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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Reinigung von Neothramycin-A und/ oder Neothramycin-B der Formel I:
EMI1.1
in welcher Rl eine Hydroxylgruppe und R2 ein Wasserstoffatom für Neothramycin-A bedeutet, während R' ein Wasserstoffatom und R2 eine Hydroxylgruppe für Neothramycin-B bedeutet, wobei das Neothramycin in Lösung ausschliesslich in Wasser behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass man (a) eine rohe wässerige Lösung, welche Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, mit einem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harz behandelt, um das Neothramycin durch das macroreticulare Harz zu adsorbieren, (b) das macroreticulare Harz, an welches das Neothramycin adsorbiert ist, mit Wasser, welches einen Anteil an Aceton enthält, oder mit verdünntem wässerigem Ammoniumhydroxid eluiert,
um eine teilweise gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B als eine Fraktion oder einige Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (c) die derart erhaltene teilweise gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin mit einem stark basischen Ionenaustauscherharz, welches quaternäre Ammoniumgruppen als funktionelle Anionenaustauschergruppen enthält, behandelt, um die Antibiotika durch diesen Anionenaustauscher zu adsorbieren, (c) den Anionenaustauscher, an welchen das Neothramycin adsorbiert ist, mit einer wässerigen Lösung eines neutraler Salzes eluiert, um eine gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin zusammen mit den neutralen Salz enthält, als eine Fraktion oder mehrere Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (d) die derart erhaltene gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin und dem neutralen Salz wiederum mit einer frischen Portion des macroreticularen,
nicht Ionen austauschenden Harzes behandelt, um Neothramycin durch das macroreticulare Harz zu adsorbieren, (f) das letztere macroreticulare Harz, welches Neothramycin adsorbiert enthält, mit Wasser, welches einen Anteil Aceton enthält, oder mit verdünntem wässerigem Ammoniumhydroxid eluiert, um eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin aber kein neutrales Salz enthält, als eine Fraktion oder mehrere Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (g) die derart erhaltene Lösung entsalzt und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin in einer Serie aufeinanderfolgender Stufen behandelt, welche eine adsorptive Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher in derselben Weise wie oben erwähnt, eine Eluierung dieses Anionenaustauschers mit einer wässerigen Lösung eines neutra len Salzes auf dieselbe Weise wie oben erwähnt,
eine adsorp tive Behandlung des erhaltenen Eluates, welches Neothramy cin als neutrales Salz enthält, mit einer frischen Portion eines macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harzes auf dieselbe Weise wie oben und eine Eluierung des letztgenann ten adsorbiertes Neothramycin enthaltenden macroreticula ren Harzes mit Wasser, welches Aceton enthält, oder mit ver dünntem wässerigem Ammoniumhydroxid in um eine ent salzte und weiter gereinigte wässerige Lösung zu gewinnen, welche Neothramycin aber kein neutrales Salz enthält, in solcher Weise, dass die gewonnene entsalzte und weiter gereinigte Lösung von Neothramycin der oben genannten Serie aufeinanderfolgender Stufen ein oder mehrmals unterworfen wird, um eine wässerige Lösung, welche Neothramycin in gewünschter Reinheit enthält, zu erhalten.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete stark basische Anionenaustauscher ein Polystyrolharz ist, welches quaternäre Ammoniumgruppen als funktionelle Anionenaustauschergruppen enthält.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Eluierung des Anionenaustauschers, welcher Neothramycin adsorbiert enthält, verwendete wässerige Lösung eines neutralen Salzes eine wässerige Lösung von Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat ist;
4. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete macroreticulare nicht Ionen austauschende Harz ein macroreticulares Divinylbenzol-Styrol-Copolymer ist.
5. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Eluierung des macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harzes, welches Neothramycin adsorbiert enthält, verwendete acetonhaltige Wasser mit einem Acetongehalt von 5 bis 50 Volumprozent ist.
6. Verfahren zur Reinigung von Neothramycin-A und/ oder Neothramycin-B der Formel I gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässerige Lösung, welche Neothramycin enthält, nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 reinigt, das Aceton oder das Ammoniumhydroxid durch Destillation unter vermindertem Druck aus der erhaltenen gereinigten wässerigen Lösung von Neothramycins entfernt und die Lösung dann gefriertrocknet.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung von Neothramycin-A und/oder Neothramy cin-B, wobei das Neothramycin in Lösung ausschliesslich mit Wasser behandelt wird. Das Verfahren ist in Patentanspruch
1 definiert. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Reinigung der Antibiotika Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B in der Form einer wässerigen Lösung, mit erhöhter Ausbeute durch ein chromatographisches Verfahren, welches das Adsorbieren von Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B auf einem stark basischen Anionenaustauscher, insbesondere einem stark basischen Anionenaustauscher, welcher quaternäre Ammoniumgruppen als funktionelle Anionenaustauschergruppen enthält, aus einer wässerigen Lösung, welche die Antibiotika enthält, gefolgt von der Eluierung des Anionenaustauschers, welcher die Antibiotika adsorbiert enthält,
mit einer wässeri gen Lösung eines neutralen Salzes umfasst.
Die nach der vorliegenden Erfindung zu reinigenden Neothramycin-A und Neothramycin-B sind neue Antibiotika, welche zuvor von denselben-Erfindern entdeckt wurden und welche durch Züchtung-eines Mikroorganismus, nämlich des Stammes Streptomyces MC916-C4 erzeugt wurden, welcher Stamm im Fermentation Research Institute in Japan unter der No. FERM-P 2352 und ebenfalls im American
Type Culture Collection unter der No. ATCC 31123 hinter legt. ist. Die Neuthramycine-A und -B weisen nur eine schwa che antibakterielle Aktivität auf besitzen jedoch eine hohe hemmende Wirkung auf das Wachstum von experimentellen Tumoren, die in Tiere transplantiert wurden, auf, so dass sie in Kliniken als Antitumormittel untersucht werden (siehe japanische Patent Nor. 1 009 206 und 1 019 568; Journal of
Antibiotics , Band 29, Seite 93 (1976) und Band 30, Seite 340 (1977); sowie die US-Patente No. 049 497 und 4 105 658).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bestätigt, dass Neothramycin-A und -B die folgende Struktur aufweist:
EMI2.1
in welcher Rl eine Hydroxylgruppe und R2 ein Wasserstoffatom für Neothramycin-A bedeutet, während R' ein Wasserstoffatom und R2 eine Hydroxylgruppe für Neothramycin-B bedeutet. Unter wasserfreien Bedingungen können die Neothramycine-A und -B als solche voneinander isoliert werden.
In wässerigen Lösungen jedoch können die Neothramycine-A und -B spontan ineinander übergehen, wobei ein Gleichgewichtsgemisch der Neothramycine-A und -B entsteht. Da die Neothramycine-A und -B in ihren wässerigen Lösungen gemäss der vorliegenden Erfindung gehandhabt werden, wird im folgenden das Gleichgewichtsgemisch der Neothramycine-A und -B einfach als Neothramycin bezeichnet.
Wie im einzelnen in den japanischen Patenten No.
1 009 206 und No. 1 019 568 sowie den US-Patenten No.
4 049 497 und No. 4 105 658 beschrieben, erfolgte die Ge winkung von Neothramycin, wie es durch die fermentative Methode erzeugt wurde, üblicherweise entweder durch Extrahieren mit Butanol aus einer wässerigen Lösung von Neothramycin, z.B. der Fermentationsbrühe des Neothramycin erzeugenden Mikroorganismus, oder durch Behandlung einer wässerigen Lösung von Neothramycin mit Aktivkohle zwecks Adsorption der Antibiotika. Gemäss der Adsorptionsmethode unter Verwendung von Aktivkohle, ist es im allgemeinen möglich, das Neothramycin, welches an der Aktivkohle adsorbiert wurde, aus der Kohle mit Hilfe eines gemischten Lösungsmittels aus Methanol-Wasser, Propanol Wasser oder Aceton-Wasser und dergleichen zu extrahieren.
Es war am zweckmässigsten, eine Gewinnungsmethode zu verwenden, welches Extrahieren der Aktivkohle, welche das Neothramycin adsorbiert enthielt, mit 50%igem Aceton Wasser, d.h. Wasser, welches 50 Volumprozent Aceton enthielt, das Konzentrieren des erhaltenen Aceton-Wasser-Extraktes unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht höher als 40 "C, das Gefriertrocknen der konzentrierten Lösung, um ein erstes rohes Pulver zu erhalten, welches Neothramycin-A und -B als erste Portion enthielt, umfasste.
Zur Reinigung wurde das obige erste rohe Pulver mit 80%igem Äthanol-Wasser, d.h. Wasser, welches 80 Volumprozent Äthanol enthielt, extrahiert, der erhaltene Extrakt unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht über 40 "C konzentriert und die konzentrierte Lösung gefriergetrocknet, um ein zweites rohes Pulver zu ergeben. Dieses zweite rohe Pulver wurde sodann in Methanol gelöst und die methanolische Lösung durch eine Säule eines Gelfiltrationsmittels, Sephadex LH-20 (ein Produkt von Pharmacia Fine Chemical Co., Schweden) geleitet, gefolgt von der Entwicklung der Säule mit Methanol, so dass Neothramycin von den coexistierenden anderen Antibiotika, wie z.B. Cycloheximid, getrennt wurde.
Jene Fraktionen des Eluates, welche Neothramycin-A und -B enthielten, wurde sodann unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft, wobei ein drittes rohes Pulver erhalten wurde.
Dieses dritte rohe Pulver wurde in Methanol aufgenommen und die methanolische Lösung wurde über eine Säule aus einem neutralen Silicagel chromatographiert und mit Chloroform-Äthanol entwickelt, so dass jene Fraktionen des Eluates, welche Neothramycin-A allein enthielten, getrennt von jenen Fraktionen des Eluates erhalten werden konnten, welche Neothramycin-B allein enthielten. Für die weitere Reinigung von Neothramycin-A und -B wurden die Fraktionen mit Neothramycin-A bzw. die Fraktionen mit Neothramycin-B einer chromatographischen Methode unterworfen, indem sie über eine Säule aus neutralem Silicagel geleitet wurden und anschliessend die Säule mit Chloroform-Äthanol entwickelt wurde.
Das derart erhaltene Eluat wurde sodann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur und nicht über 40 "C konzentriert, um ein teilweise gereinigtes Pulver aus Neothramycin-A oder -B zu ergeben. Wenn die oben erwähnten Verfahren verwendet werden für die Gewinnung und Reinigung der Neothramycine, so sind einige zusätzliche Schritte notwendig, nämlich das Auflösen des oben genannten teilweise gereinigten Pulvers aus Neothramaycin-A oder -B in Chloroform, das Vermischen der Chloroformlösung mit Äthyläther, um das Neothramycin auszufällen, das Auflösen des letzteren in Äthanol, das Chromatographieren über eine Säule aus neutralem Silicagel, die mit wässerigem Äthylacetat entwikkelt wird,
und das Konzentrieren des erhaltenen Eluates unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht über 40 "C um ein vollständig reines Pulver aus Neothramycin-A oder -B zu erhalten.
Wie oben beschrieben, kann die Fraktion, welche das Neothramycin-A allein enthält und die Fraktion, welche das Neothramycin-B allein enthält, welche Fraktionen getrennt erhalten wurden, weiter gereinigt werden über voneinander getrennten Wegen. Wenn jedoch sowohl die Fraktion von Neothramycin-A wie die Fraktion von Neothramycin-B miteinander vermischt sind und das Gemisch sodann einer Reinigungsmethode unterworfen wird, welche die oben erwähnten aufeinanderfolgenden chromatographischen Methoden umfasst, ist es möglich, ein Gemisch von reinem Neothramycin A und reinem Neothramycin-B zu erhalten.
Andererseits, wenn die oben genannte Methode zum Extrahieren einer rohen wässerigen Lösung der Neothramycine-A und -B mit Butanollösungsmittel angewandt wurde, war es notwendig, den Butanolextrakt unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht über 40 "C zu konzentrieren, so dass ein bräunliches sirupartiges rohes Material, welches die Neothramycine enthielt, als erste Portion erhalten wurde (siehe z.B. Beispiel 7 aus der US-Patentschrift No. 4 049 497).
Für die weitere Reinigung war es notwendig, das erhaltene sirupartige rohe Material anschliessend über eine Anzahl aufeinanderfolgenden Stufen zu behandeln, welche denjenigen ähnlich sind, welche für die Reinigung des mit der oben erwähnten Methode zur Behandlung der Fermentationsbrühe mit Aktivkohle erhaltenen ersten rohen Pulvers eingeschätzt werden.
Wenn entweder die Adsorptionsmethode mit Aktivkohle oder die Extraktionsmethode mit Butanol zur Gewinnung und Reinigung von Neothramycin verwendet wird, ist es somit erforderlich, dass die Stufen der Entwicklung einer Säule aus neutralem Silicagel, an welchem Neothramycin adsorbiert wurde, mit einem organischen Lösungsmittelsystem, z.B. Chloroform-Methanol oder Chloroform-Äthanol, und die anschliessende Trennung des Antibiotikums aus dem zum Entwickeln verwendeten organischen Lösungsmittel mehrmals im Laufe des Reinigungsverfahrens wiederholt werden sollten und dass ferner die Trennung von Neothramycin vom organischen Lösungsmittel das Konzentrieren der organischen Lösung unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht über 40 "C erfordert, um das organische Lösungsmittel zu entfernen.
Unter diesen Verfahrensschritten, welche in Reinigungsverfahren notwendig sind, bildet die Eluierung von Neothramycin aus der Säule aus neutralem Silicagel, welche mit dem organischen Lösungsmittel entwickelt ist, üblicherweise eine Stufe von sehr geringem Wirkungs- grad, und ausserdem ist die Konzentration der organischen Lösung von Neothramycin unter vermindertem Druck üblicherweise mit einigen Schwierigkeiten verbunden und weist einen geringen Wirkungsgrad auf.
Ferner muss das Neothramycin einer mehr oder weniger erhöhten Temperatur während des Konzentrierens der organischen Neothramycin-Lösung unter vermindertem Druck ausgesetzt werden, so dass eine Zersetzung des Neothramycins umweigerlich bis zu einem gewissen Mass stattfinden kann, abgesehen davon, dass Neothramycin als unstabil und bei einer über Zimmertemperatur erhöhten Temperatur leicht zersetzbar bekannt ist.
Ferner ist es notwendig, um Neothramycin von anderen coexistierenden antibiotischen Nebenprodukten, wie Cycloheximid, zu befreien, die rohen Neothramycine-A und -B in Methanol aufzunehmen und die methanolische Lösung über eine Säule aus eine Sephadex-Gelfiltriermittel zu chromatographieren, welche mit Methanol entwickelt wird. Grundsatz lich wird jedoch nicht bevorzugt, dass Neothramycin-A oder -B mit einem niederen Alkanol, wie Methanol und Äthanol, in Berührung gebracht werden, weil die Neothramycine-A und -B jedes die Natur aufweist, in ihr entsprechendes 3-0-alkyliertes Derivat, wie das 3-O-Methylderivat oder 3-O-Äthyl- derivat umgewandelt zu werden, wenn sie mit einem niederen Alkanol in Berührung kommen.
Aus diesen Gründen sind die Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von fermentativ erzeugten Neothramycinen-A und -B, welche früher durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung entwickelt wurden, nicht frei von Nachteilen, indem sie schwierige Operationen umfassen und keinen hohen Wirkungsgrad aufweisen und somit nicht geeignet sind für die Ausführung in technischem Massstab. Solange die bisher bekannten Methoden daher angewandt wurden, war die Gesamtausbeute an reinem Endprodukt aus Neothramycin bei einem Wert von 3% dder weniger, berechnet auf die gesamte Potenz (potency) des Neothramycins, welches ursprünglich im Brühenfiltrat der Neothramycin erzeugenden Mikroorganismen zugegen ist.
Aus diesem Grunde haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung kürzlich eine weitere Methode zur Reinigung von Neothramycin entwickelt, welche das Chromatographieren einer rohen wässerigen Lösung von Neothramycin über eine Säule aus macroreticularem Harz, welches keine lonenaustauschfähigkeit besitzt, umfasst und mit welcher eine konzentrierte Lösung, welche Neothramycin von hoher Reinheit enthält, in günstiger Ausbeute erhalten werden kann, wie in der Beschreibung der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Kokai No. Sho 53-38695 (japanische Patentanmeldung No. 1 L0723/76) ausgeführt wurde.
Gemäss dieser chromatographischen Methode unter Verwendung einer Säule aus macroreticularem, nicht Ionen austauschenden Harz, wird eine rohe wässerige Lösung von Neothramycin über eine Säule aus einem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden, adsorbierenden Harz, wie einem macroreticularen Harz hergestellt aus einem Divinyl-benzo-styrolcopolymer, z.B.
Handelsprodukte bekannt als Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-7 und dergleichen (Handelsprodukte von Rohm & BR< Haas Co., USA), sowie Diaison HP-10, HP-20, HP-40 und dergleichen (Handelsprodukte von Mitsubishi Kasei Co., Japan), geleitet, so dass das Neothramycin durch das Harz adsorbiert wird. Das derart adsorbierte Neothramycin wird sodann aus der Harzsäule eluiert durch Entwickeln mit Wasser, welches 5 bis 20 Volumprozent Aceton enthält mit Wasser mit einem Methanolgehalt von 30 bis 50 Volumprozent oder mit Wasser mit einem Gehalt an 0,01 N bis 0,1 N Ammoniumhydroxid. Das erhaltene Eluat wird sodann gefriergetrocknet, um ein rohes Pulver zu ergeben, welches Neothramycin enthält.
Diese chromatographische Methode mit dem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harz weist einen höheren Wirkungsgrad auf im Vergleich zur früheren Adsorptionsmethode mit Aktivkohle und der früheren Extraktionsmethode mit Butanol, da sie in einer einzigen Stufe durchgeführt wird. Mit der chromatographischen Methode unter Verwendung des macroreticularen nicht Ionen austauschenden Harzes kann jedoch ein vollständig reines Produkt aus Neothramycin-A oder -B nicht erhalten werden, selbst wenn die aufeinanderfolgenden Stufen der Adsorption von Neothramycin durch das macroreticulare Harz, die Eluierung des Harzes mit Aceton-Wasser oder dergleichen und die anschliessende Gefriertrocknung des erhaltenen Eluates fünfmal oder mehr wiederholt werden. Ausserdem ist es dann ziemlich schwierig, das Neothramycin-Produkt vollständig frei von einer begleitenden Spur von Cycloheximid zu erhalten.
Unter diesen Umständen bestand ein Bedarf für eine einfachere und wirksamere Methode zur Reinigung von Neothramycin, wie es aus dem fermentativen Verfahren erhalten wird. So wurden ausgedehnte Forschungsarbeiten unternommen, um ein neues Verfahren für die Reinigung von Neothramycin zu erhalten, mit welchem es vollständig überflüssig ist, solche Stufen wie das Konzentrieren einer organischen Lösung von rohem Neothramycin unter vermidertem Druck mit mehr oder weniger Zersetzung von Neothramycin bei einer erhöhten Temperatur durchzuführen, in welchen es weiterhin überflüssig ist, als organisches Lösungsmittel einen Alkanol, wie Methanol und Äthanol, zu verwenden, welcher das Neothramycin in entsprechende 3-O-alkylierte Derivate umwandeln kann, wenn sie miteinander in Berührung gebracht werden, in welchem es ferner nicht erforderlich ist,
eine zusätzliche Stufe für die Entfernung von coexistierendem Cycloheximid-Nebenprodukt einzufügen und in welchem keine Stufe auftritt, in welcher eine wässrige Lösung von Neothramycin unter sauren Bedingungen aufbewahrt werden muss, welche fähig sind, das Neothramycin zu zersetzen. Es sollte nicht ausser Acht gelassen werden, dass seit der Entdeckung von Neothramycin-A und -B die Neothramycine bekannt sind als stabil in Form von wasserfreiem Pulver aber einigermassen unstabil in Form einer Lösung. Insbesondere war es bekannt, dass wenn Neothramycin-A und -B in 50%igem wässerigem Athanol aufgelöst werden, die antibakteriellen Aktivitäten in derartigen Lösungen bei pH 2,5 auf 25 bzw.
22% im Laufvon 16 Stunden bei Zimmertemperatur reduziert werden können, und dass, wenn eine Lösung von Neothramycin-A oder -B in 50%igem wässrigem Äthanol bei pH 6,5 oder pH 8,0 bei Zimmertemperatur gelagert wird, Neothramycin-A in ein Gleichgewichtsgemisch aus Neothramycin-A und -B umgewandelt werden kann, während Neothramycin-B ebenfalls in ein Gleichgewichtsgemisch der Neothramycine-A und -B umgewandelt werden kann.
Zusätzliche Untersuchungen haben ferner ergeben, dass wässerige Lösungen von Neothramycin-A oder -B im allgemeinen unter anderen als neutralen Bedingungen instabil sind, dass die restliche Aktivität einer wässerigen Lösung von Neothramycin-A oder -B bei pH 3, pH 7 und pH 12 auf 51,7%, bzw. 85,7% und 46,4% der ursprünglichen Aktivität reduziert werden kann, wenn die Lösung während 2 Tagen bei 25 "C gehalten wird, und dass die restliche Aktivität einer wässerigen Lösung von Neothramycin-A oder -B bei pH 12 auf nur 9,9% der ursprünglichen Aktivität abfallen kann, wenn die Lösung während 2 Tagen bei 35 "C aufbewahrt wird. Es wurde daher als Notwendig erachtet, dass wässerige Lösungen von Neothramycin unter neutralen Bedingungen während des ganzen Reinigungsprozesses gehalten werden.
Es wurden eine Anzahl Untersuchungen durchgeführt und nun unerwarteterweise gefunden, dass wenn eine wässe rige Lösung, welche Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, in Berührung mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz gebracht wird, welches quaternäre Am moniumgruppen als funktionelle lonenaustauschergruppen enthält, um das Neothramycinan dem stark basichen Anionenaustauscher zu adsorbieren, gefolgt von der Entwicklung des Anionenaustauschers mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes, wie z.B. Natriumchlorid, um Neothramycin aus dem lonenaustauscher zu eluieren, nicht nur das Neothra mycin weitgehend vor Zersetzung geschützt werden kann, sondern das Neothramycin auch mit hoher Reinheit und in einer hohen Konzentration in das Eluat verbracht werden kann.
Ausserdem wurde überraschend gefunden, dass keine Spur an coexistierenden Cycloheximid im Neothramycin enthaltenden Eluat festgestellt werden kann, sehr wahrscheinlich, weil Cycloheximid nach seiner Berührung mit dem stark basischen Anionenaustauscher vollständig zersetzt und entfernt wurde.
Als Folge wurde nun das neue Verfahren entwickelt, welches die Reinigung von rohem Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B mit hohem Wirkungsgrad ermöglicht, indem die oben genannte chromatographische Methode zur Reinigung von rohem Neothramycin mit einem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harz zusammen mit einen neuen Verfahren angewandt wird, in welchem eine wässerige Lösung, welche das Neotramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, mit einem stark basischen Anionenaustauscher behandelt wird, welcher quaternäre Ammoniumgruppen enthält, zur Adsorption von Neothramycin durch diesen Anionenaustauscher, und in welchem dieser Anionenaustauscher, nachdem das Neothramycin daran adsorbiert ist, mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes, z.B. Natriumchlorid, eluiert wird, wodurch eine gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B erhalten wird.
Gemäss der vorliegenden Erfindung ist daher das Verfahren zur Reinigung von Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B der Formel 1, bei welchem das Neothramycin ausschliesslich in wässeriger Lösung behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass man (a) eine rohe wässerige Lösung, welche Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, insbesondere ein Kulturbrühenfiltrat, welches Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, mit einem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harz behandelt, um Neothramycin durch das macroreticulare Harz zu adsorbieren, (b) das macroreticulare Harz, welches Neothramycin daran adsorbiert enthält, mit Wasser, welches einen Anteil Aceton enthält, oder mit verdünntem wässerigem Ammoniumhydroxid eluiert,
um eine teilweise gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin-A und/oder Neotramycin-B als eine oder mehrere Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (c) die derart erhaltene teilweise gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin mit einem stark basischen Anionenaustauscher, welcher quaternäre Ammoniumgruppen als funktionelle Anionenaustauschergruppen enthält, behandelt, um die Antibiotika an diesen Anionenaustauscher zu adsorbieren.
(d) den Anionenaustauscher, welcher Neothramycin adsorbiert enthält, mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes eluiert, um eine gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin zusammen mit dem neutralen Salz enthält, als eine oder mehrere Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (c) die derart erhaltene gereinigte wässerige Lösung von Neothramyein und dem neutralen Salz wiederum mit einer frischen Portion des macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harzes behandelt, um Neothramycin durch das macroreticulare Harz zu adsorbieren, (f) das letztgenannte macroreticulare Harz, welches Neothramycin adsorbiert enthält, mit Wasser, welches einen Anteil Aceton enthält, oder mit verdünntem, wässerigem Ammoniak eluiert, um eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin enthält,
aber kein neutrales Salz enthält, als eine oder mehrere Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (g) die derart erhaltene entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin einer Serie von aufeinanderfolgenden Stufen unterwirft, welche eine adsorptive Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher, ausgeführt in derselben Weise wie oben, eine Eluierung des Anionenaustauschers mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes, ausgeführt wie oben, eine adsorptive Behandlung des erhaltenen, Neothramycin und neutrales Salz enthaltenden Eluates mit einer frischen Portion eines macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harzes, ausgeführt wie oben, und eine Eluierung des adsorbierten Neothramycin enthaltenden macroreticularen Harzes mit acetonhaltigem Wasser oder mit verdünntem wässerigem Ammoniak, ausgeführt wie oben, umfasst,
um eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin aber kein neutrales Salz enthält zu gewinnen, und in solcher Weise, dass die gewonnene entsalzte und weiter gereinigte Lösung von Neothramyein mit der Serie der oben genannten aufeinanderfolgenden Stufen ein oder mehrere Male behandelt wird, um eine wässerige Lösung, welche Neothramycin in der gewünschten Reinheit enthält, zu erhalten.
Nach dem in Patentanspruch 6 definierten Verfahren wird das Aceton oder das Ammoniumhydroxid durch Destillation unter vermindertem Druck aus der gereinigten wässerigen Lösung von Neothramycin von gewünschter Reinheit, welche zuletzt aus der letzten Serie der oben genannten aufeinanderfolgenden Stufen erhalten wird, entfernt und diese Lösung gefriergetrocknet.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird die entsalzte Lösung von Neothramycin, welche als eine oder mehrere Fraktionen des Eluates aus jeder Eluierung des adsorbiertes Neothramycin-haltigen macroreticularen, nichtionogenen Harzes mit dem Wasser-Aceton oder dem verdünnten wässerigen Ammoniumhydroxid gewonnen wurde, als solche der adsorptiven Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher unterworfen, doch kann sie statt dessen vorzugsweise einmal gefriergetrocknet und wieder in Wasser aufgelöst werden, bevor die durch das Wiederauflösen erhaltene wässerige Lösung der adsorptiven Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher unterworfen wird.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird zuerst eine wässerige Lösung, welche Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, insbesondere ein Filtrat der Kulturbrühe eines Neothramycin erzeugenden Mikroorganismus, mit dem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harz behandelt, so dass Neothramycin durch das Harz adsorbiert wird. Für diese Adsorptionsstufe kann das verwendete macroreticulare nicht-ionogene Harz ein Polystyrolharz umfassen, welches mit Divinylbenzol vernetzt ist.
Zum Beispiel können macroreticulare, nicht-ionogene Harze, welche aus einem Divinylbenzol-Styrol-Copolymer bestehen, wie jene, die im Handel unter der Marke Amberlite XAD-2, XAD-4 und XAD-7 (Produkte von Rohm & Haas Co., USA) oder unter der Marke Diaion HP-l0 und MP-20 (Produkte der Mitsubishi Kasei Co., Japan) erhältlich sind, verwendet werden.
Das Volumen an macroreticularen, nicht-ionogenem Harz, welches verwendet wird, kann mitVorlcil 1/5 bis 1/20 des Gesamtvolumens der rohen wässerigen Lösung von Neothramycin-A und/oder -B, welche der adsorptiven Behandlung mit diesem macroreticularen Harz unterworfen werden soll, betragen. Die Säule aus macroreticularem, nichtionogenem Harz kann derartige Dimensionen aufweisen, dass das Verhältnis vom Durchmesser zur Höhe der Säule im Bereich von 1:5 bis 1:20 liegt und vorzugsweise im Bereich von 1:10 zu 1:15 Die rohe wässerige Lösung von Neothramycin, welche der adsorptiven Behandlung mit dem macroreticularen Harz unterworfen werden soll, kann vorzugsweise ein pH von 5 bis 7 aufweisen, bei welchem Neothramycin-A und -B eine verhältnismässig gute Stabilität aufweisen können.
Das macroreticulare, nicht-ionogene Harz, an welches Neothramycin-A und -B adsorbiert sind, kann mit einem vier- bis zehnfach grösseren Volumen Wasser gewaschen und anschliessend mit Wasser, welches 5 bis 20 Volumprozent Aceton enthält oder mit Wasser, welches 0,01 N bis 0,1 N Ammoniumhydroxid enthält, eluiert werden. Diese chromatographische Eluierung des macroreticularen Harzes mit Wasser-Aceton oder verdünnter wässerigem Ammoniumhydroxid kann vorzugsweise bei einer Temperatur von nicht höher als 10 "C durchgeführt werden, unter Berücksichtigung der Instabilität von Neothramycin. Die Säule des macroreticularen Harzes ist mit Vorteil derart, dass 0,5 bis 1 Stunde für eine Volumeinheit des Eluierungsmittels zum Durchfliessen einer gleich grossen Volumeinheit des Harzes der Säule benötigt wird.
Die oben erwähnte Eluierung des macroreticularen, nichtionogenen Harzes mit Wasser-Aceton oder wässerigem Ammoniumhydroxid kann eine teilweise gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin-A und/oder -B als eine oder mehrere Fraktionen des erhaltenen Eluates ergeben. Diese Fraktion bzw. Fraktionen des Eluates können als solche für die anschliessende Stufe der adsorptiven Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher verwendet werden. Es ist jedoch auch möglich und zu empfehlen, dass diese Fraktion(en) des Eluates einmal auf bekannte Weise gefriergetrocknet werden, worauf das erhaltene gefriergetrocknete Material wiederum in Wasser aufgelöst wird und die erhaltene wässerige Lösung der anschliessenden Stufe der adsorptiven Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher unterworfen wird.
Im erfindungsgemässen Verfahren sind die oben genannten Stufen gefolgt von der Stufe, in welcher die teilweise gereinigte Lösung von Neothramycin der adsorptiven Behandlung mit einem stark basischen Anionenaustauscher unterworfen wird, wie auch der Stufe, in welcher dieser Anionenaustauscher mit der wässerigen Lösung eines neutralen Salzes eluiert wird.
Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass Neothramycin unter alkalischen Bedingungen sehr unstabil ist, war anzunehmen, dass die Reinigung von Neothramycin stark beeinträchtigt würde, wenn Neothramycin in Berührung mit einem stark basischen Anionenaustauscher, welcher quaternäre Ammoniumgruppen (üblicherweise mit einem pKa-Wert von nicht weniger als 13) als funktionelle Anionenaustauschergruppen enthält, in Berührung gebracht wird. Überraschen- derweise wurde jedoch festgestellt, dass die Stufe, in welcher das Neothramycin durch eine Säulenchromatographie mit einem stark basischen Anionenaustauscher, welcher quaternäre Ammoniumgruppen als funktionelle Gruppen enthält, gereinigt wird, sehr erfolgreich durchgeführt werden kann, um eine konzentrierte und hoch gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin in günstiger Ausbeute zu erzielen.
Es wurde ferner gefunden, dass die Adsorption von Neothramycin durch die Säule des stark basischen Anionenaustauschers, welcher gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet wird, und die Eluierung davon äusserst wirksam ist, um die Verunreinigungen zu entfernen, welche üblicherweise das fermentativ erzeugte Neothramycin begleiten. Beispielsweise kann Cycloheximid, welches üblicherweise in der Kulturbrühe, welche das Neothramycin enthält, ebenfalls enthalten ist, vollständig durch Berührung mit dem stark basischen Anionenaustauscher zersetzt werden, infolge der hohen Basizität des Austauschers, so dass das Cycloheximid leicht vom Neothramycin während dessen Durchgang durch die Säule des Anionenaustauschers entfernt werden kann.
Ausserdem können weitere Verunreinigungen unbekannter Struktur, welche eine unerwünschte Verfärbung des Neothramycin Produktes erzeugen würden, durch die adsorptive Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher ebenfalls entfernt werden. Wahrscheinlich infolge dieser Tatsache weisen Ncothramycin-Produkte, welche durch das crfindungsge- mässe Reinigungsverfahren erhalten werden, ein wesentlich weisseres Aussehen auf.
Der stark basische Anionenaustauscher, welcher im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden kann, umfasst ein Polystyrolharz, welches quaternäre Ammoniumgruppen -N(CH3)3+ als Anionenaustauschergruppen enthält, wie z.B.
jene Harze, welche unter der Marke Amberlite IRA-400, IRA-401 und IRA-402 (Produkte von Rohm & Haas Co., USA), unter der Marke Dowex I,21K und 11 (Produkte von Dow Chemical Co., USA) oder unter der Marke Diaion SA-IOA (Produkt von Mitsubishi Kasei Co., Japan) erhältlich sind, und ein Polystyrolharz, welches quaternäre Ammoniumgruppen -N(CH3)2(C2H4OH)+ als Anionenaustauschergruppe enthält, wie jene, die im Handel unter der Marke Amberlite lRA-410 (Produkt von Rohm & Haas Co., USA), unter der Marke Dowex 2 (Produkt von Dow Chemical Co., USA) oder unter der Marke Diaion SA-20A (Produkt von Mitsubishi Kasei Co., Japan) erhältlich sind, sowie eine Anionenaustauscherzellulose,
wie jene die im Handel unter der Bezeichnung ECTEOLA -Zellulose (Epichlorhydrintriäthanolamin-Cellulose) erhältlich ist. Im erfindungsgemässen Verfahren ist es üblicherweise zweckmässig, dass der Anionenaustauscher in seiner Hydroxid-(OH -)-Form verwendet wird. Wenn ein im Handel erhältlicher Anionenaustauscher in seiner Chlorid-(C1-)-Form erhältlich ist, kann er leicht durch Behandlung mit der 1 bis 4 molaren Menge an Alkalimetallhydroxid, z.B. Natriumhydroxid, in Wasser in die Hydroxid-(OH-)-Form umgewandelt werden.
Die Säule des Anionenaustauschers kann vorzugsweise derartige Dimensionen aufweisen, dass das Verhältnis vom Durchmesser zur Höhe der Säule im allgemeinen im Bereich von 1:2 bis 1:20 liegt. Die wässrige Lösung von Neothramycin, welche in die Säule des Anionenaustauscherharzes zur adsorptiven Behandlung eingeführt werden soll, kann Neothramycin in einer Konzentration in einem weiten Bereich enthalten, z.B. 1 mcg/ml bis 1 g/ml, damit die adsorptive Behandlung durch den Ionenaustauscher wirksam ist für die gewünschten Zwecke. Ferner weist die wässerige Lösung des Neothramycins vorzugsweise ein pH von 5 bis 7 auf bei welchem Neothramycin eine verhältnismässig gute Stabilität aufweist.
Der Ionenaustauscher, welcher Neothramycin adsorbiert enthält, wird mit dem vier- bis zehnfachen grösseren Volumen an Wasser gewaschen und anschliessend mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes, z.B. Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat, eluiert, so dass Neothramycin vom Anionenaustauscher desorbiert und in das Eluat übertragen wird. Das verwendete neutrale Salz kann ein Alkalimetallchlorid oder -sulfat sein, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulfat und Kaliumsulfat, doch werden Natriumchlorid und Ammoniumsulfat am meisten bevorzugt. Die verwendete wässerige Lösung eines neutralen Salzes kann das neutrale Salz in einer Konzentration von nicht über 1 M enthalten.
Die Eluierung des adsorbiertes Neothramycin enthaltenden Anionenaustauschers mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes, wie oben erwähnt, ergibt eine gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin und das neutrale Salz enthält, als eine oder mehrere Fraktionen des Eluates, welche anschliessend wiederum der chromatographischen Behandlung in einer Säule aus macroreticularem, nicht-ionogenem Harz unterworfen wird, die mit Wasser-Aceton oder verdünntem wässerigem Ammoniumoxid entwickelt wird, um eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin zu erhalten.
Die oben erwähnten chromatographischen Behandlungen können vorzugsweise bei einer niederen Temperatur von nicht über 10 C durchgeführt werden, da Neothramycin bei einer höheren Temperatur ziemlich unstabil ist. Die Durchgangsgeschwindigkeit der wässerigen Lösung von Neothramycin oder dem Eluierungsmittel durch eine Säule des Anionenaustauschers oder des macroreticularen, nichtionogenen Harzes ist zweckmässig derart, dass 0,5 bis 1 Stunde zum Durchlauf eines Harzbettvolumens benötigt werden.
Wenn die entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin, welche derart aus der Säule aus macroreticularen nicht-ionogenem Harz eluiert wurde, nicht die gewünschte Reinheit des Neothramycins aufweist, wird sie wiederum einer weiteren Serie der aufeinanderfolgenden Stufen unterworfen, welche die adsorptive Behandlung mit dem Anionenaustauscher, die Eluierung des Anionenaustauschers mit der wässerigen neutralen Salzlösung, die adsorptive Behandlung des erhaltenen Eluates mit einer frischen Portion macroreticularen nicht-ionogenem Harz und die Eluierung dieses letztgenannten mycroreticularen Harzes mit Wasser-Aceton oder wässerigem Ammoniumhydroxid, ausgeführt wie oben beschrieben, umfasst, um eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung zu ergeben, welche Neothramycin jedoch kein neutrales Salz enthält.
Wenn diese letztgenannte entsalzte Lösung noch immer nicht dem gewünschten Reinheitsgrad des Neothramycins entspricht, wird es nochmals einer dritten Serie der oben genannten aufeinanderfolgenden Stufen unterworfen und dies so oft wiederholt, bis die entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin, welche aus der letzten Stufe erhalten wird, die gewünschte Reinheit des Neothramycins aufweist. Im Laufe des erfindungsgemässen Verfahrens kann der Gehalt an Neothramycin in einer wässerigen Lösung bestimmt werden durch Untersuchung der antibakteriellen Potenz der Lösung nach einer Standard-Platten-Methode (standard cup-plate method) unter Verwendung eines Stammes von Staphylococcus aureus als Testorganismus, wobei angenommen wird, dass eine reine, authentische Probe von Neothramycin-A eine Potenz von 1000 mcg/mg aufweist.
Nach dem Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein reines oder annähernd reines Produkt von Neothramycin ausgehend aus einem Kulturbrühenfiltrat (mit einer Potenz von 500 bis 1000 mcg/ml) aus der Züchtung von Streptomyces MC916-C4 und durch Behandlung des Kulturbrühenfiltrates mit macroreticularem, nicht-ionogenem Harz zur Adsoption von Neothramycin, Eluierung des adsorbiertes Neothramycin enthaltenden macroreticularen Harzes mit acetonhaltigem Wasser, Behandlung des erhaltenen Eluates mit stark basischem Anionenaustauscher zur Adsorption von Neothramycin, Eluierung des adsorbiertes Neothramycin enthaltenden Anionenaustauschers mit wässeriger Lösung eines neutralen Salzes, Behandlung des erhaltenen Eluates mit einer frischen Portion macromolecularen,
nicht-ionogenem Harz zur Adsorption von Neothramycin durch dieses Harz und anschliessende Eluierung des letztgenannten macroreticularen Harzes mit acetonhaltigem Wasser in solcher Weise, dass die Serien dieser chromatographischen Stufen als erster Zyklus durchgeführt wird, und dann, falls notwendig, weitere Serien dieser chromatographischen Stufen in ein oder zwei zusätzlichen Zyklen durchgeführt werden, erhalten. Auf diese Weise kann Neothramycin in einer Gesamtausbeute von etwa 20%, berechnet auf die Gesamtpotenz von Neothramycin, die ursprünglich im verwendeten Kulturbrühenfiltrat vorhanden war, erhalten wird.
Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird Neothramycin in Lösung in Wasser während praktisch aller Stufen des Verfahrens verarbeitet, und die im Verfahren erforderlichen Lösungsmittel sind nur Wasser und Aceton, welche billig und leicht erhältlich sind, so dass das erfindungsgemässe Verfahren mit niederen Kosten durchgeführt werden kann.
Die Erfindung wird im folgenden durch einige Ausführungsbeispiele weiter illustriert.
Beispiel 1 (1) Ein Filtrat (10 Liter) der Kulturbrühe von Streptomyces MC916-C4 (FERM-P 2452 oder ATCC 31123), welches Neothramycin in einer Potenz von 796 mcg/ml enthielt (pH 7,13) wurde über eine Säule aus 1 Liter Diaion HP-20 (ein macroreticulares, nicht Ionen austauschendes Harz, welches aus einem Divinylbenzol-Styrol-Copolymer besteht, im Handel erhältlich von Mitsubishi Kasei Co., Japan) geleitet, so dass Neothramycin durch das Harz adsorbiert wurde. Dies Harzsäule wurde mit 7 Liter Wasser gewaschen und anschliessend mit Wasser, welches 5 Volumprozent Aceton enthielt, eluiert. Das Eluat wurde in 120 ml-Fraktionen gesammelt und die Fraktionen No. 18 bis 120, welche Neothramycin enthielten, wurden vereint zu 11,7 Liter einer teilweise gereinigten wässerigen Lösung von Neothramycin (Potenz 404 mcg/ml, pH 6, 7). Ausbeute: 59%.
(2) Diese teilweise gereinigte Lösung von Neothramycin (5,85 Liter) wurde über eine Säule (8 mm innerer Durchmesser) aus 100 ml Amberlite IRA-401 (OH--Form) (ein stark basisches Anionenaustauscherharz bestehend aus einem Polystyrol, welches quaternäre Ammoniumgruppen -N(CH3)3 + enthält, im Handel erhältlich von Rohm & Haas Co., USA) geleitet, so dass das Neothramycin durch das Anionenaustauscherharz adsorbiert wurde. Diese Harzsäule wurde sodann mit 500 ml Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung von 0,3M Natriumchlorid eluiert und das Eluat sodann in 20 ml-Fraktionen gesammelt. Diese Fraktionen enthielten keine nachweisbare Menge an Cycloheximid. Jene Fraktionen No. 8 bis 120, welche Neothramycin enthielten, wurden zu 2,16 Liter einer wässerigen Lösung vereint, welche Neothramycin und Natriumchlorid enthielt. (pH 9,6, Potenz 904 mcg/ml).
Ausbeute: 82%.
(3) Diese wässerige Lösung von Neothramycin wurde durch Zusatz von wässeriger 10%aber Schwefelsäure auf pH 6,1 gebracht und anschliessend über eine Säule aus 100 ml Diaion HP-20 geleitet zur Adsorption der Antibiotika durch dieses macroreticulare nicht-ionogene Harz. Die Harzsäule wurde mit 500 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit Wasser, welches 15 Volumprozent Aceton enthielt, zum Entsalzen eluiert. Das Eluat wurde in 20 ml -Fraktionen gesammelt und die Fraktionen No. 6 bis 19 zu einer entsalzten wässerigen Lösung Neothramycin vereint. Diese entsalzte Lösung wurde unter 30 "C unter vermindertem Druck destilliert, um das Aceton zu entfernen, und anschliessend gefriergetrocknet, wobei 2,16 g eines rohen Pulvers von Neothramycin (Potenz 606 mcg/mg) erhalten wurden. Ausbeute: 68%.
(4) 2 g des rohen Pulvers von Neothramycin (Potenz 609 mcg/mg), erhalten wie oben beschrieben, wurden in 20 ml Wasser aufgenommen und die wässerige Lösung über eine Säule (8 mm innerer Durchmesser) auf 100 ml Amberlite IRA-401 (OH--Form) geleitet, so dass Neothramycin von diesem stark basischen Anionenaustauscherharz adsorbiert wurde. Diese Harzsäule wurde mit 500 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit einer wässerigen Lösung von 0,3M Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen gesammelt.
Von jeder Fraktion wurde eine Probe ent nommen, welche mittels Silicagel-Dünnschichtchromatogra- phie (unter Verwendung von Athylacetat-Wasser (50:1 Volumverhältnis) als Entwicklungslösungsmittel und Feststellung eines Neothramycin-Flecks bei oder nahe bei Rf 0,2 un ter Färbung mit gasförmigem Jod) analysiert, um festzustel len, ob die analysierte Fraktion Neothramycin enthielt. Die Fraktionen No. 13 bis 60, welche Neothramycin und Natriumchlorid enthielten, wurden vereint und die vereinte Lösung wurde durch Zusatz von 2N wässeriger Schwefelsäure auf pH 7,0 eingestellt.
Diese neutralisierte gereinigte Lösung von Neothramycin wurde sodann über eine Säule aus 30 ml Diaion HP-20 geleitet zur Adsorption der Antibiotika, und diese Säule aus macroreticularem Harz wurde mit 150 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit Wasser, welches 10 Volumprozent Aceton enthielt, zur Entsalzung eluiert, wobei das Eluat in 16 ml-Fraktionen gesammelt wurde. Die Fraktionen No. 2 bis 11 wurden vereint und ergaben eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin.
(5) Diese entsalzte Lösung wurde bei einer Temperatur unterhalb 30 "C unter vermindertem Druck destilliert, um das Aceton zu entfernen, und die erhaltene konzentrierte Lösung wurde gefriergetrocknet und ergab 0,73 g eines gereinigten Pulvers von praktisch reinem Neothramycin-Produkt (Potenz 910 mcg/mg). Ausbeute: 55%. Die Gesamtausbeute an Neothramycin betrug 18%, berechnet auf die Gesamtmenge an Neothramycin, welche ursprünglich im verwendeten Kulturbrühenfiltrat vorhanden war.
Beispiel 2
Ein rohes Pulver (2 g), welches Neothramycin (Potenz 850 mcg/mg) enthielt und auf ähnliche Weise wie in den Schritten (1) bis (3) von Beispiel 1 beschrieben erhalten worden war, wurde in 20 ml Wasser gelöst und die erhaltene wässerige Lösung über eine Säule (8 mm innerer Durchmesser) auf 100 ml Amberlite IRA-401 (OH--Form) zur Adsorption der Antibiotika durch dieses Anionenaustauscherharz geleitet. Die Harzsäule wurde mit 500 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit einer wässerigen Lösung von 0,3M Natriumchlorid eluiert.
Das Eluat wurde in 18 ml -Fraktionen gesammelt, von jeder dieser Fraktionen eine Probe entnommen, welche sodann durch Silicagel-Dünnschichtchromatographie analysiert wurde, unter Verwendung von Äthylacetat-Wasser (50:1 Volumverhältnis) als Entwicklungslösungsmittel und Feststellung eines Neothramycin-Flecks bei oder nahe bei Rf 0,2 unter Färbung mittels gasförmigem Jod, um festzustellen, ob die analysierte Fraktion Neothramycin enthielt. Die Fraktionen No. 13 bis 60 des Eluates, welche Neothramycin enthielten, wurden vereint und ergaben eine weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin, welche sodann durch Zusatz von wässeriger 2N Schwefelsäure auf pH 7,0 eingestellt wurde.
Diese neutrale gereinigte Lösung von Neothramycin wurde der adsorptiven Behandlung mit einer Säule aus 30 ml Diaion HP-20 unterworfen, welche anschliessend mit 150 ml Wasser gewaschen und mit Wasser, welches 10 Volumenprozent Aceton enthielt, zum Entsalzen eluiert. Das Eluat aus der Diaion HP-20 -Säule wurde in 16 ml -Fraktionen gesammelt und die Fraktionen No. 2 bis 11 wurden vereint, um eine entsalzte und weiter gereinigte Lösung von Neothramycin zu ergeben. Diese entsalzte Lösung wurde bei einer Temperatur unterhalb 30 C unter vermindertem Druck destilliert, um das Aceton zu entfernen, und die konzentrierte Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 0,73 g eines reinen Pulvers von Neothramycin (Potenz 1000 mcg/mg) erhalten wurden. Ausbeute: 43%.
Beispiel 3
Ein rohes Pulver (2 g) von Neothramycin (Potenz 580 mcg/mg), welches durch ähnliche Verfahrensschritte wie die Stufen (1) bis (3) aus Beispiel 1 erhalten worden war, wurde in 20 ml Wasser gelöst. Die erhaltene wässerige Lösung wurde über eine Säule (8 mm innerer Durchmesser) aus
100 ml Amberlite IRA-410 (OH--Form) geleitet, so dass Neothramycin durch das Anionenaustauscherharz adsorbiert wurde. Diese Harzsäule wurde mit 500 ml Wasser gewaschen und dann mit einer wässerigen Lösung von 0,5N Ammoni umsulfat eluiert und das Eluat in 18 ml -Fraktionen gesammelt.
Jede Fraktion wurde mit Hilfe einer Silicagel-Dünnschichtchromatographie wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert, und jene Fraktionen No. 9 bis 96 des Eluates, welche Neothramycin enthielten, wurden vereint, um eine weitere gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin zu ergeben, welche anschliessend durch Zusatz von wässeriger 2N Schwefelsäure auf pH 7,0 eingestellt wurde. Diese neutralisierte, gereinigte Lösung von Neothramycin wurde der adsorptiven Behandlung mit einer Säule von 30 ml Diaion Hp-20 unterworfen, welche sodann mit 50 ml Wasser gewaschen und mit Wasser, welches 10 Volumprozent Aceton enthielt, zur Entsalzung eluiert wurde.
Diejenigen Fraktionen des Eluates, welches Neothramycin enthielten, wurden vereint, um eine entsalzte und weiter gereinigte Lösung von Neothramycin im Wasser-Aceton zu ergeben, die bei einer Temperatur von unter 30 "C unter vermindertem Druck destilliert wurde, um das Aceton zu entfernen. Die konzentrierte Lösung wurde gefriergetrocknet und ergab 0,35 g eines gereinigten Pulvers eines praktisch reinen Neothramycin-Produktes (Potenz 945 mcg/mg). Ausbeute: 28%.
Beispiel 4
Ein Filtrat (1 Liter) der Kulturbrühe von Streptomyces MC916-C4, welche Neothramycin in einer Potenz von 950 mcg/ml (pH 7,1) enthielt, wurde auf dieselbe Weise wie in den Stufen (1) bis (3) von Beispiel 1 verarbeitet, um ein rohes Pulver von Neothramycin mit einer Potenz von 850 mcg/mg zu ergeben. Dieses rohe Pulver (500 mg) wurde in 3 ml Wasser gelöst und die erhaltene wässerige Lösung über eine Säule (13 mm innerer Durchmesser) aus 20 ml Dowex 1 -X2 (OH--Form) (ein stark basisches Anionenaustauscherharz bestehend aus einem Polystyrol, welches quaternäre Ammoniumgruppen enthält, im Handel erhältlich von Dow Chemical Co., USA) gleitet, so dass Neothramycin durch das Anionenaustauscherharz adsorbiert wurde.
Diese Harzsäule wurde mit 100 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit einer wässerigen Lösung von 0,125M Natriumchlorid eluiert, wobei das Eluat in 8 ml -Fraktionen gesammelt wurde. Jede dieser Fraktionen wurden durch eine Silicagel-Dünnschichtchromatographie auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 untersucht und jene Fraktionen No. 9 bis 23 des Eluates, welche Neothramycin enthielten, wurden vereint und ergaben eine gereinigte Lösung, welche Neothramycin und Natriumchlorid enthielt. Diese Lösung wurde durch Zusatz einer wässerigen 10%gen Schwefelsäure auf pH 6,0 eingestellt und anschliessend der adsorptiven Behandlung mit einer Säule von 15 ml Diaion HP-20 unterworfen. Dieses macroreticulare Harz wurde mit 100 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit Wasser, welches 50 Volumprozent Aceton enthielt, zur Entsalzung eluiert.
Die Fraktionen des Eluates, welche Neothramycin enthielten, wurden vereint und ergaben eine entsalzte und weiter gereinigte Lösung von Neothramycin, welche sodann bei einer Temperatur unterhalb 30 "C unter vermindertem Druck destilliert wurde, um das Aceton zu entfernen. Die konzentrierte Lösung wurde gefriergetrocknet und ergab 220 mg eines gereinigten Pulvers von praktisch reinem Neothramycin-Produkt (Potenz 900 mcg/mg). Ausbeute: 47%. Die Gesamtausbeute des Neothramycins betrug 21%, berechnet auf die totale Potenz an Neothramycin, welche im verwendeten ursprünglichen Kulturbrühenfiltrat vorhanden war.