CH654016A5 - Verfahren zur fixierung von biologisch aktivem protein oder von substrat von biologisch aktivem protein an polyamid. - Google Patents

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CH654016A5
CH654016A5 CH1856/78A CH185678A CH654016A5 CH 654016 A5 CH654016 A5 CH 654016A5 CH 1856/78 A CH1856/78 A CH 1856/78A CH 185678 A CH185678 A CH 185678A CH 654016 A5 CH654016 A5 CH 654016A5
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fixierung von biologisch aktivem Protein oder von Substrat von biologisch aktivem Protein an Polyamid.
Die Fixierung bzw. Immobilisierung von biologisch aktiven Proteinen, wie Enzymen, Hormonen, zur Teilnahme an Antigen-Antikörperreaktionen und Hapten-Antikörperreak-tionen befähigten Substanzen, Gerinnungsfaktoren und dergleichen, insbesondere im Rahmen der präparativen und der analytischen Chemie, hat in den vergangenen Jahren grosse
Bedeutung erlangt. Es wurden bereits zahlreiche Fixierungsverfahren entwickelt. Trotzdem zeigt es sich, dass ständig neue Fixierungsprobleme auftauchen, die mit den bisher bekannten Methoden nicht befriedigend gelöst werden kön-5 nen. Hierauf ist es auch zurückzuführen, dass bisher trotz der ohne weiteres einsehbaren Vorteile der Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an Trägermaterialien auf vielen Gebieten die Einführung der fixierten Proteine in die Praxis nur zögernd erfolgte und sich der erwartete breite Durch-10 bruch noch nicht realisierte.
Von besonderem Interesse als Trägermaterialien für immobilisierte aktive Proteine sind Polyamide aufgrund ihrer interessanten physikalischen und chemischen Eigenschaften. Polyamide weisen aufgrund ihres Gehalts an sekundären 15 Aminogruppen eine gewisse chemische Ähnlichkeit mit der Proteinstruktur auf, insbesondere hinsichtlich ihrer Ladungsverteilung, so dass hier negative Auswirkungen auf die biologische Aktivität der daran immobilisierten Enzyme im Vergleich zu anderem Trägermaterialien gering sind, soweit keine 20 sonstigen Gruppen vorliegen, welche die Aktivität der Proteine nachteilig beeinflussen.
An Polyamid als Trägermaterial fixierte, biologisch aktive Proteine sind bereits bekannt, bei denen das Protein mit dem Polyamid über Amidinostrukturen gebunden ist (vgl. z.B. 25 Kollowik-Kaplan «Methods in Enzymology», Bd. 25, S. 646-648). In analoger Weise hat man auch bereits Polyamide in die Polyiminoester überführt und mit biologisch aktiven Proteinen gekuppelt.
In diesen, an Polyamid immobilisierten, biologisch akti-30 ven Proteinen kommen jedoch die grundsätzlichen günstigen Eigenschaften der Polyamide als Träger für Enzyme nicht voll zur Geltung, da hierbei positiv geladene Gruppen gebildet werden, welch ein vielen Fällen in bezug auf die Enzymbindung nachteilig ist. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe 35 zugrunde, an Polyamid fixierte, d.h. immobilisierte Proteine oder Proteinsubstrate, insbesondere Enzyme, zu schaffen, bei denen die Bindung derart erfolgt, dass der Träger neutral und ungeladen bleibt.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein 40 Verfahren zur Fixierung von biologisch aktiven Proteinen oder von deren Substraten an Polyamiden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Polyamid in Anwesenheit eines Lösungsmittels für Polyamide mit einander äquimolaren Mengen Formaldehyd und einer mit Formaldehyd konden-45 sierbaren Verbindung, welche wenigstens eine weitere reaktionsfähige Gruppe enthält, umgesetzt wird unter Bildung eines Polyamidderivates der Formel II
R-CO-N-R,
CH.
(II),
V
worin R und Ri die an der Amidogruppe gebundenen Reste des Polyamids und R2' den Rest der mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung, welche noch wenigstens eine weitere reaktionsfähige Gruppe enthält, darstellt, dieses Poly-60 amidderivat mit einem bi- oder polyfunktionellen Proteinreagens umgesetzt oder, sofern der Rest R2' ein solcher mit aromatisch gebundener, diazotierbarer Aminfunktion ist, mit salpetriger Säure, die aus Nitrit freigesetzt wird, diazotiert wird und danach in wässrigem Medium mit einem in diesem 65 Medium gelösten biologisch aktiven Protein oder mit einem Substrat davon, das im wässrigen Medium gelöst ist, gekuppelt wird.
Als Polyamid kommen im Rahmen der Erfindung sowohl
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einheitliche Polyamide, also die sogenannten Rein- oder Homopolykondensate, zu denen z.B. die Polykondensate von oo-Aminocarbonsäuren und die Polykondensate aus linearen aliphatischen Diaminen und Dicarbonsäuren sowie Polykondensate mit aromatischen oder anderen Komponenten zählen, und die Mischpolyamide in Betracht. Typische Beispiele sind Polycaprolactam, Polykondensate aus Adipinsäure und Hexamethylendiamin (6,6-Polyamid), 6,10-PoIyamid, Poly-aminoundecansäure (11-Polyamid), Mischpolyamide aus Caprolactam und Dicarbonsäurediaminsalzen, wie adipin-saurem 4,4'-Diaminodicyclohexylmethan, 12-Polyamid, Poly-cyclamide, wie Poly-(l,4-cyclohexylendimethylensuperamid), Polydodecanollactam, Wolle, Kasein, Naturseide, Polyargi-nin und ähnliche.
Die Reste R und Ri bestehen entsprechend der obigen Definition aus den an die Amidogruppe gebundenen Resten des Polyamids. Diese Reste können wiederum aliphatische, aromatische oder aliphatisch-aromatische Reste enthalten, die weitere sekundäre oder tertiäre Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen oder N-substituierte Carbonamidgruppen enthalten können. Vorzugsweise enthalten R und Ri dabei geradkettige, verzweigte und/oder zyklische Alkylgruppen bzw. Alkylengrup-pen mit 1 bis 12 C-Atomen, Phenylgruppen bzw. Phenylen-gruppen oder Alkylphenylengruppen bzw. Alkylenphenylen-gruppen, die wieder miteinander durch eine oder mehrere der vorstehend erwähnten N-substituierten Carbonamidgruppen, Amidgruppen, Estergruppen usw. verbunden sind, Peptidket-ten aus natürlichen und/oder synthetischen Aminosäuren oder dergleichen.
Der Rest Ri' leitet sich von der Verbindung ab, die mit Formaldehyd kondensierbar ist. Diese Eigenschaft ist z.B. erfüllt bei den mit Formaldehyd Harze bildenden Substanzen, beispielsweise also negative Substituenten tragende aromatische Verbindungen oder freie Aminogruppen oder Hydroxylgruppen enthaltende Verbindungen. Ausser der mit Formaldehyd kondensierbaren Struktur bzw. Funktion muss noch wenigstens eine weitere reaktionsfähige Gruppe vorhanden sein, die mit einem Proteinreagens zu reagieren vermag. Typische Beispiele für im Rahmen der Erfindung geeignete, mit Formaldehyd kondensierbare Verbindungen, von denen der Rest Ri' sich herleitet, sind Phenol, Anilin, Harnstoff, Thio-harnstoff, Melamin, Diaminotriazin, Gelatine, Amine, insbesondere aliphatische, aromatische oder araliphatische Diamine mit 2 bis 14 C-Atomen, und Alkohole, insbesondere Diole und Aminoalkohole.
Beispiele für geeignete Proteinreagentien sind Dialde-hyde, wie Glutardialdehyd, Dihydroxysuccinimidester, Dia-cetale, Bis-Maleinimide, bifunktionelle Iminoester, wie Diäthylmalonimidat, Dimethyladipinimidat, Diepoxyde, Dicarbonsäurechloride, insbesondere a-ß-ungesättigte Carbonsäuredichloride, Diisocyanate, Diisothiocyanate und dergleichen. Sie enthalten zweckmässig 2 bis 12 C-Atome, können jedoch auch längerkettig sein. Beispiele für solche länger-kettigen Verbindungen sind Copolymere aus Acrylamid/Methacrylamid und Acrylsäuresuccinimidester/ Methacrylsäuresuccinimidester. Die in den vorstehenden Beispielen aufgeführten Proteinreagentien enthalten jeweils zwei funktionelle Gruppen, die zur Kupplung mit biologisch aktiven Proteinen in wässriger Lösung ohne Beeinträchtigung der biologischen Aktivität derselben geeignet sind. Im Rahmen der Erfindung kann man jedoch auch solche Proteinreagentien verwenden, die nur eine proteinbindende Funktion oder mehr als zwei derartige Funktionen enthalten. Falls nur eine proteinbindende Gruppe vorliegt, muss wenigstens eine weitere funktionelle Gruppe vorliegen, die mit der weiteren funktionellen Gruppe, welche die mit Formaldehyd kondensierbare Verbindung, von der sich R2' ableitet, enthält unter Ausbildung einer homöopolaren Bindung zu reagieren vermag. Beispiele für geeignete Proteinreagentien finden sich weiter in den DE-OS 19 15 970, 22 37 083, 21 28 743, 22 60 185 und 26 03 319. Andere Proteinreagentien, die verwendet werden 5 können, sind z.B. Phosgen, Thiophosgen, Halogencyan und Nitrit.
Leitet sich Ri' von einem aromatischen Amin ab, so lässt sich die Proteinfixierung durch Umsetzung mit Nitrit bzw. salpetriger Säure, also Diazotierung der aromatischen Aminolo gruppe, und Kupplung durchführen.
Als biologisch aktive Proteine kommen im Rahmen der Erfindung z.B. Enzyme, immunologisch aktive Proteine, wie Antikörper, Hormone sowie biologisch aktive Peptide und dergleichen in Betracht. Anstelle der biologisch aktiven Pro-15 teine können auch ihre Substrate fixiert sein.
Als Lösungsmittel kommen die bekannten Lösungsmittel für Polyamide im Rahmen der Erfindung zur Anwendung. Hierzu gehören z.B. die niederen aliphatischen Carbonsäuren, insbesondere Ameisensäure und Essigsäure. Ihre Kon-20 zentration soll im allgemeinen wenigstens 10%, vorzugsweise wenigstens 50% betragen. Weitere geeignete Lösungsmittel sind z.B. 100%ige Schwefelsäure, Phosphorsäure, Lösungen von Metallsalzen der zweiten Hauptgruppe, wie CaCh, in Alkoholen, Phenole, Kresole, Chloralhydrat und andere. 25 Menge und Konzentration des Lösungsmittels hängen einerseits vom verwendeten Polyamid, andererseits davon ab, ob nur eine oberflächliche Anlösung gewünscht wird, die Kondensation in Gegenwart des Formaldehyds also in heterogener Phase verläuft, oder eine vollständige Lösung des Polya-30 mids gewünscht wird. Für Mischpolyamide geeignete Lösungsmittel sind z.B. auch Mischungen von wässrigen Alkoholen mit Lösungsvermittlern, wie Benzol oder chlorierten Kohlenwasserstoffen.
Wird nur eine oberflächliche Anlösung eines festen Poly-35 amids vorgenommen, so erfolgt lediglich eine oberflächliche Ankondensation, ohne dass die Form des Polyamids verändert wird. Letzteres kann daher beispielsweise als Schlauch, Granulat, Folie oder dergleichen vorliegen, und erfindungs-gemäss mit einem biologisch aktiven Protein oberflächlich 40 verbunden werden. Bei Durchführung in Lösung werden am Polyamid die Carbonamidgruppen durch Ankondensation substituiert, und anschliessend wird mit einem geeigneten Fällungsmittel, wie Wasser oder Hydrogencarbonatlösung, das gebildete substituierte Polyamid ausgefällt. Diese Arbeits-45 weise bietet auch die Möglichkeit, auf beliebigen Oberflächen, insbesondere Kunststoffoberflächen, die mit einem entsprechenden Lösungsmittel an der Oberfläche klebrig gemacht werden (z.B. bei Verwendung von Polystyrolröhr-chen mit Benzol) mit einer Lösung des substituierten Polya-50 mids zu beschichten und anschliessend die beschichteten Oberflächen durch die Umsetzung mit dem bi- bzw. multifunktionellen Proteinreagens zu aktivieren und zur Proteinbindung einzusetzen.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung 55 wird bei nur oberflächlicher Anlösung des Polyamids ein fester Träger aus beliebigem Material verwendet, dessen Oberfläche mit feinteiligem Polyamid, beispielsweise in Form von Geweben, Fäden, Flocken, Lints oder dergleichen, beschichtet ist. Die Polyamidteilchen können auf der Träger-60 Oberfläche aufgeklebt, durch elektrische Beflockung aufgebracht oder auf andere Weise gebunden sein. Bei dieser Ausführungsform liegen grosse spezifische Polyamidoberflächen vor, die bei der Proteinfixierung gemäss der Erfindung eine hohe spezifische Aktivität des beschichteten Trägers ergibt. 65 Voraussetzung ist dabei natürlich, dass nur eine oberflächliche Anlösung der feinen Polyamidteilchen erfolgt, die ihre Struktur erhält.
Gemäss einer besonderen Ausführungsform des Verfah
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rens der Erfindung wird in den Fällen, in denen die mit Formaldehyd kondensierbare Verbindung als weitere Funktion eine Aminogruppe enthält, die Kupplung mit dem biologisch aktiven Protein oder dem Proteinsubstrat mit Hilfe von bekannten Aminkupplungsmitteln, wie Phosgen, Thiophos-gen, Halogencyan oder Nitrit, durchgeführt. Derartige Kupplungsmittel sind für die Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an unlöslichen Trägermaterialien, welche Hydroxyl-oder Aminogruppen enthalten, bekannt. Beispielsweise wird bei Verwendung von Nitrit die Aminogruppe diazotiert und das Protein dann mit der Diazogruppe umgesetzt. Bei Verwendung von Thiophosgen wird in erster Stufe das entsprechende Isothiocyanat gebildet, welches dann mit einer Aminogruppe des Proteins unter Immobilisierung desselben reagieren kann.
Das Verfahren der Erfindung lässt sich auch dazu verwenden, anstelle der biologisch aktiven Proteine deren Substrate zu fixieren. Beispielsweise kann radioaktiv markierte Gelatine an dem Polyamid immobilisiert werden. Eine derart an Polyamid immobilisierte Gelatine lässt sich als empfindliches Nachweisreagens für hydrolytische Enzyme verwenden. So kann beispielsweise ein Kunststoffreagensgläschen mit der an Polyamid gebundenen markierten Gelatine beschichtet, mit einer Hydrolaselösung gefüllt und danach die in die Lösung übergegangene Markierung z.B. die Radioaktivität bestimmt werden.
Die Umsetzung der erfindungsgemäss erhaltenen Verbindung der Formel II mit dem Proteinreagens bzw. Kupplungsreagens und dem biologisch aktiven Protein oder Proteinsubstrat kann in mehreren Stufen erfolgen. Bei mehrstufiger Arbeitsweise wird das Kupplungsmittel zuerst mit der Verbindung II umgesetzt und das Produkt dann mit dem Protein oder dem Proteinsubstrat umgesetzt. Weiter kann mit dem Proteinkupplungsmittel das Protein vernetzt werden und von nichtvernetztem Protein abgetrennt werden. Dann wird das vernetzte Protein mit dem gleichen oder einem anderen Proteinkupplungsreagens mit der Verbindung II umgesetzt. Die Bindung derartiger vernetzter Proteinderivate ergibt besonders hohe Aktivitäten.
Die erste Stufe des erfindungsgemässen Verfahrens, also die Umsetzung in Gegenwart der mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung und mit Formaldehyd, kann im allgemeinen bei Temperaturen zwischen etwa 0 und 100 °C durchgeführt werden. Arbeitet man in ameisensaurer Lösung und in Gegenwart von Aminen, so kann als Konkurrenzreaktion die Leuckart-Wallach-Reaktion ablaufen. Unter diesen Bedingungen wird daher vorzugsweise bei niedrigeren Temperaturen im Rahmen des obigen Bereiches gearbeitet.
Unter Formaldehyd werden im Rahmen der Erfindung die üblichen Formen des Formaldehyds verstanden, also wässrige Formaldehydlösungen, Paraformaldehyd, Trioxan und andere Formaldehydpolymere, die sich unter den Reaktionsbedingungen wie freier Formaldehyd verhalten. Besonders bevorzugt wird Trioxan, da es als feste und chemisch eindeutig definierte Substanz am einfachsten quantitativ zu handhaben ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht die Immobilisierung bzw. Fixierung biologisch aktiver Proteine oder ihrer Substrate an Trägermaterialien auf Basis von Polyamiden in besonders schonender Weise und unter Erhalt der vorteilhaften Eigenschaften. Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung wird das Protein über ein bi- oder polyfunktionelles Proteinreagens beliebig zu wählender Grösse an die als Zwischenprodukt gebildete Verbindung der Formel II gekuppelt. Dies erlaubt es, auch den Abstand des Proteins zum eigentlichen Trägermolekül nach Belieben auszuwählen. Ein grösserer Abstand, also die Verwendung eines längeren Spa-cers, ist beispielsweise dann von Interesse, wenn bereits vorvernetzte Proteine fixiert werden sollen, also Aggregate, die aus mehreren Molekülen der biologisch aktiven Proteine bestehen. Aus räumlichen Gründen ist dann häufig ein möglichst langer Spacer erforderlich.
Die erfindungsgemäss hergestellten immobilisierten biologisch aktiven Proteine bzv/. Proteinsubstrate können in wässrigen Lösungen löslich oder unlöslich sein. Durch Kupplung mit wasserlöslichen Polyamiden kann beispielsweise das Ausbluten des Proteins durch semipermeable Membranen verringert oder beseitigt werden, die Stabilität erhöht werden oder ihre Einsatzfähigkeit als Arzneimittel ermöglicht werden. Bei der Kupplung an unlösliche Trägermaterialien steht die einfache Wiedergewinnbarkeit des biologisch aktiven Proteins im Vordergrund der Anwendungszwecke. Sie können aber auch zur Gewinnung von Antigenen und Antikörpern als spezifische Adsorptionsmittel und im Rahmen der enzymatischen Analyse verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
0,3 M Phenylendiamin und 0,1 M Trioxan werden in 50%iger Ameisensäure zusammengegeben und 3 Stunden durch einen 3 m langen Schlauch aus Nylon-6 hindurchgepumpt. Der Schlauch wird anschliessend mit Wasser gespült, mit einer 10%igen Lösung von Glutardialdehyd in 0,2 M Borat-Puffer, pH 8,5, gefüllt, 15 Minuten stehengelassen, wieder gewaschen und dann mit einer Lösung von 2 mg Glucose-oxidase pro ml 0.1 M Phosphat-Puffer, pH 7,8, gefüllt und über Nacht bei 4° stehengelassen. Nach Waschen mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,0, der 1 M an Kochsalz ist, wird eine enzymatische Aktivität von 1,8 U/m Schlauch
Beispiel 2
20 g Nylonflocken von 1 mm Länge werden in 50%iger Ameisensäure suspendiert und mit 0,3 M Phenylendiamin und 0,1 M Trioxan 3 Stunden bei 50° umgesetzt. Nach dem Abfiltrieren wird gewaschen und die modifizierten Nylonflocken werden in 1:10 verdünnter Salzsäure suspendiert, auf 0° gekühlt und unter Rühren bei 0° mit 2,5 M Natriumnitrit-Lösung versetzt. Nach 60 Minuten wird mit eisgekühltem Wasser gewaschen und ein Teil des Derivates sofort mit einer Lösung von Glucoseoxidase mit 10 mg/ml in Phosphat-Puffer, pH 7,0, versetzt. Die anschliessend nach der Fixierung über Nacht bei 4° mit 1 M Kochsalzlösung gewaschenen Nylonflocken weisen eine Aktivität von 17 U/g auf.
Ein weiterer Teil des frisch diazotierten Derivates wird mit einer Lösung von a-Foetoprotein-Antikörpern in Natri-umcarbonat-Puffer, pH 8, mit 0,1% eines Tensides versetzt und über Nacht stehengelassen. Die spezifische Bindung der Antikörper ist im Diagramm der beigefügten Zeichnung dargestellt.
Beispiel 3 bis 5
Es wird wie in Beispiel 2 verfahren, nur wird anstelle von Phenylendiamin Anilin bzw. Dianisidin bzw. Diamino-diphe-nylmethan eingesetzt. Die spezifische Bindung an Antikörpern geht ebenfalls aus der Zeichnung hervor.
Beispiel 6
0,03 M Phenylendiamin und 0,01 M Trioxan werden in 50%iger Essigsäure gelöst, auf 60° erwärmt und 3 Stunden durch einen 2 m langen Nylonschlauch gepumpt. Anschliessend wird der Schlauch mit Wasser gewaschen und eine 5%ige Lösung eines Copolymeren aus Methacrylamid und Methacrylsäure-hydroxysuccinimidester in den Schlauch eingefüllt und nach 4 Stunden wieder entleert und mit Wasser gewaschen. Dann wird eine Lösung von 2 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,8, eingefüllt und nach
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Stehen über Nacht bei 4° entleert und gewaschen. Der fertige Enzymschlauch weist eine Aktivität von 1,5 U/m auf.
Beispiel 7
Je 20 g Nylon-6-Partikel werden mit 0,3 M Phenylendiamin und 0,1 M Trioxan in 60%iger Essigsäurelösung bei 50° bzw. mit 0,3 M Diaminodiphenylmethan und 0,1 M Trioxan in 60%iger Essigsäurelösung bei 50 °C 2 Stunden lang umgesetzt. Nach Waschen mit Wasser wird jeweils die Hälfte des Phenylendiamin-Produktes und des Diaminodiphenylme-than-Produktes in 1:10 verdünnter Salzsäure suspendiert, auf 0° gekühlt und unter Rühren bei 0 °C mit 2,5 M Natriumni-trit-Lösung diazotiert. Nach 60 Minuten wird mit eisgekühltem Wasser gewaschen. Je 1 g diazotiertes Phenyldiamin-Derivat werden mit einer Lösung von 10 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,0, versetzt und bei 4°
über Nacht belassen. Nach dem Waschen mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,0, der 1 M an Kochsalz ist, ergibt sich eine Aktivität im Fall des Phenylendiamin-Derivates von 17 U/g, im Fall des Diaminodiphenylmethan-Derivates von 71 U/g. Je 1 g des frisch diazotierten Phenylendiamin-Derivates und des Diaminodiphenylmethan-Drivates werden mit einer Lösung von 5 mg Cholesterinoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 6,0, versetzt, über Nacht bei 4° belassen und anschliessend mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 6,0, der 1 M an Kochsalz ist, gewaschen. Es ergibt sich eine Aktivität von 155 U/g bei dem diazotierten Phenylendiamin-Derivat bzw. 160 U/g bei dem diazotierten Diaminodiphenylmethan-Derivat. Anschliessend werden die beiden Produkte nochmals mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 6,0, der 1 M an Kochsalz und 0,5% an Thesit ist (Hydroxypolyäthoxidodecan), gewaschen. Durch diesen Waschvorgang nimmt die Aktivität des Phenylendiamin-Derivates auf 10 U/g und die des Diamino-diphenylmethan-Derivates auf 15 U/g ab.
Beispiel 8
Jeweils 5 g Nylonpartikel werden mit jeweils 0,3 M Diaminodiphenylmethan und 0,1 M Trioxan bzw. 0,3 M Harnstoff und 0,1 M Trioxan bzw. 0,3 M Anilin und 0,1 M Trioxan bzw. 0,3 M Triaminotriazin und 0,1 M Trioxan in 50%iger Ameisensäure-Lösung 3 Stunden bei 20° umgesetzt. Nach dem Waschen werden die verschiedenen Derivate mit 10%iger GIutardialdehyd-Lösung in 0,2 M Borat-Puffer, pH 8,5, für 15 Minuten umgesetzt und abermals gewaschen. Je 1 g der verschiedenen Derivate wird danach mit 3 ml einer Niere-nacylase-Lösung von 480 mg in 40,5 ml 0,1 M Triätha-nolamin-Puffer, pH 8,3, für 1 Stunde versetzt, danach abfiltriert und gewaschen. Die gemessene Aktivität beträgt im Fall des Phenylendiamin-Derivates 7,5 U/g, bei Diaminodiphenylmethan 6,7 U/'g, bei Harnstoff 6,8 U/g, bei Triaminotriazin 8,9 U/g.
Beispiel 9
0,1 M Polyamid-6 wird in 100%iger Ameisensäure gelöst und mit 0,1 M Phenylendiamin und 0,033 M Trioxan versetzt. Nach 3 Stunden bei 50° wird die Lösung in Wasser ausgefällt und das ausgefällte Nylon-Derivat nach Waschen mit Alkohol und Wasser mit 10%iger Glutardialdehyd-Lösung in 0,2 M Borat-Puffer, pH 8,5, für 15 Minuten versetzt und erneut gewaschen. Danach wird das Nylon-Derivat zu einer Lösung von 2 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,8, gegeben, über Nacht bei 4° stehengelassen und anschliessend gewaschen. Das gewaschene Nylon-Deri-vat weist anschliessend eine Aktivität von 16 U/g auf.
Beispiel 10
Nylon-Derivat wie in Beispiel 9 wird hergestellt, jedoch nicht in Wasser ausgefällt, sondern mit Tonpartikeln mit einem Durchmesser von 0,315 bis 0,400 mm versetzt, so dass noch diskrete Partikel vorliegen, und anschliessend evakuiert. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 10%iger Glutardialdehyd-Lösung in 0,2 M Borat-Puffer, pH 8,5, versetzt, nach 5 15 Minuten abfiltriert und gewaschen und der gecoatete Ton mit einer Lösung von 2 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, versetzt. Nach Stehen über Nacht bei 4°, Abfiltrieren und Waschen, weist das Nylon-Ton-Deri-vat eine Glucoseoxidase-Aktivität von 8 U/g auf.
Beispiel 11
Nylon-Derivat wie in Beispiel 9 wird hergestellt und in vorher mit Benzol klebrig gemachte Polystyrolgläschen von 15 3 cm Höhe und 1 cm Durchmesser eingefüllt. Nach einstündigem Stehenlassen wird ausgegossen und gespült, dann mit einer 10%igen Lösung von Glutardialdehyd in 0,2 M Borat-Puffer, pH 8,5, gefüllt, nach 15 Minuten ausgeleert und gespült und mit einer Lösung von 2 mg Glucoseoxidase pro 20 ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,8, gefüllt. Nach Stehen über Nacht bei 4° werden die Gläschen gewaschen und weisen anschliessend eine Aktivität von 0,5 U/Gläschen auf.
25 Beispiel 12
In einem Gemisch aus 18,6 g CaCh und 18,6 g H2O plus 63 g Methanol und 1 bis 1000 Teilen Ameisensäure wird Polyamid-6 bei erhöhter Temperatur von 30 bis 80 °C gelöst und heiss in 2 m lange Nylon-6-Schläuche eingefüllt und 30 danach sofort mit kaltem Wasser gespült. An der inneren Oberfläche des Schlauches bleibt eine Schicht amorphes, reaktionsfähiges Nylon zurück. Dann wird eine Lösung von 0,03 M Phenylendiamin und 0,01 M Trioxan in 60%iger Essigsäure bei 60° durch die Nylonschläuche gepumpt. 35 Anschliessend wird mit Wasser gewaschen und dann eine Lösung von 50 mg Korksäuredihydroxysuccinimidester in 1 ml Dioxan in den Schlauch eingefüllt. Nach 15 Stunden wird der Schlauch geleert und a) eine Lösung von 5 mg Glucoseoxidase pro 1 0,1 M 40 Phosphat-Puffer pH 7,8, eingefüllt,
b) eine Lösung von 372 mg Glucoseoxidase in 4,5 ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,8, wird mit 6,4 mg Äthylengly-colbispropionsäurebishydroxysuccinimidester in 0,5 ml Dioxan versetzt und über Nacht bei 4° stehengelassen. Danach
45 wird die vernetzte Glucoseoxidase über eine Sephadex G200® (vernetztes Dextran) Säule chromatographiert und die vernetzten Anteile (ca. 90% im Ausschlussvolumen) werden in 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,8, in den oben propagierten Schlauch gefüllt.
50 Im Fall a) ergibt sich eine Aktivität von 4 U/m, im Fall b) eine Aktivität von 9 U/m.
Beispiel 13
55 10g Nylon-6-PartikeI mit 0,100 bis 0,125 mm Durchmesser werden in 100 ml 40%iger Ameisensäure suspendiert und 2,25 g Trioxan (0,075 Mol Formaldehydeinheiten) und 9,4 g Phenol (0,1 Mol) werden zugegeben. Nach 3 Stunden bei 50° wird abgesaugt, mit Methanol nachgewaschen und danach mit trockenem Äther nachgewaschen. Die Partikel werden in 250 ml Toluol suspendiert, in dem 10 ml Hexamethylendiiso-cyanat gelöst sind. Nach 2 Stunden wird abgesaugt, mit getrocknetem Äther nachgespült und sofort eine Lösung von 5 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,0, 65 zu den Partikeln zugegeben. Nach Stehen über Nacht wird gewaschen, und die anschliessend gemessene Aktiviät beträgt 11,2 U/g. In diesem Beispiel sind die effektiv umgesetzten Mengen des Formaldehyds und des Phenols äquimolar.
1 Blatt Zeichnungen

Claims (8)

  1. 654 016
  2. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung mit dem Formaldehyd in wenigstens 50%iger Ameisensäure oder Essigsäure durchgeführt wird.
    2
    PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Fixierung von biologisch aktivem Protein oder von Substrat von biologisch aktivem Protein an Polyamid, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamid in Anwesenheit eines Lösungsmittels für Polyamide mit einander äquimolaren Mengen Formaldehyd und einer mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung, welche wenigstens eine weitere reaktionsfähige Gruppe enthält, umgesetzt wird unter Bildung eines Polyamidderivates der Formel II
    R-CO-N-R,
    CH„
    (II),
    V
    worin R und Ri die an der Amidogruppe gebundenen Reste des Polyamids und R2' den Rest der mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung mit wenigstens einer weiteren reak-tiosfähigen Gruppe darstellt, dieses Polyamidderivat mit einem bi- oder polyfunktionellen Proteinreagens umgesetzt oder, sofern der Rest R2' ein solcher mit aromatisch gebundener, diazotierbarer Aminfunktion ist, mit salpetriger Säure, die aus Nitrit freigesetzt wird, diazotiert wird und danach in wässrigem Medium mit einem in diesem Medium gelösten biologisch aktiven Protein oder mit einem Substrat davon, das im wässrigen Medium gelöst ist, gekuppelt wird.
  3. 3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamid als Formkörper eingesetzt wird und nur eine oberflächliche Anlösung vorgenommen wird.
  4. 4. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung mit gelöstem Polyamid durchgeführt wird und die Verbindung der Formel II dann auf eine feste Trägeroberfläche abgeschieden wird.
  5. 5. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Formkörper aus einem festen Trägermaterial besteht, dessen Oberfläche mit feinteiligem Polyamid beschichtet ist.
  6. 6. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest R2' ein solcher mit aromatisch gebundener, diazotierbarer Aminfunktion ist und mit salpetriger Säure, die aus Nitrit freigesetzt wird, diazotiert wird.
  7. 7. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteinreagens Phosgen, Thiophosgen oder Halogencyan verwendet wird.
  8. 8. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein im wässrigen Medium gelöstes, vernetztes, biologisch aktives Protein gekuppelt wird.
CH1856/78A 1977-02-24 1978-02-21 Verfahren zur fixierung von biologisch aktivem protein oder von substrat von biologisch aktivem protein an polyamid. CH654016A5 (de)

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