10

(11) Boc-Glu(OBzl)-OH

(Stop für Synthese des Undeca-peptids III)

(Stop für Synthese des Dodeca-peptids II)

Boc bedeutet t-Butyloxycarbonyl, OBzl bedeutet die Benzyl-estergruppe, ONp bedeutet die p-Nitrophenylestergruppe und Z bedeutet Benzyloxycarbonyl.

Statt der vorstehend angegebenen geschützten Aminosäuren können auch äquivalente Verbindungen eingesetzt werden. So kann z. B. Boc-Gln-ONp (Stufen 4 und 7) und Boc-Lys(Z)-OH (Stufe 5) ersetzt werden durch Boc-Gln-OH und Boc-Lys(2-C1Z)-0H, nach einem Verfahren, das dem von Wang et al., Int. J. Peptide Protein Rest. 18,413-415 (1981), beschriebenen analog ist.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen IX-XIII nach der Festphasenmethode hergestellt, wobei kommerziell erhältliches Chlormethylpolystyrolharz mit Na-Boc-0-Benzyl-L-threonin in Gegenwart von DCC zu Na-Boc-0-benzyl-L-threonyl-Harz acyliert wird. Das acy-lierte Harz wird in das Reaktionsgefäss eines nach der Festphasensynthese automatisch arbeitenden Apparates gegeben. Der Apparat wird dann so programmiert, dass die in den folgenden Kolonnen A-E angegebenen geschützten Aminosäuren sukzessive eingesetzt werden:

A. Nonapeptid der Formel IX:

Boc-Lys(Z)-OH

Boc-Ala-OH

Boc-Asp(OBzl)-OH

Boc-Ser(Bzl)-OH

Boc-Glu(OBzl)-OH

Boc-Gly-OH

Boc-Ala-OH

Boc-Gln-ONp

C. Nonapeptid der Formel XI:

Boc-Lys(Z)-OH

Boc-Ala-OH

Boc-Asp(OBzl)-OH

Boc-Ser(Bzl)-OH

Boc-Glu(OBzl)-OH

Boc-Gly-OH

Boc-Sar-OH

HjC-CO-Gln-ONp

B. Nonapeptid der Formel X:

Boc-Lys(Z)-OH

Boc-Ala-OH

Boc-Asn-ONp

Boc-Ser(Bzl)-OH

Boc-Glu(OBzl)-OH

Boc-Gly-OH

Boc-Ala-OH

Boc-Gln-ONp

D. Nonapeptid der Formel XII:

Boc-Lys(Z)-OH

Boc-Ala-OH

Boc-Asn-ONp

Boc-Ser(Bzl)-OH

Boc-Glu(OBzl)-OH

Boc-Gly-OH

Boc-Sar-OH

HjC-Co-Glu-ONp

E. Dodecapeptid der Formel XIII:

Boc-Lys(Z)-OH

Boc-Ala-OH

Boc-Thr(Bzl)-OH

Boc-Ile-OH

Boc-Glu(OBzl)-OH

Boc-Asp(OBzl)-OH

Boc-Ser(Bzl)-OH

Boc-Glu(OBzl)-OH

Boc-Gly-OH

Boc-Ala-OH

Boc-Gln-ONp

(Stop für Synthese des Hexapep-tids VII)

(Stop für Synthese des Heptapep-tids VI)

(Stop für Synthese des Octapeptids V)

(Stop für Synthese des Nonapep-tids IV)

15

In jeden Kupplungsschritt (120 min) kann ein vierfacher Überschuss an Boc-Aminosäure und DCC eingesetzt werden. Die Abspaltung der BOC-Schutzgruppe erfolgt durch 30-minü-tige Behandlung mit 33 %iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid. Die Abspaltung der geschützten Peptide vom Harz unter gleichzeitiger Abspaltung der Schutzgruppe erfolgt durch Behandlung mit wasserfreiem HF-Anisol. Die rohen Peptide werden über eine Sephadex-G-10-Säule gegeben und dann durch Säulenchromatographie, beispielsweise an DEAE-Sephadex A-25, gereinigt.

Werden die erfindungsgemässen Peptide in flüssiger Phase synthetisiert, so können hierbei die üblichen Schutzgruppen verwendet werden: für Carboxyl- und Hydroxy-Gruppen beispielsweise Aryl-Gruppen, insbesondere Phenyl oder durch nie-der-Alkyl, Halogen, Nitro, Mercapto oderThiogruppen, wie Ci_7-Alkylthio, substituiertes Phenyl; für Amino-Gruppen beispielsweise Butyloxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z).

Die Verbindungen der Formel I der vorliegenden Erfindung sind aktiv im Hinblick auf die Regulierung, Differenzierung und Funktion der T-Zellen. Sie sind Inducer für die nicht-Matrizen-abhängige DNA Polymerase, die als terminale Deoxynucleo-tidyl-Transferase (TdT) bekannt ist. Schliesslich sind sie Gluco-corticoid-Antagonisten, die in vivo z. B. dem Hydrocortison-acetat (HCA) entgegenwirken. Sie wirken auf das Thymus- und 40 Immunsystem, indem sie die Rekonstitution von Thymozyten-Populationen innerhalb der Thymusdrüse und von TdT-positiven Thymocyten beschleunigen. Die Verbindungen der Formel I können ferner in nicht-spezifischer Weise die Macrophagen-Wanderung in Abwesenheit spezifischer Antigene hemmen, was 45 in vitro im MIF-Assay nachgewiesen werden kann. Schliesslich können die Verbindungen der Formel I die Immunantwort in Steroid-supprimierten Säugern wiederherstellen.

20

25

30

35

50

Biologische Aktivität:

Teil A

Die in-vivo-Wirkung von Thymosin ß3, Thymosin ß4, Thymo-55 sin-Fraktion 5, Verbindung V (ß4-C8-Fragment) und Verbindung XIII (ß3-C12-Fragment) auf die Thymocyten-TdT-Aktivi-tät in mit Hydrocortisonacetat (HCA) behandelten C57BL/6J Mäusen wurde nach der Methode von Hu et al. (Fed. Proc. 38, 1079 [1979]; Mol. Cell. Biochem41,49 [1981]) bestimmt. Eine 601,25 mg HCA-Injektion pro Tier wurde am Tage null (0) verabreicht. Auf jede Injektion folgte während 11 Tagen eine tägliche Behandlung des Tieres mit den zu untersuchenden Verbindungen und Kontrollen (d. h. kein HCA bzw. HCA-Kochsalzlösung). Es wurde der Anstieg der TdT-spezifischen 65 Aktivität (nMol aufgenommenes dGTP pro 108 Thymocyten pro Stunde) gegenüber der von mit HC A-Kochsalzlösung behandelten Tieren bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Spalten 3 und 4 der Tabelle 1 zusammengefasst.

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Teil B

Die in-vivo-Wirkung von Thymosin ß3, Thymosin ß4 Thymo-sin-Fraktion5, Verbindung Vund Verbindung XIII auf die Wiederherstellung der Milz-Mitogen-Antwort in HCA-suppri-mierten C57BL/6J-Mäusen wurde nach der von Thurman und Goldstein in «The Biological Activity of Thymic Hormones», D.W. vonBekkum (Herausg.), Kooyker Scientific Publications, Rotterdam, S. 261 (1975) beschriebenen Methode bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Spalten 5 und 6 der Tabelle 1 wiedergegeben.

Der standardisierte MIF-Assay wurde nach der Methode von Thurman et al., Lymphokines and Thymic Hormones: Their Potential Utilization in Cancer Therapeutics, Goldstein und Chirigos (Herausg.), Raven Press, New York, Seiten 145-157 5 (1981), für natürliches Thymosin ß4, synthetisches Thymosin ß4, Verbindung XIII (ß3-C12-Fragment), Verbindung V (ß4-C8-Fragment), Verbindung VII (ß4-C6-Fragment) und das bekannte ß4-C10-Fragment durchgeführt. Die Werte für die prozentuale unspezifische Hemmung (PNSI) wurden berechnet und in 10 Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 1

In-vivo-Effekte von Thymosin ß3, Thymosin ß4, Thymosin-Fraktion 5, Verbindung V und Verbindung XIII auf die Thymocy ten-TdT-Aktivität und auf die Wiederherstellung der Milz-Mitogen-Antwort in HCA-supprimierten C57BL/6J-Mäusen.

Behandlung*

Menge

TdT-Aktivität

Mitogen-Antwort

Spez.Akt

Zunahme[%]

ConAfcpmJ

PHA-P[cpm]

Kontrolle (kein HCA)

-

8,9

-

210,000

30,000

Kontrolle (HCA-NaCl-Lsg.)

-

6,4

86,000

12,000

Thymosin-Fraktion 5

100|xg

10,0

1 57

175,000

35,000

Thymosin ß4

l|*g

8.8

+38

125,000

10,000

Verbindung XIII

10ng

7,6

+19

140,000

11,000

Thymosin ß3

lug

9,7

+52

120,000

27,000

Verbindung V

10ng

8,2

+28

110,000

65,000

*) 6-8 Mäuse/Gruppe

Tabelle 2

Effekt von Thymosin ß4 und synthetischen Carboxyl-endstän-digen ß3- und ß4-Fragmenten auf die Hemmung der Macro-phagen-Wanderung.

Thymosin-Verbindung

Konzentration (nMol/ml)

PNSI

Natürl. Thymosin ß4

0,5

37,6

0,05

29,2

0,005

23,1

Synthet. Thymosin ß4

0,5

30,3

0,05

25,9

0,005

25,0

ß3-C12-Fragment (XIII)

0,5

30,2

0,05

29,7

0,005

24,7

0,0005

23,5

ß4-C8-Fragment (V)

0,5

24,1

0,05

25,4

0,005

27,0

0,0005

5,5

ß4-C10-Fragment

0,5

21,6

0,05

18,8

0,005

10,7

0,0005

- 5,3

ß4-C6-Fragment (VII)

0,5

18,3

0,05

15,2

0,005

- 5,1

0,0005

3,1

Die Verbindungen der Formel I können warmblütigen Säugern parenteral verabreicht werden, und zwar entweder intravenös , subcutan oder intramuskulär. Diese Verbindungen sind wirksame Immunpotentiatoren bei einer täglichen Dosierung im Bereich von etwa 0,1 bis 50 mg/kg Körpergewicht bei intravenöser Verabreichung. Selbstverständlich hängt aber die notwendige

Dosierung von der speziellen Krankheit, die behandelt werden soll, ihrer Schwere sowie der Dauer der Behandlung ab. Eine geeignete pharmazeutische Dosierungseinheit besteht aus 1-5 mg einer lyophilisierten Verbindung der Formel I, die vor der Anwendung durch Zusatz von sterilem Wasser oder steriler Kochsalzlösung rekonstituiert wird.

Die erfindungsgemässen Verbindungen umfassen auch pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindungen der Formel I. Geeignete Salze sind beispielsweise die Kalium- und Natriumsalze oder Salze mit einer starken organischen Base wie Guani-din. Ausserdem können als Gegenionen zu diesen Kationen, z. B. Chlorid, Bromid, Sulfat, Phosphat, Malat, Ascorbat usw., in den Präparaten vorliegen.

Die Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen wird durch die folgenden Beispiele illustriert.

Beispiel 1

Eine Lösung von 3,511 g (11,9 mMol) Na-Boc-0-Benzyl-L-serin in 1,50 ml (10,8 mMol) Triethylamin und 25 ml absolutem Ethanol wurde mit 10,0 g (11,9 mMol) chlormethyliertem Copo-lystyrol-1 % Divinylbenzol (1,19 mMol Cl/g Harz) umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss 48 h gerührt, filtriert, dreimal mit jeweils Ethanol, Wasser, Methanol und CH2CI2 gewaschen und im Vakuum getrocknet. Durchführung der unten angegebenen Reaktionsschritte (a)-(d) lieferte TFA-H-Ser(Bzl)-0-Harz.

10,0 g (2,71 mMol) dieses Harzes wurden nacheinander gekuppelt mit Boc-Glu(OBzl)-OH (3,65 g, 10,84 mMol, 4 Äquiv.) und Boc-Gly-OH (2,05 g, 10,84 mMol, 4 Äquiv.) zu demTripeptidyl-Harz.

Während eines Kupplungs-Zyklus' wird das acylierte Harz nacheinander umgesetzt mit (a) Methylenchlorid (dreimal 5 min) ; (b) 33 %ige Trifluoressigsäure-Methylenchlorid (2 min) ;

(c) 33%ige Trifluoressigsäure-Methylenchlorid (30 min);

(d) Methylenchlorid (dreimal 5 min) ; (e) 5 % Diisopropylethyl-amin-Methylenchlorid (2 min); (f) 5 % Diisopropylethylamin-Methylenchlorid (10 min); (g) Methylenchlorid (dreimal 5 min); (h) DMF (dreimal 5 min); (i) Methylenchlorid (dreimal 5 min);

(j) der geschützten Aminosäure (10 min); (k) DCC (2 h); (1) Methylenchlorid (dreimal 5 min); (m) Isopropanol (dreimal 5 min) und (n) DMF (dreimal 5 min).

1,0 g (0,271 mMol) des Tripeptidyl-Harzes wurde während 45min mit HF (ca. 10ml),enthaltendAnisol(l,5ml),bei0°C behandelt. Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Ether gewaschen, in 0,1M Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde Glycyl-L-glutamyl-L-serin (VIII) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

Beispiel 2

2,439 mMol des Tripeptidyl-Harzes von Beispiel 1 wurden nacheinander mit jeweils 4 Äquivalenten Boc-Ala-OH (1,85 g, 9,76 mMol), Boc-Gln-ONp in 25 ml DMF (24 h ; unter Auslassung des Schrittes (k) des Kupplungs-Zyklus') und N-Boc-N"-Z-L-Lys-OH zu dem Hexapeptidyl-Harz umgesetzt.

1,0 g des Hexapeptidyl-Harzes wurde 45 min mit HF (ca. 10ml), enthaltend Anisol (1,5 ml), bei0°Cumgesetzt. Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Ether gewaschen, in 0, IM Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde L-Lysil-L-glutaminyl-L-alanyl-glycyl-L-glut-amyl-L-serin (VII) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

Beispiel 3

1,626 mMol des Hexapeptidyl-Harzes aus Beispiel 2 wurden mit Boc-Glu(OBzl)-OH (2,92 g, 8,67 mMol, 4 Äquiv.) zum Heptapeptidyl-Harz gekoppelt.

1,0 g dieses Harzes wurden 45 min mit HF (ca. 10 ml), enthaltend Anisol (1,5 ml), bei 0° C behandelt. Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Ether gewaschen, in 0,1M Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde L-Glutamyl-L-lysil-L-glutaminyl-L-alanyl-glycyl-L-gluta-myl-L-serin (VI) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

Beispiel 4

1,355 mMol des Heptapeptidyl-Harzes aus Beispiel 3 wurden mit Boc-Gln-ONp (1,99 g, 5,42 mMol, 4Äquiv.;unter Auslassung des Schrittes (k) des Kupplungs-Zyklus') in 25 ml DMF während 24 h zu dem entsprechenden Octapeptidyl-Harz gekoppelt.

1,0 g dieses Harzes wurde während 45 min mit HF (ca. 10 ml), enthaltend Anisol (1,5 ml), bei 0°C behandelt. Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt, der Rest mit Ether gewaschen, in 0,1M Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde L-Glutaminyl-L-glutamyl-L-lysyl-L-glutaminyl-L-alanyl-glycyl-L-glutamyl-L-serin (V) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

Beispiel 5

1,084 mMol des Octapeptidyl-Harzes aus Beispiel 4 wurden mitBoc-Glu(OBzl)OH (1,46 g, 4,336 mMol, 4 Äquiv.) zudem entsprechenden Nonapeptidyl-Harz gekoppelt.

1,0 g des Nonapeptidyl-Harzes wurde während 45 min mit HF (ca. 10 ml), enthaltend Anisol (1,5 ml), bei 0°C behandelt. Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand mit Wasser gewaschen, in 0,1M Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde L-Glutamyl-L-glutaminyl-L-glutamyl-L-lysyl-L-glutaminyl-L-alanyl-glycyl-L-glutamyl-L-serin (IV) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

Beispiel 6

0,813 mMol des Nonapeptidyl-Harzes aus Beispiel 5 wurde nacheinander mit jeweils 4 Äquiv. von Boc-Ile-OH und Boc-Thr(Bzl)-OH zum entsprechenden Undecapeptidyl-Harz gekuppelt.

1,0 g des Undecapeptidyl-Harzes wurde während 45 min mit HF (ca. 10 ml), enthaltend Anisol (1,5 ml), bei 0°C behandelt.

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Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand mit Ether gewaschen, in 0,1M Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde L-Threonyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L-glutaminyl-L-glutamyl-L-lysyl-L-glutaminyl-L-alanyl-glycyl-L-glutamyl-L-serin (III) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

Beispiel 7

0,271 mMol des Undecapeptidyl-Harzes aus Beispiel 6 wurden mit Boc-Glu(OBzl)-OH (365 mg, 1,084mMol, 4Äquiv.) zu dem entsprechenden Dodecapeptidyl-Harz gekoppelt. Das erhaltene Produkt wurde während 45 min mit HF (ca. 10 ml), enthaltend Anisol (1,5 ml), bei 0° C behandelt. Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand mit Ether gewaschen, in 0,1 ml Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde L-Glutamyl-L-threonyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L-glutaminyl-L-glutamyl-L-lysyl-L-glutaminyl-L-alanyl-glycyl-L-glutamyl-L-serin (II) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

Beispiel 8

Eine Lösung von 3,678 g (11,9 mMol) Na-Boc-0-Benzyl-L-threonin in 1,50 ml (10,7 mMol) Triethylamin und 25 ml absolutem Ethanol wurde mit 10,0 g (11,9 mMol) chlormethyliertem Copolystyrol-1 % Divinylbenzol (1,19 mMol Cl/g Harz) umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde wie in Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet.

Die Festphasen-Synthese wurde wie in Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. 10,0 g TFA-H-Thr(Bzl)-0-Harz (3,12 mMol) wurden nacheinander mit Boc-Lys(Z)-OH (4,742 g, 12,48 mMol, 4 Äquiv.) und Boc-Ala-OH (2,360 g, 12,48 mMol, 4 Äquiv.) zum entsprechenden Tripeptidyl-Harz umgesetzt.

1,0 g (0,312 mMol) des Tripeptidyl-Harzes wurde dann nacheinander gekoppelt mit Boc-Asp(OBzl)-OH (4,03 mg, 1,248 mMol, 4 Äquiv.), Boc-Ser(Bzl)-OH (368 mg, 1,248 mMol, 4 Äquiv.), Boc-Glu(OBzl)-OH (421 mg, 1,248 mMol, 4 Äquiv.), Boc-Gly-OH (218 mg, 1,248 mMol, 4 Äquiv.) und Boc-Ala-OH (236 mg, 1,248 mMol, 4 Äquiv.). Ein abschliessender Kupplungs-Zyklus mit Boc-Gln-ONp (458 mg, 1,248 mMol, 4 Äquiv.) in 25 ml DMF (24 h) unter Auslassung des Schrittes (k) lieferte das entsprechende Nonapeptidyl-Harz. Das erhaltene Produkt wurde während 45 min mit HF (ca. 10 ml), enthaltend Anisol (1,72 ml), bei 0°C behandelt. Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Ether gewaschen, in 0,1M Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde L-Glutaminyl-L-alanyl-glycyl-L-glutamyl-L-seryl-L-aspartyl-L-alanyl-L-lysyl-L-threonin (IX) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

Beispiel 9

1,0 g (0,312 mMol) des Tripeptidyl-Harzes aus Beispiel 8 wurde in Stufe (j) mit 441 mg Boc-Asn-ONp (1,248 mMol, 4 Äquiv.) in 25 ml DMF (24 h) gekoppelt, wobei Stufe (k) des Kupplungs-Zyklus' ausgelassen wurde. Anschliessend wurde jeweils mti 4 Äquiv- Boc-Ser(Bzl)-OH (368 mg), Boc-Glu-(OBzl)-OH (218 mg), Boc-Gly-OH (218 mg) und Boc-Ala-OH (236 mg) gekuppelt. Ein abschliessender Kupplungs-Zyklus, in dem die Stufe (k) ausgelassen wurde, mit Boc-Gln-ONp (458 mg, 1,248 mMol, 4 Äquiv. ) in 25 ml DMF (24 h) lieferte das entsprechende Nonapeptidyl-Harz. Das Reaktionsprodukt wurde während 45 min mit HF (210 ml), enthaltend Anisol (1,72 ml), bei 0° C behandelt. Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Ether gewaschen, in 0, IM Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde L-Glutaminyl-L-alanyl-glycyl-L-glutamyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-alanyl-L-lysyl-L-threonin (X) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

Beispiel 10

1,0 g (0,312 mMol) des Tripeptidyl-Harzes aus Beispiel 8 wurde nacheinander mit jeweils 4 Äquiv. Boc-Asp(OBzl)-OH

5

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65

652 409

(403 mg), Boc-Ser(Bzl)-OH (368 mg), Boc-Glu(OBzl)-OH (421 mg), Boc-Gly-OH (218 mg) undBoc-Sar-OH (236 mg) gekuppelt. In einem letzten Kupplungs-Zyklus, in dem die Stufe (k) ausgelassen wurde, mit Acetyl-Gln-ONp (386 mg, 1,247 mMol, 4 Äquiv.) in 25 ml DMF (24 h) wurde das entsprechende Nonapeptidyl-Harz erhalten. Das Reaktionsprodukt wurde während 45 min mit HF (ca. 10 ml), enthaltend Anisol (1,72 ml), bei 0° C behandelt. Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand mit Ether gewaschen, in 0, IM Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde N-Acetyl-L-glutaminyl-sarcosyl-glycyl-L-glutamyl-L-seryl-L-aspartyl-L-alanyl-L-lysyl-L-threonin (XI) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

Beispiel 11

1,0 g (0,312 mMol) des Tripeptidyl-Harzes von Beispiel 8 wurde in Stufe (j) mit Boc-Asn-ONp (441 mg, 1,248 mMol, 4 Äquiv. ) in 25 ml DMF (24 h) gekoppelt, wobei Schritt (k) des Kupplungs-Zyklus' ausgelassen wurde. Anschliessend wurde mit jeweils 4 Äquiv. Boc-Ser(Bzl)-OH (368 mg), Boc-Glu(OBzl)-OH (421 mg), Boc-Gly-OH (218 mg) und Boc-Sar-OH (236 mg) gekoppelt. Ein abschliessender Kupplungs-Zyklus, in dem Stufe (k) ausgelassen wurde, mit Acetyl-Gln-ONp (386 mg, 1,248 mMol, 4 Äquiv.) in 25 ml DMF (24 h) lieferte das entsprechende Nonapeptidyl-Harz. Das Reaktionsprodukt wurde während 45 min mit HF (ca. 10ml), enthaltend Anisol (1,72 ml), bei 0° C behandelt. Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Ether gewaschen, in 0, IM Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde N-Acetyl-L-glutami-5 nyl-sarcosyl-glycyl-L-glutamyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-alanyl-L-lysyl-L-threonin (XII) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

Beispiel 12

10 1,0 g (0,312 mMol) des Tripeptidyl-Harzes aus Beispiel 8 wurde mit jeweils 4 Äquiv. Boc-Thr(Bzl)-OH (386 mg), Boc-Ile-OH (289 mg), Boc-Glu(OBzl)-OH (421 mg), Boc-Asp(OBzl)-OH (403 mg), Boc-Ser(Bzl)-OH (368 mg, Boc-Glu(OBzl)-OH (421 mg), Boc-Gly-OH (218 mg), und Boc-Ala-OH (236 mg) 15 gekuppelt. Ein abschliessender Kupplungs-Zyklus, in dem Schritt (k) ausgelassen wurde, mit Boc-Gln-ONp (458 mg, 1,248 mMol, 4 Äquiv.) in 25 ml DMF (24 h) lieferte das entsprechende Dodecapeptidyl-Harz. Das Reaktionsprodukt wurde während 45 min mit HF (ca. 10ml), enthaltend Anisol (1,72 ml), 20 bei 0° C behandelt. Das HF wurde unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand mit Ether gewaschen, in 0,1M Essigsäure extrahiert und lyophilisiert. Es wurde L-Glutaminyl-L-alanyl-glycyl-L-glutamyl-L-seryl-L-aspartyl-L-glutamyl-L-iso-25 leucyl-L-threonyl-L-alanyl-L-lysyl-L-threonin (XIII) in Form eines weissen Feststoffes erhalten.

M

Claims

652 409 PATENTANSPRÜCHE

1. Peptide der Formel

R'-Gly-Glu-Ser-R2 I

worin R1 Q, Q'-Ala-, Q'-GLN-Ala-, Q-Lys-Gln-Ala-, Q-Glu-Lys-Gln-Ala-, Q-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-, Q-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-, Q'-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-, Q-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-, Q-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala- oder Q-Gln-Sar- darstellt; Q Wasserstoff oder Acyl ist; Q' Wasserstoff oder Acyl ist, aber Acyl, sofern R2 Hydroxy bedeutet; R2 Hydroxy, -A-C oder -A-B-C; A Asp oder Asn; B Glu-Ile-Thr und C Ala-Lys-Thr-OH darstellen und deren pharmazeutisch verträgliche Additionssalze mit Säuren oder Basen.

2. Ein Peptid gemäss Anspruch 1 der Formel H-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH.

3. Ein Peptid gemäss Anspruch 1 der Formel H-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH.

4. Ein Peptid gemäss Anspruch 1 der Formel H-Gly-Glu-Ser-OH.

5. Ein Peptid gemäss Anspruch 1 der Formel H-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-Asp-Ala-Lys-Thr-OH.

6. Ein Peptid gemäss Anspruch 1 der Formel H-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-Ala-Lys-Thr-OH.

7. Ein Peptid gemäss Anspruch 1 der Formel H3C-CO-Gln-Sar-Gly-Glu-Ser-Asp-Ala-Lys-Thr-OH.

8. Ein Peptid gemäss Anspruch 1 der Formel H3C-CO-Gln-Sar-Gly-Glu-Ser-Asn-Ala-Lys-Thr-OH.

9. Ein Peptid gemäss Anspruch 1 der Formel H-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-Asp-Glu-Ile-Thr-Ala-Lys-Thr-OH.

10. Peptide gemäss einem der Ansprüche 1-9 als pharmazeutisch aktive Verbindungen.

11. Peptide gemäss einem der Ansprüche 1-9 als Mittel, die die Differenzierung und Funktion von T-Zellen regulieren.

12. Peptide gemäss einem der Ansprüche 1-9 als Mittel, die die Produktion von TdT-positiven Prothymocyten stimulieren, die Macrophagen-Wanderung hemmen oder die Immun-Antwort Steroid-supprimierter Säuger wiederherstellen.

13. Pharmazeutische Kompositionen, enthaltend ein Peptid gemäss einem der Ansprüche 1-9 und einen verträglichen Träger.

14. Die Verwendung eines Peptids gemäss einem der Ansprüche 1-9 zur Herstellung pharmazeutischer Kompositionen gemäss Anspruch 13.

ß3 und ß4 das Wiederauftreten von TdT-positiven Zellen im Thymus nach Steroidinduzierter Immunsuppression beschleunigen (Low et al., PNAS 78,1162 [1981] ; Hu et al., Mol. Cell. Biochem. 41,49 [1981]) und die Wanderung von Macrophagen 5 hemmen (Thurman et al., Lymphokines and Thymic Hormones: Their Potential Utilization in Cancer Therapeutics, Goldstein & Chirigos [Herausg.], Raven Press, 1981, S. 145).

Bei der Synthese von Thymosin et] in flüssiger Phase verwendete Wang die geschützten Carboxyl-endständigen Octa-, 10 Undeca- und Tetradecapeptide von Thymosin ocj als Zwischenprodukte. Diese Verbindungen wurden durch Hydrogenolyse und anschliessende Behandlung mit HF in die freie Form übergeführt und als aktiv in der Regulierung und Differenzierung von T-Zellen beschrieben (U.S.P. 4148788).

15 Schliesslich wurden die Peptide H-AIa-Gly-GIu-Ser-OH, H-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH und H-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH durch Abbau von Thymosin ß4 mit Trypsin und Thermolysin erhalten (Low et al., PNAS 78,1162 [1981]).