CH658250A5 - Nuovi antibiotici macrolidici semisintetici, procedimenti microbiologici per la loro preparazione nuovi intermedi per la loro preparazione e composizioni farmaceutiche che li contengono. - Google Patents

Nuovi antibiotici macrolidici semisintetici, procedimenti microbiologici per la loro preparazione nuovi intermedi per la loro preparazione e composizioni farmaceutiche che li contengono. Download PDF

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CH658250A5
CH658250A5 CH98/82A CH9882A CH658250A5 CH 658250 A5 CH658250 A5 CH 658250A5 CH 98/82 A CH98/82 A CH 98/82A CH 9882 A CH9882 A CH 9882A CH 658250 A5 CH658250 A5 CH 658250A5
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esters
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Description

La presente invenzione riguarda nuovi antibiotici macrolidi-ci, utili come agenti antibatterici, ed un procedimento microbiologico per la loro produzione a partire da un nuovo intermedio, derivato dall'eritronolide A, dall'eritronolide B ovvero dal 3-O-micarosiI-eritronolide B.
La presente invenzione riguarda inoltre nuovi intermedi derivati dall'eritronolide A, dall'eritronolide B ovvero dal 3-0-micarosil-eritronolide B, ed il relativo procedimento chimico di sintesi.
658 250
4
Come menzionati in precedenza, i nuovi antibiotici macroli-dici semisintetici della presente invenzione sono utili come agenti antibatterici, essi presentano, infatti, in confronto con le eri-tromicine di tipo noto, spettri di attività e livelli analoghi o più ampi, sono meno suscettibili di degradazione in ambiente acido per cui si prestano ad un miglior assorbimento per via orale; i loro esteri e sali-esteri vengono assorbiti in maniera più rapida e completa determinando livelli ematici più elevati e protratti delle basi libere.
I nuovi antibiotici dell'invenzione in virtù della presenza del gruppo basico formano sali di addizione sia con acidi organici sia con acidi inorganici. I sopraddetti sali possono essere preparati dalla base libera mediante metodi convenzionalmente usati per la preparazione di sali di addizione di antibiotici basici.
I sali non idrosolubili sono usati in sospensioni orali liquide (sono poco amari). Derivati monoesteri dei nuovi antibiotici e sali di addizione di quest'ultimi possono essere inoltre preparati mediante procedimenti analoghi a quelli usati per la preparazione di esteri e sali-esteri di eritromicina A.
Gli esteri e i sali-esteri di eritromicina A e i procedimenti per prepararli sono noti nella tecnica. Esempi di esteri, sali-esteri e sali di (8S)-8-fluoroeritromicina A (P-80206), (8S)-8-fluoro-eritromicina B (P-80203) (8S)-8-fluoroeritromicina C (P-80205), (8S)-8-fluoroeritromicina D (P-80202), 3-0-oleandrosil-5-0--desosaminil-(8S)-8-fluoroeritronolide A (P-80207) e 3-0-oleandrosil-5-0-desosaminil-(8S)-8-fluoroeritronolide B (P-80204), (dove le sigle tra parentesi indicano i riferimenti interni della Richiedente) che possono essere preparati sono l'acetato, il propionato, il butirrato, il succinato, il valerato, l'etil-succinato, il propionato laurilsolfato, lo stearato, il lattobiona-to, il glucoeptonato, il solfato, il laurilsolfato, carbonato-derivati e simili, di cui il lattobionato e il glucoeptonato, essendo sali idrosolubili, si prestano per la somministrazione per via endovenosa. L'etilsuccinato, a sua volta, si presta alla somministrazione, oltre che per via orale, anche per quella parenterale.
I nuovi antibiotici secondo l'invenzione sono polveri bianche, amare, inodori, termostabili in polvere, più stabili dell'eri-tromicina A in soluzione acquosa a pH acido e, pertanto, più stabili in ambiente acido gastrico. I tempi di dimezzamento dell'attività iniziale dell'eritromicina A e degli antibiotici ma-crolidici della presente invenzione in soluzione a diversi pH sono riportati nella tabella 1 che segue.
TABELLA 1
Stabilità in ambiente acido a 25°C dei nuovi antibiotici in confronto con eritromicina A
TABELLA 1 (continuazione)
(8S)-8-fluoroeritromicina D (P-80202) pH 2,0 3,0 4,0
s t 1/2 (ore) 0,4 10 >100
3-0-oleandrosil-5-0-desosaminil-(8S)-8-fluoroeritronolide A (P-80207)
pH 10 t 1/2 (ore)
2,0 10
3,0 100
4,0 >100
3-0-oleandrosil-5-0-desosaminil-(8S)-8-fluoroeritronolide B (P-80204)
pH 2,0 3,0 4,0
t 1/2 (ore)
25
100
>100
Eritromicina A pH
t 1/2 (minuti)
Nota bene: t 1/2 rappresenta il tempo di dimezzamento della potenza iniziale dell'antibiotico determinata mediante meto-20 do microbiologico per diffusione su piastra utilizzando il ceppo test Micrococcus luteus (Sarcina lutea) ATCC 9341.
Secondo un primo aspetto dell'invenzione, vengono preparati nuovi intermedi derivati dall'eritronolide A, dall'eritronolide B ovvero dal 3-O-micarosil-eritronolide B che vengono uti-25 lizzati nel processo microbiologico di preparazione dei nuovi antibiotici. È ben noto (R.A. LeMahieu et al. J. Med. Chem. 17, 963, (1974) che l'eritronolide A è un substrato ottenibile da eritromicina A mediante selettiva rimozione degli zuccheri cla-dinosio e desosamina.
3o È anche noto che l'eritronolide B ed il 3-O-micarosil-eritronolide B sono substrati ottenibili per fermentazione diretta in notevole quantità e quindi a prezzi economicamente validi utilizzando microorganismi produttori di eritromicina e loro mutanti. D'altro canto, come è anche ben noto, a parte la produ-35 zione di normale eritromicina A, questi substrati non trovano uso in altre fermentazioni che possano portare ad antibiotici esenti dagli inconvenienti e problemi presentati dalla stessa eritromicina, mentre dal punto di vista industriale appare massimamente desiderabile una loro utilizzazione.
40 È stato trovato che i derivati dall'eritronolide A, dall'eritronolide B ovvero dal 3-O-micarosil-eritronolide B ottenibili per via chimica in modo semplice ed industrialmente vantaggioso, costituiscono utili substrati per processi di fermentazione che, utilizzando microorganismi derivati per mutagenesi dai ceppi 45 adatti alla produzione microbiologica di eritromicina A, portano ai nuovi antibiotici macrolidici della presente invenzione, come verrà più specificamente descritto nel seguito.
Il procedimento chimico per la preparazione dei nuovi intermedi secondo la presente invenzione è rappresentato dallo sche-5o ma che segue:
2,0 2
3,0 6
4,0 120
Schema I
(8S)-8-fluoroeritromicina A (P-80206)
pH
t 1/2 (ore)
2,0 9
3,0 82,5
4,0 >100
(8S)-8-fluoroeritromicina B (P-80203)
pH
t 1/2 (ore)
2,0 3
3,0 45
4,0 >100
(8S)-8-fluoroeritromicina C (P-80205)
pH
t 1/2 (ore)
2,0 1,65
3,0 41,5
4,0 >100
5
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dove quando R = H, X rappresenta H, oppure il gruppo
—/0sVCH3
e quando R = OH, X = H e si caratterizza per gli stadi di:
a) trattamento di un composto (I), scelto tra eritronolide A, eritronolide B e 3-O-micarosil-eritronolide B con un acido anidro, quale acido acetico glaciale oppure una soluzione metano-lica di idrossilamina cloridrato, per formare il composto II, ossia 8,9-anidro eritronolide A 6,9-emiacetale, 8,9-anidroeritro-nolide B-6,9-emiacetaIe oppure 3-0-micarosil-8,9-anidroeritro-nolide B 6,9-emiacetale;
b) reazione del composto (II) con un reattivo capace di generare fluoro elettrofilo, preferibilmente scelto tra fluorossi--perfluoro-alcani (aventi formula generale CnF2n+1 OF) e perdoni fluoruro, per formare il corrispondente acetale (III) in presenza di un solvente organico inerte ed a bassa temperatura;
c) reazione del composto (III) con acido acquoso con formazione del composto (IV) desiderato.
Con riferimento allo stadio (b) tra i reattivi della classe dei fluorossiperfluoro-alcani quello maggiormente usato è il fluorossi-trifluoro-metano, che è reperibile in commercio.
Altri reagenti contenenti atomi di fluoro aventi carica positiva che si possono utilizzare in questa reazione comprendono fluorossi-zolfopentafluoruro, fluoro molecolare ed il piombo tetraacetato-acido fluoridrico.
Tra i solventi di reazione sono contemplati gli idrocarburi clorurati come il triclorofluorometano (Freon 11), cloroformio, cloruro di metilene e simili, tetraidrofurano e loro miscele.
È preferibile effettuare la reazione a basse temperature, preferibilmente nell'intervallo da —75°C a —85°C, sotto agitazione continua.
La reazione risulta solitamente completata in un tempo compreso tra 15 minuti circa ed un'ora.
È importante osservare che, la formazione dell'acetale (III) è accompagnata dalla formazione già in questo stadio di quantità non trascurabili del composto (IV) desiderato.
Per quanto riguarda il terzo stadio (c) di reazione, si utilizzano acidi acquosi organici o minerali, quali acido acetico od acido cloridrico. Per le reazione si possono adottare temperature comprese tra circa 30°C e circa 150°C. Il prodotto risultante (IV) viene ricuperato in forma purificata mediante ricristallizzazione o cromatografia.
Poiché i composti (II), (III) e (IV) sono nuovi, anche essi costituiscono parte dell'invenzione.
L'invenzione oltre che sull'intermedio (IV) si basa sull'uso del mutante, Streptomyces erythreus ATCC 31772, di tipo bloccato, ottenuto per mutagenesi con metodi chimici (ossia con agenti mutageni chimici), con irradiazioni con raggi U.V. oppure raggi X, mediante azione di fagi e simili. Streptomyces erythreus ATCC 31772 è stato depositato il 4. dicembre 1980 dal American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 (USA).
La coltura dello Streptomyces erythreus ATCC 31772, usando il composto (IV) come substrato porta alla produzione dei nuovi antibiotici macrolidici della classe delle eritromicine (8S)-8-fluorurate (Schema II: P-80202, P-80203, P-80205 e P-80206), aventi rispettivamente Rsl di 0,9, 1,13, 0,89 e 1,12 rispetto aH'eritromicina A e di 0,85, 1,06, 0,87 e 1,04 rispetto al-l'eritromicina B, detti antibiotici avendo inoltre colorazioni specifiche se trattati con reagenti cromatici e riscaldati, ossia il primo avendo colorazione mattone (a caldo), il secondo ed il quarto colorazione viola scuro (dopo raffreddamento), ed il terzo colorazione marrone scuro (a caldo).
Schema II:
ch ch oh ch ho'-
CH
ch
CH
oh ch
R = CH3(8S)-8-fluoroeritromicina B (P-80203) R = H (8S)-8-fluoroeritromicina D (P-80202)
CH.
ch
.ch ch ch ch ch
R = CH3(8S)-8-fluoroeritromicina A (P-80206) R = H (8S)-8-fluoroeritromicina C (P-80205).
Forma inoltre oggetto dell'invenzione un procedimento microbiologico per la preparazione di nuovi antibiotici macrolidici della classe delle eritromicine che si caratterizza per il fatto che un composto (IV) viene utilizzato come substrato per la fermentazione con Streptomyces antibioticus ATCC 31771 che dà origine rispettivamente all'antibiotico 3-0-oleandrosil-5-0--desosaminil-(8S)-8-fluoroeritronilide A (Schema III: P-80207) avente un Rs) di 0,87 rispetto all'oleandomicina e di 0,80 rispetto aH'eritromicina A, quando il substrato (IV) è (8S)-8-fluoro-eritronolide A, ed all'antibiotico 3-0-oleandrosiI-5-0-desosami-nil-(8S)-8-fluoroeritronolide B (schema III: P-80204), avente RS1 di 0,82 rispetto aH'eritromicina B e di 0,90 rispetto all'oleandomicina, quando il substrato (IV) è (8S)-8-fluoroeritronolide B.
Schema III:
CH
ch ch ch oh ch och
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
658 250
6
3-0-oleandrosil-5-0-desosaminil-(8S)-8-fluoroeritronolide A (P-80207)
3-0-oleandrosil-5-0-desosaminil-(8S)-8-fluoroeritronolide B (P-80204).
La coltivazione dei microorganismi Streotpmyces erythreus ATCC 31772 e Streptomyces antibioticus ATCC 31771 usando i composti (IV) come substrato per produrre gli antibiotici desiderati può essere condotta in conformità a varie tecniche di fermentazione.
Dopo completamento della fermentazione, si possono utilizzare svariate procedure per l'isolamento e la purificazione degli antibiotici.
Tra le procedure consigliabili per l'isolamento e la purificazione rientrano le tecniche di estrazione con solvente, sia in forma discontinua che in colonne di estrazione liquido-liquido in controcorrente, e la cromatografia a permeazione di gel.
Secondo una procedura preferita, gli antibiotici prodotti in conformità alla presente invenzione vengono ricuperati dal mezzo di coltura mediante separazione del micelio e di tutto il solido non disciolto dal brodo di fermentazione con mezzi convenzionali quali filtrazione o centrifugazione. Gli antibiotici vengono quindi estratti dal brodo filtrato e centrifugato usando tecniche di estrazione con distribuzione in controcorrente oppure con lavorazione a lotti. L'estrazione con solvente può essere effettuata usando un intervallo di pH compreso tra 8 e 10 ed impiegando come solvente un solvente organico inerte. Solventi adatti includono alcool, come metanolo, etanolo e simili, idrocarburi clorurati quali cloroformio, cloruro di metilene e simili, etil acetato, butil acetato, amil acetato, acetone, metil isobutil-chetone e acetonitrile, il metil isobutilchetone essendo preferito.
La purificazione finale degli antibiotici anzidetti può essere realizzata mediante cromatografia su gel permeabili.
Dopo filtrazione o centrifugazione del mezzo di fermentazione, è possibile impiegare cromatografia su strato sottile oppure cromatografia in fase liquida ad alta pressione per individuare mediante analisi gli antibiotici in questione.
In aggiunta è anche possibile utilizzare vantaggiosamente la tecnica della bioautografia.
Gli esempi che seguono illustrano l'invenzione senza costituire una indebita limitazione.
Esempio 1
Ottenimento del mutante Streptomyces erythreus ATCC 31772
Una sospensione di spore di Streptomyces erythreus produttore di eritromicina è stata sottoposta a trattamento mutageno con raggi ultravioletti (massimo di emissione 250 nm) ad una dose tale da uccidere circa il 99,6% delle spore (circa 3000 erg/cmq).
Le spore sopravissute sono state piastrate su un terreno nutritivo e le colonie risultanti sono state analizzate per la loro incapacità di produrre eritromicina utilizzando la tecnica descritta da A. Keiner (1949) J. Bact. 57, 73.
I mutanti bloccati nella sintesi dell'eritromicina (circa il 2% dei sopravvissuti) sono stati quindi analizzati per la loro capacità di riconoscere e trasformare il composto (IV) come substrato in nuovi composti ad attività antibiotica.
Esempio 2
Preparazione di 8,9-anidroeritronolide A 6,9-emiacetale (II)
Una soluzione di 4,185 g (0,01 moli) di eritronolide A (I), descritto da R.A. Le Mahieu et al. nel J. Med. Chem. 17, 953 (1974), in 32 mi di acido acetico glaciale viene lasciata a riposo per due ore a temperatura ambiente. L'acido acetico viene poi rimosso sotto vuoto alla temperatura di 40° C e il residuo oleoso disciolto in 150 mi di cloroformio. La soluzione cloroformi-ca viene lavata con soluzione satura di sodio bicarbonato e poi con acqua fino a neutralità ed in ultimo essiccata su Na2SOj.
Dopo rimozione del solvente sotto vuoto si è ottenuto un grezzo che è stato purificato su colonna di gel di silice, preparata in cloruro di metilene-metanolo (1:1). L'eluizione con cloruro di metilene-metanolo (98:2) ha permesso di ottenere frazioni contenenti solamente 1'8,9-anidroeritronolide A 6,9-emiacetale (II). Per evaporazione a secchezza di tali frazioni riunite e per successiva cristallizzazione da acetone n-esano si sono ottenuti 2,750 g del composto II con le seguenti caratteristiche:
p.f. 188-193°C
[a]D° + 20,5° (C = 1 in metanolo)
UV(MeOH) 210 nm (s 6720)
IR (KBr) 3630; 3520; 3495; 3400; 1710; 1465; 1450; 1440; 1415; 1400; 1370; 1350; 1310; 1285; 1230; 1200; 1170; 1140; 1090; 1075; 1060; 1050; 1035; 1020; 1010; 1000; 970; 950; 940; 920; 915; 905; 890; 870; 825; 810; 800 cm1.
L'analisi per C21H36O7 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 62,97; H 9,06 trovato (percento) C 63,12; H 9,10
Esempio 3
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritronoIide A 6,9;9,11--acetale (III) e (8S)-8-fluoroeritronolide A (IVda 8,9-anidroeritronolide A 6,9-emiaceale (II).
È stata preparata una soluzione di fluorossi trifluorometano in CCI3F a —80°C: un eccesso di CF3OF (solamente di circa 2 volte) è stato disciolto in CCI3F (preventivamente raffreddato a —80°C su ghiaccio secco) mediante aggiunta lenta del gas attraverso un tubo di spurgo (mentre il cilindro contenente CF3OF veniva continuamente pesato su una bilancia elettrica Sartorius).
La sua concentrazione è stata determinata mediante titolazione iodometrica.
La soluzione di CF3OF/CCI3F a —80°C oppure a —85°C è stata lentamente aggiunta ad una soluzione contenente 4 g (0,010 moli) di 8,9-anidroeritronolide A 6,9-emiacetale in CCI3F/CH2CI2 (295 ml/370 ml) a circa —80°C, sottoposta ad agitazione magnetica con ossido di calcio (1,920 g) per allontanare l'acido fluoridrico. L'andamento della reazione è stato periodicamente controllato mediante cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC), in relazione alla scomparsa del picco caratteristico del composto II.
Dopo scomparsa (oppure minimizzazione) del picco del composto II, l'agitazione è stata continuata per 5 minuti ed azoto gassoso è stato fatto gorgogliare attraverso la soluzione per allontanare l'eccesso di CF3OF a —80°C e la soluzione è stata lasciata riscaldare fino a temperatura ambiente.
La soluzione è stata lavata con una soluzione satura di NaHCC>3 (650 mi), e quindi lavata fino a neutralità con acqua ed in ultimo essiccata su Na2SC>4.
Dalla rimozione del solvente si è ottenuto un residuo solido che è stato poi purificato per cromatografia su colonna di gel di silice (rapporto 1:50) preparata in cloruro di metilene-metanolo (1:1). L'eluizione con concentrazioni crescenti di metanolo in
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
fiO
65
7
658 250
cloruro di metilene ha dato frazioni che contenevano soltanto (8S)-8-fluoroeritronolide A-6,9; 9,11-acetale (III) e frazioni che contenevano soltanto (8S)-8-fluoroeritronolide A (IV). Dopo evaporazione a secchezza delle frazioni contenenti il composto III e loro cristallizzazione da acetone/n-esano si sono ottenuti 3,435 g con le seguenti caratteristiche:
p.f. 192-3°C
[a]o +64,7° (C = 1 in metanolo)
UV (metanolo): nessun assorbimento corrispondente ad un gruppo chetonico
IR (KBr) 3560; 3420; 1720; 1460; 1395; 1380; 1355; 1345; 1330; 1320; 1305; 1290; 1270; 1255; 1240; 1215; 1180 (larga); 1095; 1070; 1045; 1025; 1020; 990; 980; 970; 955; 940; 930; 920; 910; 905; 895; 855; 840; 830; 805 cm1.
L'analisi per C21H35FO7 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 60,27; H 8,43; F 4,54 trovato (percento) C 60,22; H 8,51; F 4,69
Dopo evaporazione a secchezza delle frazioni contenenti il composto IV e cristallizzazione da acetone/n-esano si sono ottenuti 145 mg con le seguenti caratteristiche:
p.f. 239-40°C
[alo —3,1° (C = 1 in metanolo)
UV (metanolo) 287-8 nm (e 25,3)
IR (KBr) 3610; 3550; 3480 (spalla); 3380 (spalla); 1735; 1700; 1460; 1405; 1390; 1380; 1350; 1325; 1300; 1290; 1270; 1175; 1105; 1090; 1050; 1035; 1020; 980; 960; 940; 920; 905; 895; 875; 860 cm1.
L'analisi per C21H37FO8 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 57,78 H 8,54 F 4,35 trovato (percento) C 57,87 H 8,63 F 4,19
Esempio 4
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritronolide B-6,9; 9,11-acetale (III) e (8S)-8-fluoroeritronolide B (IV) da 8,9-anidroeritronolide B-6,9 emiacetale (II)
Procedendo analogamente all'esempio 3, ma a partire da una soluzione contenente 3,845 g (0,010 moli) di 8,9-anidro-eritronolide B 6,9-emiacetale (II), (descritto nel brevetto USA No. 3 697 547), si è ottenuto un prodotto grezzo che mediante cristallizzazione da acetone-esano dava 3,450 g di (8S)-8-fluoro-eritronolide B-6,9; 9,11-acetale (III) avente le seguenti caratteristiche:
p.f. 191-2°C;
[a]o +42,6° (C 1,0 in metanolo);
UV (metanolo); nessun assorbimento corrispondente ad un gruppo chetonico;
IR (KBr) 3540; 3450; 1735; 1460; 1260; 1170; 1060; 1035; 980; 925; 875; 450 cnr1.
L'analisi per C21H35FO6 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 62,67; H 8,76; F 4,72 trovato (percento) C 62,63; H 8,82; F 4,81
Quando le acque madri sono state purificate mediante cromatografia su colonna di gel di silice (rapporto 1:50) con cloruro di metilene-metanolo (98:2) come eluente, sono stati ottenuti mg 75 di un secondo prodotto, (8S)-8-fluoroeritronolide B (IV), aventi le seguenti caratteristiche:
p.f. 247-8°C
UV (metanolo) 286 nm (s 26)
[a]n —30° (C = 1 in metanolo)
IR (KBr) 3540; 1727; 1703; 1460; 1330; 1270; 1175; 1130; 1075; 1050; 1015; 940; 920; 895; 860 cnr1.
L'analisi per C21H37FO7 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 59,98; H 8,87; F 4,52 trovato (percento) C 59,92; H 9,00; F 4,59
Esempio 5
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritronolide B (IV) da (8S)-8-fluoroeritronolide B-6,9; 9,11-acetale (III).
Una miscela formata da 4,830 g (0,012 moli) di (8S)-8--fluoroeritronolide B-6,9; 9,11-acetale (III) e 3000 mi di una soluzione acquosa (pH = 3) di acido acetico è stata portata a ricadere a 110°C per 15 minuti sotto agitazione e quindi sono stati aggiunti 220 mi di acido acetico. Dopo un'ora a 110°C tutto il materiale di partenza era disciolto. II riscaldamento è stato continuato per mezz'ora e la soluzione è stata quindi raffreddata quanto più rapidamente possibile a temperatura ambiente, resa neutra con NaHCOj ed estratta con etil acetato.
La soluzione di etil acetato dopo anidrificazione su solfato di sodio è stata evaporata a secchezza sotto vuoto.
Quando il prodotto grezzo è stato purificato mediante cromatografia in colonna di gel silice (rapporto 1:50) con cloruro di metilene-metanolo (95:5) come eluente, sono stati ottenuti 1,8 g di un prodotto con caratteristiche chimico-fisiche uguali al prodotto (IV) isolato nell'esempio 4.
Esempio 6
Preparazione di 3-0-micarosil-8,9-anidroeritronolide B 6,9-emiacetale (II)
Una soluzione di 5,465 g (0,010 moli) di 3-O-micarosil-eritronolide B (I), descritto da J.R. Martin in Biochemistry, 5, 2852 (1966), in 32 mi di acido acetico glaciale viene lasciata a riposo per due ore a temperatura ambiente.
L'acido acetico viene poi rimosso sotto vuoto alla temperatura di 40°C e il residuo oleoso disciolto in 150 mi di cloroformio. La soluzione cloroformica viene lavata con soluzione satura di sodio bicarbonato e poi con acqua fino a neutralità ed in ultimo essiccata su NaaSO.).
Dopo rimozione del solvente sotto vuoto si è ottenuto un grezzo che è stato purificato su colonna di gel di silice (rapporto 1:100), preparata in cloroformio. L'eluizione con concentrazioni crescenti di metanolo in cloroformio ha permesso di ottenere frazioni contenenti solamente 3-0-micarosil-8,9-anidro-eritronolide B 6,9-emiacetale (II).
Per evaporazione a secchezza di tali frazioni riuniti e per successiva cristallizzazione da acetone/n-esano si sono ottenuti g 1,160 del composto II con le seguenti caratteristiche:
p.f. 85-88°C
Md —5° (C = 1 in metanolo)
UV (MeOH) 210 nm (s 6850)
IR (KBr) 3500; 1730; 1465; 1415; 1380; 1340; 1185; 1120; 1085; 1055; 1005; 985; 945; 895; 810 cm1.
L'analisi per C28H48O9 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 63,61; H 9,15 trovato (percento) C 63,52; H 9,09
Esempio 7
Preparazione di 3-0-micarosil-(8S)-8-fluoroeritronolide B-6,9; 9,11-acetale (III) e 3-0-micarosiI-(8S)-8-fluoroeritro-nolide B (IV) da 3-0-micarosil-8,9-anidroeritronolide B-6,9 emiacetale (lì).
È stata preparata una soluzione di fluorossi trifluorometano in CCI3F a —80°C: un eccesso di CF3OF (solitamente di circa 2 volte) è stato disciolto in CCI3F (preventivamente raffreddato a —80°C su ghiaccio secco) mediante aggiunta lenta del gas attraverso un tubo di spurgo (mentre il cilindro contenente CF3OF veniva continuamente pesato su una bilancia elettrica Sartorius).
La sua concentrazione è stata determinata mediante titolazione iodometrica.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
fiO
65
658 250
La soluzione di CF3OF/CCI3F a —80°C oppure a —85°C è stata lentamente aggiunta ad una soluzione contenente 5,285 g (0,010 moli) di 3-0-micarosil-8,9-anidroeritronolide B 6,9-emiacetale (II) in CCI3F/CH2CI2 (295 ml/370 ml) a circa —80°C, sottoposta ad agitazione magnetica con ossido di calcio (g 1,920) per allontanare l'acido fluoridrico.
L'andamento della relazione è stato periodicamente controllato mediante cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC), in relazione alla scomparsa del picco caratteristico del composto II.
Dopo scomparso (oppure minimizzazione) del picco relativo al composto II l'agitazione è stata continuata per 5 minuti ed azoto gassoso è stato fatto gorgogliare attraverso la soluzione per allontanare l'eccesso di CF3OF a —80°C e la soluzione è stata lasciata riscaldare fino a temperatura ambiente.
La soluzione è stata lavata con una soluzione satura di NaHC03 (650 mi), e quindi lavata fino a neutralità con acqua ed in ultimo essiccata su Na2S04.
Dalla rimozione del solvente si è ottenuto un residuo solido che è stato poi purificato per cromatografia su colonna di gel di silice (rapporto 1:100) preparata in cloroformio.
L'eluizione con concentrazioni crescenti di metanolo in cloroformio hanno dato frazioni che contenevano soltanto 3-0-micarosil-(8S)-8-fluoroeritronolide B-6,9; 9,11-acetale (III) e frazioni che contenevano soltanto 3-0-micarosiI-(8S)-8-fIuoro-eritronolide B (IV).
Dopo evaporazione a secchezza delle frazioni contenenti il composto III e loro cristallizzazione da acetone si sono ottenuti 1,100 g con le seguenti caratteristiche:
p.f. 175-7°C
[a]t? —9,8° (C = 1 in metanolo)
UV (metanolo): nessun assorbimento corrispondente ad un gruppo chetonico
IR (KBr) 3540; 3490; 1720; 1460; 1395; 1380; 1365; 1355; 1330; 1320; 1290; 1275; 1265; 1245; 1205; 1185; 1165; 1145; 1120; 1100; 1080; 1060; 1045; 1015; 1005; 990; 960; 940; 925; 915; 900; 880; 865; 840; 815 cm1.
L'analisi per C28H47FO9 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 61,52; H 8,67; F 3,47 trovato (percento) C 61,46; H 8,51; F 3,48
Dopo evaporazione a secchezza delle frazioni contenenti il composto IV e cristallizzazione da acetone/n-esano si sono ottenuti 290 mg con le seguenti caratteristiche:
p.f. 214-5°C
[<x]d —73,2° (C = 1 in metanolo)
UV (metanolo) 287 nm (s 25,3)
IR (KBr) 3570; 3550; 3530; 3460 (spalla); 1745; 1735; 1465; 1380; 1365; 1340; 1300; 1275; 1250; 1180; 1115; 1080; 1055; 1010; 1000 (spalla); 985, 945; 935; 920; 895; 855; 840; 810 cm1.
L'analisi per C28H49FO10 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 59,55; H 8,75; F 3,37 trovato (percento) C 59,68; H 8,60; F 3,48
Esempio 8
Preparazione di 3-0-micarosil-(8S)-8-fluoroeritronolide B (IV) da 3-0-micarosil-(8S)-8-fluoroeritronoIide B-6,9;
9,11-acetale (III)
Una miscela formata da 6,560 g (0,012 moli) di 3,0-micaro-sil-(8S)-8-fluoroeritronolide B-6,9; 9,11-acetale (III) e 3000 mi di una soluzione acquosa (pH = 3) di acido acetico è stata tenuta a temperatura ambiente sotto agitazione fino a completa soluzione e quindi sono stati aggiunti 220 mi di acido acetico.
La soluzione è stata lasciata sotto agitazione a temperatura ambiente fino a completa scomparsa del prodotto di partenza
(III) (il controllo è stato eseguito mediante cromatografia in fase liquida ad alta pressione), resa neutra con NaHCC>3 ed estratta con etilacetato.
La soluzione di etil acetato dopo anidrificazione sul solfato di sodio è stata evaporata a secchezza sotto vuoto.
Quando il prodotto grezzo è stato purificato mediante cromatografia in colonna di gel di silice (rapporto 1:50) con cloruro di metilene-metanolo (95:5) come eluente, è stato ottenuto un prodotto con caratteristiche chimico-fisiche uguali al prodotto IV isolato nell'esempio 7.
Esempio 9
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritrononolide A (IV) da (8S)-8-fluoroeritronolide A-6,9; 9,11-acetale (III).
Una miscela formata da 5,020 g (0,012 moli) di (8S)-8--fluoroeritronolide A-6,9; 9,11-acetale (III) e 3000 mi di una soluzione acquosa (pH = 3) di acido acetico è stata portata a ricadere a 110°C per 15 minuti sotto agitazione e quindi sono stati aggiunti 220 mi di acido acetico.
Dopo un'ora a 110°C tutto il materiale di partenza era disciolto.
Il riscaldamento è stato continuato per mezz'ora e la soluzione è stata quindi raffreddata quanto più rapidamente possibile a temperatura ambiente, resa neutra con NaHCC>3 ed estratta con etil acetato.
La soluzione di etil acetato dopo anidrificazione su solfato di sodio è stata evaporata a secchezza sotto vuoto.
Il solido grezzo è stato poi purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice (rapporto 1:50) preparata in cloruro di metilene.
L'eluizione con concentrazioni crescenti di metanolo in cloruro di metilene ha dato frazioni che contenevano ancora il prodotto di partenza (8S)-8-fluoroeritronolide A-6,9; 9,11-acetale (III) e frazioni che contenevano solamente (8S)-8-fluoro-eritronolide A (IV).
Ripetendo la reazione sul prodotto di partenza ricuperato e la successiva purificazione cromatografica è stato possibile ottenere altre frazioni contenenti (8S)-8-fluoroeritronolide A (IV). Per evaporazione a secchezza di tutte le frazioni riunite e per successiva cristallizzazione del solido ottenuto si sono ottenuti 0,725 g di (8S)-8-fluoroeritronolide A (IV) con le stesse caratteristiche riportate nell'esempio 3.
Esempio 10
Preparazione degli antibiotici (8S)-8-fluoroeritromicina C (P-80206) e (8S)-8-fluoroeritromicina A (P-80205)
Una coltura inseminata di Streptomyces erythreus ATCC 31772, un mutante bloccato nella biosintesi delPeritromicina, è stata preparata in un mezzo costituito da (in grammi per litro) saccarosio 30,0; melasso di canna 8,0, olio di semi di soia 9,0; (NH4)2S042,0; CaC037,0.
La coltura è stata incubata a 33°C per 48 ore su shaker rotativo. L'inoculo è stato aggiunto ad un livello del 5% (V/V) in beute di Erlenmeyer da 250 mi contenenti 30 mi di un mezzo di fermentazione avente la seguente composizione in grammi per litro; destrina di mais 3,0; amido di mais grezzo 40,0; farina di semi di soia 30,0; olio di semi di soia 20,0; (NH^SCW.O; CaC036,0.
Le beute di fermentazione sono state incubate a 33 °C su shaker rotante (220 rpm, corsa di 4 cm) per 24 ore. A ciascuna beuta sono stati aggiunti 15 mg di (8S)-8-fluoroeritronolide A (III) in forma finemente suddivisa sterilizzato sotto luce ultravioletta per 15 minuti, e l'incubazione con sbattimento è stata continuata per 96 ore.
8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
9
658 250
Trattamento dei campioni in cromatografia su strato sottile e per cromatografia in fase liquida ad alta pressione (HPLC):
alla fine del periodo di fermentazione un campione del brodo di fermentazione avente un'attività di circa 900-1000 mcg/ml (titolo espresso come eritromicina A) è stato centrifugato ed il liquido sovranatante è stato chiarificato mediante aggiunta di volumi uguali di una soluzione acquosa al 10% (P/V) di ZnSC>4 e una soluzione acquosa al 4% (P/V) di idrossido di sodio. Dopo centrifugazione il liquido sovranatante limpido è stato estratto mediante agitazione vorticosa con un terzo del suo volume di etil acetato.
CONTROLLO TLC
Un campione della parte organica è stato depositato su una piastra di gel di silice G e sviluppata in CH2Cl2-Met0H-H20--NH4OH concentrato (90:9,5:0,5:1) per due ore; le macchie sono state localizzate con reagente a spruzzo di metanolo-anisaldeide-acido solforico concentrato-acido acetico, (85:0,5:5:10) ed i composti attivi sono stati rilevati mediante bioautografia su piastre inoculate con Micrococcus luteus (Sartina lutea) ATCC 9341.
I risultati della TLC hanno mostrato la scomparsa di (8S)-8--fluoroeritronolide A (IV) aggiunto e la scomparsa dei due composti attivi il cui valore di Rst rispetto alla eritromicina A sono rispettivamente di 0,89 e 1,12 (0,87 ed 1,04 rispetto aH'eritromicina B). Inoltre essi presentano reazioni cromatiche differenti dopo applicazione di un reagente a spruzzo e riscaldamento: colore marrone scuro (a caldo) per il composto più lento (antibiotico P-80205) e colore viola scuro (dopo raffreddamento) per l'altro composto (antibiotico P-80206).
CONTROLLO HPLC
Un campione della fase organica viene evaporato a secchezza ripreso con acetonitrile e iniettato in colonna (RP8 10 jim 25 cm; fase mobile tampone fosfato 0,01 M pH 7/acetonitrile 36:64; flusso 2 ml/min; temperatura colonna 40°C). Si evidenziano due picchi con tempo di ritenzione relativo aH'eritromicina A di 0,68 (P-80205) e di 0,87 (P-80206).
Esempio 11
Purificazione degli antibiotici (8S)-8-fluoroeritromicina C (P-80205) e (8S)-8-fluoroeritromicina A (P-80206)
Secondo il procedimento descritto nell'esempio 10 precedente, diverse fermentazioni per un volume totale di 2100 ml a cui erano stati aggiunti 1,00 g di (8S)-8-fluoroeritronilide A sono state filtrate sottovuoto dopo aggiunta sotto agitazione di Hy-flo Supercell (4% peso/volume). Il solido è stato lavato con acqua e i filtrati combinati sono stati regolati a pH 5,5 con acido acetico. La soluzione acquosa acida è stata estratta tre volte con un uguale volume di etil acetato. La fase acquosa è stata neutralizzata con NH4OH 2N ed evaporata sotto pressione ridotta fino ad un volume di 1000 mi; regolata a pH 8,8 con NH4OH 2N ed estratta con un volume uguale di metil isobutil-chetone. Questi ultimi estratti organici sono stati riuniti e lavati due volte con metà volume di KH2PO4 0,1 M e quindi ancora una volta con acqua.
Dopo essiccamento (Na2S04) ed allontanamento del solvente sottovuoto, il residuo è stato purificato mediante cromatografia di ripartizione in colonna su gel di silice seguendo il procedimento indicato da N.L. Oleinick in J. Biol. Chem. voi. 244, n. 3 pag. 727 (1969).
Le frazioni 90-174 contenenti soltanto l'antibiotico P-80206 sono state riunite ed evaporate a secchezza a 40°C. Il residuo solido per cristallizzazione da etanolo assoluto ha dato mg 230 di (8S)-8-fluoroeritromicina A (P-80206) aventi le seguenti caratteristiche:
p.f. 183-4°C
[ci]d —55° (c = 1 in metanolo)
UV (metanolo): 283 nm (s 17,9)
IR (KBr) 3520; 3480 (spalla); 3250 (larga); 1735; 1720; 1460; 5 1425; 1400; 1380; 1345; 1330; 1305; 1280; 1190; 1170; 1120; 1090; 1075; 1055; 1030; 1015; 1005; 980; 960 (spalla); 935, 890; 870; 855; 835; 800 cm"1 (questo spettro è riportato nella fig. 1).
L'analisi per C37H66FNO13 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 59,10; H 8,85; N 1,86 10 trovato (percento) C 59,09; H 8,89; N 1,88
Le frazioni 280-400 contenenti soltanto l'antibiotico P-80205 sono state riunite ed evaporate a secchezza a 40°C sottovuoto. Il residuo solido per cristallizzazione da etanolo assois luto ha dato mg 145 di (8S)-8-fluoroeritromicina C (P-80205) aventi le seguenti caratteristiche:
p.f. 217-8°C
[oc]d —42,35° (C = 1 in metanolo)
UV (metanolo): 284 nm (e 23,2)
20 IR (KBr) 3550; 3500; 3440 (spalla); 3300 (larga); 1730; 1455; 1425; 1410; 1380; 1360; 1340; 1330; 1305; 1280; 1270; 1245; 1200 (spalla); 1170 (larga); 1115; 1090; 1075; 1060; 1030; 1010; 1000; 980 (spalla); 965; 955; 945; 935; 920; 905; 895;
870; 840; 830; 810 cm"1 (lo spettro relativo è rappresentato in 25 fig. 2).
L'analisi per C3f,H6(FNOi3 ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 58,60; H 8,74; F 2,57; N 1,90 trovato (percento) C 58,47; H 8,87; F 2,60; N 1,82
30
Esempio 12
Preparazione dell'antibiotico 3-0-oleandrosil-5-0-desosaminil--(8S)-8-fluoroeritronoIide A (P-80207)
35 Una coltura pre-inoculata di S. antibioticus ATCC 31771, mutante bloccato nella biosintesi dell'oleandomicina, è stata preparata in un mezzo costituito (in grammi per litro di acqua deionizzata) da farina di semi di soia 30,0; cerelose 15,0; auto-silato di lievito 1,0; olio di semi di soia 30,0; MgSÛ4 • 7H20 40 1,0 e CaCÛ3 10,0; il pH del mezzo veniva regolato a 7,2 prima della sterilizzazione.
Dopo 24 ore a 28°C su shaker rotante, questa coltura è stata utilizzata per inoculare lo stesso mezzo ad una concentrazione del 2% (V/V) ed è stata ulteriormente incubata nelle stesse 45 condizioni per 16 ore.
Questo inoculo è stato addizionato alla concentrazione del 3% (V/V) in beute di Erlenmeyer da 250 mi contenenti 30 mi di un mezzo di fermentazione avente la seguente composizione (in grammi per litro):
50 cerelose 40,0; farina di semi di soia 20,0; farina di mais 3,0; lievito di birra secco 2,0; Ca.CC>} 20,0.
Le beute per la fermentazione sono state incubate a 28° C su shaker rotante (240 rpm, corse di 4 cm) per 32 ore; 15 mg di (8S)-8-fluoroeritronolide A (IV) in forma finemente suddivisa 55 sono stati aggiunti a ciascuna beuta e la incubazione con agitazione è stata continuata per 64 ore.
Alla fine di questo periodo, il titolo della coltura espresso come eritromicina A è di 100-120 mcg/ml. Il trattamento del brodo di fermentazione per l'analisi TLC è stato effettuato con 60 il sistema e le condizioni indicate nell'esempio 10.
CONTROLLO TLC
In conformità alla tecnica indicata nell'esempio 10 viene ri-65 velato un nuovo composto attivo (antibiotico P-80207) che segna la scomparsa del substrato aggiunto. Il suo Rf rispetto al-l'eritromicina A è di 0,80 ed è di 0,87 rispetto all'oleandromi-cina.
658 250
10
CONTROLLO HPLC
In conformità alla tecnica indicata nell'esempio 10 il nuovo composto attivo (antibiotico P-80207) presenta un tempo di ritenzione relativo aH'eritromicina A di 0,69 e relativo all'olean-domicina di 0,95.
Esempio 13
Purificazione dell'antibiotico 3-0-oleandrosil-5-0-desosaminil--(8S)-8-fluoroeritronolide A (P-80207).
Da 50 fermentazioni effettuate in beute di Erlenmeyer, agitate e condotte come descritto nel precedente esempio 12, la brodocoltura totale derivante è stata trattata con un volume uguale di metanolo. Dopo l'aggiunta della Hyflo Supercell in 30 min sotto agitazione la miscela è stata filtrata. II solido è stato lavato con acqua-metanolo (1:1) ed i filtrati combinati sono stati evaporati sotto pressione ridotta fino a metà del volume di partenza.
Il pH della soluzione è stato regolato ad 8,2 mediante aggiunta di KOH e la soluzione è stata estratta tre volte con quantità pari ad un terzo del volume di metilisobutilchetone. Gli estratti con solvente organico combinati sono stati lavati con Na2HPÛ4 0,1 M quindi con acqua.
La soluzione organica dopo anidrificazione su Na2S04 è stata evaporata a secchezza sotto vuoto. Il residuo è stato purificato mediante cromatografia di ripartizione su colonna di gel di silice seguendo il procedimento indicato nell'esempio 11.
Le frazioni 45-80 contenenti solamente l'antibiotico P-80207 sono state riunite e portate a secco sottovuoto a 40°C. II residuo solido è stato cristallizzato da etanolo assoluto per ottenere 130 mg di 3-0-oleandrosil-5-0-desosaminil-(8S)-8-fluoroeritro-nolide A (P-80207) con le seguenti caratteristiche:
p.f. 155-7°C
[<x]d —40,2° (C = 1 in metanolo)
UV (metanolo): 283 nm (e 20,3)
IR (KBr) 3480 (larga); 1730; 1510; 1380; 1340 (larga); 1305; 1275; 1195; 1165; 1105; 1095; 1075; 1050; 1030; 1010; 1000; 980; 960 (spalla); 935; 915; 895; 875; 830 (questo spettro è riportato nella fig. 3).
L'analisi per C36H64FNO13 ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 58,60; H 8,74; F 2,57; N 1,90 trovato (percento) C 58,52; H 8,75; F 2,63; N 1,95
Esempio 14
Preparazione degli antibiotici (8S)-8-fluoroeritromicina D (P-80202) e (8S)-8-fluoroeritromicina B (P-80203)
Una coltura inseminata di Streptomyces erythreus ATCC 31772, un mutante bloccato nella biosintesi delPeritromicina, è stata preparata in un mezzo costituito da (in grammi per litro) saccarosio 30,0; melasso di canna 8,0; olio di semi di soia 9,0; (NH4)2S04 2,0; CaC03 7,0.
La coltura è stata incubata a 33 °C per 48 ore su shaker rotativo. L'inoculo è stato aggiunto ad un livello del 5% (V/V) in beute di Erlenmeyer da 250 mi contenenti 30 mi di un mezzo di fermentazione avente la seguente composizione in grammi per litro; destrina di mais 30,0; amido di mais grezzo 40,0; farina di semi di soia 30,0; olio di semi di soia 20,0; (NH4)2S04 2,0; CaC03 6,0.
Le beute di fermentazione sono state incubate a 33 °C su shaker rotante (220 rpm, corsa di 4 cm) per 24 ore.
A ciascuna beuta sono stati aggiunti 15 mg di (8S)-8-fluoro-eritronolide B (IV) in forma finemente suddivisa sterilizzato sotto luce ultravioletta per 15 minuti, e l'incubazione con sbattimento è stata continuata per 96 ore.
Trattamento dei campioni per cromatografia su strato sottile (TLC) e per cromatografia in fase liquida ad alta pressione
(HPLC); alla fine del periodo di fermentazione un campione del brodo di fermentazione avente un'attività di circa 900-1000 mcg/ml (titolo espresso come eritromicina A) è stato centrifugato ed il liquido sovranatante è stato chiarificato mediante aggiunta di volumi uguali di una soluzione acquosa al 10% (P/V) di ZnS04 e di una soluzione acquosa al 4% (P/V) di idrossido di sodio. Dopo centrifugazione il liquido sovranatante limpido è stato estratto mediante agitazione vorticosa con un terzo del suo volume di etil acetato.
CONTROLLO TLC
Un campione della parte organica è stato depositato su una piastra di gel di silice G e sviluppato in CH2Cl2-Met0H-H20--NH4OH concentrato (90:9,5:0,5:1) per 2 ore; le macchie sono state localizzate con reagente a spruzzo di metanolo-anisal-deide-acido solforico concentrato acido acetico (85:0,5:5:10) ed i composti attivi sono stati rivelati mediante bioautografia su piastre inoculate con Micrococcus luteus (Sarcina lutea) ATCC 9341.
I risultati della TLC hanno mostrato la scomparsa dell'(8S) -8-fhioroeritronoiIde B (IV) aggiunto e la comparsa dei due composti attivi il cui valore di Rst rispetto alla eritromicina A sono rispettivamente di 0,9 e 1,13 (0,85 e 1,06 rispetto aH'eritromicina B).
Inoltre essi presentano reazioni cromatiche differenti dopo applicazione di un reagente a spruzzo e riscaldati: colore marrone scuro (a caldo) per il composto più lento (antibiotico P-80202) e colore viola scuro (dopo raffreddamento) per l'altro composto (antibiotico P-80203).
CONTROLLO HPLC
Un campione della parte organica viene evaporato a secchezza, ripreso con acetonitrile e iniettato in colonna (RP8 10 jim 25 cm; fase mobile tampone fosfato 0,01 M pH 7/aceto-nitrile 36:64; flusso 2 ml/min; temperatura colonna 40°C). Si evidenziano due picchi con un tempo di ritenzione relativo al-l'eritromicina A di 0,79 (P-80202) e di 1,06 (P-80203).
Esempio 15
Purificazione degli antibiotici (8S)-8-fluoroeritromicina D (P-80202) e (8S)-8-fluoroeritromicina B (P-80203)
Secondo il procedimento descritto nell'esempio 14, precedente, diverse fermentazioni per un volume totale di mi 2100 a cui vi erano stati aggiunti 1,0 g di (8S)-8-fluoroeritronolide B sono state filtrate sottovuoto dopo aggiunta sotto agitazione di Hyflo Supercell (4% peso/volume). Il solido è stato lavato con acqua e i filtrati combinati sono stati regolati a pH 5,5 con acido acetico. La soluzione acquosa acida è stata estratta tre volte con un uguale volume di etil acetato. La fase acquosa è stata evaporata neutralizzata NH4OH 2N e sotto pressione ridotta fino ad un volume di 1000 mi, regolata a pH 8,8 con NH4OH 2N ed estratta con un volume uguale di metilisobutilchetone.
Questi ultimi estratti organici sono stati riuniti e lavati due volte con metà volume di KH2P04 0,1 M e quindi ancora una volta con acqua. Dopo essiccamento (Na2S04) ed allontanamento del solvente sottovuoto il residuo è stato purificato mediante cromatografia di ripartizione in colonna su gel di silice seguendo il procedimento indicato da N.L. Oleinick in J. Biol. Chem. Voi. 244, n. 3, pag. 727 (1969).
Le frazioni 18-32 contenenti solamente l'antibiotico P-80203 sono state riunite e portate a secco sottovuoto a 40°C. Il residuo solido per cristallizzazione da etanolo assoluto ha dato mg 150 di (8S)-8-fluoroeritromicina B (P-80203) aventi le seguenti caratteristiche:
p.f. 164-6°C
[<x]d —63° (C = 1 in metanolo)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
11
658 250
UV (metanolo) 285 nm (e 29,5)
IR (KBr) 3480 (larga); 1735; 1465; 1435; 1385; 1375; 1330; 1305; 1280; 1170; 1115; 1090; 1075; 1055; 1035; 1020; 1000; 975; 940; 890; 835; 805 cm"1 (fig. 4)
L'analisi per C37H66FNO12 ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 60,39; H 9,04; F 2,58; N 1,90 trovato (percento) C 60,31; H 9,09; F 2,60; N 1,88
Le frazioni 55-105 contenenti solamente l'antibiotico P-80202 sono state riunite e portate a secco sottovuoto a 40°C. Il residuo solido per cristallizzazione da etanolo assoluto ha dato mg 150 di (8S)-8-fluoroeritromicina D (P-80202) aventi le seguenti caratteristiche:
p.f. 213-15°C
[«]d —60° (C = 1 in metanolo)
UV (metanolo) 285 nm (e 30,8)
IR (KBr) 3600; 3520; 3300 (larga); 1730; 1460; 1420; 1385; 1370; 1355; 1345; 1330; 1310; 1275; 1190; 1160; 1120; 1100; 1060; 1040; 1030; 1010; 1000; 995; 975; 960; 935; 920; 910; 890; 875; 840; 825; 810 cm"1 (fig. 5)
L'analisi per C36H64FNO12 ha dato i seguenti valori: calcolato (percento') C 59,89; H 8,94; F 2,63; N 1,94 trovato (percento) C 59,87; H 8,85; F 2,63; N 1,88
Esempio 16
Preparazione dell'antibiotico 3-0-oleandrosil-5-0-desosaminil--(8S)-8-fluoroeritronolide B (P-80204)
Una coltura pre-inoculata di S. antibioticus ATCC 31771, mutante bloccato nella biosintesi dell'oleandomicina, è stata preparata in un mezzo costituito (in grammi per litro di acqua deionizzata) da farina di semi di soia, 30,0; cerelose 15,0; auto-lisato di lievito 1,0; olio di semi di soia 30,0; MgSC>4 • 7H2O 1,0; CaC03 10,0; il pH del mezzo veniva regolato a 7,2 prima della sterilizzazione.
Dopo 24 ore a 28°C su shaker rotante, questa coltura è stata utilizzata per inoculare lo stesso mezzo ad una concentrazione del 2% (V/V) ed è stata ulteriormente incubata nelle stesse condizioni per 16 ore.
Questo inoculo è stato addizionato alla concentrazione del 3% (V/V) in beute di Erlenmeyer da 250 mi contenenti 30 mi di un mezzo di fermentazione avente la seguente composizione (in grammi per litro):
cerelose 40,0; farina di semi di soia 20,0; farina di mais 3,0; lievito di birra secco 2,0 e CaCCb 20,0.
Le beute per la fermentazione sono state incubate a 28° C su shaker rotante (240 rpm, corsa di 4 cm) per 32 ore; 15 mg di (8S)-8-fluoroeritronolide B (III) in forma finemente suddivisa sono stati aggiunti a ciascuna beuta e la incubazione con agitazione è stata continuata per 64 ore.
Alla fine di questo periodo, il titolo della coltura espresso come eritromicina A è di 100-200 mcg/ml. Il trattamento del brodo di fermentazione per l'analisi TLC è stato effettuato con il sistema e le condizioni indicate nell'esempio 14.
CONTROLLO TLC
In conformità alla tecnica indicata nell'esempio 14 viene rivelato un nuovo composto attivo (antibiotico P-80204) che segue la scomparsa del substrato aggiunto. Il suo Rs, rispetto aH'eritromicina B è di 0,82 ed è di 0,90 rispetto all'oleandomi-cina.
CONTROLLO HPLC
In conformità alla tecnica indicata nell'esempio 14 il nuovo composto attivo (antibiotico P-80204) presenta un tempo di ritenzione relativo alla eritromicina B di 0,62 e relativo all'olean-domicina di 1,06.
Esempio 17
Purificazione dell'antibiotico 3-0-olendrosil-5-0-desosaminil--(8S)-8-fluoroeritronolide B (P-80204)
Da 50 fermentazioni effettuate in beute di Erlenmeyer, agitate e condotte come descritto nel precedente esempio 16, la brodocoltura totale derivante è stata trattata con un volume uguale di metanolo. Dopo l'aggiunta dello Hyflo Supercell in 30 min sotto agitazione la miscela è stata filtrata. Il solido è stato lavato con acqua-metanolo (1:1) ed i filtrati combinati sono stati evaporati sotto pressione ridotta fino a metà del volume di partenza.
Il pH della soluzione è stato regolato ad 8,2 mediante aggiunta di KOH e la soluzione è stata estratta tre volte con quantità pari ad un terzo del volume di metil isobutilchetone. Gli estratti con solvente organico combinati sono stati lavati con Na2HP04 0,1 M quindi con acqua. La soluzione organica dopo anidrificazione su Na2SÛ4 è stata evaporata a secchezza sottovuoto. Il residuo è stato purificato mediante cromatografia di ripartizione in colonna di gel di silice seguendo il procedimento indicato nell'esempio 15.
Le frazioni 17-42 contenenti soltanto l'antibiotico P-80204 sono state riunite e portate a secco sottovuoto a 40°C. Il residuo solido è stato ulteriormente purificato su una colonna (2 x 98 cm) di Sephadex LH-20 preparata in esano-cloroformio 1:1 ed eluita con lo stesso solvente.
Le frazioni contenenti solamente il nuovo antibiotico P-80204 sono state riunite e concentrate a secchezza sottovuoto a 40°C per dare, dopo cristallizzazione da acetine-esano, mg 170 di 3-0-oleandrosil-5-0-desosaminiI-(8S)-fluoroeritronolide B (P-80204) con le seguenti caratteristiche:
p.f. 195-6°C
Md —48° (C = 1 in metanolo)
UV (metanolo) 285 nm (e 29)
IR (KBr) 3600; 3440 (larga); 3250 (larga); 1730; 1455; 1400; 1380; 1365; 1350; 1325; 1305; 1270; 1255; 1180; 1160; 1145; 1100; 1060; 1040; 1010; 995; 975; 960; 935; 915; 890; 875; 855; 845; 830; 829 cnr1 (fig. 6)
L'analisi per C3(,HmFNO|2 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 59,90; H 8,94; F 2,63; N 1,94 trovato (percento) C 59,94; H 9,06; F 2,69; N 1,83
Esempio 18
Preparazione degli antibiotici (8S)-8-fluoroeritromicina D (P-80202) e (8S)-8-fluoroeritromicina B (P-80203)
Una coltura inseminata di Streptomyces erythreus ATCC 31772, un mutante bloccato nella biosintesi dell'eritromicina è stata preparata in un mezzo costituito da (in grammi per litro) saccarosio 30,0; melasso di canna 8,0; olio di semi di soia 9,0 (NH4)2S04 2,0; CaC03 7,0.
La coltura è stata incubata a 33°C per 48 ore su shaker rotativo.
L'inoculo è stato aggiunto ad un livello del 5% (V/V) in beute di Erlenmeyer da 250 contenenti 30 mi di un mezzo di fermentazione avente la seguente composizione in grammi per litro: destrina di mais 30,0; amidi di mais grezzo 40,0; farina di semi di soia 30,0; olio di semi di soia 20,0; (NH4hS04 2,0; CaCOì 6,0.
Le beute di fermentazione sono state incubate a 33°C su shaker rotante (220 rpm, corsa di 4 cm) per 24 ore.
A ciascuna beuta sono stati aggiunti 15 mg di 3-O-micarosil--(8S)-8-fIuororeritronolide B (IV) in forma finemente suddivisa sterilizzato sotto luce ultravioletta per 15 minuti, e l'incubazione con sbattimento è stata continuata per 96 ore.
Trattamento dei campioni per cromatografia su strato sottile (TLC) e per cromatografia in fase liquida ad alta pressione
5
!0
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
658 250
12
(HPLC); alla fine del periodo di fermentazione un campione del brodo di fermentazione avente un'attività di circa 900-1000 mcg/ml (titolo espresso come eritromicina A) è stato centrifugato ed il liquido sovranatante è stato chiarificato mediante aggiunta di volumi uguali di una soluzione acquosa al 10% (P/V) di ZnSC>4 e di una soluzione acquosa al 4¥o (P/V) di idrossido di sodio. Dopo centrifugazione il liquido sovranatante limpido è stato estratto mediante agitazione vorticosa con un terzo del suo volume di etilacetato.
CONTROLLO TLC
Un campione della parte organica è stato depositato su una piastra di gel di silice G e sviluppato in CHaCk-MetOH-LfeO--NH4OH concentrato (90:9,5:0,5:1) per 2 ore; le macchie sono state localizzate con reagente a spruzzo di metanolo-anis-aldeide-acido solforico concentrato-acido acetico (85:0,5:5:10) ed i composti attivi sono stati rivelati mediante bioautografia su piastre inoculate con Micrococcus luteus (Sarcina lutea) ATCC 9341.
I risultati della TLC hanno mostrato la scomparsa del 3-0--micarosil-(8S)-8-fluoroeritronolide B (IV) aggiunto e la comparsa dei due composti attivi i cui valori di Rst rispetto aH'eritromicina A sono rispettivamente di 0,9 e 1,13 (0,85 ed 1,06 rispetto aH'eritromicina B).
Inoltre essi presentano reazioni cromatiche differenti dopo applicazione di un reagente a spruzzo e riscaldati: colore marrone scuro (a caldo) per il composto più lento (antibiotico P-80202) e come viola scuro (dopo raffreddamento) per l'altro composto (antibiotico P-80203).
CONTROLLO HPLC
Un campione della parte organica viene evaporato a secchezza, ripreso con acetonitrile e iniettato in colonna (RP8 10 p.m 25 cm; fase mobile tampone fosfato 0,01 M pH 7/aceto-nitrile 36:64; flusso 2 ml/min; temperatura colonna 40°C). Si evidenziano due picchi con un tempo di ritenzione relativo al-l'eritromicina A di 0,79 (P-80202) e di 1,06 (P-80203).
Esempio 19
Purificazione degli antibiotici (8S)-8-fluoroeritromicina D (P-80202) e (8S)-8-fluoroeritromicina B (P-80203)
Secondo il procedimento descritto nell'esempio 18 precedente, diverse fermentazioni per un volume totale di mi 2100 a cui erano stati aggiunti 1,0 g di 3-0-micarosil-(8S)-8-fluoroeritro-nolide B sono state filtrate sottovuoto dopo aggiunta sotto agitazione di Hyflo Supercell (4% peso/volume).
II solido è stato lavato con acqua e i filtrati combinati sono stati regolati a pH 5,5 con acido acetico.
La soluzione acquosa acida è stata estratta tre volte con uguale volume di etil acetato. La fase acquosa è stata neutralizzata con NH4OH 2N evaporata sotto pressione ridotta fino ad un volume di 1000 mi, regolata a pH 8,8 con NH4OH 2N ed estratta con un volume uguale di metilisobutilchetone.
Questi ultimi estratti organici sono stati riuniti e lavati due volte con metà volume di KH2PO4 0,1 M e quindi ancora una volta con acqua. Dopo essiccamento (Na2SÛ4) ed allontanamento del solvente sottovuoto il residuo è stato purificato mediante cromatografia di ripartizione in colonna su gel di silice seguendo il procedimento indicato da N.L. Oleinick in J. Biol. Chem., Voi. 244, n° 3, pag. 727 (1969).
Le frazioni 23-38 contenenti solamente l'antibiotico P-80203 sono state riunite e portate a secco sottovuoto a 40°C.
II residuo solido per cristallizzazione da etanolo assoluto ha dato mg 165 di (8S)-8-fluoroeritromicina B (P-80203) avente le seguenti caratteristiche:
p.f. 164-6°C
[a]?? —63 ° (C = 1 in metanolo)
UV (metanolo) 285 nm (s 29,5)
IR (KBr) 3480 (larga); 1735; 1465; 1435; 1385; 1375; 1330; 1305; 1280; 1170; 1115; 1090; 1075; 1055; 1035; 1020; 1000; 975; 940; 890; 835; 805 cm1.
L'analisi per C37H66FNO12 ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 60,39; H 9,04; F 2,58; N 1,90 trovato (percento) C 60,31; H 9,09; F 2,60; N 1,88
Le frazioni 65-120 contenenti solamente l'antibiotico P-80202 sono state riunite e portate a secco sottovuoto a 40°C. Il residuo solido per cristallizzazione da etanolo assoluto ha dato mg 125 di (8S)-8-fluoroeritromicina D (P-80202) avente le seguenti caratteristiche:
p.f. 213-15°C
[<x]d —60° (C = 1 in metanolo)
UV (metanolo) 285 nm (s 30,8)
IR (KBr) 3600; 3520; 3300 (larga); 1730; 1460; 1420; 1385; 1370; 1355; 1345; 1330; 1310; 1275; 1190; 1160; 1120; 1100; 1060; 1040; 1030; 1010; 1000; 995; 975; 960; 935; 920; 910; 890; 875; 840; 825; 810 cnr1.
L'analisi per C36H64FNO12 ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 59,85; H 8,94; F 2,63; N 1,94 trovato (percento) C 59,87; H 8,85; F 2,63; N 1,88
Esempio 20
Preparazione di (8S)-8-fluoroerìtromicina A acetato
Ad una soluzione di 7,520 g (0,010 moli) di (8S)-8-fluoroeritromicina A in 30 mi di acetone anidro contenente 3,760 g di sodio bicarbonato sono stati aggiunti 1,23 mi (0,013 moli) di anidride acetica. La miscela è stata mantenuta sotto agitazione a 25 °C per 2 ore e poi versata in acqua-ghiaccio. Dopo 2 ore si è estratto tre volte con cloroformio, lavato repidamente con una soluzione satura di sodio bicarbonato e poi con acqua.
La soluzione cloroformica è stata essiccata su Na2S04 anidro ed evaporata sotto vuoto a secchezza per dare 7,545 g di residuo solido.
Per cristallizzazione del solido da etere etilico-esano n si sono ottenuti 6,325 g di (8S)-8-fluoroeritromicina A acetato con le seguenti caratteristiche:
p.f 130-5°C
[a]o —52° (C = 1 in acetone)
IR (KBr) 3480; 1740; 1455; 1370; 1340; 1280; 1235; 1160; 1110; 1085; 1050; 1030; 1010; 995; 975; 955; 930; 890; 870; 830; 800 cm1.
L'analisi per C39H68FNO14 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 59,00; H 8,63; F 2,39; N 1,76
trovato (percento) C 59,32; H 8,75; F 2,32; N 1,79
Esempio 21
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritromicina A propionato
Usando il procedimento generale dell'esempio 20 la (8S)-8fluoroeritromicina A è stata trasformata in (8S)-8-fluoroeritromicina propionato mediante esterificazione con anidride propionica. Il prodotto finale presentava le seguenti caratteristiche:
p.f. 115-20°C (etere etilico-esano n)
[afn —56,5° (C = 1 in acetone)
IR (KBr) 3480; 1735; 1455; 1375; 1340; 1180 (spalla); 1160; 1080; 1050; 1030; 995; 975; 955; 930; 890; 800 cnr1.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
5$
60
65
13
658 250
L'analisi per C40H70FNO14 ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 59,46; H 8,73; F 2,35; N 1,73 trovato (percento) C 59,75; H 8,65; F 2,42; N 1,69
Esempio 22
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritromicina A butirrato
Usando il procedimento generale dell'esempio 20 la (8S)-8-fluoroeritromicina A è stata trasformata in (8S)-8--fluoroeritromicina A butirrato mediante esterificazione con anidride butirrica. Il prodotto finale presentava le seguenti caratteristiche:
p.f. 120-5°C (etere etilico-esano n)
[<x]i? —49° (C = 1 in acetone)
IR (KBr) 3490; 1740; 1455; 1370; 1340; 1180 (spalla); 1160; 1085; 1050; 1030; 1010; 995; 975; 955; 930; 890; 865; 830 cm'1 .
L'analisi per C4iH72FNOi4 ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 59,91; H 8,83; F 2,31; N 1,70 trovato (percento) C 60,13; H 8,71; F 2,27; N 1,75
Esempio 23
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritromicina A etilsuccinato
Usando il procedimento generale dell'esempio 20 la (8S)-8--fluoroeritromicina A è stata trasformata in (8S)-8-fluoroeritro-micina A etilsuccinato mediante esterificazione etil succinil cloruro. Il prodotto finale presentava le seguenti caratteristiche: p.f. 80-85°C (etere etilico-esano n)
[a]!? —52,7° (C = 1 in acetone)
IR (KBr) 3480; 1735; 1450; 1370; 1345; 1190 (spalla); 1160; 1050; 1030; 1010; 995; 975; 955; 890; 800 cm'1 .
L'analisi per C43H74FNO16 ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 58,69; H 8,48; F 2,16; N 1,59 trovato (percento) C 58,81; H 8,57; F 2,07; N 1,65
Esempio 24
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritromicina A succinato
Una soluzione contenente 7,520 g (0,010 moli) di (8S)-8--fluoroeritomicina A e 1 g (0,010 moli) di anidride succinica in 37,5 mi di acetone anidro è stata riscaldata a 80°C per 15 minuti, raffreddata e mantenuta a temperatura ambiente per 2 ore. Si è poi proceduto secondo l'esempio 20 fino a ottenere un residuo solido di 7,565 g.
Per cristallizzazione del solido da etere etilico si sono ottenuti 6,450 g di (8S)-8-fluoroeritromicina A succinato con le seguenti caratteristiche:
p.f. 150-55°C
[aji? —52,7° (C = 1 in acetone)
IR (KBr) 3450; 1730; 1575; 1455; 1370; 1340; 1190 (spalla); 1160; 1050; 990; 975; 950; 930; 885; 860; 825; 800 cm'1.
L'analisi per CaiHioFNOk, ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 61,25; H 8,77; F 2,36; N 1,74 trovato (percento) C 61,52; H 8,65; F 2,32; N 1,78
Esempio 25
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritromicina A lattobionato
Una soluzione di 3,4 g (0,010 moli) di 8-lattone dell'acido Iattobionico in 20 mi di acqua distillata è stata aggiunta ad una soluzione di 7,520 g (0,010 moli) di (8S)-8-fluoroeritromicina A in 40 mi di acetone.
La soluzione risultante è stata evaporata sotto vuoto a 40°C fino ad ottenere un residuo gommoso. Il residuo è stato poi sciolto in 50 mi di acqua distillata e la soluzione risultante è stata liofilizzata. Sono stati così ottenuti 10,6 g di (8S)-8-fluoro-eritromicina A lattobionato con le seguenti caratteristiche: p.f. 145-55°C
IR (KBr) 3400 (larga); 1725; 1605; 1455; 1400 (spalla); 1370; 1340 (spalla); 1160; 1070; 1040; 1000; 950; 885 cm"1.
L'analisi per C49H88FNO25 ha dato i seguenti valori:
calcolato (percento) C 53,01; H 7,99; F 1,71; N 1,26 trovato (percento) C 52,72; H 7,67; F 1,65; N 1,21
Esempio 26
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritromicina A stearato
Una soluzione di 2,85 g (0,010 moli) di acido stearico in 20 mi di acetone-acqua distillata (1/1) è stata aggiunta ad una soluzione di 7,250 g (0,010 moli) di (8S)-8-fluoroeritromicina A in 40 mi di acetone. La soluzione risultante è stata poi evaporata sotto vuoto a 40°C fino ad ottenere un residuo solido che per cristallizzazione da acetone-esano n ha dato 10,2 g di (8S)-8--fluoroeritromicina A stearato caratterizzato da:
p.f. 100-105°C (acetone-esano n)
IR (KBr) 3470; 1730; 1455; 1375; 1340; 1160; 1105; 1050; 1030; 1010; 990; 975; 950; 930; 890; 830, 800 cm"1.
L'analisi per C55H102 FNO15 ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 63,74; H 9,92; F 1,83; N 1,35 trovato (percento) C 63,37; H 9,81; F 1,69; N 1,27
Esempio 27
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritromicina A propionato laurilsolfato
Una soluzione di 2,885 g (0,010 moli) di laurilsolfato sale sodico in 50 mi di acqua distillata è stata aggiunta ad una soluzione di 8,080 g (0,010 moli) di (8S)-8-fluoroeritromicina A propionato (preparata nell'esempio 21) in 75 mi di acetone. Sotto agitazione elettromagnetica alla soluzione così ottenuta sono stati poi aggiunti 20 mi di una soluzione acquosa al 5% di acido acetico. Il sale formatosi è stato filtrato, lavato diverse volte con acqua e poi essiccato a 50°C sotto vuoto. Si sono così ottenuti 10,25 g di (8S)-8-fIuoroeritromicina A propionato laurilsolfato.
L'analisi per C52H96FNO18S ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 58,13; H 9,01; F 1,77; N 1,30; S 2,99 trovato (percento) C 57,89; H 8,92; F 1,72; N 1,26; S 2,94
Esempio 28
Preparazione di (8S)-8-fluoroeritromicina A carbonato
Una soluzione riscaldata a parte di 7,045 g (0,080 moli) di etilene carbonato in 20 mi di benzene anidro è stata aggiunta goccia a goccia (in circa 1 ora) ad una miscela di 7,520 g (0,010) moli di (8S)-8-fluoroeritromicina A, 3,760 g di carbonato di potassio e 20 mi di benzene agitata vigorosamente e riscaldata a riflusso. Alla fine dell'aggiunta la miscela di reazione è stata riscaldata a riflusso ancora per 15 minuti e raffreddata a temperatura ambiente. Sono stati poi aggiunti sotto agitazione 40 mi di acqua. La fase benzenica è stata separata, lavata tre volte con acqua, essiccata su Na2S04 anidro e poi evaporata a secchezza sotto vuoto a 50°C. II residuo è stato sciolto in etere etilico e portato a secco sotto vuoto. Quest'ultima operazione è stata ripetuta alcune volte e il residuo risultante è stato poi purificato mediante cromatografia di ripartizione in colonna di gel di silice. Si sono riunite le frazioni contenenti solamente (8S)-8-fluoroeritromicina A carbonato (controllo effettuato mediante cromatografia in fase liquida ad alta pressione). Le frazioni 16-22 riunite, evaporate sotto vuoto a secchezza e cristal5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
658 250
14
lizzate da etere etilico hanno dato 0,980 g di (8S)-8-fluoro-eritromicina A carbonato con le seguenti caratteristiche: p.f. 234-5°C
[a]o —44,2° (C = 1 in metanolo)
IR (KBr) 3500; 3450; 1795; 1745; 1455; 1380; 1365; 1345; 1325; 1295; 1280; 1235; 1160; 1090; 1070; 1040; 1015; 1000; 990; 940; 930; 900; 875; 865; 830; 815; 800 cm1.
L'analisi per C38H64FNO14 ha dato i seguenti valori: calcolato (percento) C 58,67; H 8,29; F 2,44; N 1,80 trovato (percento) C 58,41; H 7,80; F 2,40; N 1,71
Con le stesse modalità vengono preparati i sali, esteri ed esteri-sali corrispondenti degli altri antibiotici macrolidici dell'invenzione.
I nuovi antibiotici della presente invenzione, nonché i relativi derivati sopra citati vengono utilizzati per la preparazione di composizioni farmaceutiche, soprattutto per la somministrazione per via orale, le quali vengono ottenute con le tecniche farmaceutiche convenzionali e con gli usuali eccipienti, veicoli, inerti ecc.
Si prevedono pertanto compresse, confetti, capsule, sospensioni e soluzioni contenenti da 10 a 1000 mg di principio attivo per dose, mentre i dosaggi giornalieri sono quelli normalmente adottati per l'analogo antibiotico ossia l'eritromicina.
Gli esempi che seguono illustrano la preparazione delle composizioni e formulazioni contenenti (8S)-8-fluoroeritromicina A, restando inteso che analogamente si procede per gli altri antibiotici macrolidici della presente invenzione e che questi esempi non intendono limitare indebitamente l'invenzione.
Esempio 29 Capsule: dosi per 1000 unità
(8S)-8-fluoroeritromicina A g 100
magnesio stearato g 3
Preparazione
Si mescolano omogeneamente le sostanze indicate in formula e si procede al riempimento di capsule di gelatina dura secondo la tecnica usuale.
II contenuto per capsula è di 103 mg.
Ogni capsula contiene: mg 100 di principio attivo.
Esempio 30 Capsule: dosi per 1000 unità
(8S)-8-fluoroeritromicina A g 250
magnesio stearato g 7,5
Preparazione
La stessa tecnica descritta nell'esempio precedente.
Ogni capsula, contenente 257 mg di miscela polveri, corrisponde a 250 mg di principio attivo.
Esempio 31
Capsule: dosi per 1000 unità
(8S)-8-fluoroeritromicina A g 500
magnesio stearato g 15
Preparazione
La stessa tecnica descritta nell'esempio precedente.
Ogni capsula contenente 515 mg di miscela polvere, corrisponde a 500 mg di principio attivo.
Esempio 32
Compresse: dose per 1000 unità
(8S)-8-fluoroeritromicina A
g
100
amido di mais g
50
lattosio g
30
talco g
8
magnesio stearato
CT
O
2
idrossipropilmetilcellulosa g
6
etilcellulosa g
4
Preparazione
Si miscelano omogeneamente (8S)-8-fluoroeritromicina A, parte dell'amido e lattosio e si procede alla granulazione, con la tecnica della granulazione ad umido, impiegando come legante la rimanente quantità di amido in forma di salda.
II granulato essiccato viene miscelato con lubrificanti e si procede alla compressione. Si ottengono compresse del peso 190 mg.
Ogni compressa contiene 100 mg di principio attivo.
Le compresse possono essere poste in bassina e ricoperte a film mediante una soluzione di idrossipropilmetilcellulosa ed etilcellulosa.
Il peso delle compresse finite è di 200 mg.
Esempio 33 Compresse: dosi per 1000 unità
(8S)-8-fluoroeritromicina A g 250
amido di mais g 70
lattosio g 40
talco g 16
magnesio stearato g 4
idrossipropilmetilcellulosa g 12
etilcellulosa g 8
Preparazione
La stessa tecnica descritta nel precedente esempio.
Ogni compressa del peso di mg 400 contiene 250 mg di principio attivo.
Esempio 34 Compresse: dosi per 1000 unità
(8S)-8-fluoroeritromicina A
g
500
amido di mais g
140
lattosio g
85
talco g
37
magnesio stearato g
8
idrossipropilmetilcellulosa g
18
etilcellulosa g
12
Preparazione
La stessa tecnica descritta nel precedente esempio.
Ogni compressa del peso di 800 mg contiene 500 mg di principio attivo.
Esempio 35
Sospensione estemporanea: 60 ml di sospensione
(8S)-8-fluoroeritromicina A
g 0,6
sodio carbossimetilcellulosa g 0,010
metil p-idrossibenzoato g 0,048
propile p-idrossibenzoato g 0,012
aromatizzanti g 0,600
saccarosio velo q.b. a g 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
15
658 250
Preparazione
Gli ingredienti vengono intimamente miscelati e posti in un flacone tarato a 60 mi.
Prima dell'uso il flacone viene riempito con acqua per ottenere 60 mi di sospensione, che vengono bene agitati prima dell'uso. La sospensione ricostituita contiene 10 mg/ml di principio attivo.
Esempio 36
Sospensione estemporanea: dosi per 60 mi di sospensione
(8S)-8-fluoroeritromicina A
g
3
carbossimetilcellulosa g
0,010
metil p-idrossibenzoato g
0,048
propile p-idrossibenzoato a o
0,012
aromatizzanti g
0,600
saccarosio q.b.a g
30
Preparazione
La stessa tecnica descritta nell'esempio precedente. La sospensione ricostituita contiene 50 mg/ml di principio attivo.
Preparazione
Si usa la stessa tecnica descritta nel precedente esempio 29. Il contenuto per capsula à di 147 mg.
5 Ogni capsula contiene (8S)-8-fluoroeritromicina A propionato laurilsolfato corrispondente a 100 mg di (8S)-8-fluoro-eritromicina A.
Esempio 40
io
Capsule: dose per 1000 unità
(8S)-8-fluoroeritromicina A propionato laurilsolfato (pari a 250 g di
(8S)-8-fluoroeritromicina A g 357,2
magnesio stearato g 10,8
Preparazione
Si usa la stessa tecnica descritta nell'esempio precedente. 20 Ogni capsula, contenente 368 mg di miscela polveri, contiene 357,2 mg di (8S)-8-fluoroeritromicina A propionato laurilsolfato corrispondente a 250 mg di (8S)-8-fluoroeritromicina A.
Esempio 37
Esempio 41
Gocce: dosi per 10 ml
Compresse: dosi per 1000 unità
(8S)-8-fluoroeritromicina A
g 0,5
(8S)-8-fluoroeritromicina A stearato
metile p-idrossibenzoato g 0,009
(pari a 100 g di (8S)-8-fluoroeritro-micina A)
propile p-idrossibenzoato g 0,001
g 137,83
idrossietilcellulosa g 0,050
amido di mais g 55,00
glicerina g 0,400
lattosio g 32,50
dolcificanti e aromatizzanti g 0,100
talco g 10,00
acqua depurata q.b.a ml 10
magnesio stearato idrossipropilmetilcellulosa g 2,17
g 7,50
In opportuno contenitore munito di agitatore meccanico si etilcellulosa g 5,00
pone il 90% dell'acqua necessaria alla preparazione e si scalda
a 80°C. Vi si sciolgono i parasettici e successivamente l'idros-
Preparazione
sietilcellulosa. Si aggiungono sotto agitazione gli altri componenti e si procede al riempimento di flaconcini della capacità di 10 mi.
La sospensione così ottenuta ha un contenuto di 50 mg/ml di principio attivo.
Esempio 38
Gocce: dosi per 10 mi
(8S)-8-fluoroeritromicina A metile p-idrossibenzoato propile p-idrossibenzoato glicerina dolcificanti e aromatizzanti acqua depurata q.b.a
Preparazione mi
2,500 0,009 0,001 0,400 0,100 10
Viene impiegata la stessa tecnica descritta nell'esempio precedente. Ogni mi di sospensione contiene 250 mg di principio attivo.
Esempio 39
4o Si usa la stessa tecnica descritta nel precedente esempio 32.
Si ottengono compresse del peso di 240 mg. Ogni compressa contiene 137,83 mg di (8S)-8-fluoroeritromicina A stearato, corrispondente a 100 mg di (8S)-8-fluoroeritromicina A.
Le compresse vengono poste in bassina e ricoperte a film 45 mediante una soluzione di idrossipropilmetilcellulosa ed etilcellulosa.
II peso delle compresse finite è di 250 mg.
Esempio 42
Compresse: dosi per 1000 unità
(8S)-8-fluoroeritromicina A stearato (pari a 500 g di (8S)-8-fluoroeritro-
micina A) g 689,17
amido di mais g 150,00
lattosio g 80,00
talco g 40,83
magnesio stearato g 10,00
idrossipropilmetilcellulosa g 18,00
etilcellulosa g 12,00
Capsule: dosi per 1000 unità
(8S)-8-fluoroeritromicina A propionato laurilsolfato ( pari a 100 g di (8S)-8-fluoroeritromicina A) magnesio stearato
142,9 4,1
Preparazione
Si usa la stessa tecnica descritta nel precedente esempio 32. Ogni compressa del peso di g 1 contiene 689,17 mg di (8S)-8-fIuoroeritromicina A stearato, corrispondente a 500 mg di (8S)-8-fluoroeritromicina A.
658 250
16
Esempio 43
Sospensione estemporanea: 60 mi di sospensione
(8S)-8-fluoroeritromicina A etilsuccinato (corrispondente a 0,6 g di (8S)-8-fluoroeritromicina A)
g
0,702
sodio carbossimetilcellulosa g
0,010
metil p-idrossibenzoato g
0,048
propile p-idrossibenzoato g
0,012
aromatizzanti g
0,600
saccarosio q.b.a g
30
Preparazione
Si usa la stessa tecnica descritta al precedente esempio 35.
La sospensione ricostituita contiene (8S)-8-fluoroeritro-micina A etilsuccinato corrispondente a 10 mg/ml di (8S)-8-fluoroeritromicina A.
Esempio 44 Fiale uso e.v. - Dose per 1000 unità
g 738 di (8S)-8-fluoroeritromicina A lattobionato, corri-s spondenti a g 500 di (8S)-8-fluoroeritromicina A vengono sciolti in acqua e dopo filtrazione sterile, sottoposti a liofilizzazione. Il prodotto ottenuto viene suddiviso in ambiente sterile in fla-concini di vetro in ragione di mg 738/flaconcino (corrispondente a 500 mg di (8S)-8-fluoroeritromicina A).
io Gli antibiotici macrolidici della presente invenzione sono stati oggetto di indagini farmacologiche, volte a determinare:
— il poter batteriostatico espresso come minima concentrazione inibente (MIC) su ceppi batterici aerobi ed anaerobi, Gram positivi e Gram negativi, i cui risultati sono riportati nel-
15 le tabelle 2 e 3
— le concentrazioni seriche relative alla (8S)-8-fluoroeritro-micina A e di eritromicina A (tabella 4)
— il poter battericida, espresso come concentrazione minima battericida (MBC) su alcuni ceppi aerobi Gram positivi (ta-
20 bella 5).
TABELLA 2
Potere batteriostatico in terreno solido di Eritromicina A, Eritromicina B, Oleandomicina, P80202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 e P80206 carbonato su ceppi batterici aerobi ed anaerobi, Gram positivi e Gram negativi. Concentrazioni minime inibenti espresse in mcg/ml.
Entro- Eritro- Oleando- P80206 P80203 P80205 P80202 P80207 P80204 P80206
micina micina micina carbonato
A B
1. AEROBI
A. GRAM POSITIVI
Staphylococcus aureus ATCC 6358P
LRP39
0,049
0,097
0,39
0,097
0,097
0,097
0,097
0,39
0,39
0,097
Staphylococcus aureus
LRP144**
0,049
0,195
0,39
0,097
0,097
0,097
0,097
0,39
0,39
0,097
Staphylococcus aureus ATCC 14154
LRP78*
>25
>25
>25
>25
>25
>25
>25
>25
>25
>25
Streptococcus faecalis
LRP7
0,097
0,195
1,56
0,195
0,195
0,097
0,097
0,39
0,39
0,097
Streptococcus faecalis
subsp. zymogenes ATCC 12958
LRP61
0,097
0,195
1,56
0,195
0,195
0,097
0,097
0,39
0,39
0,097
Streptococcus pneumoniae
ATCC 6303
LRP35
0,012
0,024
0,195
0,024
0,049
0,024
0,024
0,49
0,49
0,012
Streptococcus pneumoniae
LRP52
0,012
0,024
0,195
0,024
0,024
0,012
0,024
0,049
0,049
0,012
Streptococcus pneumoniae
LRP53
0,012
0,024
0,195
0,024
0,024
0,024
0,024
0,097
0,049
0,012
Streptococcus pyogenes ATCC 8668
LRP34
0,012
0,024
0,195
0,012
0,024
0,024
0,024
0,049
0,049
0,012
Streptococcus pyogenes
LRP197
0,012
0,024
0,195
0,012
0,049
0,024
0,024
0,097
0,049
0,024
Corynbacterium diphteriae
LRP24
0,006
0,012
0,097
0,012
0,006
0,012
0,006
0,049
0,049
0,024
Micrococcus luteus ATCC 9341
LRP6
0,006
0,006
0,049
0,006
0,012
0,012
0,006
0,049
0,049
0,024
Micrococcus ATCC 15957
LRP193*
>25
>25
>25
>25
>25
>25
>25
>25
>25
>25
Bacillus subtilis
LRP25
0,049
0,049
0,39
0,049
0,049
0,097
0,049
0,39
0,195
0,049
B. GRAM NEGATIVI
Haemophilus influenzae ATCC 19418
LRP213
3,12
6,25
>25
3,12
6,25
12,5
6,25
12,5
6,25
6,25
Neisseria gonorrhoeae ATCC 19424
LRP214
0,049
0,097
0,39
0,049
0,097
0,195
0,097
0,097
0,39
0,049
Escherichia coli
LRP50
6,25
25
>25
12,5
25
12,5
25
>25
>25
3,12
Klebsiella pneumoniae
LRP54
12,5
25
>25
12,5
>25
25
>25
>25
>25
12,5
Proteus vulgaris ATCC 6380
LRP13
>25
>25
>25
>25
>25
25
>25
>25
>25
>25
Pseudomonas auruginosa
LRP9
>25
>25
>25
>25
>25
25
25
>25
>25
>25
Salmonella typhi
LRP8
12,5
>25
>25
12,5
25
12,5
12,5
>25
>25
12,5
Shigella sonnei
LRP5
12,5
>25
>25
25
25
25
>25
>25
>25
12,5
Acholephasma laidlawii ATCC 23206
LRP204
0,097
0,097
6,25
0,097
0,195
3,12
3,12
3,12
3,12
0,195
Mycoplasma hominis I ATCC 14027
LRP211
>25
>25
>25
>25
>25
>25
>25
>25
>24
>25
2. ANAEROBI
Clostridium perfrigens ATCC 3624
LRP206
1,56
1,56
3,12
0,78
0,39
6,25
3,12
6,25
1,56
3,12
Bacterioides fragilis ATCC 23745
LRP205
0,195
0,195
0,39
0,195
0,195
0,78
0,39
3,12
3,12
0,78
Fusobacteriumnectrophroum
ATCC 27852
LRP210
3,12
6,25
6,25
1,56
3,12
12,5
6,25
12,5
12,5
6,25
Legenda:
* Eritromicina resistente ** Penicillina resistente
17
658 250
TABELLA 3
Potere batteriostatico in terreno liquido di Eritromicina A, Eritromicina B, Oleandomicina, P80202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 e P80206 carbonato su alcuni ceppi aerobi Gram positivi. Concentrazioni minime inibenti espresse in mcg/ml.
Microorganismo
Prodotto
Eritromicina A
Eritromicina B
Oleandomicina
P80206
P80203
P80205
P80202
P80207
P80204
P80206 carbonato
Staphylococcus aureus ATCC 6538P
LRP39
0,097
0,195
0,39
0,195
0,097
0,195
0,195
0,78
0,195
0,39
Streptococcus faecalis subs. zyomogenes ATCC 12958
LRP61
0,39
0,39
1,56
0,39
0,39
0,39
0,39
0,78
0,39
0,195
Streptococcus pneumoniae
ATCC 6303
LRP35
0,024
0,049
0,195
0,049
0,049
0,097
0,049
0,049
0,024
0,049
Streptococcus pyogenes
ATCC 8668
LRP34
0,024
0,024
0,195
0,097
0,024
0,049
0,049
0,097
0,049
0,024
Corynebacterium diphteriae
LRP24
0,012
0,012
0,097
0,012
0,012
0,049
0,012
0,049
0,024
0,024
TABELLA 4
Concentrazioni seriche di P80206 ed Eritromicina A base nel ratto dopo somministrazione di 100 mg/kg per via orale. I valori, ai vari tempi di prelievo corrispondono a mcg di prodotto per mi di siero*.
P80206 - Tempo prelievo (ore) ERITROMICINA A BASE — Tempo prelievo (ore)
0,5
1
2
4
6
0,5
1
2
4
6
0,078
8,505
3,712
1,792
0,867
0,016
1,542
1,332
0,075
0,112
0,198
0,880
6,516
2,134
0,393
0,010
0,102
2,205
0,540
0,245
0,630
1,273
3,510
1,270
1,192
0,063
0,090
0,220
0,117
0,010
0,487
1,251
6,907
2,817
1,792
0,387
0,285
0,830
0,499
0,246
1,105
1,714
6,601
2,362
1,620
1,545
0,503
0,360
0,198
0,246
1,333
0,531
7,195
2,115
1,147
0,849
0,686
1,878
0,144
0,135
Media
0,638
2,359
5,740
2,081
1,168
0,478
0,534
1,137
0,262
0,165
Errore stand.
0,2026
1,240
0,680
0,213
0,207
0,250
0,222
0,330
0,083
0,039
Limiti inf.
0,118
—0,829
3,990
1,533
0,636
—0,167
—0,038
0,289
0,048
0,064
Fiduc. sup.
1,159
5,547
7,491
2,630
1,701
1,123
1,107
1,986
0,476
0,268
* I sieri dei ratti al tempo 0 non presentavano attività antibatterica.
TABELLA 5
Potere battericida di Eritromicina A, Eritromicina B, Oleandomicina, P80202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207, P80206
carbonato su alcuni ceppi aerobi Gram Positivi. Concentrazioni minime battericide (MBC), espresse in mcg/ml;
a lato è pure indicato il rapporto MBC/MIC.
Eritro- MBC/ Eritro- MBC/ Oleando- MBC/ P80206 MBC/ P80203 MBC/
Prodotto micina MIC micina MIC micina MIC MIC MIC Microorganismo ""—A B
Staphylococcus aureus
ATCC 6538 P LRP39 1,56 16 6,25 32 6,25 16 3,12 16 3,12 32 Streptococcus faecalis subs. zymogenes LRP61 6,25 16 6,25 16 >12,5 >8 6,25 16 3,12 8 Streptococcus pneumoniae
ATCC 6303 LRP35 0,097 4 0,195 4 0,78 4 0,195 4 0,049 1 Streptococcus pyogenes
ATCC 8668 LRP34 0,39 16 0,195 8 3,12 16 0,78 8 0,195 8
Corynebacterium diphteriae LRP24 0,049 4 0,195 16 0,39 4 0,097 8 0,049 4
658 250
18
TABELLA 5 (continuazione)
Microorganismo
Prodotto
P80205
MBC/ MIC
P80202
MBC/ MIC
P80207
MBC/ MIC
P80204
MBC/ MIC
P80206 MBC/ carbonato MIC
Staphylococcus aureus
ATCC 6538P
LRP39
3,12
16
3,12
16
6,25
8
3,12
16
6,25
16
Streptococcus faecalis subs.zymogenes
LRP61
>3,12
8
3,12
8
6,25
8
6,25
16
3,12
16
Streptococcus pneumoniae ATCC 6303
LRP35
0,195
2
0,195
4
0,097
2
0,049
2
0,195
4
Streptococcus pyogenes ATCC 8668
LRP34
0,78
16
0,39
8
0,78
8
0,39
8
0,39
16
Corynebacterium diphteriae
LRP24
0,39
8
0,195
16
0,195
4
0,39
16
0,39
16
V
3 fogli disegni

Claims (24)

  1. 658 250
    2
    RIVENDICAZIONI 1. (8S)-8-fluoroeritromicina A, avente formula:
    ChWCH3
    OH HO.. JT
    :ch3 Ti
    — 0 —kn^CH-
    ch3 'och3
    e suoi esteri, sali-esteri e sali con acidi organici ed inorganici non tossici e farmaceuticamente accettabili.
  2. 2. (8S)-8-fluoroeritromicina B, avente formula
    CHo CH3
    •N'
  3. HO.. A.
    CH,
    r-CO
    CH3 OCH3
    e suoi esteri, sali-esteri e sali con acidi organici ed inoranici, non tossici e farmaceuticamente accettabili.
  4. 3. (8S)-8-fluoroeritromicina C avente formula:
    e suoi esteri, sali-esteri e sali con acidi organici ed inorganici non tossici e farmaceuticamente accettabili.
  5. 4. (8S)-8-fluoroeritromicina D avente formula:
    CH CH_ HO N' 3
    u»n nu jL
    o'il
    *CH--CH-
    '"'OH
    OCH-
    e suoi esteri, sali-esteri e sali con acidi organici ed inorganici non tossici e farmaceuticamente accettabili. 15 6. 3-0-oleandrosil-5-0-desosaminil-(8S)-8-fluoroeritro-nolide B avente formula
    20
  6. 5. 3-0-oleandrosil-5-0-desosaminiI-(8S)-8-fluoroeritro-nolide A avente formula
    0 och3
    e suoi esteri, sali-esteri e sali con acidi organici ed inorganici 30 non tossici e farmaceuticamente accettabili.
  7. 7. Carbonato-derivati degli antibiotici secondo le rivendicazioni 1, 3 e 5.
  8. 8. Procedimento per la preparazione dei composti secondo le rivendicazioni 1 e 3, caratterizzato dal fatto che si opera una
    35 fermentazione,
    usando Streptomyces erythreus ATCC 31772 quale microorganismo di biosintesi ed (8S)-8-fluoroeritronolide A quale substrato della fermentazione.
  9. 9. Procedimento per la preparazione del composto secondo 40 la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che si opera una fermentazione,
    usando Streptomyces antibioticus ATCC 31771 quale microorganismo di biosintesi ed (8S)-8-fluoroeritronolide A quale substrato di fermentazione.
    45 10. Procedimento per la preparazione dei composti secondo le rivendicazioni 2 e 4, caratterizzato dal fatto che si opera una fermentazione,
    usando Streptomyces erythreus ATCC 31772 quale microorganismo di biosintesi e un composto scelto tra (8S)-8-fluoro-50 eritronolide B e 3-0-micarosil(8S)-8-fluoroeritronolide B, quale substrato della fermentazione.
  10. 11. Procedimento per la preparazione del composto della rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che si opera una fermentazione,
    55 usando Streptomyces antibioticus ATCC 31771 quale microorganismo di biosintesi e (8S)-8-fluoroeritronolide B quale substrato della fermentazione.
  11. 12. Procedimento secondo le rivendicazioni 8-11, caratterizzato dal fatto che la fermentazione viene proseguita fino a soso stanziale scomparsa del substrato e, dopo controllo con tecniche cromatografiche e/o bioautografiche, si isolano e purificano i composti desiderati.
  12. 13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che l'isolamento viene effettuato per estrazione
    65 con solvente.
  13. 14. Procedimento secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che la purificazione viene effettuata per cromatografia su colonna.
    3
    658 250
  14. 15. (8S)-8-8fluoroeritronolide A avente formula come intermedio per la produzione dei composti secondo le rivendicazioni 2, 4 e 6.
  15. 20. 3-0-micarosil-(8S)-fluoroeritronolide B avente formula:
    ho--.
    come intermedio per la produzione dei composti secondo le rivendicazioni 1, 3 e 5.
  16. 16. (8S)-8-fluoroeritronolide A-6,9;9,ll-acetale avente formula
    ,ch3
    ch,
    ch3.-'
    ^Ov^CHg i5 come intermedio per la produzione dei composti delle rivendicazioni 2 e 4.
  17. 21. 3-0-micarosil-(8S)-8-fluoroeritronolide B-6,9;9,ll-ace-tale avente formula come intermedio per la produzione dei composti secondo le rivendicazioni 1, 3 e 5.
  18. 17. 8,9-anidroeritronolide A 6,9-emiacetale, avente formula ch3 oh
    30 come intermedio per la produzione dei composti delle rivendicazioni 2 e 4.
  19. 22. 3-0-micarosil-8,9-anidroeritronolide B-6,9-emiacetale avente formula:
    come intermedio per la produzione dei composti secondo le rivendicazioni 1, 3 e 5.
  20. 18. (8S)-8-fluoroeritronolide B avente formula:
    come intermedio per la produzione dei composti delle rivendicazioni 2 e 4.
  21. 19. (8S)-8-fluoroeritronolide B-6,9;9,ll-acetale, avente formula
    45 come intermedio per la produzione dei composti delle rivendicazioni 2 e 4.
  22. 23. Composizione farmaceutica, caratterizzata dal contenere, quale ingrediente attivo, una quantità efficace di un antibiotico secondo le rivendicazioni 1, 2, 3, 4, 5 e 6, unitamente agli so eccipienti, veicoli, cariche.
  23. 24. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 23, caratterizzata dal fatto di essere in forma adatta per la somministrazione orale.
  24. 25. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 55 23, caratterizzata dal contenere una dose unitaria compresa tra
    10 e 1000 mg di ingrediente attivo.
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