CH657623A5 - Procedimento per purificare glucosidi antraciclinonici. - Google Patents

Description

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RIVENDICAZIONI

1. Un procedimento per purificare glucosidi antraciclinoni-ci, in cui la purificazione viene effettuata per adsorbimento selettivo su resine della soluzione acquosa del prodotto grezzo.

2. Un procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la soluzione contenente il prodotto grezzo da purificare viene portata ad un pH compreso tra 3 e 5 prima di essere adsorbito sulla resina.

3. Un procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui le resine usate per l'adsorbimento possono essere scelte dal gruppo comprendente resine adsorbenti polimeriche ed a scambio ionico oppure carbossimetilcellulosa.

4. Un procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il glucoside antraciclinico purificato viene disadsorbito dalla resine mediante eluizione con acqua leggermente acida, con una miscela di acqua ed un solvente polare o con una miscela di acqua leggermente acida ed un solvente polare.

5. Un procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui l'eluato ottenuto da un primo tipo di resina viene successivamente adsorbito su di una resine polimerica, a scambio ionico, o su carbossimetilcellulosa, detta resina essendo di tipo diverso da quella impiegata nel primo adsorbimento.

6. Un procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui l'eluizione del prodotto ulteriormente purificato viene effettuata usando gli stessi solventi o miscele di solventi della rivendicazione 4.

7. Applicazione del procedimento secondo una delle rivendicazioni 1 a 6 per la purificazione di un glucoside antraciclinico grezzo, ottenuto per fermentazione o per sintesi.

Questa invenzione si riferisce ad un procedimento per purificare glucosidi antraciclinonici.

L'esigenza di disporre di un metodo altamente specifico per l'ottenimento di detti glucosidi in una forma sostanzialmente pura deriva principalmente dal fatto che sia nei processi di produzione fermentativa che in quelli di sintesi la quantità di impurezze organiche ed inorganiche nel prodotto grezzo è particolarmente elevata e va dal 12% al 25%.

I metodi convenzionali usati finora in note tecniche di purificazione estraendo il prodotto grezzo con solventi clorurati e successivamente lavando con tamponi portano comunque ad un prodotto finale in cui la percentuale di impurezza, sebbene abbassata considerevolmente, è compresa nell'intervallo tra 4,5 e 5,0%.

Mentre generalmente viene considerato come accettabile, detto standard di purezza, in considerazione della particolare sensibilità al maneggiamento ed agli agenti chimici della molecola glucosidica, ha stimolato il nostro interesse per la ricerca di un metodo migliorato di purificazione che permetta di ottenere un prodotto finale sostanzialmente puro. Tenendo presente l'uso particolare dei glucosidi antraciclinonici nella pratica clinica come agenti antitumorali ed i problemi collaterali di dosaggio e tossicità, l'ottima eliminazione delle impurezze, generalmente di elevata tossicità, è un evidente conferma dell'utilità dell'invenzione rivendicata.

Detta invenzione, che permette di ottenere un prodotto finale contenente impurezze in una quantità massima del 2%, è basata su un procedimento in cui la purificazione viene effettuata per adsorbimento selettivo su resine della soluzione acquosa del prodotto grezzo, di preferenza ambiente acido (pH = 3-5).

II glucosido antraciclinico purificato può venire disadsorbito della resina mediante eluzione con acqua o miscela di acqua con un solvente polare. Più in particolare, detto procedimento comprende una fase in cui la soluzione acquosa debolmente acida contenente la sostanza idrosolubile disciolta viene adsorbita sulla resina dispersa in particelle, come per esempio granuli o perline ed uno stadio successivo di disadsorbimento della sostanza che era stata adsorbita nella prima fase o passaggio.

La resina adsorbente può essere contenuta in un opportuno contenitore o recipiente che in sostanza ha generalmente la forma di una torre o colonna opportunamente riempita con particelle di resina. A seconda del tipo di impurezze contenute nel prodotto grezzo, l'eluato ottenuto per disadsorbimento da un primo tipo di resina può essere successivamente e convenientemente adsorbito su una resina di tipo diverso da cui poi viene eluito secondo un metodo noto.

Nel questo procedimento di purificazione, sono state usate resine adsorbenti di tipo polimerico ed a scambio ionico oppure del tipo carbossimetilcellulosa: la giusta scelta, la opportuna successione nell'uso dei diversi tipi di resina secondo il prodotto grezzo da purificare, l'ambiente leggermente acido durante l'adsorbimento permettono di ottenere un elevato grado di purezza nel prodotto finale, l'eliminazione dell'uso dei solventi organici clorurati e rese eccellenti durante la purificazione.

I seguenti esempi illustrano in modo non restrittivo il procedimento dell'invenzione.

Esempio 1

Purificazione di 4-demetossi-daunorubicina

15,0 g di 4-demettossi-daunorubicina grezza, avente un titolo del 70,2% come tale ed un contenuto di impurezza del 18%, vengono sciolti in 3,6 1 di soluzione di sodio acetato allo 0,5%. La soluzione, portata a pH 4,7 per aggiunta di acido acetico, viene adsorbita su 400 mi di resina Amberlite XAD2® (Rohm and Haas) in una colonna con un diametro di 2,5 cm. Il prodotto viene lavato con 1000 mi di acqua e poi eluito con una miscela di acqua-metanolo (5:1 v/v). Come primo elutao vengono raccolti 2000 mi di soluzione contenenti agliconi ed impurezze varie.

L'eluizione viene continuata con una miscela di acqua-metanolo (1:1 v/v) e si raccoglie una frazione di 4500 mi: l'eluato contiene detta 4-demetossi-daunorubicina in soluzione, insieme con il 10% di impurezze.

L'eluato viene portato a pH 2,8 per aggiunta di acido cloridrico e quindi concentrato sotto vuoto fino ad un volume di 1500 mi. Per aggiunta di sodio acetato alla soluzione concentrata il pH viene portato a 4,0 e la soluzione debolmente acida è adsorbita su 150 mi di resina CM Sepharose Cl 6B® (Pharmacia), contenuta in una colonna avente un diametro di 2,5 cm ed una velocità di flusso di 150 ml/h. Al termine dello adsorbimento, la colonna viene dapprima lavata con 450 mi di acqua e poi eluita con acido cloridrico 0,03%.

I primi 800 mi di eluato, contenenti il 18% di impurezze, vengono portati a pH 4,7 per aggiunta di sodio acetato e raccolti per essere riciclati nella soluzione di 4-demetossi-daunorubicina grezza che deve essere adsorbita su resine Amberlite XAD2 per il primo stadio di purificazione. L'eluato successivo (3500 mi), contenente 4-demetossi-daunorubicina pura, viene concentrato fino al volume di 50 mi. Si aggiungono 250 mi di acetone, il precipitato ottenuto viene filtrato, lavato con acetone e seccato.

Si ottiene 4-demetossi-daunorubicina con un titolo del 97% ed un contenuto di impurezze inferiore al 3%, con una resa del 52% sul prodotto grezzo di partenza.

Esempio 2 Purificazione di daunorubìcina

15,0 g di daunorubicina clorurata, con titolo del 74,2% come tale ed un contenuto di impurezze dell'8,5%, vengono sciolti in 4500 mi di acqua. La soluzione viene portata a pH 5,0 per aggiunta di sodio acetato ed adsorbita su 400 mi di resina

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SI 12® Kastell oppure su resina Amberlite ERI80® (Rohm and Haas) in una colonna avente diametro di 2,5 cm ad una velocità di flusso di 600 ml/h (1,5 b/v).

Il prodotto viene lavato con 1000 mi di soluzione di cloruro di sodio all' 1 % e poi eluito con una miscela di acqua-etanolo (1:1 v/v).

Le frazioni di testa (400 mi) contenenti gli agliconi in soluzione vengono separate e l'eluizione viene continuata raccogliendo ancora 260 mi di eluato contenente daunorubicina pura. Il pH viene corretto a 2,5 per aggiunta di acido cloridrico diluito, si aggiunge acetone ed il prodotto viene lasciato cristallizzare ad una temperatura di + 5°C per 6 ore. Il prodotto viene filtrato, lavato con acetone ed essiccato sotto vuoto per 12 ore. Con una resa dell'80% sul prodotto grezzo di partenza si ottiene daunorubicina con le seguenti caratteristiche determinate per HPLC: titolo 97%; impurezze 2,6%.

Esempio 3 Purificazione di 4-demetossi-doxorubicina

2000 mi di soluzione acquosa contenente 10,4 g di 4-demetossi-doxorubicina con un contenuto di impurezze del 14% vengono adsorbiti su 50 mi di resina ER180® (Rohm and Haas) contenuti in una colonna avente un diametro di 2,5 cm ad una velicotà di flusso di 250 ml/h.

L'eluato, parzialmente purificato per adsorbimento selettivo delle impurezze, viene poi adsorbito su 200 mi di resina CM Se-pharose Cl 6B (Pharmacia). Il prodotto viene eluito con una miscela di metanolo 50, acqua 50 e acido cloridrico concentrato 0,015, scaricando le frazioni di testa (circa 800 mi) contenenti agliconi ed altre impurezze. Vengono poi raccolti 2000 mi di eluato contenenti la sostanza pura e si concentra sotto vuoto a 60 mi. Agitando per 3 ore, si aggiungono 300 mi di acetone. Il precipitato viene filtrato, lavato con acetone e seccato. Con una resa del 58,2% sul teorico, si ottengono 6,5 g di 4-demetossi-doxorubicina con un contenuto di impurezze del 3%.

Esempio 4 Purificazione di 4' -desossi-doxorubicina

15,0 g di 4' -desossi-doxorubicina, con titolo del 69,2%, un contenuto del 12% di impurezze organiche ed una impurezza del 12% di sali minerali, vengono sciolti in 2000 mi di acqua ed adsorbiti su 300 mi di resina CM Sephadex C25 ad una velocità di flusso di 600 ml/h. Completato l'adsorbimento, si eluisce la soluzione con acido cloridrico 0,03% e si ottiene una frazione (6500 mi) contenente 4' -desossi-doxorubicina. Detto eluato, portato a pH 3,8 per aggiunta di una soluzione di sodio idrata, viene adsorbito su 200 mi di resina SI 12 Kastel ad una velocità di flusso di 400 ml/h. Il prodotto viene lavato con 600 mi di acqua e quindi eluito con metanolo acidificato a pH 2,0 con acido cloridrico.

Vengono ottenuti 600 mi di eluato centrale che vengono concentrati a 60 mi sotto vuoto. La soluzione concentrata viene versata lentamente in 600 mi di acetone sotto agitazione.

Il precipitato formato viene filtrato, lavato con acetone e seccato. Si ottiene 4'-desossi-doxorubicina con una resa del 61% sul teorico, con un titolo del 95,8% ed un tenore di impurezze del 4,2%.

Esempio 5 Purificazione di 4' -epi-doxorubicina

15,0 g di 4' -epi-doxorubicina grezza, avente un titolo del s 75,9% ed un contenuto di impurezze del 15%, vengono sciolti in 4000 mi di acqua.

La soluzione viene portata a pH 4,8 per aggiunta di sodio formiato ed adsorbito su 400 mi di resina Amberlite IRC 724 contenuta in una colonna con diametro di 2,5 cm ad una veloci-ìo tà di flusso di 1600 ml/h (4 b/v).

La colonna viene lavata con 800 mi di acqua e poi eluita con una miscela di metanolo 95, acqua 5 ed acido cloridrico concentrato 0,015. Si raccolgono 4000 mi di eluato centrale con 4'-epi-doxorubicina contenente ancora il 10% di impurezze e is 1500 mi di eluato di coda in cui prevalgono le impurezze.

L'eluato centrale viene concentrato a 1500 mi, portato a pH 4,8 per aggiunta di sodio formiato ed adsorbito su 250 mi di resina Carbossimetilcellulosa® Wathman contenuta in una colonna avente un diametro di 2,5 cm ad una velocità di flusso di 20 500 ml/h (2 b/v).

Completato l'adsorbimento, il prodotto viene lavato con una miscela di etanolo 99,3, acqua 0,7 ed acido cloridrico concentrato 0,015 e quindi eluito con una miscela di etanolo 90, acqua 10 ed acido cloridrico concentrato 0,05, raccogliendo 3200 25 di eluato centrale.

L'eluato viene concentrato sotto vuoto a 60 mi ed il prodotto è precipitato per aggiunta di 300 mi di acetone.

Si ottengono 6,9 g di 4' -epi-doxorubicina con titolo del 91,2% ed un tenore di impurezze del 3%. Resa: 55,3%.

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Esempio 6 Purificazione di doxorubicina

(a) 70 g di doxorubicina vengono sciolti in 28 1 di acqua. Il 35 pH viene portato a 3,7-4,5 per aggiunta di tampone e la soluzione è adsorbita su 2 1 di resina SI 12 Kastell® contenuta in una colonna avente un diametro di 6 cm. Il prodotto viene eluito con una miscela di 35 1 di acqua e 15 1 di metanolo.

L'eluato (40 1) viene concentrato sotto vuoto a 0,5 1 ed il 4o prodotto è cristallizzato per aggiunta di una miscela di 1 1 di etanolo e 4,5 1 di acetone sotto agitazione a + 5°C per 3 ore.

Il prodotto viene filtrato, lavato con 0,1 1 di acetone ed essiccato sotto vuoto a + 40°C per 5 ore.

Si ottengono 56,0 g di doxorubicina monopurificata. (I) 45 (b) 80 g di doxorubicina monopurificata (I), ottenuta con il procedimento (a), vengono sciolti in 24 1 di acqua e portati a pH 4,0 per aggiunta di tampone.

La soluzione viene adsorbita su una colonna con diametro di 12 cm e contenente 1,6 1 di resina carbossimetilcellulosa so Wathman.

L'effluente della colonna viene allontanato.

Dopo lavaggio con 3,2 1 di acqua, il prodotto viene eluito con 55 1 di acqua portata a pH 2,5 per aggiunta di acido cloridrico.

55 Vengono raccolti 46 I di eluato, si concentrano sotto vuoto fino a 0,6 1 ed il prodotto viene lasciato cristallizzare per cauta aggiunta di una miscela isopropanolo-acetone 1:3.

Il prodotto viene filtrato, lavato con 1 1 di acetone e seccato a +40°C per 4 ore.

«i Si ottengono 65 g di doxorubicina con un titolo del 98,5% ed un contenuto di impurezze dell'1,5%.

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