CH658670A5

CH658670A5 - Verfahren zur erzeugung von l-phenylalanin unter wiederverwendung von phenylalanin-ammoniumhydroxid-lyase.

Info

Publication number: CH658670A5
Application number: CH5328/83A
Authority: CH
Inventors: Wayne Elliott Swann
Original assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-10-01
Filing date: 1983-09-30
Publication date: 1986-11-28
Also published as: PL243972A1; DK452783D0; SE8305151L; GB2127821B; IL69672A0; FI833552L; LU85019A1; DD217822A5; CA1206435A; AU1864883A; BE901938R; GR79053B; SE8305151D0; FR2533941A1; JPS5991890A; DK452783A; GB8325797D0; DE3333246A1; ZA836626B; BE897889A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von Phenylalanin durch die mittels Phenylala-nin-ammoniumhydroxid-lyase (PAL) katalysierte Reaktion von t-Zimtsäure und Ammoniumhydroxid, bei welchem ein hoher Grad an Aktivität des PAL-Katalysators aufrechterhalten und der Katalysator wieder verwendet werden kann. Das Verfahren ist in Patentanspruch 1 definiert.

L-Phenylalanin ist eine wesentliche Aminosäure, welche wichtig ist in der Ernährung und auf medizinischen Gebieten.

5 Es wurde kommerziell aus einer Vielzahl von Proteinen, einschliesslich Ovalbumin und Lactalbumin, isoliert. Ein bekanntes Laborverfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin verwendet das Enzym Phenylalanin-ammonium-lyase (im folgenden PAL genannt), um die reversible Reaktion:

10

L-Phenylalanin -» trans-Zimtsäure + Ammoniumhydroxid zu katalysieren. Siehe britisches Patent No. 1 489 468 (vom 19. Oktober 1977).

i5 Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt üblicherweise bei 80:20 zugunsten der t-Zimtsäure, und verschiedene Mittel wurden vorgeschlagen, um einen hohen Grad an Umwandlung zu L-Phenylalanin zu erzielen. Das britische Patent No. 1 489 468 beschreibt, dass eine Ausbeute an L-Phenylalanin, 20 welche sich zu 20% der theoretischen Ausbeute nähert, erzielt werden kann durch Verwendung einer grossen Masse an Zellen, welche den PAL-Katalysator enthalten, und eines Überschusses an Ammoniumionen. Gemäss dem Verfahren der genannten Patentschrift ist die Quelle für Ammoniumionen vor-25 zugsweise Ammoniumchlorid und die Reaktion wird bevorzugt bei einem pH zwischen 8,5 und 9,7 durchgeführt.

S. Yamada et al., Appi. Environ. Microbiol., 42,773 bis 778 (1981) berichten, dass die Umwandlungsausbeute auf über 70% erhöht werden konnte durch Einstellung des pH 30 der Substratlösung auf 10,0 mit Salzsäure. Diese Bedingungen sind jedoch so hart, dass die PAL-Aktivität der wiedergewonnenen Zellen stark vermindert ist, so dass eine Wiederverwendung des Enzyms nicht durchführbar ist. Ausserdem beschreiben Yamada et al., dass die Immobilisierung des celula-35 ren Enzyms keinen Vorteil gegenüber der Verwendung intakter Zellen erbringt. Obwohl also mit dieser Methode eine hohe Konzentration an L-Phenylalanin anfänglich erzielt werden kann, macht die Unfähigkeit, das katalytische Enzym wieder zu verwenden, diese Methode für grosstechnische An-40 wendung unwirtschaftlich.

Es besteht daher noch immer ein Bedarf für ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin aus t-Zimtsäure und Ammoniumhydroxid, bei welchem sowohl eine hohe Ausbeute an L-Phenylalanin erzielt wird als auch die PAL genü-45 gend katalytische Aktivität behält, um wieder verwendet werden zu können.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu ermöglichen zur Herstellung von L-Phenylalanin aus t-Zimtsäure, bei welchem das Produkt in hohen Konzen-50 trationen erzeugt wird und das PAL-Enzym wiederholt verwendet werden kann.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, bei welchem die Reaktion entweder als Freizellenbeschickungssystem (free cell 55 batch system) oder in einem immobilisierten Zell- oder Enzymsystem durchgeführt werden kann.

Das Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Reaktion von t-Zimtsäure und Ammoniumhydroxid in Gegenwart von Phenylalanin-ammoniumhydroxid-lyase wurde 6o derart verbessert, dass hohe Ausbeuten an L-Phenylalanin erhalten werden und ein hoher Grad an katalytischer Aktivität der PAL beibehalten wird. Unter kontrollierten Reaktionsbedingungen wird die Stabilität der PAL erhöht, so dass sie wiederholt verwendet werden kann, um L-Phenylalanin in hohen 65 Konzentrationen zu erzeugen.

Um dieses gewünschte Resultat zu erzielen, wird eine Substratlösung hergestellt durch Umsetzung der t-Zimtsäure mit einer Ammoniumionenquelle. Die Ammoniumionenquelle

3

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kann aus jedem nicht-halogenhaltigen Ammoniumsalz bestehen. Das pH der Substratlösung wird derart eingestellt, dass es vorzugsweise im Bereich von etwa 8,0 bis 10,0 liegt, unter Verwendung einer nicht-halogenhaltigen Säure, worauf die Lösung zu einer PAL-Quelle, wie einem freien intakten Zellsystem oder einem immobilisierten Zell- oder Enzymsystem, welches PAL enthält, zugesetzt wird.

Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung kann die Ammoniumionenquelle entweder durch direkten Zusatz eines Ammoniumsalzes einer beliebigen organischen Säure oder einer Mineralsäure zur t-Zimtsäure eingeführt werden oder indem man sie in der Substratlösung herstellt, z.B. durch Vermischen von Ammoni umhydroxid und einer halogenfreien Säure.

Die britische Patentschrift No. 1 489 468 offenbart, dass eine bevorzugte Quelle für Ammoniumionen ein Gemisch von Ammoniumchlorid und Ammoniumhydroxid darstellt (Seite 3, Zeilen 25 bis 26). Das Verfahren nach Yamada et al. verwendet ebenfalls Ammoniumchlorid. Im Gegensatz zu diesen Offenbarungen des Standes der Technik wurde nun gefunden, dass es vorteilhaft ist, wenn das Ammoniumsalz keine Halogenionen enthält. Es wurde gefunden, dass die Gegenwart von Halogenionen in den Substratlösungen die kata-lytische Aktivität von PAL inhibiert. Bevorzugte Ammoniumsalze umfassen daher Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumeitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat. Ein besonders bevorzugtes Ammoniumsalz ist Ammoniumsulfat.

Es ist ferner wünschenswert, dass das Ammoniumsalz der Substratlösung in hohen Konzentrationen zugesetzt wird. Die Konzentration an Ammoniumionen liegt im allgemeinen zwischen etwa 0,1 bis 7,5 M, vorzugsweise zwischen etwa 1 und 5 M. Die hohe Konzentration an Ammoniumsalz erhöht die Konzentration des Ammoniumhydroxides im System und wirkt ausserdem als Puffer, so dass die pH-Einstellung der Reaktion leichtet reguliert werden kann.

Wenn die Konzentration an Ammoniumionen innerhalb der oben genannten Bereiche liegt, beträgt die Konzentration an t-Zimtsäure in der Lösung im allgemeinen etwa 30 bis etwa 200 mM und vorzugsweise etwa 60 bis etwa 150 mM.

Yamada et al. beschreiben, dass die Substratlösung auf ein pH von 10,0 eingestellt werden sollte. Im Verfahren der vorliegenden Erfindung kann jedoch das pH im Bereich von etwa 8 bis 10 eingestellt werden und vorzugsweise liegt es im Bereich von etwa 8,5 bis etwa 9,5. Die Veröffentlichung von Yamada beschreibt ferner die Einstellung des pH der Substratlösung mit Salzsäure. Dies kann eine beträchtliche Menge an Chlorid in das Substrat einbringen. Im vorliegenden Verfahren wird jedoch das pH der Substratlösung mit einer nicht-halogenhaltigen Säure eingestellt. Bevorzugte Säuren zur Einstellung des pH sind Schwefelsäure, Phosphorsäure und Essigsäure, doch können auch andere halogenfreie Säuren verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Säure ist Schwefelsäure, da sie beim Zusatz zu einer Substratlösung, welche Ammoniumhydroxid enthält, unter Bildung von Ammoniumsulfat reagiert, welches ein bekanntes Mittel zur Enzymstabilisierung darstellt.

Die Substratlösung wird im allgemeinen zu einer PAL enthaltenden Kulturbrühe, den aus einer solchen Brühe getrennten Zellen oder dem isolierten Enzym zugesetzt. Die PAL kann gemäss üblichen, bekannten Methoden erzeugt werden. Die durch PAL katalysierte Reaktion verläuft unter L-Phenylalanin erzeugenden Bedingungen, welche vorzugsweise eine Reaktionstemperatur von etwa 10 °C bis etwa 45 'C umfassen. Unter den Bedingungen des erfindungsge-mässen Verfahrens wird die Stabilität der PAL erhöht, so dass sie wiederholt verwendet werden kann, um L-Phenylalanin in hohen Konzentrationen zu erzeugen.

Das vorliegende Verfahren zur Erzeugung von L-Phenylalanin kann entweder als Freizellenbeschickungssystem oder als immobilisiertes Zell- oder Enzymsystem eingesetzt werden. Das Beschickungssystem kann entweder ein einfaches Beschickungssystem oder ein kontinuierliches Zufuhrbeschik-kungssystem sein. Wenn die PAL in einer Säule immobilisiert ist, kann die Säule als System mit einem einzelnen Durchgang, als Recyclisierungssystem oder als kontinuierliches Zu-fuhrrecyclisierungssystem verwendet werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Immobilisierung des PAL-Enzyms oder der en-zymhaltigen Zellen ist in der US-Patentanmeldung Serial No. 400 141, eingereicht am 20. Juli 1982, beschrieben. Wenn die PAL-Enzyme oder Zellen, welche das Enzym enthalten, an einer Säule immobilisiert werden, kann die Säule bei einer Temperatur von etwa 10 bis etwa 40 °C und vorzugsweise bei etwa 18 bis etwa 30 °C gehalten werden, wenn die Substratlösung durch die Säule gepumpt wird.

Das Reaktionsgemisch kann durch übliche Methoden für die L-Phenylalaninerzeugung analysiert werden. Wenn Schwefelsäure anstelle von Salzsäure in der Substratlösung verwendet wird, wird das L-Phenylalanin in etwa der acht- bis zehnfachen Menge im Vergleich zur Erzeugung in Gegenwart von Salzsäure erzeugt. Wenn das PAL-Enzym immobilisiert wurde, zeigt es eine etwa 50%ige Retention der Aktivität nach 41 Tagen Reaktionsdauer. Dies steht im Gegensatz zu der 20%igen Retention nach 24 Stunden, welche von Yamada et al. beschrieben wurde.

Das L-Phenylalanin kann aus dem Reaktionsgemisch nach üblichen Verfahren isoliert werden.

Die folgenden Präparationen und Beispiele illustrieren das erfindungsgemässe Verfahren.

Präparation I

Ein Kulturmedium wurde nach folgendem allgemeinen Verfahren hergestellt:

Zu 1 Litter deionisiertem Wasser wurden 10 g Pepton, 10 g Hefeextrakt, 0,5 g D,L-Phenylalanin, 5 g Natriumchlorid und 5 g L-Isoleucin zugesetzt. Das pH wurde mit Schwefelsäure auf 6,0 eingestellt und das Gemisch bei 120 °C während 10 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm3 im Autoklaven erhitzt. Auf diese Weise entstand ein Standard-Ausgangsmedium für Kulturröhrchen und Schüttelflaschen.

Präparation 2

Das allgemeine Verfahren von Präparation 1 wurde befolgt, jedoch 100 mM Kaliumjodid (KI) zu dem Medium zugesetzt. Dies bildet ein hochinduzierendes Auswahlmedium.

Präparation 3

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 1 wurde befolgt, jedoch wurden 200 mM KI zum Medium zugesetzt. Dies bildet ebenfalls ein hochinduzierendes Auswahlmedium.

Präparation 4

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 1 wurde befolgt, jedoch 15 g Hefeextrakt anstelle des Peptons verwendet. 200 mM KI wurden ebenfalls zugesetzt. Dies ergab ein hochinduzierendes Schüttelflaschen-Produktionsmedium.

Präparation 5

Ein Fermentationsmedium wurde nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 4 hergestellt, jedoch Natriumchlorid und L-Isoleucin weggelassen. Dies ergab ein hochinduzierendes Fermentationserzeugungsmedium.

Präparation 6

Drei Kulturmedien wurden hergestellt wie in Präparationen 1,2 und 3 beschrieben. Ein PAL erzeugender Stamm von

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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Rhodotorula rubra (ATCC No. 4056), welches auf Schräg-nähragar gehalten wurde, wurde verwendet, um 4,5 cm3 jeder Teströhrchenkultur zu impfen. Die Röhrchen wurden sodann bei 30 °C und 250 Touren pro Minute auf einer Schüttelvorrichtung gehalten. Sieben Übertragungen (0,2 cm3) von jedem Röhrchen in 4,5 ml frisches Kulturmedium wurden nach 24 oder 48 Stunden durchgeführt. Die Kulturröhrchen wurden verwendet, um 200 cm3 Medium in 1000 ml Schüttelflaschen zu impfen. Eine Flasche von jedem Medium wurde nach 3 Stunden und nach 54 Stunden geerntet. Die Zellausbeute nach 30 Stunden betrug durchschnittlich 14 g Paste/Liter und nach 54 Stunden durchschnittlich 29 g Paste/Liter. Die PAL-Aktivität von 100 mM KI war 31 % höher als diejenige der Kontrolle. Die PAL-Aktivität von 200 mM KI war 39% höher als diejenige der Kontrolle.

Präparation 7

Das allgemeine Verfahren von Präparation 6 zur Züchtung der R. rubra -Zellen in 200 mM KI -hochinduzierendem Medium wurde angewendet mit Ausnahme, dass 25 Selektionsübertragungen der 200 mM KI-Kultur durchgeführt wurden. Ferner wurde 24 Stunden nachdem die Schüttelflasche geimpft worden war, 2,5% des Mediums verwendet, um 15 frische (Endflaschen) Schüttelflaschen zu beimpfen, und nach 24 Stunden Kulturdauer wurden diese Flaschen geerntet. Die Zellausbeuten und die PAL-Aktivität wurden bei einigen Flaschen und den gesammelten Endzellpastenprodukt bestimmt. Die höchste PAL-Aktivität von 28,7 g Paste/Liter Medium betrug 18,4 Einheiten/Gramm Paste (528 Einheiten PAL/Liter). (1 Einheit = 1 Mol L-Phenylalanin umgewandelt zu t-Zimtsäure und Ammoniumhydroxid/Minute bei 30 °C). Die Aktivität wurde nach einer Modifikation der Methode von Kalghatgi und Subba Rao, Biochem. J. 149,67 bis 72,1975, bestimmt. Das gesammelte Endprodukt wies 15,0 Einheiten PAL/Gramm Paste bei 27 g Paste/Liter durchschnittlicher Zellausbeute (405 Einheiten PAL/Liter) auf.

Beispiel 1

A) Eine Ammoniumcinnamat-Substratlösung wurde nach folgendem allgemeinen Verfahren hergestellt. Zimtsäure wurde zu Ammoniumhydroxid (28%) zugesetzt, bis sie aufgelöst war. Wasser und Säuren wurden dann zugesetzt, um das Substratvolumen bzw. das pH einzustellen. Die Zimtsäurekonzentration, die Ammoniumhydroxidkonzentration und das pH (Menge an zugesetzter Säure) variiert in den folgenden Beispielen, entsprechend variiert auch die Menge an erzeugtem Ammoniumsalz.

B) Die Wirkung von hohen Halogenkonzentrationen aus PAL wurde untersucht unter Verwendung verschiedener Säuren zur Herabsetzung des pH der Substratlösung. Zwei Substrate, welche nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 8 hergestellt wurden, wurden zubereitet (60 mM CA; 7,5 M NH3; pH 10,0). Lösung A wurde unter Verwendung von Salzsäure auf das gewünschte pH eingestellt, und das pH der Lösung LB wurde unter Verwendung von Schwefelsäure eingestellt. Zellen von R. rubra, gezüchtet wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden in Bechergläser verbracht, welche durch Wassermäntel auf 30 "C gehalten wurden. In zeitlichen Abständen wurden Proben entnommen und auf ihren L-Phe-nylalaningehalt untersucht unter Verwendung von sowohl Dünnschichtchromatographie wie L-Aminosäure-oxydase-enzym-Methoden. Es wurde gefunden, dass die Substratlösung A (enthaltend Ammoniumchlorid) das PAL-Enzym inhibiert. Substratlösung B -Zellen erzeugten zehnmal mehr L-Phenylalanin (nach 24 Stunden Reaktionsdauer) als die Substratlösung A -Zellen.

Beispiel 2

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 1 B wurde durchgeführt, wobei Phosphorsäure mit Schwefelsäure verglichen wurde. Die Zellen von R. rubra in dem mit Phosphorsäure auf das gewünschte pH eingestellte Substrat erzeugten 90% 5 der Menge an L-Phenylalanin, welche unter Verwendung von Schwefelsäure zur Einstellung des pH erhalten wurden.

Beispiel 3

Das allgemeine Verfahren von Beispiel I B wurde durch-lo geführt zum Vergleich von Essigsäure mit Schwefelsäure. Die Menge an L-Phenylalanin, welche in den Reaktoren erzeugt wurde, war dieselbe.

Beispiel 4

15 Nach dem allgemeinen Verfahren gemäss Präparation 6 wurden Zellen erzeugt. Diese Zellen wurden verwendet, um die Wiederverwendbarkeit (Stabilität) der ganzen Zellen zu untersuchen. Drei Substrate wurden zubereitet, 60 mM t-Zimtsäure, 7,5 M Ammoniumhydroxid, pH mit Schwefel-20 säure auf 10,0 bzw. 9,0 bzw. 8,0 eingestellt. Die Zellen (4,5 g Zellpaste) wurden in jedes Substrat (45 cm3) verbracht und während 16 Stunden bei 30 C gehalten. Die L-Phenylalanin-Konzentration wurde nach der L-Aminosäureoxidase-Me-thode und durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. 25 Die Zellen wurden zentrifugiert, gewaschen und während 16 Stunden in frisches Substrat verbracht. Die Resultate sind unten zusammengestellt.

Ansatz I Ansatz II % Aktivitäts-30 pH mg/ml L-PHE mg/ml L-PHE rétention

9

10

0,22 0,95 2,02

0,12 0,78 0,43

55 82 21

35

Die obigen Resultate zeigen, dass, obwohl pH 10,0 die doppelte anfängliche Aktivität von pH 9,0 ergibt, nach einem Ansatz die pH 9,0 -Zellen eine 163% höhere Aktivität als diejenigen von pH 10,0 aufweisen.

40

Beispiel 5

Eine Untersuchung der Stabilität über 2 Wochen wurde wie in Beispiel 4 durchgeführt. Die pH-Werte im Reaktor betrugen jedoch 8,75, bzw. 9,00 bzw. 9,25, und die Ammonium-45 hydroxid-Konzentration betrug 5,5 M. Der 14-tägigeTest wurde mit 6 aufeinanderfolgenden Beschickungsversuchen von freien R. rubra -Zellen durchgeführt.

Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

50

Tabelle I

55

mg L-Phenylalanin erzeugt / Stunde / Gramm Trockengewicht an Zellen (% der noch vorhandenen anfänglichen Aktivität)

pH der Reaktion

60

Tage beim angegebenen pH

1

7

14

65

8,75

9,00

9,25

5,9

5,7

3,6

3,8

7,2

(61)

(67)

(74)

3,5

4,0

(59)

(61)

(70)

Diese Resultate zeigen, dass die richtigen Bedingungen die Wiederverwendung von PAL zur Erzeugung von L-Phenyl-

alanin erlauben, und dass die Retentionsaktivität für freie Zellen hoch ist.

Beispiel 6

Die Zellpaste aus Präparation 7 wurde immobilisiert nach dem allgemeinen Verfahren, welches in der US-Patentanmel-dung Serial No. 400 141 beschrieben ist. Das Substrat (80 mM; 4,8 M NH3; pH 9,23) wurde von unten nach oben durch eine Säule gepumpt, welche mit immobilisierten R. rubra -Zellen gefüllt war. Die Fliessgeschwindigkeiten variierten zwischen 0,10,0,25 und 0,50 SVh_1 bei 22 °C und zwischen 0,25 und 0,50 SVh 1 bei 28 °C. Die ausfliessende Flüssigkeit wurde auf L-Phenylalanin untersucht. Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben.

Tabelle II

Temperatur

Fluss erzeugtes

Produktivität

(°C)

(SVhl)

L-PHE

(g/l/h)

0,10

5,4

0,54

22

0,25

2,7

0,68

0,50

2,1

1,05

0,25

3,8

0,95

28

0,50

2,8

1,40

Bei 0,1 SVh 1 wurde eine 40%ige Umwandlung des Substrates beobachtet, wobei 5,4 g L-Phenylalanin/Liter bei 22 "C erzeugt wurden.

10

20

25

30

Beispiel 7

Die Kultur- und Immobilisierungsbedingungen aus Beispiel 6 wurden wiederholt. Eine Säule aus immobolisierten R. rubra -Zellen, welche PAL enthielt wurde verwendet, um die Produktivität Halblebenszeit der Säule unter gewissen Bedin- 35 gungen zu bestimmen. Das Substrat war 75 mM CA; 4,5 M NH3; pH 9,25, und wurde bei 23 °C mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,25 SVh 1 kontinuierlich betrieben. Die Produk-tivitäts-Halblebenszeit erwies sich als 41 Tage dauernd (siehe Figur 1). Diese Untersuchung zeigt, dass immobilisiertes PAL40 über eine lange Zeil verwendet werden kann und kontinuierlich L-Phenylalanin erzeugt.

Beispiel 8

A) Ein Fermentationsmedium wurde zubereitet wie in Präparation 5 beschrieben und verwendet, um R. rubra in einem 10 Liter -Fermentor zu züchten. Die Beimpfung des Fer-mentors erfolgte wie in Präparation 3. Proben der Zellen wurden periodisch aus dem Fermentor entnommen. Die Zellen

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wurden auf ihre PAL-Aktivität untersucht, um die optimale Erntezeit zu bestimmen. Es wurde gefunden, dass innerhalb 6 Stunden nach Auftreten der Spitzenaktivität weniger als 50% der Spitzenaktivität verblieben.

Es wurde ferner festgestellt, dass das ganze D,L-Phenylalanin vor Erreichung der Spitzenaktivität aus dem Medium verbraucht worden war.

B) Eine Wiederholung des Beispiels 8 A wurde durchgeführt. Jedoch wurde unmittelbar nachdem die Spitzenaktivität aufgetreten war, D,L-Phenylalanin in den Fermentor zugeführt (5 g /10 Liter). In der ersten Stunde erfolgte ein Abfall der PAL-Aktivität wie in 16 A. Die PAL-Aktivität stabilisierte sich jedoch für die nächsten 3 Stunden, bevor die Ernte erfolgte (siehe Figur 2).

Beispiel 9

Zellen wurden gezüchtet und immobilisiert nach dem Verfahren von Beispiel 6. Das verwendete Substrat enthielt jedoch 75 mM CA und 4,5 M NH3 und wies ein pH von 9,43 bei 23 °C und eine Fliessgeschwindigkeit von SVh 1 = 0,50 auf. Es wurde gefunden, dass die Säule 1,9 g L-Phenylalanin / Liter Bettvolumenträger / Stunde erzeugte. Die Konzentration an L-Phenylalanin in der ausfliessenden Flüssigkeit betrug 3,8 g/Liter.

Beispiel 10

Zellen wurden nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 6 gezüchtet und immobilisiert. Die immobilisierten Zellen wurden in eine Säule eingefüllt und 352 cm3 Substrat (75 mM CA; 4,5 M NH3; pH 9,4) wurden mit 1,0 SVh 1 durch die Säule umlaufen gelassen. Proben des Substrates wurden in Zeitabständen entnommen und die L-Phenylalaninkonzen-tration durch L-Amino-oxidas-Enzymversuch und durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. Die Resultate sind in der untenstehenden Tabelle zusammengestellt.

Tabelle III Umlaufzeit (Stunden)

7

21,5

24

44,5

L-Phenylalanin (Gramm/Liter)

2,8 4,6 5,0 6,8

% Umwandlung

23 37 40 55

45

Dieses Beispiel zeigt, dass unter den Bedingungen der Reaktion L-Phenylalanin in hohen Konzentrationen und in hohem Konversionsmass hergestellt werden kann unter Verwendung immobilisierter Zellen, welche PAL enthalten.

C

1 Blatt Zeichnungen

Claims

658 670

1. Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, in welchem

(a) trans-Zimtsäure mit einer Ammoniumionenquelle umgesetzt wird, um eine Substratlösung zu bilden,

(b) das pH dieser Substratlösung eingestellt wird, und

(c) diese Substratlösung mit Phenylalaninammoniumhy-droxid-lyase unter L-Phenylalanin erzeugenden Bedingungen in Berührung gebracht wird, um L-Phenylalanin zu bilden, dadurch gekennzeichnet, dass man

(A) als Ammoniumionenquelle ein halogenfreies Ammoniumsalz verwendet, und

(B) das pH der Substratlösung durch Zusatz einer halogenfreien Säure einstellt.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das pH der Substratlösung derart eingestellt wird, dass es im Bereich von 8 bis 10, insbesondere von 8,5 bis 9,5 liegt.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ammoniumionenquelle ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrit, Ammoniumeitrat und Ammoniumacetat, und vorzugsweise Ammoniumsulfat ist.

4. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das pH der Substratlösung mit einer Säure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Schwefelsäure, Phosphorsäure und Essigsäure, eingestellt wird, vorzugsweise mit Schwefelsäure.

5. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Ammoniumionen im Bereich von 0,1 M bis 7,5 M, vorzugsweise im Bereich von 1 M bis 5 M liegt.

6. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der t-Zimt-säure in der Lösung im Bereich von 30 mM bis 200 mM, vorzugsweise zwischen 60 mM und 150 mM liegt.

7. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Phenylalaninammoniumhy-droxid-lyase wieder verwendet werden kann.

8. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass dem Substrat Phenylalanin-am-moniumhydroxid-lyase enthaltende intakte Zellen in einem Beschickungsreaktor zugesetzt werden.

9. Verfahren nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Beschickungssystem ein einfaches Beschik-kungssystem ist.

10. Verfahren nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Beschickungssystem eine kontinuierliche Zufuhrbeschickung ist.

11. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Phenylalaninammonium-hydroxid-lyase auf oder in einem wieder verwendbaren Träger immobilisiert ist.

12. Verfahren nach Patentanspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Phenylalanin-ammoniumhydroxid-lyase in einer Säule immobilisiert ist, welche vorzugsweise bei einer Temperatur von 10 bis 40 "C, insbesondere von 18 bis 30 nC gehalten wird, wenn die Substratlösung durch die Säule gepumpt wird.