CH662056A5 - Procede de purification de polyosides de streptococcus pneumoniae et vaccin a base de polyosides ainsi purifies. - Google Patents
Procede de purification de polyosides de streptococcus pneumoniae et vaccin a base de polyosides ainsi purifies. Download PDFInfo
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Description
La présente invention a pour objet un procédé de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae.
L'invention a également pour objet un vaccin contre les infections provoquées par les bactéries Streptococcus pneumoniae à base de polyosides ainsi purifiés.
On sait que plusieurs types de Streptococcus pneumoniae provoquent diverses infections telles que des méningites, des pneumonies, des otites et diverses bactériémies.
Il est connu également que la purification de polyoside capsulaire purifié extrait de bactéries Streptococcus pneumoniae permet de réaliser des vaccins pour l'immunisation contre les infections provoquées par lesdites bactéries.
Le brevet français N° 2.388.563 décrit un. procédé de séparation et de purification de Polysaccharides capsulaires de pneumocoque. Cette purification comporte un stade final d'élimination des protéines éventuellement encore présentes par un traitement avec un mélange phénol/eau à 65° C. Il convient de remarquer que ce brevet n'indique pas que les Polysaccharides ainsi préparés ont un pouvoir immunogène. Ce brevet envisage simplement d'utiliser ces Polysaccharides capsulaires en vue de potentialiser l'action de vaccin contenant à titre de principe vaccinal des ARN ou des ribosomes. Par ailleurs, il résulte des expériences effectuées qu'un traitement à 65° C entraîne une dégradation des Polysaccharides capsulaires.
L'article résumé dans Chemical Abstracts, volume 71,1969, 121704g, décrit l'extraction des antigènes polysaccharidiques de streptocoques à partir de cellules entières séchées par extraction à l'acide trichloracétique et précipitation des Polysaccharides par l'acétone. La partie soluble dans un mélange phénol/eau est ensuite précipitée par l'étahnol.
L'article résumé dans Chemical Abstracts, volume 76, 1972, 2430h, ne mentionne pas de procédé de préparation des antigènes polysaccharidiques.
L'article résumé dans Chemical Abstracts, volume 77, 1972, 32483r, décrit l'extraction d'un antigène de la paroi cellulaire d'un streptocoque par diverses méthodes, dont l'extraction par un mélange phénol/eau à 68° C. Il s'agit dans ce procédé de solubiliser les lipopolysaccharides de la paroi cellulaire. Cet article ne concerne pas l'extraction de Polysaccharides capsulaires et, comme remarqué ci-dessus, un traitement à 68" C dégrade les Polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae.
La demande de brevet européenne N° 78.400185.1, décrit notamment un procédé de purification de polyoside de Streptococcus pneumoniae par précipitation fractionnée à l'alcool puis élimination des protéines et des acides nucléiques. L'élimination des protéines et des acides nucléiques est effectuée soit par des traitements à l'aide d'enzymes, soit par des traitements à l'aide de tensioactif cationique, ces traitements étant suivis d'une diafiltration.
Dans cette demande de brevet européenne, la précipitation fractionnée par l'alcool est appliquée directement au milieu de culture,
sans lyse préalable, et, en raison de la présence d'impuretés variées, les divers traitements de purification nécessitent la réalisation systématique sur chaque lot d'essais préliminaires de détermination des quantités de matières premières à utiliser pour les précipitations al-5 cooliques fractionnées et pour le traitement par le tensioactif cationique.
Le procédé de la présente demande est effectué sur un produit de départ lysé dont les débris cellulaires ont été éliminés (clarification). Ce procédé permet d'éviter la réalisation d'essais préliminaires l0 systématiques.
D'une façon générale, ce procédé permet de raccourcir de façon importante la durée de l'ensemble des étapes de purification des polyosides de Streptococcus pneumoniae.
La présente invention a pour objet un procédé de purification 15 d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae, caractérisé par le fait que le produit de départ est une solution aqueuse dudit polyoside, contenant des impuretés protéiques, obtenue par lyse d'une culture de Streptococcus pneumoniae puis clarification et concentration du polyoside, que l'on ajoute de 5 à 50% en volume de phénol, à tem-2o pérature de 5 à 30° C environ, que l'on agite, puis sépare et recueille la phase aqueuse, et que l'on répète, si nécessaire, le traitement au phénol jusqu'à ce que la teneur en protéines de la phase aqueuse soit inférieure à un seuil prédéterminé.
Ce procédé de traitement au phénol permet donc de réaliser l'éli-25 mination de la majeure partie des protéines présentes dans la solution impure de départ. On a découvert que ce traitement au phénol ne modifie pas la structure moléculaire et donc l'activité biologique du polyoside.
On notera que ce traitement au phénol est effectué ici à un stade 30 précoce du procédé de purification, sur un produit de départ contenant au moins 20% en poids, et généralement de 30 à 50% en poids, de protéines (sur produit de départ sec).
Selon des modes de réalisation particuliers actuellement préférés, ce procédé présente encore les caractéristiques suivantes, prises isolé-35 ment ou en combinaison:
— la solution aqueuse de départ contient de 1 à 30 g/litre de polyoside impur;
— on opère à température de 10 à 20 C environ;
— on ajoute le phénol sous la forme d'un mélange phénoleau; 40 — le mélange phénol/eau est constitué par du phénol dans lequel l'eau est dissoute;
— on effectue le traitement au phénol à un pH de 6,9 ± 0.5 environ;
— la solution de polyoside de départ est une solution tamponnée;
— la solution tamponnée est par exemple un tampon acétate de 45 sodium;
— le phénol est ajouté sous la forme d'un mélange phénol/solution tamponnée;
— on ajoute de 10 à 60% vol./vol. du mélange phénol/eau ou phénol/solution tamponnée;
so — la quantité d'eau ou de solution tamponnée dudit mélange correspond sensiblement à la quantité maximum pouvant être dissoute dans le phénol;
— ledit seuil correspond à une teneur en protéines de 5% en poids, c'est-à-dire de 5 g de protéines pour 100 g de polyoside brut;
55 — on soumet la phase aqueuse recueillie à une dialyse pour éliminer le phénol résiduel.
Pour mettre en œuvre ce procédé de déprotéinisation par un phénol, on procède avantageusement de la façon suivante: on ajoute le phénol à la solution de polyoside à purifier puis on soumet le 60 mélange à une ultracentrifugation. On obtient ainsi une séparation en trois phases: une phase inférieure phénolique, une interphase pro-téique et une phase aqueuse supérieure contenant le polyoside. Cette phase aqueuse est recueillie et soumise si nécessaire à un nouveau traitement au phénol. Le processus peut être ainsi recommencé 65 jusqu'à l'obtention d'une teneur en protéines inférieure au seuil fixé. La détermination du taux de contamination protéique peut être réalisée après isolement, par précipitation alcoolique puis dessiccation sous vide, d'une quantité aliquote de polyoside contenu dans la
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phase aqueuse, par dosage colorimétrique selon la technique de Lowry et coll. décrite dans J. Biol. Chem. 143, 265 (1951) avec la sérum-albumine bovine comme étalon.
Toutefois, l'expérience a montré qu'en utilisant des techniques constantes de culture, il est possible de déterminer une fois pour toutes le nombre de traitements au phénol (généralement 1 ou 2) nécessaires pour chaque type de polyoside.
Afin de purifier davantage le polyoside, on peut effectuer, outre le traitement de déprotéinisation par le phénol, d'autres traitements, et notamment des traitements permettant d'éliminer les contaminants nucléiques.
Selon un mode de réalisation du procédé tel que défini ci-dessus, et afin d'éliminer les contaminants nucléiques, on ajoute en outre à la solution de polyoside, en présence d'ions calcium, un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité puis on ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside.
Selon des modes de réalisation particuliers, ce traitement supplémentaire par un alcool en présence d'ions calcium présente encore les caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison:
— on effectue cette précipitation fractionnée à l'alcool généralement après le traitement au phénol; il est toutefois possible de l'effectuer avant le traitement au phénol, comme illustré à l'exemple 17 ci-après;
— l'alcool utilisé est l'éthanol;
— on effectue la précipitation fractionnée à l'alcool à une température de 0 à + 15° C environ;
— on ajoute l'alcool jusqu'à une concentration de 10 à 35% environ (vol./vol.) pour précipiter les contaminants nucléiques, puis on ajoute encore de l'alcool au surnageant jusqu'à précipitation complète du polyoside;
— on opère en présence d'ions calcium à une molarité de 0,25-2M environ.
Selon un autre mode de réalisation du procédé de purification de l'invention, pour éliminer les contaminants nucléiques, il est encore possible de soumettre la solution à purifier à un traitement supplémentaire au charbon actif en quantité suffisante pour adsorber la majeure partie des contaminants nucléiques, puis d'éliminer le charbon actif sur lequel les contaminants nucléiques sont adsorbés.
Généralement, on ajoute de 0,1 à 12% (poids/volume) de charbon actif. Si la teneur en acides nucléiques, après un premier traitement au charbon actif, est supérieure au seuil que l'on s'est fixé, on peut répéter ledit traitement.
Ce traitement au charbon actif peut être effectué soit à la place du traitement à l'alcool en présence d'ions calcium, soit en complément de ce traitement.
Si le taux initial de contamination nucléique est supérieur à 15% en poids, on effectue d'abord la précipitation fractionnée à l'alcool en présence d'ions calcium.
Si, après la précipitation fractionnée à l'alcool, la teneur en acide nucléique du polyoside est supérieure au seuil fixé (par exemple supérieure à 1 ou 2% en poids), on peut remettre en solution le précipité de polyoside et le soumettre alors à un traitement au charbon actif tel que décrit précédemment.
Si le taux initial de contamination nucléique est inférieur à 15% en poids, l'élimination des acides nucléiques est de préférence réalisée uniquement par un traitement au charbon actif.
Le taux de contamination nucléique peut être apprécié par mesure spectrophotométrique de l'absorption à 260 nm d'une solution aqueuse polyosidique préparée par redissolution dans l'eau distillée d'une quantité aliquote de polyoside obtenu par dessiccation du précipité provenant du traitement à l'éthanol d'une partie aliquote de la solution obtenue après le traitement au phénol et dialyse. Une valeur égale à 1 est attribuée à l'absorbance de 50 microgrammes d'acide nucléique dans 1 ml d'eau, dans une cuve ayant un trajet optique de 1 cm.
Toutefois, l'expérience a montré qu'en utilisant des techniques constantes de culture, il est possible de déterminer une fois pour toutes le type et le nombre de traitements nécessaires pour une élimination satisfaisante des contaminants nucléiques. La concentration optimale en charbon actif, qui est celle qui permet la plus forte réduction du taux d'acides nucléiques, est déterminée par des esais 5 préliminaires sur chaque lot de polyoside à purifier. Cette concentration en charbon actif varie en pratique de 0,1 à 12% (poids/volume).
Pour la purification finale du polyoside, on peut soumettre le polyoside à une précipitation puis laver le précipité. On peut effectuer par exemple la précipitation avec une solution aqueuse de sulfate io d'ammonium ou avec un alcool. On lave ensuite le précipité avec au moins un agent de lavage choisi dans le groupe constitué par un alcool (tel que l'éthanol), l'acétone ou l'éther éthylique.
Généralement, pour obtenir la solution aqueuse de polyoside de départ, on ajoute à une solution aqueuse de polyoside à purifier 15 (obtenue après lyse, clarification et concentration) un alcool miscible à l'eau de façon à précipiter le polyoside puis l'on remet le précipité en solution. On peut effectuer cette précipitation en plusieurs étapes (généralement deux étapes) en ajoutant l'alcool en quantités croissantes de façon à précipiter d'abord des impuretés puis le polyoside. 20 On peut également dans certains cas, en particulier lorsque le polyoside précipite pour une concentration d'alcool relativement faible, effectuer une précipitation alcoolique directe. C'est en particulier le cas pour les polyosides des types 3 et 8, comme cela est illustré ci-après dans la partie expérimentale. De préférence la précipitation à 25 l'alcool est effectuée en présence d'un sel soluble dans le milieu, afin d'augmenter la force ionique. On peut utiliser par exemple un sel de sodium. On peut également effectuer cette précipitation préliminaire à l'alcool en présence de sels de calcium. Dans ce cas ce stade préliminaire permet d'éliminer la majeure partie des contaminants nucléi-30 ques, avant le stade d'élimination des protéines par le phénol.
La concentration du sel peut varier de 0,1 à 2M.
La précipitation directe consiste en l'addition d'un volume d'alcool suffisant pour permettre d'obtenir l'insolubilisation du polyoside. Celui-ci est récupéré par centrifugation avec ou sans décantation 35 préalable du surnageant.
La précipitation alcoolique fractionnée est réalisée de préférence en deux temps. Dans un premier temps on ajoute un volume d'étha-nol permettant la précipitation sélective des contaminants (principalement protéines et acides nucléiques). Au surnageant obtenu après 40 centrifugation, on ajoute dans un deuxième temps le volume d'alcool suffisant pour provoquer la précipitation complète du Polysaccharide. Après centrifugation le sédiment est remis en solution en vue du traitement par le phénol.
Généralement une concentration en alcool de 10 à 30% (vol./vol.) 45 est suffisante pour insolubiliser une partie des contaminants protéiques et nucléiques. Une concentration finale variant selon les cas entre 30 et 80% est généralement nécessaire pour la précipitation des polyosides. Toutefois, lorsque le polyoside précipite déjà pour une faible concentration en alcool (par exemple pour une concentration 50 de 15-20%) on effectue alors une précipitation directe du polyoside.
L'alcool utilisé est de préférence l'étahnol. On effectue la précipitation à l'alcool généralement à une température de 0 à +15° C environ.
Cette précipitation préliminaire à l'alcool peut être remplacée 55 par une précipitation avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de concentration suffisante pour précipiter le polyoside.
Comme il a été indiqué ci-dessus, le produit de départ a été soumis à une concentration préalable après lyse du milieu de culture et élimination des débris de culture cellulaire par clarification. Pour réali-60 ser cette concentration, on opère de préférence par ultrafiltration. Le facteur de concentration peut varier de 4 à 15 environ, suivant le volume et la viscosité du surnageant à concentrer. L'ultrafiltration est réalisée par exemple à l'aide de membranes retenant les substances de poids moléculaire supérieur à 10 000. Il est également possible 65 d'utiliser des membranes qui retiennent les substances de poids moléculaire supérieur à 50000, ou supérieur à 100000.
Selon un mode de réalisation préféré, pour obtenir la solution de polyoside de départ, on effectue la culture de Streptococcus pneumo-
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niae en milieu semi-synthétique exempt de protéines. La culture comporte de préférence trois étapes de préculture de 3-4 heures chacune.
L'utilisation d'un milieu semi-synthétique pour une culture industrielle de Streptococcus pneumoniae n'avait jamais été réalisée. Elle permet de simplifier les purifications ultérieures en évitant l'addition de protéines étrangères difficiles à éliminer.
Les précultures liquides et la culture industrielle sont effectuées en milieu semi-synthétique. Pour la culture en grand fermenteur, il est avantageux de prévoir une régulation du pH et une addition de glucose automatiques.
Le pH est, suivant les cas, régulé entre 6,0 et 7,4 environ par addition de soude 5N ou de toute autre solution alcaline.
Afin d'obtenir un taux optimal en Polysaccharide, il y a lieu d'arrêter la culture après complet développement des corps microbiens, soit environ après 12-18 heures à température de 37 ± 0,2° C.
En fin de cycle, la culture est stérilisée par exemple par addition d'une faible quantité de phénol (par exemple 0,5%) et les germes sont lysés par addition d'un agent lysant tel que le désoxycholate de sodium.
Pour la culture on utilise comme milieu de base, le milieu suivant:
— Hydrolysat acide de caséine 22,230 g
— LCystine 0,166 g
— L Tryptophane 0,022 g
— L Tyrosine 0,220 g
— Phosphate bipotassique K2H P04 5,560 g
— Eau distillée q.s.p. 1000 ml
Le pH est ajusté à 7,6 par addition de soude.
Le milieu complet utilisé pour effectuer la deuxième préculture et les suivantes ainsi que la culture industrielle correspond à la formule suivante:
— Milieu de base 900 ml
— Solution de glucose à 50% 25 ml
— Solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance 50 ml
— Solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique 25 ml
Le pH est ajusté à 7,6.
La solution de glucose à 50% est préparée par dissolution de 50 g de glucose anhydre dans 100 ml d'eau distillée. On stérilise pendant 30 minutes à 120° C.
La solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance a la formule suivante:
— Solution de vitamines
200 ml
—• Solution de sels
40 ml
— L-Glutamine
12,5 g
— Asparagine
2g
— Chlorhydrate de choline
0,2 g
— Eau distillée q.s.p.
1000 ml
Cette solution filtrée stérilement est conservée à + 4° C.
La solution de vitamines peut avoir la composition suivante:
— Biotine
0,15 mg
—■ Ac. Nicotinique
100 mg
— Pyridoxal
100 mg
— Calcium pantothénate
500 mg
— Thiamine
100 mg
— Riboflavine
100 mg
— Adénine sulfate
1000 mg
— Uracil
1000 mg
— Eau distillée froide q.s.p.
1000 mi
La solution de sels a la formule suivante:
— Sulfate de magnésium Mg S04,7H20
250 g
— Sulfate ferreux Fe S04,7H20
2,5 g
— Sulfate de zinc Zn S04,7H20
0,400 g
— Sulfate de manganèse Mn S04, H20 0,180 g
— Acide chlorhydrique 10 ml
— Eau distillée q.s.p. 1000 ml
La solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique a la formule suivante:
— Bicarbonate de sodium 40 g
— Acide thioglycolique 10% 40 ml
— Eau disitillée q.s.p. 1000 ml
On donne ci-après le schéma d'une technique de culture: Préculture I
On ensemence des boîtes de gélose à 5% de sang de cheval avec le Streptococcus pneumoniae choisi lyophilisé. On dilue le contenu de l'ampoule lyophilisée avec 1 ml de bouillon trypticase soja et on répartit à la surface des boîtes de Pétri. On place à l'étuve pendant 16-17 heures à 361 C.
Préculture II
Dans des récipients contenant 45 ml de milieu de base on ajoute stérilement 1,25 ml de la solution de glucose à 50%, 2,50 ml de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance et 1,25 ml de la solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique.
On ensemence à partir du produit de la préculture I et on cultive à 36" C pendant 3 à 4 heures sous agitation lente.
Préculture III
Dans un flacon de 5 1 renfermant 2,4 litres de milieu de base, on ajoute 60 ml de la solution de glucose, 120 ml de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance et 60 ml de la solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique.
On ensemence avec 500 ml de la préculture II, puis on cultive pendant 3 à 4 heures en agitant à 36 C.
Culture proprement dite
On utilise 36 1 de milieu de base stérilisés que l'on sature en gaz carbonique. On ajoute à ce milieu de base 1 litre de la solution de glucose, 2 1 de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance, et 1 litre de la solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique.
On ramène le pH à 7,6 avec de la soude 5N.
On cultive à température de 36 C, en agitant, sans aération, de préférence sous gaz inerte ou sous gaz carbonique, le pH étant régulé entre 6,0 et 7,4 avec de la soude 5N.
Au bout de 8 heures de culture environ, on ajoute le mélange suivant:
— 1 litre de la solution de glucose à 50%
— 0,335 1 d'une solution d'acétate d'ammonium à 46,2 g%
Arrêt de la culture
L'arrêt de la culture est fonction de la lyse des germes:
a) lyse naturelle: elle survient au bout de 60 à 96 heures de culture et on peut la suivre par l'examen microscopique de la morphologie des germes;
b) lyse provoquée au bout de 12-17 heures de culture: à la culture refroidie et transvasée dans un récipient, on ajoute sous agitation 10% d'une solution de désoxycholate de sodium à 10%, soit une concentration finale de 1%. On agite pendant 30 minutes.
Clarification
Pour éliminer les débris cellulaires, on effectue une centrifugation et on récupère le surnageant clarifié.
Comme il a été indiqué ci-dessus, les polyosides purifiés de Streptococcus pneumoniae permettent de réaliser des vaccins.
L'invention a également pour objet un vaccin pneumococcique contenant au moins un polyoside purifié selon le procédé décrit dans la présente demande.
Un exemple de réalisation et d'utilisation d'un tel vaccin est donné ci-après dans la partie expérimentale.
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Un vaccin pneumococcique monovalent est constitué par dissolution d'un polyoside purifié dans une soluté isotonique tamponné. Un vaccin pneumococcique polyvalent est constitué d'au moins 2 polyosides purifiés dissous dans un soluté isotonique tamponné. On sait que l'on peut distinguer plusieurs types sérologiques de Streptococcus pneumoniae, qui sont répertoriés selon la nomenclature rappelée dans le Tableau I ci-après.
Tableau 1
Type
Nomenclature danoise
Nomenclature américaine
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2
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3
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5
5
6A
6
6B
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7F
Q
51
Q
O
9N
Ö
9
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34
12A
83
12F
12
14
14
15B
54
17F
17
18C
56
19F
19
20
20
22F
22
23F
23
25
25
Dans la présente demande, on a utilisé la nomenclature danoise.
On donne ci-après des modes d'exécution non limitatifs du procédé de l'invention pour certains polyosides particuliers:
— Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 1, 4, 5, 10A, 12F, 15B, 17F, 18C, 22F, 23F ou 25, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute d'abord à ladite solution aqueuse de départ un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés puis, après élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, et que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par précipitation fractionnée avec un alcool en présence d'ions calcium puis par le traitement au charbon actif.
— Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 2, 6A, 6B ou 19F, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute d'abord à ladite solution aqueuse de départ un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés puis, après élimination de cel-les-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un .phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par précipitation fractionnée avec un alcool en présence d'ions calcium.
— Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 7F, 9N, 12A ou 14, et selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés puis, après élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on dissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines,
puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par le charbon actif.
— Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 3 ou 8, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter directement le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par le charbon actif.
— Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 6B, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside, en présence d'ions calcium, un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité et ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside, que l'on redissoùt le précipité de polyoside puis que l'on soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines.
L'invention a également pour objet un procédé de purification présentant tout ou partie des caractéristiques des procédés décrits dans les exemples non limitatifs suivants.
Dans ces exemples, l'acétate de sodium utilisé est l'acétate de sodium hydraté AcNa, 3H20.
L'acide acétique utilisé est l'acide acétique pur appelé acide acétique glacial.
On rappelle que l'eau physiologique est une solution aqueuse apyrogène de chlorure de sodium à 8 g/1.
D'une façon générale, pour les précipitations à l'éthanol, on utilise de l'éthanol prérefroidi à — 20° C afin d'éviter une augmentation notable de température due à la dissolution de l'éthanol.
Exemple 1:
Purification du polyoside pneumococcique type 1 Stade 1: culture Précultures lre préculture:
A partir de germes lyophilisés on ensemence des boîtes de Roux de 2 1 renfermant de la gélose à 5% de sang de cheval. On laisse incuber 16 h à 36° C ± 1, de préférence en atmosphère humide et sous gaz carbonique.
2e préculture:
Après un contrôle de pureté on ensemence, avec la suspension obtenue à partir de ces 6 boîtes de gélose, 6 erlens renfermant 500 ml de milieu complet. On culture pendant 2 à 2 lA h à 36° C ± 1 avec une agitation modérée.
3e préculture:
On utilise à ce stade soit un fermenteur, soit un récipient comportant un système permettant une légère agitation de l'ordre de 50 rpm. Après un contrôle de pureté, on transfère la culture obtenue à partir des erlens dans 12 1 de milieu complet frais et on laisse incuber à 36° C ± 1 pendant 3 à 3 'A h.
Culture
On utilise un fermenteur de capacité utile de 200 1 comportant une agitation de type vortex.
Après la stérilisation du milieu et l'introduction des facteurs de croissance, on procède à un balayage par du gaz carbonique jusqu'à stabilisation du pH à 6,2 ± 0,2. On ramène le pH à 7,6 avec de la soude 5N et on ensemence à raison de 6% d'inoculum. On maintient la culture à 36' C ± 1 sous agitation de 600 rpm avec une régulation de pH à 6,8 avec de la soude 5N. Au bout de 8 h de culture on
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procède à une addition de glucose et d'acétate d'ammonium à raison respectivement de 12,50 g et 4 g par litre de milieu.
Au bout de 16 h de culture on vérifie la pureté et l'identité de la culture puis on procède à la lyse des germes par addition de 1 %
d'une solution de désoxycholate de sodium à 10%.
Après une demi-heure de contact sous agitation, on vérifie que la lyse est totale. On ajoute 0,5% de phénol aqueux puis on centrifuge. Le surnageant est collecté dans une cuve préalablement stérilisée et refroidie.
Stade 2: Purification préliminaire du polyoside pneumococcique Concentration
Le surnageant de culture (3 x 200 litres) préparé comme précédemment décrit est concentré, lavé avec 3 x 60 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10 000 (type Amicon ou Romicon).
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée (110 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5% (poids/volume).
Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale d'alcool comprise entre 15 et 35% (préférentiellement 20%). L'agitation est poursuivie pendant 20 minutes à +4° C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35 000 rpm à +4° C.
La concentration en acétate de sodium de surnageant alcoolique (153 litres) est amenée à 5 g% (poids/volume) et le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique glacial.
On ajoute, sous agitation, de l'éthanol absolu déshydraté prérefroidi à —20° C jusqu'à une concentration finale en alcool de l'ordre de 40-65% (préférentiellement 44,4%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,8 avec l'acide acétique. Le mélange est laissé au repos à +4° C pendant 16 heures, le précipité est alors recueilli par décantation et centrifugation à 4200 rpm, à +4° C. Il constitue le polyoside brut.
Stade 3: Dèprotéinisation
Le polyoside brut (1900 g poids humide) est mis en solution dans environ 40 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,2 à 0,4 volume (préférentiellement 0,33 volume) du mélange phénol/tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9 (1:0,4 vol./vol.).
Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un dis-perseur, on soumet l'émulsion obtenue à une ultracentrifugation à 35 000 rpm, à +14° C. La phase aqueuse contenant le polyoside est à nouveau soumise à un deuxième traitement phénolique. Le processus est recommencé, si nécessaire, jusqu'à ce que la phase aqueuse contienne moins de 5 g% de protéines (généralement 2 cycles sont suffisants). Le dosage des protéines est effectué selon la technique de Lowry et coll., J. Biol. Chem. 143, 265 (1951).
La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à +4° C pour éliminer le phénol résiduel.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (44,7 litres) on ajoute lentement 6,4 litres d'une solution aqueuse de CaCl2 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'étahnol jusqu'à l'obtention d'une concentration finale comprise entre.10 et 30% (préférentiellement 15%). L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à +4C C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 30 000 rpm à +4° C.
La concentration éthanolique du surnageant est, sous agitation vive, amenée à une valeur comprise entre 40 et 60%, généralement 44,4%.
Après 30 minutes d'agitation, la solution est laissée au repos à + 4 C pendant 16 heures puis centrifugée en continu à 15 000 rpm, à +4 C.
Le précipité ainsi obtenu (430 g poids humide) est remis en solution dans 40 litres d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0.14M.
b) Traitement au charbon actif
On ajoute rapidement, sous agitation, à la solution polyosidique le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20 g% (poids/volume) dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9, pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 8 g% (préférentiellement 3 g%).
Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à +4 C.
Le charbon est ensuite éliminé par filtration.
Le filtrat est dialysé contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à +4:: C.
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution polyosidique dialysée (57 litres) on ajoute 3420 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté prérefroidi à —20e C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique finale comprise entre 40 et 65% (préférentiellement 44,4%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 et la solution est laissée au repos à +4" C pendant 16 heures. Le polyoside est récupéré par décantation et centrifugation à 4200 rpm à +4: C.
Le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu prérefroidi à —20 C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus. Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à 2 lavages successifs par 3 x 500 ml d'acétone prérefroidi à —20 C et par 3 x 500 ml d'éther éthylique prérefroidi à — 20; C. On filtre sur verre fritté de porosité 5. Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché sous vide durant une nuit à 0? C.
Le polyoside déshydraté est réduit en poudre.
On obtient ainsi 80 g de polyoside purifié type 1.
En opérant de façon analogue à celle décrite ci-dessus, on a purifié les polyosides pneumococciques de types 10A, 15B, 17F, 20 et 22F.
Exemple 2:
Polyoside pneumococcique type 4 Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation de surnageant sont analogues à celles décrites dans l'exemple 1, exception faite de la régulation pH qui est réalisée à un pH égal à 7,2 ± 0,2.
Stade 2: Purification préliminaire Concentration
Le surnageant de culture (600 litres) est réduit à un volume d'environ 50 litres et lavé plusieurs fois par dilution-concentration avec 100-200 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette opération est réalisée par filtration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10000.
Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors à nouveau concentré par ultrafiltration. Le facteur de concentration dépend du volume et de la viscosité du surnageant initial, il est compris généralement entre 4 et 15.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée (47 litres), on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 6% (poids/volume). Le pH est ajusté à 5,40 par l'acide acétique et on ajoute lentement, sous agitation vive, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir une con-
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centration finale en alcool comprise entre 30 et 50% (préférentiellement 37,5%).
Après 30 minutes d'agitation à +4° C, le mélange est ultracentri-fugé.
La concentration en acétate de sodium du surnageant (73 litres) est amenée à 7,5 g% et le pH ajusté à 5,80 par l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale en alcool de l'ordre de 60-80% (préférentiellement 75%).
Au bout d'une demi-heure d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 avec l'acide acétique et le mélange est laissé au repos à +4 C pendant 16-18 heures. Le surnageant est éliminé par décantation et le précipité de polyoside brut récupéré par centrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (530 g poids humide) est mis en solution dans environ 20 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9.
A cette solution est ajouté 0,2 à 0,5 volume, généralement 0,25 volume, du mélange phénol/tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9 (1:0,4 vol./vol.).
Après agitation vive pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, le mélange est ultracentrifugé comme à l'exemple 1.
La phase aqueuse contenant le polyoside est soumise à un deuxième cycle de traitement phénolique. Le processus est recommencé, si nécessaire, jusqu'à l'obtention d'une solution polyosidique contenant moins de 5 g% de protéines.
La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à +4° C.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (18,5 litres), on ajoute lentement 2,65 litres d'une solution de CaCl2 4M. Après 15 minutes d'agitation à +4° C, on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à l'obtention d'une concentration finale comprise entre 15 et 35% (préférentiellement 25%). L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à +4° C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35000 rpm, à +4°C.
La concentration en éthanol du surnageant est, sous agitation, amenée à une valeur comprise entre 60 et 80%, généralement 75.
Après une demi-heure d'agitation, le mélange est laissé au repos à +4" C pendant 16 heures.
Après décantation, le précipité est récupéré par centrifugation à 4200 rpm à +4° C puis dissous dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9 (8 litres).
b) Traitement au charbon actif
A la solution polyosidique on ajoute rapidement, sous agitation, le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20 g% (poids/volume) dans du chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9 pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 5 g% (préférentiellement 0,5%). Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à +4° C.
Le charbon est ensuite éliminé par filtration. Le filtrat est dialysé contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à +4° C.
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution obtenue après dialyse (11 litres), on ajoute 1320 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,40 par addition d'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté prérefroidi à —20° C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique comprise entre 60 et 80% (préférentiellement 75%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 ± 0,1 et la solution est laissée au repos à +4° C pendant 16-18 heures. Le polyoside est récupéré par décantation et centrifugation. Il est mis en suspension par agitation manuelle dans un litre d'éthanol absolu prérefroidi à — 20° C puis centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à 2 lavages successifs par 3 x
300 ml d'acétone prérefroidi à — 20° C et par 3 x 300 ml d'éther éthy-lique prérefroidi à —20° C. On filtre sur verre fritté de porosité 5.
Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché à 0° C et réduit en poudre. On obtient ainsi 64 g de polyoside purifié type 4.
Exemple 3:
Polyoside pneumococcique type 5 Stade 1: Culture
Les conditions de culture et de préparation du surnageant de culture sont identiques à celles utilisées pour la préparation du polyoside pneumococcique type 4 (exemple 2).
Stade 2: Purification préliminaire Concentration
Le surnageant de culture (43 litres) est concentré, lavé avec 3 x 12 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré par ultrafiltration de façon à retenir les substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10 000. Le facteur de concentration varie de 4 à 10 suivant le volume et la viscosité de surnageant initial.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée (8 litres), on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5 g% (poids/volume). Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale comprise entre 15 et 40%. L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à +4° C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35 000 rpm à +4° C.
La concentration en acétate de sodium du surnageant alcoolique (11,1 litres) est amenée à 7,5 g% et le pH est ajusté à 5,8-6,0 par addition d'acide acétique.
On ajoute, sous agitation, un volume d'éthanol permettant la précipitation complète du polyoside (concentration finale comprise entre 40 et 80%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 ± 0,2 avec l'acide acétique glacial. Le mélange est laissé au repos à +4° C pendant environ 24 heures. Le précipité de polyoside brut est recueilli par décantation et centrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (400 g poids humide) est mis en solution dans environ 3 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,2 à 0,6 volume du mélange phénol/tampon acétate de l'exemple 1. Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, on soumet la dispersion à une ultracentri-fugation comme à l'exemple 1. La phase aqueuse contenant le polyoside est à nouveau soumise à un deuxième traitement phénolique. Le processus est éventuellement recommencé jusqu'à l'obtention d'une solution polyosidique contenant moins de 5 g% de protéines. La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4° C pour éliminer le phénol résiduel.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (2,1 litres), on ajoute lentement 0,3 litre de solution aqueuse de CaCl2 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à l'obtention d'une concentration finale comprise entre 10 et 35%. L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à +4° C puis le mélange est ultracentrifugé à 10 000 rpm pendant 20 minutes à +4° C.
On dilue le surnageant avec un à deux volumes d'éthanol pour précipiter complètement le polyoside. Le mélange est laissé au repos pendant 24 heures à 4-4° C puis on recueille le précipité par centrifugation.
b) Traitement au charbon actif
Le précipité (2 g) est mis en solution dans 0,6 litre de tampon NaCl 0,14M, pH 6,9 ± 0,2 puis on ajoute rapidement sous agitation le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à
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20 g% (poids/volume) dans une solution de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9, pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8 g%. Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à +4° C.
Le charbon est éliminé par centrifugation et/ou par filtration. Le filtrat est dialysé contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à +4°C. \
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
La concentration en acétate de sodium de la solution dialysée obtenue précédemment est amenée à une valeur comprise entre 6 et 12 g% (poids/volume) et le pH est ajusté à 5,4-5,8 par l'acide acétique glacial.
On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté prérefroidi à — 20° C permettant la précipitation complète du principe actif (concentration finale en alcool comprise entre 40 et 80%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 avec l'acide acétique et la solution est laissée au repos à +4° C pendant 24 à 48 heures. Le polyoside est récupéré par ultracentrifugation en continu à 35 000 rpm, à +4° C.
Le précipité est mis en suspension dans de l'éthanol absolu prérefroidi à — 20° C puis centrifugé à 4200 rpm à +4° C.
Cette opération est recommencée une fois puis le précipité est lavé successivement par l'acétone et l'éther, comme décrit aux exemples précédents.
Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché sous vide à 0° C.
Le polyoside purifié est réduit en poudre.
Exemple 4:
Polyoside pneumococcique type 12F Stade 1: Culture
Les conditions expérimentales de culture et de préparation du surnageant sont analogues à celles décrites dans l'exemple 1, exception faite du pH qui est régulé à 7,2-7,4 avec la soude 5N.
Stade 2: Purification préliminaire du polyoside pneumococcique
Concentration
Le surnageant de culture (2 x 220 litres) préparé comme précédemment décrit est concentré, lavé avec 2 x 60 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré, par ultrafiltration, comme décrit à l'exemple 1, stade 2.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée (91 litres), on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5,2% (poids/volume).
Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol, jusqu'à une concentration finale d'alcool comprise entre 15 et 35% (préférentiellement 25%), puis on centrifuge.
La concentration en acétate de sodium (AcNa, 3H20) du surnageant (131 litres) est amenée à 6,9 g% (poids/volume) et le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique.
On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale en alcool de l'ordre de 45-75% (préférentiellement 56,5%). Après une demi-heure d'agitation, le mélange est laissé au repos à +4° C pendant 16 heures; le précipité est alors recueilli par centrifugation. Il constitue le polyoside brut.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (1100 g poids humide) est mis en solution dans environ 50 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,4 volume (préférentiellement 0,25 volume) du mélange phénol/tampon acétate de l'exemple 1.
Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, on soumet la dispersion à une ultracentrifugation. Le processus est recommencé plusieurs fois, si nécessaire, jusqu'à l'obtention d'une phase aqueuse contenant moins de 5 g% de protéines (généralement 1 ou 2 cycles sont suffisants).
La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution dialysée (60,4 litres) on ajoute lentement 8,6 litres d'une solution aqueuse de CaCl2 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale comprise entre 10 et 35% (préférentiellement 20%). L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à +4° C puis le mélange est ultracentrifugé.
La concentration éthanolique du surnageant est amenée entre 45 et 70%, généralement 56,5%.
Après 30 minutes d'agitation, la solution est laissée au repos à +4° C pendant 16 heures puis centrifugée. Le précipité ainsi obtenu est remis en solution dans 50 litres d'une solution de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9.
b) Traitement au charbon actif
On opère comme à l'exemple 1, stade 4b, avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 8 g% (préférentiellement 2 g%).
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution polyosidique dialysée (70 litres), on ajoute 6400 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol suffisant pour obtenir une concentration alcoolique finale comprise entre 45 et 75% (préférentiellement 56,5%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 et la solution est laissée au repos à +4° C pendant 16 heures. Le polyoside est récupéré par décantation et centrifugation.
Le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu prérefroidi à — 20 C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus. Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1.
On obtient ainsi 76 g de polyoside purifié type 12F.
Exemple 5:
Polyoside pneumococcique type 18C
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant de culture sont analogues à celles utilisées à l'exemple 2.
Stade 2: Purification préliminaire du polyoside pneumococcique Concentration
Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à 35 litres, lavé avec 3 x 40 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à 60 litres par ultrafiltration sur Amicon H10 PIO.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée, on ajoute 3000 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,40 avec l'acide acétique.
De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 20-35% (préférentiellement 28,5%) et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,14 g%, le pH est ajusté à 5,80 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-80% (préférentiellement 63,6° o).
Après une demi-heure d'agitation, le pH est ajusté à 6,8 avec l'acide acétique. Le précipité est ensuite recueilli par centrifugation. ,11 constitue le polyoside brut.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (1143 g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,33 volume) du mélange phénol/acétate de l'exemple 1, stade 3, et on opère comme à l'exemple 1.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
662 056
10
Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution dialysée (26,1 litres) on ajoute lentement, sous agitation, 8,7 litres d'une solution de chlorure de calcium 2M. On effectue ensuite la double précipitation à l'éthanol, comme à l'exemple 1, stade 4a, d'abord avec une concentration en alcool de 15-35% (préférentiellement 25%), puis de 45-75%, généralement 63,6%.
b) Traitement au charbon actif
Le précipité (400 g poids humide) est dissous dans 40 litres de chlorure de sodium 0,14M et on opère ensuite comme à l'exemple 1, stade 4b, avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 10 g% (préférentiellement 2 g%).
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution dialysée (51 litres), on ajoute 2560 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-80% (préférentiellement 63,6%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,6-6,8 avec l'acide acétique et le mélange est laissé au repos 16 heures à +4"C. Le précipité est récupéré par décantation et centrifugation puis mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu prérefroidi à -20° C.
Après centrifugation, le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthyli-que, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1.
On obtient ainsi 108 g de polyoside purifié type 18C.
Exemple 6:
Polyoside pneumococcique type 23F
Stade 1: Culture
Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant de culture sont identiques à celles de l'exemple 2.
Stade 2: Purification préliminaire Concentration
Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à un volume d'environ 80 litres, lavé plusieurs fois par dilution-concentration avec 240 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% puis à nouveau concentré (facteur de concentration = 5,6). Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration respectivement sur Amicon type H10 PIO et sur Romicon PM 10.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée (71,4 litres), on ajoute 3570 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4-5,6 avec l'acide acétique.
De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 17-37% (préférentiellement 28%) et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,20 g%, le pH est ajusté à 5,90 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-75% (préférentiellement 60%).
Après une demi-heure d'agitation à +4° C, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80. Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation. Il constitue le polyoside brut.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (500 g poids humide) est mis en solution dans 42 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9.
A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,2 volume) du mélange phénol/tampon acétate de sodium et l'on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée
On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1,
stade 4a.
A la solution polyosidique obtenue après dialyse (56 litres), on ajoute 7,9 litres de solution CaCl2 4M. On effectue ensuite le fractionnement à l'éthanol, avec une concentration en alcool de 10-35% (préférentiellement 25%), puis de 50-75% (généralement 60%). Le précipité (350 g poids humide) est récupéré par centrifugation puis dissous dans 36 litres d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9.
b) Traitement au charbon actif
De façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on traite la solution obtenue au charbon actif avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 10 g% (préférentiellement 1,5%), puis on élimine le charbon et on diaylse.
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution obtenue après dialyse (47,7 litres), on ajoute 5700 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4-5,6 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-70% (préférentiellement 60%). Après 30 minutes d'agitation, et repos à 4-4 ' C pendant 16-18 heures, le précipité est recueilli par centrifugation, puis mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu prérefroidi à —20° C et centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1.
On obtient ainsi 100 g de polyoside purifié type 23F.
Exemple 7:
Polyoside pneumococcique type 25 Stade 1 : Cidture
Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1, exception faite de la régulation du pH qui est réalisée à un pH égal à 7,2 ± 0,2.
Stade 2: Purification préliminaire Concentration
Le surnageant de culture (600 litres) est réduit à un volume d'environ 100 litres et lavé plusieurs fois par dilution-concentration avec 200 à 300 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette opération est réalisée par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10 000 (type Amicon ou Romicon).
Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors concentré à 96 litres par ultrafiltration.
Préparation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée, on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5,6 g%. Le pH est ajusté à 5,70 par l'acide acétique. De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 20-35% (préférentiellement 28,5%) et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,14 g%, le pH est ajusté à 5,80 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de l'ordre de 40-70% (préférentiellement 62%).
Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par ultracentrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (335 g poids humide) est mis en solution dans 48 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9.
A cette solution est ajoute 0,2 à 0,5 volume (généralement 0,29 volume) du mélange phénol/tampon acétate de sodium et l'on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée
On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 4a.
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15
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25
30
35
40
45
50
55
60
65
11
662 056
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (55,7 litres) on ajoute lentement 8 litres de CaCl2 4M. On effectue ensuite la double précipitation à l'éthanol, d'abord avec une concentration de 15-35% (préférentiellement 30%), puis de 40-70% (généralement 62%).
Après décantation, le précipité est récupéré par centrifugation puis dissous dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9 (20 litres).
b) Traitement au charbon actif
De façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on traite la solution . obtenue par le charbon actif en quantité comprise entre 0,1 et 8 g% (préférentiellement 2 g%), puis on élimine le charbon et on diaylse.
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution obtenue après dialyse (27,76 litres), on ajoute 2760 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,80 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 40-70% (préférentiellement 62%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 ± 0,1 et on laisse au repos à +4° C pendant 16-18 heures. Le précipité est récupéré par décantation et centrifugation, mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu prérefroidi à —20° C puis centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à des lavages successifs par l'acétone et par l'éther éthylique, puis on sèche, comme décrit à l'exemple 1. On obtient ainsi 35 g de polyoside purifié type 25.
Exemple 8:
Polyoside pneumococcique type 2
Stade 1: Culture
Les conditions expérimentales de fermentation sont celles décrites à l'exemple 2. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le désoxycholate de sodium, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation.
Stade 2: Purification préliminaire Concentration
Le surnageant de culture (200 litres) est concentré à 40 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% puis à nouveau concentré à 34,5 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romicon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10000.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 7,5 g%. On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 10-30% (préférentiellement 18%) et, après ultracentrifugation, jusqu'à une concentration finale de 45-65% (préférentiellement 55,5%).
Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par décantation et centrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (690 g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (préférentiellement 0,3 volume) du mélange phénol/tampon acétate de sodium et on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Après dialyse, le principe actif est extrait de la solution par précipitation éthanolique (concentration finale = 45-65%) en présence d'acétate de sodium. Le précipité est récupéré par centrifugation (430 g poids humide) et mis en solution dans 12 litres d'eau distillée stérile apyrogène.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques
On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 4a. A la solution obtenue au stade 3 (12 litres) on ajoute lentement, sous agitation, 4 litres de solution de CaCl2 2M. On effectue ensuite la double précipitation à l'éthanol, d'abord avec une concentration de 15-35% (généralement 25%) puis, après ultracentrifugation, avec une concentration finale de 45-65% (préférentiellement 55,5%).
Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation.
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
Le précipité obtenu au stade 4 est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu prérefroidi à — 20 C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus. L'opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, et on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 69 g de polyoside purifié.
Exemple 9:
Polyoside pneumococcique type 6A Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de culture et de préparation du surnageant sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1, exception faite du pH qui est régulé à 7,2-7,4 avec la soude 5N.
Stade 2: Purification préliminaire Concentration
Le surnageant de culture (2 x 200 litres) préparé comme précédemment décrit est concentré à 40 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré (volume final = 33,6 litres), sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10000 (type Amicon H10 PIO). Le facteur de concentration varie de 4 à 15 suivant le volume et la viscosité du surnageant à ultrafiltrer.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée, on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5 g%. Le pH est ajusté à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 20-35% (préférentiellement 27%) puis, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 8,75 g%, le pH est ajusté à 5,6 par l'acide acétique, et l'on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 40-70% (préférentiellement 60%). Le précipité de polyoside brut est ensuite recueilli par centrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (469 g poids humide) est mis en solution dans 16 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,25 volume) du mélange phénol/tampon acétate de sodium et on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques
On opère de façon analogue à l'exemple 1, stade 4a.
Pour cela, à la solution dialysée obtenue au stade 3 (18,2 litres) on ajoute lentement 6 litres de solution aqueuse CaCl2 2M. Après agitation on ajoute l'éthanol (concentration finale comprise entre 15 et 35%, généralement 25%) puis le mélange est ultracentrifugé, et on ajoute au surnageant de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 40-70% (préférentiellement 60%). Le précipité est récupéré par décantation et centrifugation.
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
Le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu prérefroidi à — 20° C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus.
Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, et on sèche le précipité comme décrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 119 g de polyoside purifié type 6A.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
662 056
12
Exemple 10:
Polyoside pneumococcique type 19F
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation sont celles utilisées à l'exemple 2. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le désoxycholate de sodium, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation.
Stade 2: Purification préliminaire Concentration
Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à 50 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% puis à nouveau concentré à 40,3 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romicon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10 000.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5 g%. On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 15-35% (préférentiellement 27%) et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant recueilli est amenée à 7,3%, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 55-75% (préférentiellement 63,5%), et le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par centrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (427 g poids humide) est mis en solution dans 16 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (préférentiellement 0,25 volume) du mélange phénol/tampon acétate de sodium et on opère comme décrit à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques
On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 4a. A la solution obtenue au stade 3 (18,9 litres), on ajoute 2,7 litres de solution de CaCl2 4M. On ajoute de l'éthanol (concentration finale en alcool comprise entre 15 et 35%, généralement 25%) et, après ultracentrifugation, on ajoute au surnageant de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 55-75% (préférentiellement 63,5%), et le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation.
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
Le précipité est mis en suspension dans trois litres d'éthanol absolu prérefroidi à — 20° C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus. L'opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 120 g de polyoside purifié, type 19F.
Exemple 11:
Polyoside pneumococcique type 7F
Stade 1: Culture
Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple 1, stade 1, exceptions faites de la régulation pH (6,2-6,8) et de l'addition de glucose (addition toutes les 2 'A h).
Stade 2: Purification préliminaire du polyoside pneumococcique Concentration
Le surnageant de culture (200 litres) est concentré, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10 000 (type Amicon ou Romicon). Le facteur de concentration varie de 4 à 10 suivant le volume et la viscosité du surnageant à ultrafiltrer.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée (41 litres), on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 7 g%. Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 35-55% (préférentiellement 45%) et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 8,2 g% et le pH est ajusté à 6,8 par l'acide acétique, puis on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de l'ordre de 60-80% (préférentiellement 75%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est ajusté à 6,8 avec l'acide acétique glacial. Le mélange est laissé au repos à +4° C pendant 16 heures, le précipité de polyoside brut est alors récupéré par centrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (110 g poids humide) est mis en solution dans environ 30 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,4 volume (préférentiellement 0,15 volume) du mélange phénol/tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9 (1:0,4 vol./vol.).
Après agitation douce (manuelle ou magnétique) pendant environ 10 minutes pour créer l'émulsion, la solution phénolée est ultracen-trifugée. La phase aqueuse contenant le polyoside est, si nécessaire, soumise à un deuxième traitement phénolique, mais généralement 1 cycle est suffisant.
La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à +4° C pour éliminer le phénol résiduel.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques
On ajoute rapidement, sous agitation, à la solution polyosidique dialysée (36 litres) le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20 g% (poids/volume) dans du chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9, ou dans l'eau distillée apyrogène pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8 g% (préférentiellement 1,5 g%).
Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à +4° C.
Le charbon est ensuite éliminé par filtration.
Le filtrat est dialysé contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à +4° C.
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution polyosidique dialysée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à l'obtention d'une concentration de 15 g% et on ajuste le pH à 6,00 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté prérefroidi à —20° C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique finale de 60-80% (préférentiellement 75%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,9 et la solution est laissée au repos à 4-4° C pendant 16 heures. Le polyoside est récupéré par centrifugation. Le précipité est mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu prérefroidi à —20° C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus.
Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages successifs par l'acétone et par l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 20 g de polyoside purifié type 7F.
Exemple 12:
Polyoside pneumococcique type 9N Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple 2, stade 1. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le désoxycholate de sodium, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation.
Stade 2: Purification préliminaire Concentration
Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à 50 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% puis à nouveau concentré à
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42 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romicon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10000.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 6 g%. On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. On opère comme à l'exemple 1, stade 2, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 20-40% (préférentiellement 33%) puis, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 6 g%, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-65% (préférentiellement 55,5%).
Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par décantation et centrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (660 g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (préférentiellement 0,3 volume) du mélange phénol/tampon acétate de sodium, et on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques
On effectue un traitement au charbon actif, suivi d'une dialyse, en opérant de façon analogue à celle de l'exemple 1, stade 4b.
On ajoute, à la solution polyosidique dialysée (30 litres) obtenue au stade 3, la suspension de charbon actif Norit jusqu'à une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,2 et 8 g% (préférentiellement 3,33%).
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution obtenue au stade 4 (38 litres), on ajoute 3420 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-65% (préférentiellement 55,5%).
Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation, et mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu prérefroidi à —20° C puis centrifugé. L'opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche le précipité, comme à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 68 g de polyoside purifié type 9N.
Exemple 13:
Polyoside pneumococcique type 12A Stade 1: Culture
Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple 4.
Stade 2: Purification préliminaire du polyoside pneumococcique Concentration
Le surnageant de culture (40 litres) est concentré à 10 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à 9 litres par ultrafiltration à l'aide d'un système Amicon supportant 5 colonnes H10 PIO.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée, on ajoute 468 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,8 avec l'acide acétique. En opérant comme à l'exemple 1, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 15-35% (préférentiellement 25%) puis, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,1 g%, le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 45-75% (préférentiellement 58,5%).
Le précipité de polyoside brut est ensuite recueilli par centrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le précipité précédemment obtenu (174 g poids humide) et mis en solution dans 8 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9.
A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,5 volume) du mélange froid phénol/acétate de l'exemple 1, stade 3, et on opère comme à l'exemple 1.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques
En opérant de façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on effectue un traitement au charbon actif suivi d'une dialyse.
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (7,6 litres), on ajoute la suspension de charbon actif Norit pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 1 et 7 g% (préférentiellement 3 g%).
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution dialysée obtenue au stade 4 (9 litres), on ajoute 450 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 45-75% (préférentiellement 66,6%), et on ajuste le pH, si nécessaire, à 6,6-6,8. Le polyoside est ensuite récupéré par centrifugation, puis mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu prérefroidi à — 20 C et centrifugé. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche le précipité, comme décrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 2 g de polyoside purifié type 12A.
Le polyoside 12A ainsi obtenu se distingue du polyoside type 12F par l'absence de galactose dans sa composition chimique.
La détermination quantitative des hexosamines et des oses (glucose, galactose) a été effectuée, après hydrolyse ménagée, respectivement par dosage colorimétrique selon la technique de G. Ash-well, «Méthods in Enzymology» 3 (1957), pages 95-97, S.P. Colo-wick & N.O. Kaplan, Eds. Academic Press, N.Y., et par dosage spectrophotomégtrique des coenzymes réduits (NADH et NADPH) obtenus après action enzymatique du galactose déshydrogénase pour le dosage du galactose et du système plurienzymatique hexoki-nase-glucose 6 phosphate déshydrogénase pour le dosage du glucose. Le polyoside type 12A ainsi obtenu contient 33-38% d'hexosamines et 23-28% de glucose (poids/'poids).
Exemple 14:
Polyoside pneumococcique type 14 Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation sont analogues à celles utilisées à l'exemple 2, stade I.
Stade 2: Purification préliminaire du polyoside pneumococcique Concentration
Le surnageant de culture (30 litres) est concentré, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à un volume égal à 9 litres, par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10 000 (type Amicon H10 P10).
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée, on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5 g%. Le pH est ajusté à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 15-35% (préférentiellement 20%) et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 8 g% et le pH est ajusté à 5,8, puis on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-70% (préférentiellement 60%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est ajusté à 6,6-6,8. Le mélange est laissé au repos à +41C pendant 16 heures, le précipité de polyoside brut est alors récupéré par centrifugation.
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Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (110 g poids humide) est mis en solution dans environ 4 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,3 volume) de mélange phénol/tampon acétate de sodium, et on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques ■
En opérant de façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on effectue un traitement au charbon actif suivi d'une dialyse. Pour cela, la concentration en chlorure de sodium de la solution obtenue après dialyse au stade 3 (4,3 litres) est amenée à 0,14M, puis on ajoute la suspension de charbon actif Norit à 20 g% pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8 g% (préférentiellement 3,6 g%).
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution dialysée (6 litres) obtenue au stade 4, on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration de 10 g% et on ajuste le pH à 5,8 par l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 50-70% (préférentiellement 60%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,8. Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation, mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu prérefroidi à —20° C puis centrifugé.
Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche le précipité comme à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 4,4 g de polyoside purifié type 14.
Exemple 15:
Polyoside pneumococcique type 3 Stade 1: Culture
Les conditions expérimentales sont analogues à celles décrites dans l'exemple 1, stade 1, exception faite de la régulation pH qui est effectuée à un pH voisin de 7,2.
Stade 2: Purification préliminaire Concentration
Le surnageant de culture (200 litres) est réduit à un volume d'environ 80 litres et lavé plusieurs fois à l'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette opération est réalisée par ultrafiltation sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10 000. Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors concentré à 50 litres.
Précipitation alcoolique directe
A la solution concentrée, on ajoute 2500 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir une concentration finale de 15-40% (préférentiellement 33,3%).
Après 30 minutes d'agitation, le mélange est laissé au repos pendant 16 heures à +4° C. Le précipité est récupéré par centrifugation. Le précipité recueilli est remis en solution dans 60 litres de tampon acétate de sodium 0,37M, pH 5,4, puis est à nouveau précipité par addition, sous agitation, de 0,15 à 0,7 volume (préférentiellement 0,5 volume) d'éthanol. Après 30 minutes d'agitation et 16 heures de repos à +4° C, le précipité de polyoside brut est récupéré par centrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (2180 g poids humide) est dissous dans 85 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,2 volume) du mélange phénol/tampon acétate de sodium, en opérant comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques
Comme à l'exemple 1, stade 4b, on effectue un traitement au charbon actif suivi d'une dialyse. Pour cela, la concentration en chlorure de sodium de la solution obtenue au stade 3 après dialyse (115 litres) est amenée à 0,14M et on ajoute la suspension de charbon actif Norit pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 01, et 8 g% (préférentiellement 4 g%).
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution dialysée (139 litres) obtenue au stade 4, on ajoute 6950 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 15-40% (préférentiellement 33,3%). Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation puis mis en suspension dans dix litres d'éthanol absolu prérefroidi à —20° C.
Après centrifugation, le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 235 g de polyoside purifié type 3.
Exemple 16:
Polyoside pneumococcique type 8 Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales sont analogues à celles décrites dans l'exemple 1, stade 1, exception faite de la régulation pH qui est effectuée à un pH voisin de 7,2.
Stade 2: Purification préliminaire Concentration
Le surnageant de culture (400 litres) est réduit à un volume d'environ 60 litres et lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette concentration est réalisée par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10000. Le surnageant ainsi débarrassé des subtances de faible poids moléculaire est alors concentré à 51,5 litres.
Précipitation alcoolique directe
A la solution concentrée (51,5 litres), on ajoute 3090 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir une concentration finale de 18-40% (préférentiellement 33,3%).
Après 30 minutes d'agitation, le mélange est laissé au repos pendant 16 heures à +4° C. Le précipité de polyoside brut est récupéré par décantation et centrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (2260 g poids humide) est dissous dans 32 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,25 volume) du mélange phénol/tampon acétate de sodium, en opérant comme à l'exemple 1, stade 3.
En outre, après diaylse, le polyoside est extrait de la phase aqueuse par précipitation éthanolique en présence de 10 g% d'acétate de sodium (pH = 5,4), avec 0,15 à 0,7 volume (préférentiellement 0,37 volume) d'éthanol absolu déshydraté prérefroidi à —20° C.
Stade 4: Elimination des acides nucléiques
Le précipité du stade 3 (1400 g poids humide) est mis en solution dans 27 litres de tampon de sodium 0,14M, pH 6,9. Sur cette solution on effectue un traitement au charbon actif, suivi d'une dialyse, comme à l'exemple 1, stade 4b, en ajoutant une suspension de charbon actif Norit pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 1 et 10 g% (préférentiellement 10 g%).
Stade 5: Obtention du polyoside purifié
A la solution obtenue au stade 4 après dialyse (27 litres), on ajoute 1350 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4-5,6 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 18-40% (préférentiellement 33,3%) et, après centrifugation, le préci5
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pité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu prérefroidi à — 20° C puis centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme déqrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 52 g de polyoside purifié type 8.
Exemple 17:
Polyoside pneumococcique type 6B
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation sont analogues à celles décrites dans l'exemple 9, stade 1, exception faite de la durée de la culture qui est prolongée à 42 heures. La culture est alors stérilisée par le phénol et les germes entiers et les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation.
Stade 2: Purification préliminaire Concentration
Le surnageant de culture (40 litres) est concentré à 10 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à 8,2 litres. Ces opérations sont effectuées par ultrafiltration sur fibres creuses Amicon type H10 PIO.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée, on ajoute de l'acétate de calcium jusqu'à une concentration finale de 5 g%, et le pH est ajusté à 5,4 avec l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 10-35% (préférentiellement 25%) et, près ultracentrifugation, on ajoute au surnageant le volume d'éthanol nécessaire à la précipitation complète du polyoside (concentration éthanolique finale comprise entre 45 et 70%, généralement 50%). Le précipité de polyoside brut est ensuite recueilli par décantation et centrifugation.
Stade 3: Déprotéinisation
Le polyoside brut (40 g poids humide) est mis en solution dans 4 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,5 volume) du mélange phénol/tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9 (1:0,4 vol./vol.). Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, le mélange est ultracentrifugé.
La phase aqueuse supérieure est récupérée puis soumise à un deuxième traitement au phénol froid. Le processus est recommencé au total 3 fois.
La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 18 heures à +4° C.
Stade 4: Obtention du polyoside purifié
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (5,2 litres), on ajoute 260 g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir la précipitation complète du polyoside (concentration finale en alcool comprise entre 45 et 70%, préférentiellement 55,5%).
Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation, puis mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu prérefroidi à — 20° C et centrifugé. Cette opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 9 g de polyoside purifié type 6B.
Remarque: Le polyoside pneumococcique type 6B peut être également purifié selon les techniques décrites dans l'exemple 9.
Exemple 18:
Polyoside 7F
Cet exemple illustre la purification finale par précipitation du polyoside (7F) au sulfate d'ammonium.
La solution de départ sur laquelle est effectuée la précipitation au sulfate d'ammonium est la solution dialysée obtenue après traitement au charbon actif, c'est-à-dire la solution obtenue à l'exemple 11, stade 4.
La concentration en NaCl est amenée à 0,85 g%.
Le pH de cette solution est ajusté à 6,5 par l'acide acétique dilué et on ajoute lentement, sous agitation, le volume nécessaire d'une solution saturée de sulfate d'ammonium, ou la quantité de (NH4)2S04 suffisante pour obtenir une concentration finale en (NH4)2S04 comprise entre 30 et 80 g%, préférentiellement 74 g%.
Le mélange est laissé au repos (30 minutes à 4 heures) puis ultracentrifugé à 15 000 rpm pendant 30 minutes.
Le précipité est récupéré et mis en solution dans environ 10 litres d'eau distillée apyrogène. Les sels résiduels sont éliminés par dialyse ou diafiltration.
Le principe actif est ensuite récupéré par précipitation directe à l'éthanol en présence de sels de sodium, comme décrit à l'exemple 11, stade 5.
Exemple 19:
Réalisation et utilisation d'un vaccin Exemple de formule vaccinale
— Polyoside purifié de
Streptococcus pneumoniae 50 microgrammes de chacun des 14 types suivants: 1, 2, 3, 4,
6A, 7F, 8, 9N, 12F, 14, 18C, 19F, 23F, 25
— Soluté tamponné isotonique, q.s.p. 0,5 ml
— Phénol (conservateur), au maximum 1,25 mg
Le soluté tamponné isotonique a la formule suivante:
— Chlorure de sodium 4.15 mg
— Phosphate disodique (Na2HP04, 2H20) 0,065 mg
— Phosphate monosodique (NaH2P04, 2H20) 0,023 mg
— Eau pour préparations injectables 0,5 ml
Mode et voie d'administration
Voie sous-cutanée ou intramusculaire
Exemple de posologie
Adultes: 25 à 100 p.g de chaque polyoside en une seule injection. Enfants: 10 à 50 |tg de chaque polyoside en une ou plusieurs injections, à quelques semaines d'intervalle.
Indications thérapeutiques
Prévention de l'infection pneumococcique en fonction de l'épidé-miologie. Elles concernent plus particulièrement :
— les personnes âgées de plus de 50 ans d'une façon générale,
— les bronchitiques chroniques, insuffisants respiratoires et tabagi-ques,
— les patients fragilisés par une maladie chronique (insuffisance cardiaque, diabète, insuffisance hépatique ou rénale, cancer viscéral ou alcoolisme chronique),
— les splénectomisés,
— les enfants drépanocytaires homozygotes,
— les personnes exposées aux méningites à pneumocoque en raison d'un traumatisme crânien avec fistule ostéo-méningée ou d'une otite chronique,
— et probablement les enfants sujets aux infections optiques récidivantes ou atteints de syndromes néphrotiques.
Contre-indications
Par prudence, il convient de ne pas utiliser le vaccin antipneumo-coccique chez la femme enceinte.
Il en est de même pour les personnes présentant une infection aiguë en évolution, en particulier pneumococcique, pour les enfants de moins de 2 ans qui ne s'immunisent pas régulièrement contre plusieurs sérotypes souvent en cause dans l'infection pneumococcique à cet âge, et pour les personnes atteintes d'un déficit immunitaire (cancer - chimiothérapie) et en particulier d'une agranulocytose ou d'une aplasie médullaire.
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Claims (37)
- 662 0562REVENDICATIONS1. Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae, caractérisé par le fait que l'on soumet une solution aqueuse clarifiée et concentrée dudit polyoside, contenant au moins 20% d'impuretés protéiques sur produit sec, à un traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines de la phase aqueuse à une valeur inférieure à un seuil prédéterminé.
- 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'à la solution aqueuse de polyoside on ajoute de 5 à 50% en volume de phénol, à température de 5 à 30" C, que l'on agite, puis sépare et recueille la phase aqueuse, et que l'on répète, si nécessaire, le traitement au phénol.
- 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on opère à température de 10 à 20r* C.
- 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on ajoute le phénol sous la forme d'un mélange phénol/eau.
- 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que ledit mélange est constitué par du phénol dans lequel l'eau est dissoute.
- 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on effectue le traitement au phénol à un pH de 6,9 ± 0,5.
- 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que la solution de polyoside de départ est une solution tamponnée.
- 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'on ajoute le phénol sous la forme d'un mélange phénol/solution tamponnée.
- 9. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé par le fait que l'on ajoute de 10 à 60% vol./vol. dudit mélange.
- 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que ledit seuil correspond à une teneur en protéines de 5% en poids.
- 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que ledit polyoside est un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 6B.
- 12. Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae, caractérisé par le fait que l'on soumet une solution aqueuse clarifiée et concentrée dudit polyoside, contenant au moins 20% d'impuretés protéiques sur produit sec, à un traitement selon le procédé de la revendication 1, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie à un traitement d'élimination des contaminants nucléiques par précipitation fractionnée avec un alcool en présence d'ions calcium.
- 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait qu'on ajoute à la solution aqueuse de polyoside un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité puis on ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside.
- 14. Procédé selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisé par le fait que ledit alcool est l'éthanol.
- 15. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé par le fait que l'on effectue la précipitation fractionnée à l'alcool à une température de 0 à +15° C.
- 16. Procédé selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé par le fait que l'on ajoute l'alcool jusqu'à une concentration de 10 à 35% (vol./vol.) pour précipiter les contaminants nucléiques, puis que l'on ajoute encore de l'alcool au surnageant jusqu'à précipitation complète du polyoside.
- 17. Procédé selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisé par le fait que l'on opère en présence d'ions calcium à une molarité de 0,25-2M.
- 18. Procédé selon l'une des revendications 12 à 17, caractérisé par le fait que le polyoside est un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 2, 6A, 6B ou 19F.
- 19. Procédé de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae, caractérisé par le fait que l'on soumet une solution aqueuse clarifiée et concentrée desdits polyosides, contenant au moins 20% d'impuretés protéiques sur produit sec, au traitement selon le procédé de la revendication 1, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques5 par le charbon actif.
- 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que ledit traitement par le charbon actif consiste à ajouter du charbon actif en quantité suffisante pour éliminer la majeure partie des contaminants nucléiques, puis à éliminer le charbon actif.10 21. Procédé selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisé par le fait que l'on ajoute de 0,1 à 12% (poids/vol.) de charbon actif.
- 22. Procédé selon la revendication 20, caractérisé par le fait que le polyoside est un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 3, 8, 7F, 9N, 12A ou 14.
- 23. Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae, caractérisé par le fait que l'on soumet une solution aqueuse clarifiée et concentrée dudit polyoside, contenant au moins 20% d'impuretés protéiques sur produit sec, au traitement selon le2o procédé de la revendication 1, que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par précipitation fractionnée avec un alcool en présence d'ions calcium puis par un traitement au charbon actif.
- 24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé par le fait que2J ledit traitement au charbon actif est effectué lorsque la teneur en acides nucléiques du polyoside est supérieure à 1 ou 2% en poids après la précipitation fractionnée à l'alcool, le précipité de polyoside étant alors remis en solution avant le traitement susmentionné.
- 25. Procédé selon l'une des revendications 23 et 24, caractérisé par le fait que le polyoside est un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 1, 4, 5, 10A, 12F, 15B, 17F, 18C, 20, 22F, 23F ou 25.
- 26. Vaccin pneumococcique, caractérisé par le fait qu'il contient au moins un polyoside purifié selon le procédé de l'une des revendications 1,12,19 ou 23.
- 27. Procédé pour la préparation d'une solution aqueuse de polyoside de Streptococcus pneumoniae destinée à la mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 1, 12, 19 ou 23, caractérisé par le fait qu'après lyse d'une culture de Streptococcus pneumoniae, clarification et concentration, on ajoute un alcool miscible à l'eau à40 la solution aqueuse obtenue, de façon à précipiter le polyoside, puis que l'on remet le précipité en solution pour obtenir la solution aqueuse de polyoside de départ.
- 28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé par le fait que l'on ajoute l'alcool en quantités croissantes de façon à précipiter4J d'abord des impuretés avant de précipiter le polyoside.
- 29. Procédé selon la revendication 27, caractérisé par le fait que le polyoside est précipité directement par addition d'une quantité suffisante d'alcool.
- 30. Procédé selon l'une des revendications 27 à 29, caractériséJ0 par le fait que la précipitation à l'alcool est effectuée en présence d'un sel dissous.
- 31. Procédé selon la revendication 28, caractérisé par le fait que ladite précipitation est effectuée en présence d'ions calcium.
- 32. Procédé selon l'une des revendications 27 à 31, caractérisé55 par le fait que ladite concentration est effectuée par ultrafiltration, le facteur de concentration étant de 4 à 10.
- 33. Procédé selon la revendication 32, caractérisé par le fait que l'ultrafiltration est réalisée à l'aide de membranes retenant les substances de poids moléculaire supérieur à 10 000.60 34. Procédé selon la revendication 33, caractérisé par le fait que lesdites membranes retiennent les substances de poids moléculaire supérieur à 50 000 ou supérieur à 100 000.
- 35. Procédé selon la revendication 28, caractérisé par le fait que la solution aqueuse ainsi purifiée est destinée à la mise en œuvre du65 procédé selon la revendication 19, appliqué à un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 7F, 9N, 12A ou 14.
- 36. Procédé selon la revendication 29, caractérisé par le fait que la solution aqueuse ainsi purifiée est destinée à la mise en œuvre du3662 056procédé selon la revendication 19, appliqué à un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 3 ou 8.
- 37. Procédé selon la revendication 28, caractérisé par le fait que la solution aqueuse ainsi purifiée est destinée à la mise en œuvre du procédé selon la revendication 23, appliqué à un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 1, 4, 5, 10A, 12F, 15B, 17F, 18C, 20, 22F, 23F ou 25.
- 38. Procédé selon la revendication 28, caractérisé par le fait que la solution aqueuse ainsi purifiée est destinée à la mise en œuvre du procédé selon la revendication 12, appliqué à un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 2, 6A, 6B ou 19F.
- 39. Procédé selon la revendication 31, caractérisé par le fait que la solution aqueuse ainsi purifiée est destinée à la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, appliqué à un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 6B.
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