CH655947A5 - Verfahren zur herstellung von restriktionsenzymen aus bifidobakterien. - Google Patents
Verfahren zur herstellung von restriktionsenzymen aus bifidobakterien. Download PDFInfo
- Publication number
- CH655947A5 CH655947A5 CH1487/81A CH148781A CH655947A5 CH 655947 A5 CH655947 A5 CH 655947A5 CH 1487/81 A CH1487/81 A CH 1487/81A CH 148781 A CH148781 A CH 148781A CH 655947 A5 CH655947 A5 CH 655947A5
- Authority
- CH
- Switzerland
- Prior art keywords
- buffer
- dna
- restriction enzymes
- column
- enzymes
- Prior art date
Links
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 claims description 14
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 claims description 12
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 claims description 7
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 44
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 28
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 28
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 241000192537 Anabaena cylindrica Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- SPOMEWBVWWDQBC-UHFFFAOYSA-K tripotassium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O SPOMEWBVWWDQBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical group N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241001655328 Bifidobacteriales Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N L-cysteine hydrochloride Chemical compound Cl.SC[C@H](N)C(O)=O IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical class CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Restriktionsenzymen aus Bifidobakterien.
Restriktionsenzyme sind Endonucleasen mit der Eigenschaft, spezifische Nucleotidsequenzen in einer doppelt gewendelten Desoxyribonucleinsäure (DNA) zu erkennen und diese Sequenz genau dort wo sie beginnt und endet oder in der Nähe davon herauszuschneiden, wobei dann ganz spezifische Fragmente der DNA entstehen. Seit der Entdeckung der Restriktionsenzyme in dem Haemophilus influenzae, wurde eine weitere grosse Anzahl von Restriktionsenzymen aus einem weiten Spektrum von verschiedenen Bakterienarten isoliert (Roberts, 1980).
Durch die einmalige Fähigkeit, die Desoxyribonucleinsäure an bestimmten Orten aufzutrennen, haben diese Enzyme vielerlei Anwendung in der DNA-Forschung gefunden, beispielsweise in der «Kartographie» der Gene, in der DNA-Sequenzanalyse, in der Genisolierung und in der Technik der DNA Rekombination. Wenn auch schon viele Restriktionsenzyme bestimmter und verschiedener Eigenschaften bekannt sind, so ist es immer noch nötig, über weitere Restriktionsenzyme mit neuen spezifischen Eigenschaften zu verfügen, um DNA-Moleküle weiter zu charakterisieren sowie für die Konstruktion rekombinierter DNA-Moleküle in vitro, und auch, um bessere Lieferquellen von bekannten Enzymen zur praktischen Anwendung zu schaffen.
Die Anmelderin hat sich die Aufgabe gestellt, nach weiteren Quellen von Restriktionsenzymen zu suchen und sie zu erschliessen; zur Lösung dieser Aufgabe wurden eine ganze Anzahl von nichtpathogenen Arten von Intestinalbakterien auf die Anwesenheit von Restriktionsenzymen untersucht und dabei gefunden, dass Bifidobakterien eine ganze Anzahl dieser Enzyme mit sehr vorteilhaften Eigenschaften zum praktischen Gebrauch zü produzieren fähig sind.
Bifidbakterien sind sehr leicht in grosser Menge über wachsende Bakterienkulturen herzustellen. Die dabei entstehenden Enzyme können direkt und auf unkomplizierte Weise aus dem Rohextrakt gereinigt werden, aufgrund ihrer bemerkenswerten Stabilität und der geringen Aktivität von interferierenden Nucleasen. Von den zur Gewinnung von Restriktionsenzymen ausgewählten Bifidobakterien zeigten deren Enzymaktivität. Diese Stämme sind nachfolgend angegeben.
B. bifidum YIT4007 FERM-P 5871
B. breve YIT4006 FERM-P 3906
B. longum E194b ATCC15707
B. breve S1 ATCC15700
Die beiden ersten Stämme der vorangehenden Liste sind beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Adresse: Higashi 1-1-3, Yatabe-cho Tsukuba-Gun, Ibaragi-Ken, Japan) öffentlich zugänglich hinterlegt worden, und zwar der Stamm Bifidobacterium bifidum YIT-4006 am 28. Januar 1977 unter der Nummer FERM-P 3906 und der Stamm Bifidobacterium breve YIT-4007 am 4. Februar 1981 unter der Nummer FERM-P 5871. Die anderen zwei Stämme der vorangehenden Liste sind bei American Type Culture Collection (Adresse: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA) vor dem Jahr 1980 öffentlich zugänglich hinterlegt worden und im ATCC-Katalog für 1980 sowie im «Bergey's Manual of Determinative Bacterilogy», 8. Auflage, Seite 673, aufgeführt.
Als nächstes wird das bevorzugte Vorgehen zur Herstellung von Restriktionsenzymen angegeben.
Die Kultivierung von restriktionsenzymenproduzierenden Stämmen gemäss vorliegender Erfindung kann mit Hilfe bekannter Methoden und den üblichen Kultiviermedien durchgeführt werden. Die Anwendung dieser Methoden zur Kultivierung der Bakterien und das dazu verwendete Nährmedium unterliegt keinen speziellen, die Erfindung betreffenden Vorschriften.
Für die Präparation von Restriktionsenzymen aus Bifidobakterien werden die Zellen in der Regel bei 37°C in einem geeigneten anaeroben Medium wachsengelassen bis zu einer ersten frühen stationären Phase. Das heisst, dass die Bakterienkultur nicht speziell vorsichtig überwacht werden muss. Das Zellmaterial der vermehrten Bakterien wird durch Zen-trifugieren gewonnen und bei — 20° C bis zu ihrem weiteren Gebrauch gelagert.
Ein typisches Vorgehen zur Reinigung von Restriktionsenzymen aus Bifidobakterien sei nachfolgend beschrieben. Die tiefgekühlten Zell-Pellets werden aufgetaut und suspendiert in vier Volumenteile einer Mischung von 10 mM K2HPO4-KH2PO4 (Kaliumhydrogenphosphat) vom pH 7,0, 7 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA (Puffer A) enthaltend 25 ,ug Phenylmethyl Sulfonylfiuorid (PNSF), 1 mM NaN3 und 0,4 M Natriumchlorid.
Die Zellsuspension wird dann bei Eistemperatur weiterbehandelt mit Lysozym (100 ug/ml), um damit die Zellen sus-zeptibel zur Ultraschallbehandlung zu machen. Diese Ultraschallbehandlung wird solange angewendet, bis mehr als 90% der Zellen zerstört sind. Wichtig ist dabei, dass die Temperatur ständig unterhalb 10°C bleibt. Alle nachfolgenden Arbeitsgänge werden dann unterhalb von 5°C durchgeführt.
Die ultraschallbehandelte Zellsuspension wird während einer Stunde mit 100 000 g zentrifugiert und die überstehende Lösung abdekantiert. Dann wird eine 10%ige (Gewicht/Volumen) Lösung von Streptomycinsulfat vorsichtig zugefügt, bis schliesslich eine Gesamtkonzentration von 1,2% erreicht ist. Nach mindestens 30 Minuten dauerndem Rühren wird die ausgefällte Nucleinsäure mit Hilfe einer Normalzentrifugie-rung sedimentiert. Die DNA-freie, überstehende Lösung wird mit Ammoniumsulfat fraktioniert; die restriktionsenzymakti-vitätenthaltende Fraktion wird dann über eine Gelfiltration, Ionenaustausch und Affinitätschromatographie weiter gereinigt. Normalerweise reichen zwei oder drei Säulenchromatographien aus, um ein teilweise gereinigtes Enzym frei von kontaminierenden Nucleasen zu erhalten. Die aus den Bifidobakterien gewonnenen und gereinigten Restriktionsenzyme zeigen gemeinsame Eigenschaften. Eine dieser vorteilhaften Eigenschaften ist ihre bemerkenswerte Stabilität, d.h. diese Enzyme können ohne grossen Verlust an Enzymaktivität in Abwesenheit von Glyzerin oder Serumalbumin gereinigt werden.
Wie oben beschrieben, zeigten von den weitgehend unter5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
655 947
suchten Bifidobakterien 8 in 15 Stämmen aus 9 Spezies Restriktionsenzymaktivität und diese Enzyme wurden gemäss der Nomenklatur von Smith and Nathans (1973; Tabelle 1) benannt. Bis jetzt wurden noch nicht alle in dieser Liste aufgeführten Enzyme gereinigt und charakterisiert, doch die generellen Eigenschaften wurden schon an den teilweise gereinigten Enzymen beobachtet.
1. Substratspezifizierung: Die Restriktionsenzyme von 4 Bifidobakterienstämmen wurden mit Hilfe von Standard-DNA auf ihre Substratspezifität geprüft. Als DNA wurde E. coli phage Ä.-DNA, E. coli phageß XI74 RFI DNA, tierisches virus adenovirus typ 2 DNA, und tierisches virus SV40 DNA verwendet. Die Enzymverdauungswirkung auf diese DNA wurden analysiert durch Elektrophorese an Agar-Gel und die Enzymwirkung am Substrat unter UV Licht photographiert. Wie Tabelle 2 zeigt, sind die meisten dieser Enzyme in ihrer Substratspezifität verschieden.
2. pH-Optimum: Das pH-Optimum der Aktivität dieser Enzymen liegt zwischen pH 6,8 und 8,0.
3. Optimale Temperatur: Die optimale Temperatur der Aktivität dieser Enzyme liegt in der Gegend von 37° C.
4. Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung: Die Anwesenheit von Magnesiumionen Mg2+ ist essentiell, doch wer-
5 den weder Adenosintriphosphat noch S-Adenoxylmethionin gebraucht. Monovalente Kationen werden nicht benötigt, sie behindern die Enzymaktivität bei höheren Konzentrationen.
Tabelle 1
io Restriktionsenzyme in Bifidobakterien
Stamm Herkunft Enzym
B. bifidum YIT 4007 Bbi I
15 Bbi II
B. breve S1 ATCC 15700 Bbe SI
B. breve YIT 4006 Bbe I
Bbe II
B. longum E194b ATCC 15707 B10I
Tabelle 2
Restriktionsenzyme in Bifidobakterien
Stamm Herkunft Enzym Sequenz Anzahl von Trennstellen
Lambda Ad2 SV40 0X174
B. bifidum YIT 4007 Bbi I
Bbi II
B. breve SI ATCC 15700 BbE SI B. breve YIT 4006 Bbe 1
B. longum EI94b ATCC 15707 BIO I
CTGCAG 18 25 2 1
GRCGYC >14 >14 0 7
+ 4-
GGCGCC 1 >18 0 2
+ +
Zur weiteren Offenbarung der Erfindung sind die folgenden Beispiele angegeben:
Beispiel 1
Gezüchtet wird ein Stamm von Bifidobakterium breve YIT 4006 in einer modifizierten VL-G Nährlösung (Azuma und Suto, 1970) hergestellt gemäss der modifizierten Hungate Methode (Azuma und Suto, 1970; Hungate, 1969). Das modifizierte VL-G Medium enthält in einem Liter: 75 ml einer 0,1% K2HPO4 (Salzlösung I), 75 ml einer Salzlösung II, welche besteht aus 0,6% KH2PO4, 1,2% (NH4)2S04, 1,2% NaCl, 0,12% MgS04-7H20, und 0,12% CaCh-2H20, 0,1% Resazurin 0,1 ml, Trypticase 1 g, Hefeextrakt 0,5 g, Fleischextrakt 0,2 g, Glucose 0,5 G, 5 ml 8% Na2C03,1 ml 3% Cystein-HCL, und wird auf 1000 ml mit destiliertem Wasser ergänzt.
Für einen kleinen Ansatz wurden 6 mal 1 Liter VL-G Nährlösung mit dem 250stem Volumenteil einer über Nacht gezüchteten Kultur von Bifidobakterium breve inokuliert und die Zellen bei 37°C während ungefähr fünfzehn Stunden bis zu einer ersten frühen stationären Phase wachsen gelassen, zentrifugiert und bei — 20°C gelagert. Die Ausbeute betrug ungefähr 35 g aus 6 1 Kulturbrühe.
Ein DNA-freier Zellextrakt wurde wie eingangs beschrieben hergestellt. Festes Ammoniumsulfat wird dem DNA-freien Extrakt über einen Zeitraum von 30 Minuten langsam zugesetzt, bis zu einer Sättigung von 55%. Nach einstündigem Rühren bei 0°C wird das Präzipitat durch Zentrifugieren während 25 Minuten bei 12000 upm gewonnen, in einer minimalen Menge Puffer A suspendiert und dialysiert, wobei der Puffer dreimal ausgetauscht wird.
Die enzymaktiven Anteile werden in Puffer A der 0,1 M Natriumchlorid enthält suspendiert. Nach der Dialyse gegen denselben Puffer, wird das Dialysat auf eine Whatman phosphorcellulose P-l 1 Kolonne von der Grösse 1,5 mal 35 cm gegeben, welche vorgängig mit Puffer A der ebenfalls 0,1
M Natriumchlorid enthält equilibriert wurde. Das Präparat 35 wird eingewaschen und mit 450 ml NaCl mit linearer Konzentrationsabstufung zwischen 0,1 bis 0,6 M in Puffer A extrahiert. Das mit 0,25 bis 0,35 M Natriumchlorid eluierte Enzym wird gesammelt und gegen Puffer B (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 7mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM EOTA) dialysiert. 40 Eine Whatman DEAE-Cellulose DE52 Kolonne (1 mal 15 cm) in Puffer B wird vorbereitet. Die Phosphorcellulosefrak-tion wird auf die Kolonne gegeben und nach dem Einwaschen mit 120 ml 0-0,5 M Natriumchlorid in Puffer B extrahiert. Die zwischen 0,2-0,25 M NaCl eluierten aktiven Frak-45 tionen werden zusammengegeben, dialysiert gegen Puffer B enthaltend 0,25 M NaCl, auf eine im gleichen Puffer zubereitete Heparin-Sepharose CL-6B Kolonne (1 mal 15 cm) gegeben und mit 40 ml 0,25 bis 0,75 NaCl in linearen Konzentrationsabstufungen extrahiert. Enzymaktivität wurde festgestellt 50 in den Fraktionen von 0,4 bis 0,5 M Natriumchlorid. Diese Fraktionen werden vereinigt und durch Dialyse gegen Puffer B konzentiert, wobei dem Puffer B 50% Glyzerin zugesetzt wird. Das Konzentrat wird bei — 20° C aufbewahrt.
Das partiell gereinigte Enzym Bbe I ist praktisch frei von 55 verunreinigenden nichtspezifischen Nucleasen und bei der Anwendung des Bbe I auf ^-DNA in überschüssiger Konzentration und über längere Inkubitionszeit entsteht ein Fragmentmuster, welches an Agarose-Gel keine Bandenaufwei-tung aufweist und nur Spuren von Nicht-Substrat SV40 DNA 60 wurden von der superhelikalen in die relaxierte Form konvertiert.
Bbel trennt verschiedene standard DNA wie dies in Tabelle 2 gezeigt ist. Bezüglich dieser Trennmuster kann geschlossen werden, dass die Bestimmungssequenz für Bbel b5 wahrscheinlich ein palindromisches Hexanucleotid GGCGCC ist. Da dieses Enzym eine neue Sequenzspezifität aufweist ist es speziell wertvoll für die DNA-Forschung.
655 947
4
Beispiel 2
B. bifidum YIT4007 wird in einem modifizierten VL-G Medium gleich wie das B. breve YIT4006 gezüchtet. Die Ausbeute ist ungefähr 25 g aus 6 1 Brühe.
Das DNA-freie Extrakt wird wie oben beschrieben behandelt und soviel Ammoniumsulfat zugesetzt bis 65% Sättigung erreicht ist. Das Präzipitat wird mit der Zentrifugation gewonnen und in 10 mM K2HPO4-KH2PO4, pH 7,4, mM 2-Mercap-toethanol, 1 mM EDTA (Puffer C) gelöst und gegen diesen Puffer dialysiert.
Eine mit Puffer C equilibrierte Whatman phosphorcellu-lose P-l 1 Kolonne von der Grösse 1,5 mal 35 cm wird vorbereitet und das Dialysat auf die Kolonne gegeben. Nach dem Einwaschen wird die Kolonne mit 450 ml 0-0,7 M Natriumchlorid in Puffer C in linearer Konzentrationsabstufung elu-iert. Zumindest zwei verschiedene Enzymaktivitäten wurden dabei gewonnen und Bbil und Bbill benannt. Bbil fliesst gleich durch die Kolonne, während das Bbill bei 0,1-0,2 M Natriumchlorid eluiert wird.
Die Durchflussfraktion und die Nachflussfraktion, die Bbil Aktivität aufweisen, werden zusammengefasst, ausgefällt durch Zusatz von Ammoniumsulfat bis 60% Sättigung und in einem Minimum von Puffer B mit 0,1 M Natriumchlorid suspendiert. Diese Suspension wird auf eine Sephadex G-200 Kolonne (2,5 mal 55 cm) gegeben, wobei diese Kolonne mit dem obenerwähnten Puffer equilibriert wird. Anschliessend wird die Kolonne mit Puffer B, welches 0,1 M Natriumchlorid enthält durchgewaschen. Das Bbil wird ungefähr bei 0,6-0,8 Kolonnenvolumen eluiert zusammengefasst und gegen Puffer B dialysiert.
Eine Whatman DEAE Cellulose DE-52 Kolonne (1,0 mal 10 cm) und der Puffer B wird vorbereitet. Die Bbil Sephadex-fraktion wird auf die Kolonne gegeben. Nach dem Einwaschen wird die Kolonne mit 80 ml 0-0,5 M Natriumchlorid in Puffer B eluiert. Die zwischen 0,25-0,3 M Natriumchlorid Eluiermittel eluierten Enzymaktivitätfraktionen werden kombiniert und dialysiert gegen Puffer A welcher 0,2 M Natriumchlorid enthält.
Das Dialysat wird auf eine Hydroxylapatitkolonne (1,0 mal 10 cm) gegeben, welche vorgängig mit Puffer A, welcher 0,2 M Natriumchlorid enthält equilibriert wurde. Die Kolonne wird gewaschen und mit 80 ml 0,01 bis 0,5 M Kali-5 umphosphat in Puffer A mit 0,2 M Natriumchlorid eluiert. Das Bbil eluiert zwischen 0,1 bis 0,25 M Kaliumphosphat.
Die spezifische Wirkung des Bbil wurde anhand von verschiedenen Standard-DNA geprüft und mit den Verdauungsmustern bekannter Enzyme verglichen. Eine Ähnlichkeit des 10 Bbil mit den Pstl, d.h. eine Ähnlichkeit der beiden Muster wurde beobachtet. Die Fragmentmuster aus dem X DNA oder aus dem Adenovirus Typ 2 DNA, welches mit dem Pstl-Enzym behandelt wurde, war identisch mit denen, welche erhalten wurden bei der DNA-Verdauung mit Bbil gefolgt 15 von Pstl. Dies zeigt an, dass das Bbil ein Isoschizomer von Pstl ist, welches zur Bestimmung des symetrischen Hexan-ucleotids CTGCAG dient.
Bbil ist wesentlich stabiler als Pstl, was ein grosser Vorteil für die praktische Verwendung bedeutet. 20 Die Bbil-aktiven Fraktionen werden zusammengeführt und gegen Puffer A, welcher 0,2 M Natriumchlorid enthält dialysiert. Das Dialysat wird auf eine vorgängig mit dem obigen Puffer äquilibrierte Hydroxylapatitkolonne (1,0 mal 10 cm) gegeben. Nach dem Einwaschen wird die Kolonne mit 80 25 ml einer 0,01 bis 0,5 M Kaliumphosphat in Puffet A mit 0,2 M Natriumchloriden haltende Lösung in linearer Konzentrationsabstimmung eluiert. Das aktive Enzym befindet sich im Eluat von 0,05 bis 0,1 Kaliumphosphat.
Vorgängige Experimente zeigen, dass das Bbill ein Iso-3o schizomer von Acyl ist, welche zur Bestimmung der Hexa-nucleotiden GRCGYC dient, worin R eine Purinbase und Y eine Pyrimidinbase ist. Das Acyl ist isoliert aus den Ana-baena cylindrica, ein Stamm aus den blau-grün Algen. Die Kultivierung dieses Mikroorgansimus ist sehr schwierig und 35 zeitaufwendig. Dagegen ist das B. bifidum YIT4007 als Ausgangsmaterial zur Enzymgewinnung wesentlich besser als die Anabaena cylindrica.
G
o
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von Restriktionsenzymen, dadurch gekennzeichnet, dass restriktionsenzymproduzie-rende Stämme aus der Gruppe von Bifidobakterien kultiviert werden und das Restriktionsenzym aus diesem Kultivat gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bifidobakterium ein B. bifidum YIT4007/FERM-P 5871 ist.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bifidobakterium ein B. breve YIT4006/FERM-P 3906 ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bifidobakterium ein B. longum E194b/ATCC15707 ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bifidobakterium ein B. breve S1/ATCC1570 ist.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4385780A JPS56140888A (en) | 1980-04-02 | 1980-04-02 | Preparation of limiting enzyme |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH655947A5 true CH655947A5 (de) | 1986-05-30 |
Family
ID=12675370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH1487/81A CH655947A5 (de) | 1980-04-02 | 1981-03-05 | Verfahren zur herstellung von restriktionsenzymen aus bifidobakterien. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4542099A (de) |
| JP (1) | JPS56140888A (de) |
| CH (1) | CH655947A5 (de) |
| DE (1) | DE3108152A1 (de) |
| FR (1) | FR2479850A1 (de) |
| GB (1) | GB2073202B (de) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5860986A (ja) * | 1981-10-05 | 1983-04-11 | Yakult Honsha Co Ltd | 新規制限酵素及びその製造法 |
| JPS6178382A (ja) * | 1984-09-27 | 1986-04-21 | Takara Shuzo Co Ltd | 制限酵素の製造法 |
| US20020132543A1 (en) * | 2001-01-03 | 2002-09-19 | Baer David J. | Stretchable composite sheet for adding softness and texture |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5315491A (en) * | 1976-07-23 | 1978-02-13 | Rikagaku Kenkyusho | Preparation of novel nucleicacidase |
| US4064011A (en) * | 1977-03-16 | 1977-12-20 | Gesellschaft Fur Biotechnologische Forschung Mbh | Process for producing ECoRI restriction endonuclease with E.coli mutants |
| JPS5519058A (en) * | 1978-07-28 | 1980-02-09 | Rikagaku Kenkyusho | Preparation of nuclease |
-
1980
- 1980-04-02 JP JP4385780A patent/JPS56140888A/ja active Pending
-
1981
- 1981-03-04 US US06/240,363 patent/US4542099A/en not_active Expired - Lifetime
- 1981-03-04 FR FR8104342A patent/FR2479850A1/fr active Granted
- 1981-03-04 GB GB8106851A patent/GB2073202B/en not_active Expired
- 1981-03-04 DE DE19813108152 patent/DE3108152A1/de active Granted
- 1981-03-05 CH CH1487/81A patent/CH655947A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4542099A (en) | 1985-09-17 |
| DE3108152C2 (de) | 1987-06-11 |
| GB2073202B (en) | 1983-06-29 |
| JPS56140888A (en) | 1981-11-04 |
| FR2479850B1 (de) | 1984-03-16 |
| GB2073202A (en) | 1981-10-14 |
| DE3108152A1 (de) | 1982-01-07 |
| FR2479850A1 (fr) | 1981-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69928121T2 (de) | Verwendungen von sulfatierten fuko-oligosacchariden zum pflanzenschutz | |
| DE69636852T2 (de) | Verfahren zur herstellung eines nucleosid-5'-phosphatesters | |
| DE3012921C2 (de) | ||
| EP0069697A2 (de) | Herstellung und Anwendung von Plasmiden mit Genen für die Biosynthese von L-Prolin | |
| DE2933000A1 (de) | Verfahren zur darstellung einer gencodierung fuer ein ein hohes molekulargewicht aufweisendes protein | |
| EP0066857B1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus, welcher alpha-Galactosidase, aber keine Invertase bildet, so erhaltener Mikroorganismus and seine Verwendung | |
| CH655947A5 (de) | Verfahren zur herstellung von restriktionsenzymen aus bifidobakterien. | |
| DE2167078B1 (de) | Verfahren zur Herstellung einer Amylase und deren Verwendung zur Gewinnung von Maltose aus Staerke | |
| EP1636389B1 (de) | Plasmidfreier klon des e. coli-stammes dsm 6601 | |
| DE3640382C2 (de) | ||
| DE2930922C2 (de) | ||
| DE3512435A1 (de) | Restriktionsendonuklease asp 718, ihre gewinnung und verwendung | |
| DE3527682C2 (de) | ||
| DE3530218C2 (de) | ||
| DE4226657A1 (de) | TYP II-Restriktionsendonuklease SexAI | |
| DE3141691A1 (de) | Plasmid pac 1, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung | |
| DE3425957C2 (de) | ||
| DE3420298C2 (de) | ||
| EP0306847B1 (de) | Typ II-Restriktionsendonuklease Ksp632I | |
| DE2945762A1 (de) | Verfahren zur herstellung von antibiotica erzeugenden micromonospora- staemmen mit veraendertem genetischem material | |
| DE3528392C2 (de) | ||
| DE3401619A1 (de) | Restriktionsendonuklease mae ii, ihre gewinnung und verwendung | |
| DE2645548B2 (de) | Endonucleasen und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
| AT386607B (de) | Verfahren zum herstellen eines dns-transfer-vektors | |
| DE2151265C3 (de) | Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von a-Amylase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased |