CH662363A5

CH662363A5 - Verfahren zum zuechten von zellen, die normalerweise nur eine mitose erfahren, wenn sie auf einem substrat fixiert sind.

Info

Publication number: CH662363A5
Application number: CH1573/82A
Authority: CH
Inventors: Allan P Jun Jarvis; Franklin Lim
Original assignee: Damon Biotech Inc
Priority date: 1981-03-13
Filing date: 1982-03-12
Publication date: 1987-09-30
Also published as: GB2094832A; FR2501715A1; FR2501715B1; JPS6038111B2; GB2094832B; SE8201555L; JPS57202289A; NO161446C; DK112482A; IT8220138A0; DE3209098A1; NO161446B; DE3209098C2; NO820796L; IT1150680B; CA1172586A; BE892478A; SE452335B

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Züchten von Zellen, die normalerweise nur eine Mitose erfahren, wenn sie auf einem Substrat fixiert sind, den sogenannten «fixierungsunabhängigen» Zellen, das heisst, Zellen des Typs, die normalerweise in Form einer oder mehrerer Schichten auf einem Substrat gezüchtet werden müssen und nicht in Suspension gezüchtet werden können, sowie auf ein Verfahren zur Herstellung von Interferon. Diese Verfahren sind in den Patentansprüchen 1 und 10 definiert.

Die Fortschritte in der Zellenbiologie haben ergeben, dass die fixierungsabhängigen Zellen verschiedener höherer Organismen kleine Mengen von Substanzen erzeugen können, die eine signifikante potentielle oder beweisbare Nützlichkeit für die Behandlung von Erkrankungen haben, z.B. Interferon. Derartige Zellen sind auch für Forschungszwek-ke brauchbar.

Bei derartigen Zellkulturen besteht immer die Gefahr der Verunreinigung mit Bakterien oder anderen Substanzen. In

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den meisten Fällen sind auch die Mengen der interessierenden Substanz, die von den Zellkulturen erzeugt werden, sehr gering. Da fixierungsabhängigen Zellen, im Gegensatz zur Züchtung in Suspensionskulturen, nicht gezüchtet werden können, um ein Volumen auszufüllen, wird angenommen, dass zur Zeit keine praktische Methode zur Züchtung grosser Anzahlen von Zellen existiert, die für die Erzeugung von signifikanten Mengen der durch derartige Zellen erzeugten interessierenden Substanzen erforderlich sind.

Zur Zeit müssen fixierungsabhängige Zellen, wie normale Fibroblasten und bestimmte Nieren- und Epithelzellen, auf einem Substrat gezüchtet werden. Kunststoffolien, die als Substrate verwendet werden können, sind im Handel erhältlich. Einige der Typen von fixierungsabhängigen Zellen vermehren sich, bis die Folie mit einer einfachen Schicht von Zellen bedeckt sind, und hören dann auf, sich zu vermehren. Andere Typen vermehren sich weiter, bis eine oder mehrere zusätzliche Schichten über der ersten Zellschicht gebildet worden sind.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Züchten von fixierungsabhängigen Zellen in Suspension und ermöglicht es dadurch, pro Volumeneinheit des Kulturmediums eine grössere Anzahl von Zellen zu züchten als bei einschichtigen Kulturen.

Spezielle Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden beschrieben.

Erfindungsgemäss wird eine Impfkultur von fixierungsabhängigen Zellen innerhalb einer Vielzahl von Mikrokap-seln, die semipermeable Membranen aufweisen, eingekapselt. Die Synthese der Membranen wird so gesteuert, dass sie eine vorgegebene Obergrenze der Durchlässigkeit haben, das heisst, die Membranen haben Mikroporen, deren Abmessungen genügen, um den Durchtritt von Molekülen mit einem Molekulargewicht bis zum Beispiel 2 x 105 Dalton zu ermöglichen, aber den Durchtritt von Materialien mit höherem Molekulargewicht im wesentlichen zu verhindern. Die Kapselmembran begrenzt somit ein Mikromilieu, in dem die Zellen zusammen mit hochmolekularen Serumkomponenten eingeschlossen sind, das aber den Zellen freien Zugang zu niedrigermolekularen Zellnährstoffen, wie Aminosäuren, gewährt und es den niedrigmolekularen Zell-Stoffwechselpro-dukten ermöglicht, das Milieu zu verlassen.

Die Zellen enthaltende Mikrokapseln werden dann in einem herkömmlichen Kulturmedium dispergiert. Die inneren Oberflächen der Kapselmembranen und/oder bestimmte hochmolekulare in Wasser dispergierbare Materialien, die in die Mikrokapseln eingeschlossen werden, dienen als Substrat, an dem sich die Zellen fixieren. Weil das Verhältnis der Oberfläche der Kapseln zu dem Volumen des Mediums ausserhalb der Kapseln ziemlich gross sein kann, erhalten die einzelnen Zellen einen angemessenen Zugang zu.den erforderlichen Nährstoffen, und die Fläche, auf der die Zellen wachsen können, wird gegenüber herkömmlichen einschichtigen Kulturen erhöht. Im allgemeinen kann der durchschnittliche Durchmesser der Mikrokapseln zwischen einigen Mikrometer und einem Millimeter oder mehr variiert werden. Eine bevorzugte durchschnittliche Grösse liegt in der Grössenordnung von 100 bis 500 um Durchmesser.

Wenn ein Fixierungssubstrat, wie Kollagen oder dergleichen, in die Kapseln eingeschlossen wird, dann wachsen die Fibroblasten auch innerhalb der Kapselmembranen und zeigen die normale fibroblastische Morphologie.

Ziel der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zum Züchten von fixierungsabhängigen Zellen zur Verfügung zu stellen, die Ausbeute an in vitro gezüchteten fixierungsabhängigen oder kontaktgehemmten Zellen zu verbessern, in dem ganzen Volumen eines Zellwachstumsmediums eine grosse Oberfläche zur Verfügung zu stellen, die als Substrat für fixierungsabhängige Zellen geeignet ist, und ein Verfahren zum Züchten von Zellen, die Interferon zu erzeugen vermögen, zur Verfügung zu stellen. Diese und andere Ziele und Merkmale der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung und aus der Zeichnung ersichtlich. Die einzige Figur der Zeichnung ist eine Mikrophotographie (200fach vergrös-sert), die fixierungsabhängige Zellen zeigt, die erfindungsgemäss innerhalb einer Mikrokapsel gezüchtet worden sind und die klassische fibroblastische Morphologie erläutern.

Der allgemeine Erfindungsgedanke besteht darin, eine Vielzahl von semipermeablen Membranen um einzelne Zellen oder Gruppen von Zellen herum vorzusehen, die als ein Substrat mit hoher Oberfläche wirken, an das die Zellen sich fixieren können, und/oder ein hochmolekulares Material innerhalb von Mikrokapseln einzuschliessen, damit es als Fixierungssubstrat dient. Zellen, die in Suspension zu wachsen vermögen, können ebenfalls in dieser Weise eingekapselt werden. Die Mikrokapseln dienen als Mikromilieu für die Zellen zusammen mit mindestens hochmolekularen Komponenten ihres Kulturmediums und trennen die Zellen von einem ausserhalb der Kapseln vorhandenen wässrigen Medium. Bakterien und andere verhältnismässig grosse Verunreinigungen können nicht durch die Membranen hindurchdringen.

Fixierungsabhängige Zellen von Säugetieren oder Menschen, wie Fibroblasten, Epithelzellen oder Nierenzellen, benötigen für ihre fortlaufende Lebensfähigkeit das Vorhandensein von Serumkomponenten, von denen ein Teil ein Molekulargewicht oberhalb der oberen Durchlässigkeitsgrenze der Membranen haben können. Derartige Komponenten können zusammen mit den eingekapselten Zellen eingeschlossen werden und brauchen nicht in dem ausserhalb der Kapseln vorhandenen Medium vorhanden zu sein.

Es wird bevorzugt, ist aber nicht notwendig, auch ein hochmolekulares Material, das als Fixierungssubstrat dient, in die Mikrokapseln einzuschliessen. Kollagen, ein natürliches Protein, das ein Hauptbestandteil der Bindegewebe ist, wurde mit Erfolg für diesen Zweck verwendet. Es können aber auch andere verträgliche, hochmolekulare, in Wasser dispergierbare Proteine, z.B. Polylysin, verwendet werden. Wenn die Proteine freie Aminogruppen haben, können sie durch Reaktion mit einem wasserlöslichen Gummi während der Membranbildung in der weiter unten beschriebenen Weise wasserunlöslich gemacht werden. Die Verwendung derartiger Materialien führt, wie angenommen wird, zur Erzeugung einer Matrix innerhalb des Kapselvolumens. Der Ein-schluss eines solchen Materials kann die Zelldichte innerhalb der Kapseln verbessern, während die Zellen innerhalb des Volumens der Kapseln statt um das Innere der Kapselmembran herum wachsen oder innerhalb des Volumens der Kapsel und um das Innere der Kapselmembran herum wachsen.

Die eingekapselte Impfkultur wird dann in einem geeigneten Kulturmedium des für die Züchtung herkömmlicher Kulturen verwendeten Typs suspendiert. Serumproteine, die von den Zellen nicht aufgenommen werden, können aus dem Medium ausserhalb der Kapseln weggelassen werden. Jedoch sollten der pH-Wert, die Temperatur, die Ionenkonzentration und dergleichen gleich wie in herkömmlichen Medien sein. Auch die Übertragung von Sauerstoff und Kohlendioxyd können in gleicher Weise wie bei herkömmlichen Kulturen gefördert werden, da diese gelösten Gase frei durch die Membranen hindurchtreten.

Die Bebrütung der eingekapselten Zellkultur führt zur Mitose der Zellen. Zellgewächse von Fibroblasten zeigen die klassische fibroblastische Morphologie und bilden auf dem Inneren der Membran oder auf dem innerhalb der Kapseln enthaltenen Fixierungssubstrat erhebliche Mengen von Zellen. Frisches Kulturmedium kann nach Bedarf entweder

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kontinuierlich oder intermittierend durch Wechsel des ausserhalb der Kapseln vorhegenden Mediums zugeführt werden. Wenn es Zweck der Kultur ist, ein interessierendes Zellstoffwechselprodukt zu erzeugen, kann das Stoffwechselprodukt entweder aus dem Volumen innerhalb der Kapsel oder aus dem Medium ausserhalb der Kapsel geerntet werden, was von seinem Molekulargewicht und der oberen Durchlässigkeitsgrenze der Membran abhängt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gehören die Membranen einem Typ an, der ohne Schädigung der Zellen selektiv zerstört werden kann. Dies ermöglicht es, dass die Zellen nach Wunsch aus den Kapseln freigegeben werden (siehe die US-Patentanmeldung Nr. 243 584).

Einer der Gründe für die Freigabe der Zellen nach ihrer Wachstumsperiode besteht darin, die Produktion einer interessierenden Substanz durch die Zellen zu stimulieren. Ein Beispiel ist die Erzeugung von Interferon aus menschlichen Fibroblasten, Leukozyten oder lymphoblastoiden Zellen, die durch Behandlung mit bestimmten Viren oder hochmolekularen Nukleinsäuren zur Ausscheidung von Interferon veranlasst werden. In einer solchen Situation müssen die Zellen, wenn die obere Durchlässigkeitsgrenze der Membranen geringer als das Molekulargewicht des die Ausscheidung von Interferon veranlassenden Faktors ist, vor der Einkapselung der Interferoninduktion unterworfen werden, oder die Kapselmembranen müssen nach der Züchtung der Zellen selektiv zerstört werden, damit derartige hochmolekulare Materialien mit der Zelle in Berührung kommen können.

Das erfindungsgemässe Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, um Zellen herum semipermeable Membranen zu bilden, ohne gleichzeitig ihre fortlaufende Lebensfähigkeit nachteilig zu beeinflussen. Eines der geeigneten Einkapse-lungsverfahren wird im folgenden detailliert beschrieben.

Das Gewebe oder die Zellen, das bzw. die eingekapselt werden sollen, werden in einem wässrigen Medium suspendiert, das sich vorzugsweise für das Wachstum des betreffenden Zelltyps eignet. Für diesen Zweck geeignete Medien sind im Handel erhältlich. Der durchschnittliche Durchmesser des einzukapselnden Materials kann innerhalb weiter Grenzen zwischen einigen Mikrometern und ca. 1 mm variieren. Die besten Ergebnisse werden aber mit Kapseln mit einer Grösse im Bereich von 100 bis 500 |xm erzielt. Individuelle fixierungsabhängige Zellen, wie Fibroblasten aus menschlichem oder tierischem Gewebe, Nierenzellen und Epithelzellen, können nach Wunsch eingekapselt werden. Auch andere Zellen, wie Leukozyten, Lymphoblastoide, pankreatische ß-Zellen, a-Zellen, 5-Zellen oder Gemische derselben in verschiedenen Verhältnissen, oder andere Gewebeeinheiten können eingekapselt werden.

Die fortlaufende Lebensfähigkeit derartiger lebender Materialien hängt u.a. von der Zugänglichkeit der erforderlichen Nährstoffe, der Sauerstoffübertragung, dem Fehlen von toxischen Substanzen in dem Medium und dem pH-Wert des Mediums ab. Bisher war es nicht möglich, derartige lebende Materialien in einem physiologisch verträglichen Milieu zu erhalten, während man sie gleichzeitig einkapselte. Das Problem bestand darin, dass die für die Membranbildung erforderlichen Bedingungen für das Gewebe tödlich oder schädlich waren, und vor den Erfindungen der US-Patentanmeldungen Nr. 953 413 und 24 600 bestand kein Membranbildungsverfahren, das es einem Gewebe ermöglichte, in gesundem Zustand zu überleben.

Es wurde jedoch gefunden, dass bestimmte wasserlösliche Substanzen, die mit lebendem Gewebe physiologisch verträglich sind und wasserunlöslich gemacht werden können, um eine formbeständige, zusammenhängende Masse zu bilden, verwendet werden können, um eine «zeitweilige Kapsel» oder schützende Sperrschicht um einzelne Zellen oder

Gruppen von Zellen herum zu bilden, und dass diese zeitweilige Kapsel behandelt werden kann, um eine weniger zeitweilige semipermeable Membran um die Zellen herum abzuscheiden, ohne die Zellen zu schädigen. Eine solche Substanz wird, im typischen Falle bei einer Konzentration in der Grössenordnung von weniger als 1,0 Gew.-%, zu dem Kulturmedium des Gewebes gegeben, das auch Zellen der Impfkultur, Serumkomponenten (falls erforderlich) und gegebenenfalls Kollagen oder ein anderes hochmolekulares, in Wasser dispergierbares Material, das als Fixierungssubstrat wirkt, enthält. Die Konzentration des als Substrat verwendeten Materials sollte im Bereich von ca. 10 (ig/ml bis 1 mg/ml liegen, liegt aber vorzugsweise in der Grössenordnung von 100 bis 500 (ig/ml.

Die Lösung wird dann zu Tröpfchen verformt, die das Gewebe zusammen mit seinem Medium enthalten, und diese werden sofort wasserunlöslich gemacht und geliert, mindestens in einer Oberflächenschicht. Danach werden die formbeständigen zeitweiligen Kapseln mit einer weniger zeitweiligen Membran versehen, die ihrerseits anschliessend selektiv zerstört werden kann, wenn man wünscht, das Gewebe ohne Schädigung freizusetzen. Sofern es das zur Bildung der zeitweiligen Kapseln verwendete Material erlaubt, kann das Innere der Kapsel nach Bildung der permanenten Membran wieder verflüssigt werden. Dies erfolgt durch Widerhers tel-, lung der Bedingungen, unter denen das Material löslich ist, in dem Medium.

Das zur Bildung der zeitweiligen Kapseln verwendete Material kann ein beliebiges nichttoxisches, wasserlösliches Material sein, das durch eine Veränderung der ionischen Umgebung oder der Ionenkonzentration in eine formbeständige Masse übergeführt werden kann. Das Material sollte auch mehrere leicht ionisierbare anionische Reste, z.B. Carboxylgruppen, enthalten, die durch Salzbildung mit Polymeren, die mehrere kationische Gruppen enthalten, reagieren können. Wie weiter unten erklärt werden wird, ermöglicht es die Verwendung eines Materials dieses Typs, ohne Schwierigkeiten in Oberflächenschichten der temporären Kapsel eine permanente Membran mit einer vorgegebenen Obergrenze der Durchlässigkeit (im allgemeinen nicht höher als 100 000 bis 150 000 Dalton) abzuscheiden.

Die zur Zeit bevorzugten Materialien zur Bildung der zeitweiligen Kapsel sind saure, wasserlösliche, natürliche oder synthetische Polysaccharidgummis. Derartige Materialien sind im Handel erhältlich. Sie werden im typischen Falle aus pflanzlichem Material extrahiert und werden häufig als Additive für verschiedene Nahrungsmittel verwendet. Na-triumalginat ist das zur Zeit bevorzugte wasserlösliche Gummi. Alginate mit Molekulargewichten im Bereich oberhalb von 150 000 Dalton können zwar verwendet werden, vermögen aber wegen ihrer molekularen Abmessungen und ihrer Viskosität gewöhnlich nicht, die am Ende gebildeten Kapselmembranen zu durchdringen. Alginate mit niedrigeren Molekulargewichten, z.B. 50 000 bis 80 000 Dalton, können durch Diffusion durch eine Membran mit genügender Porosität leichter aus dem Volumen innerhalb der Kapsel entfernt werden und werden daher bevorzugt. Andere verwendbare Gummis sind saure Fraktionen von Guargummi, Car-rageenan, Pektin, Tragantgummi oder Xanthangummi.

Diese Materialien weisen glykosidisch verknüpfte Sac-charidketten auf. Ihre freien Säuregruppen liegen oft in der Alkalimetallsalzform, z. B. der Natriumform, vor. Wenn ein mehrwertiges Ion, wie Calcium oder Strontium, gegen das Alkalimetallion ausgetauscht wird, werden die wasserlöslichen Polysaccharidmoleküle «vernetzt» unter Bildung eines wasserunlöslichen, formbeständigen Gels, das durch Entfernung dieser Ionen durch Ionenaustausch oder mit Hilfe eines Sequestriermittels wieder löslich gemacht werden kann. Ob5

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gleich im wesentlichen jedes beliebige mehrwertige Ion, das mit dem sauren Gummi ein Salz zu bilden vermag, verwendbar ist, werden vorzugsweise physiologisch verträgliche Ionen, z.B. Calcium, verwendet. Dies trägt dazu bei, das Gewebe im lebenden Zustand zu halten. Auch andere mehrwertige Kationen können verwendet werden. Magnesiumionen bewirken keine Gelierung von Natriumalginat.

Eine Lösung mit typischer Zusammensetzung umfasst gleiche Volumen einer Zellkultur und ihres Kulturmediums (mit oder ohne Fixierungssubstrat) und eine 1 %ige oder 2%ige Lösung von Gummi in physiologischer Kochsalzlösung. Wenn man Natriumalginat verwendet, wurde eine 1,0-bis 1,5-%ige Lösung erfolgreich verwendet. Kollagen oder andere hochmolekulare, in Wasser dispergierbare Proteine oder Polypeptide, entweder natürliche oder synthetische, können in die Zellkultur einverleibt werden und werden dann innerhalb des Volumens der endgültig gebildeten Kapsel eingeschlossen. Wenn ein Polymer mit mehreren kationischen Gruppen, z.B. Polylysin, verwendet wird, reagieren die kationischen Gruppen mit anionischen Gruppen in dem wasserlöslichen Gummi unter Bildung einer im wesentlichen wasserunlöslichen Matrix, die mit dem Gummi verflochten ist. Die bevorzugten Konzentrationen derartiger Materialien liegen in der Grössenordnung von 100 bis 500 ng/ml der Suspension (einschliesslich der Gummilösung).

In der nächsten Stufe des Einkapselungsprozesses wird die das Gewebe enthaltende Gummilösung in Tröpfchen mit der gewünschten Grösse übergeführt, und die Tröpfchen werden sofort geliert, um formbeständige sphärische oder sphäroide Massen zu bilden. Die Tropfenbildung kann fol-gendermassen ausgeführt werden:

Ein Röhrchen, das eine wässrige Lösung mehrwertiger Kationen, z.B. eine l,5%ige Calciumchloridlösung, enthält, wird mit einem Stopfen versehen, der einen Tropfenbildungsapparat enthält. Der Apparat besteht aus einem Gehäuse mit einer oberen Luftaufnahmedüse und einem langgestreckten Hohlkörper, der durch Reibungskraft in dem Stopfen befestigt ist. Eine 10 ml-Spritze, die mit einer Fortschaltpumpe versehen ist, wird oben auf dem Gehäuse montiert, wobei z. B. eine mit Teflon beschichtete Nadel mit einem Innendurchmeser von 0,25 mm durch die ganze Länge des Gehäuses hindurchreicht. Das Innere des Gehäuses ist so konstruiert, dass die Spitze der Nadel einem dauernden laminaren Luftstrom ausgesetzt ist, der als Luftmesser wirkt. Im Gebrauch wird die Spritze mit der Lösung, die das einzukapselnde Material enthält, gefüllt und die Fortschaltpumpe betätigt, um in Inkrementen Tröpfchen der Lösung aus der Spitze der Nadel hinauszutreiben. Jeder Tropfen wird durch den Luftstrom «abgeschnitten» und fällt annähernd 2,5 cm hinab in die Calciumchloridlösung, wo er sofort durch Absorption von Calciumionen geliert. Der Abstand zwischen der Spitze der Nadel und der Oberfläche der Calciumchloridlösung ist in diesem Falle genügend gross, damit die Na-triumalginat/Zell-Suspension die physikalisch günstigste Form annimmt, nämlich eine Kugel (maximales Volumen bei minimaler Oberfläche). Die Luft innerhalb des Röhrchens entweicht durch eine Öffnung in dem Stopfen. Dies führt zur «Vernetzung» des Gels und zur Bildung einer hochviskosen, formbeständigen schützenden zeitweiligen Kapsel, die das suspendierte Gewebe und sein Medium enthält. Die Kapseln sammeln sich in der Lösung als getrennte Phase an und können durch Absaugen abgetrennt werden.

In der nächsten Stufe des Verfahrens wird durch «Vernetzung» von Oberflächenschichten eine semipermeable Membran um die Oberfläche der zeitweiligen Kapseln herum abgeschieden. Dies kann erfolgen, indem man die gelierten zeitweiligen Kapseln einer wässrigen Lösung eines Polymeren aussetzt, das kationische Gruppen enthält, die mit den anionischen funktionellen Gruppen oder Gelmoleküle reaktionsfähig sind. Polymere, die mit Säure reaktionsfähige Gruppen, wie freie Imin- oder Amingruppen, enthalten, werden bevorzugt. In dieser Situation wird der Polysaccharid-gummi durch Wechselwirkung (Salzbindungsbildung) zwischen den Carboxylgruppen und den Amin- oder Imingrup-pen vernetzt. Die Durchlässigkeit kann innerhalb gewisser Grenzen gesteuert werden, indem man das Molekulargewicht des verwendeten vernetzenden Polymeren in geeigneter Weise auswählt und indem man die Konzentration der Polymerlösung und die Dauer und Temperatur der Einwirkung reguliert. Eine Lösung eines Polymeren mit niedrigem Molekulargewicht dringt innerhalb einer gegebenen Zeit weiter in die zeitweiligen Kapseln ein als ein hochmolekulares Polymer. Der Grad des Eindringens des Vernetzungsmittels wurde in Beziehung zu der resultierenden Durchlässigkeit gesetzt. Im allgemeinen ist die Porengrösse umso grösser, je höher das Molekulargewicht und je geringer die Eindringung ist. Allgemein können Polymere mit Molekulargewichten im Bereich von 3000 bis 100 000 Daltons verwendet werden, und zwar in Abhängigkeit von der Dauer der Reaktion, der Konzentration der Polymerlösung und dem gewünschten Grad der Durchlässigkeit. Eine erfolgreiche Kombination von Reaktionsbedingungen bei Verwendung eines Polylysins mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ca. 35 000 Dalton umfasste die Reaktion einer 0,0167% Polylysin enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung unter Rühren während zwei Minuten. Dies ergab Membranen mit einer oberen Durchlässigkeitsgrenze von ca. 100 000 Dalton. Die optimalen Reaktionsbedingungen, die sich für die Steuerung der Durchlässigkeit bei einem gegebenen System eignen, können im Hinblick auf die vorstehenden Richtlinien leicht empirisch festgelegt werden. Unter Anwendung dieses Verfahrens ist es möglich, die obere Durchlässigkeitsgrenze der Membranen auf einen vorgegebenen Wert, der im allgemeinen unter ca. 150 000 Dalton, liegt, einzustellen.

Beispiele von geeigneten vernetzten Polymeren sind Proteine und Polypeptide, die entweder natürlich oder synthetisch sein können und freie Amino- oder Iminogruppen enthalten, Polyäthylenamine, Polyäthylenimine und Polyvinyl-amine. Polylysin, sowohl in der D-Form als auch in der L-Form, wurde erfolgreich verwendet. Auch Proteine, wie Po-lyarginin, Polycitrullin oder Polyornithin, sind verwendbar. Polymere mit einer positiven Ladungsdichte im höheren Bereich, z.B. Polyvinylamin, haften stark an den anionischen Gruppen der Gelmoleküle unter Bildung beständiger Membranen, aber die Membranen lassen sich etwas schwieriger zerstören.

Die Behandlung mit einer verdünnten Lösung von Gummi oder einem zwitterionischen Puffer verknüpft die freien Aminogruppen auf den Oberflächen der Kapseln, die andernfalls den Kapseln eine Neigung zum Zusammenklumpen verleihen könnten.

An diesem Punkt des Einkapselungsverfahrens können Kapseln gesammelt werden, die eine semipermeable Membran aufweisen, die eine gelierte Lösung von Gummi, ein mit dem Zelltyp verträgliches Kulturmedium, Zellen und gegebenenfalls eine innere Matrix von Kollagen oder einem anderen Fixierungssubstrat enthalten. Da innerhalb der Kapseln und durch die Membranen hindurch eine Massenübertragung begünstigt werden soll, wird das Gel vorzugsweise wieder zu seiner wasserlöslichen Form verflüssigt. Dies kann geschehen, indem man die Bedingungen, unter denen das Gummi flüssig ist, wieder herstellt, z. B. indem man das Calcium oder die anderen mehrwertigen Kationen aus dem inneren Gel entfernt. Das Medium in den Kapseln kann einfach wieder löslich gemacht werden, indem man die Kapseln in mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung eintaucht, die

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Alkalimetallionen und Wasserstoffionen enthält. Die einwertigen Ionen tauschen sich gegen die Calciumionen oder anderen mehrwertigen Ionen innerhalb des Gummis aus, wenn die Kapseln unter Rühren in die Lösung eingetaucht werden. Natriumcitratlösungen können für den gleichen Zweck verwendet werden und dienen dazu, die mehrwertigen Ionen zu sequestrieren.

Zellkulturen, die wie oben beschrieben eingekapselt worden sind, können in einem Wachstumsmedium suspendiert werden, das spezifisch darauf ausgerichtet ist, alle Anforderungen des betreffenden Zelltyps zu erfüllen, und unterliegen weiterhin normalem in vitro-Stoffwechsel und der Mitose. Wenn die Kultur ein Milieu mit hochmolekularen Komponenten, wie Serumkomponenten, benötigt, können diese aus dem Medium ausserhalb der Kapseln weggelassen werden. Im typischen Fall haben die Komponenten, die normalerweise von den Zellen aufgenommen werden, ein verhältnismässig geringes Molekulargewicht und diffundieren leicht durch die Kapselmembranen in das Mikromilieu der Zellen, wo sie durch die Zellmembran hindurchdringen. Stoffwechselprodukte der Zellen, die in das Medium innerhalb der Kapsel ausgeschieden werden, diffundieren gleichfalls durch die Kapselmembran hindurch und sammeln sich im Medium ausserhalb der Kapsel an, wenn sie ein Molekulargewicht unterhalb der Obergrenze der Durchlässigkeit der Kapselmembran haben.

Die eingekapselten Zellen werden unter Bedingungen z.B. der Temperatur, des pH-Wertes und des ionischen Milieus gezüchtet, die gleich sind wie bei herkömmlichen Kulturen. Die Zell-Stoffwechselprodukte können aus dem Medium ausserhalb der Kapsel oder aus dem Volumen der Kapsel in herkömmlicher Weise geerntet werden. Jedoch hat das hier offenbarte Kulturverfahren die folgenden Vorteile:

1. Die Zellen der Kultur sind gegen Verunreinigung durch Faktoren mit Abmessungen oberhalb der oberen Durchlässigkeitsgrenze der Membran geschützt. Dies bedeutet, dass die Anforderungen an die Sterilität, die normalerweise mit Züchtungsverfahren verbunden sind, etwas gelok-kert werden können, da Mikroorganismen die eingekapselten Zellen nicht erreichen können.

2. Die Kapseln immobilisieren die Zellen innerhalb eines Milieus, in das hochmolekulare Materialien eingeschlossen sind, und trotzdem werden niedrigermolekulare Zellnährstoffe und -produkte leicht entfernt und eingeführt. Dies erlaubt es, das Nährmedium nach Wunsch intermittierend oder kontinuierlich zu sammeln und zu ergänzen, ohne die Zellen zu stören.

3. Interessierende Substanzen, die durch die Zellen erzeugt werden, lassen sich leichter gewinnen. Zellprodukte mit Molekülabmessungen, die genügend klein sind, um die Kapselmembranen zu durchdringen, sammeln sich in dem Medium ausserhalb der Kapseln im Gemisch mit Nährstoffen an. Jedoch werden hochmolekulare Serumkomponenten und dergleichen nicht in das Medium ausserhalb der Kapseln freigesetzt, was die Gewinnung eines interessierenden Zellproduktes vereinfacht. Zellprodukte mit Molekülabmessungen oberhalb der oberen Durchlässigkeitsgrenze der Membranen sammeln sich innerhalb der Kapseln an. Sie können in relativ konzentrierter Form gewonnen werden, indem man die Kapseln isoliert und anschliessend die Membranen selektiv zerstört, z.B. unter Anwendung der im folgenden angegebenen Methode.

4. Das Volumen innerhalb der Kapseln stellt ein Milieu zur Verfügung, das für die Zellteilung gut geeignet ist. Es wurde beobachtet, dass Suspensionskulturen innerhalb der Kapseln eine Mitose erfahren. Fixierungsabhängige Zellen, die in normalen Kulturen in einer zweidimensionalen einfachen Schicht wachsen, vermehren sich unter Bildung einer erheblichen Menge von Zellen innerhalb der Kapsel. Derartige Zellen verwenden die Innenoberflächen der Membran als Substrat und/oder fixieren sich an den hochmolekularen Materialien, die oben genannt wurden und die innerhalb der Kapseln angeordnet sind. Dies führt zu signifikanten Zunahmen der Zelldichte, verglichen mit herkömmlichen Kulturen. Die fortlaufende Lebensfähigkeit derartiger Zelltrauben wird durch die Tatsache begünstigt, dass die Verhältnisse von Oberfläche zu Volumen der Kapseln ziemlich gross sein können, so dass alle Zellen Zugang zu den erforderlichen Nährstoffen, Sauerstoff usw. haben.

In bestimmten Situationen ist es vorteilhaft, die Kapselmembranen selektiv zu zerstören, um die Zellen ohne Schädigung freizusetzen. Eines der bemerkenswerten Beispiele ist die Herstellung von Interferon. Zellen, die Interferon zu erzeugen vermögen, müssen bei der Vorbereitung für das Interferonerzeugungsstadium bestimmten Viren oder Nuclein-säuren ausgesetzt werden. Bei mehreren Interferon-Induk-tionsverfahren werden der Kultur Reagentien zugesetzt, um die Proteinsynthese zu hemmen. Demzufolge muss das Wachstumsstadium des Züchtungsprozesses unter Bedingungen ausgeführt werden, die von denen der Interferon-Induktionsstufe ganz verschieden sind. Wenn die für die Interferon-Induktion verwendeten Substanzen ein Molekulargewicht oberhalb der oberen Durchlässigkeitsgrenze der Kapselmembran haben (wie im Falle von Virusinduktionen), kann der Induktionsprozess nicht in der eingekapselten Zellkultur ausgeführt werden. Demzufolge müssen Interferon erzeugende Zellen, wenn sie innerhalb der Kapsel gezüchtet worden sind, durch Zerstören der Membran freigesetzt werden, um sie dem Induktionsprozess zu unterwerfen.

Zellen, die in Membranen des oben dargelegten Typs eingeschlossen sind, können mittels eines Verfahrens freigesetzt werden, bei dem im Handel erhältliche Reagentien, deren Eigenschaften die eingekapselten Zellen nicht in signifikanter Weise nachteilig beeinflussen, verwendet werden. Zuerst werden die Kapseln von ihrem Suspendiermedium abgetrennt, gründlich gewaschen, um alle auf dem Äusseren der Mikrokapseln vorhandenen Verunreinigungen zu entfernen, und dann unter Rühren in einer gemischten Lösung von einatomigen, mehrwertigen Kationen, wie Calciumionen, und einem Polymer mit mehreren anionischen Resten, wie einem Salz einer Polysulfonsäure oder Polyphosphorsäure, disper-giert. Für diese Stufe wird Heparin, ein natürliches sulfonier-tes Polysaccharid, bevorzugt. Die anionische Ladungsdichte auf dem verwendeten Polymer sollte gleich wie die Ladungsdichte des ursprünglich zur Bildung der Membranen verwendeten sauren Gummis oder vorzugsweise grösser sein. Das Molekulargewicht des Polymeren sollte mindestens vergleichbar sein mit dem Molekulargewicht des Polymeren mit mehreren kationischen Gruppen, das zur Bildung der Membran verwendet wurde, und ist vorzugsweise grösser. Innerhalb der Suspension von Kapseln in der gemischten Lösung konkurrieren die Calciumionen mit den kationischen Polymerketten, die zur Bildung der Membran verwendet wurden, um anionische Gruppen auf dem wasserlöslichen Gummi. Gleichzeitig konkurriert das Heparin oder andere Polymer mit mehreren anionischen Gruppen, das in der Lösung gelöst ist, mit dem anionischen Gummi in der Membran um die kationischen Gruppen auf den Polymerketten. Dies führt zu einem in Wasser dispergierbaren oder vorzugsweise wasserlöslichen Komplex von z.B. Polylysin und Heparin und zur Assoziierung der einatomigen Kationen mit den Molekülen des Gels.

Diese Stufe macht die Membran bei der anschliessenden Einwirkung eines Sequestriermittels, das den Zerstörungs-prozess durch Aufnahme von einatomigen Ionen aus dem Gel zu Ende führt, löslich. Falls Reste von Kapselmembra5

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Die zur Zeit bevorzugte Lösung für die erste Stufe des selektiven Zerstörungsprozesses enthält 1,1% (Gew./Vol.) Calciumchlorid und zwischen 500 und 1500 Einheiten Heparin pro ml der Lösung. Zu dieser Lösung wird ein Volumen von Mikrokapseln zugesetzt, das genügt, um zwischen ca. 20 und 30% des Gesamtvolumens der Dispersion auszumachen. Calciumchlorid und Heparin werden bevorzugt, da beide Reagentien mit den meisten Zellen physiologisch verträglich sind und daher die Möglichkeit einer Zellschädigung minimieren. Gemische von Strontiumsalzen oder Salzen anderer mehrwertiger Kationen (aber keine Magnesiumionen) können ebenfalls zusammen mit den Polysulfonsäure- oder Polyphosphorsäuresalzen des oben beschriebenen Typs verwendet werden.

Im allgemeinen können die Konzentrationen der einatomigen Ionen und des anionischen Polymeren, die in dieser Stufe angewandt werden, innerhalb weiter Grenzen schwanken. Die optimalen Konzentrationen können leicht empirisch bestimmt werden und hängen von der Einwirkungszeit sowie von dem zur Bildung der Membranen verwendeten speziellen Polymeren ab.

Das zur Zeit bevorzugte Sequestriermittel zur Ausführung der selektiven Zerstörung ist Natriumeitrat, obgleich auch andere Alkalimetallcitrate und Alkalimetallsalze der Äthylendiamintetraessigsäure verwendet werden können. Wenn Natriumeitrat verwendet wird, liegt die optimale Konzentration in der Grössenordnung von 50 bis 60 mMol pro Liter. Es wird bevorzugt, das Citrat oder andere Sequestriermittel in isotonischer Kochsalzlösung zu lösen, um die Zellschädigung zu minimieren.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1: Menschliche Fibroblasten

Menschliche Fibroblasten, die durch Behandlung einer herkömmlichen einschichtigen Kultur mit Trypsin und Äthylendiamintetraessigsäure während 5 Minuten bei 37 °C in bekannter Weise erhalten wurden, werden in einem kompletten Wachstumsmedium (CMLR 1969, Connaught Laboratories), ergänzt mit 40 Vol.-% gereinigtem fötalem Kälberserum, 0,8% Natriumalginat (Sigma) und 200 |J.g/ml gereinigtem Kalbshautkollagen, suspendiert. Die Dichte der Zellsuspension beträgt ca. 1,5 x 107 Zellen/ml.

Dann wird eine l,5-%ige Calciumchloridlösung verwendet, um Tröpfchen zu gelieren, die unter Verwendung eines oben beschriebenen Tropfenbildungsapparates gebildet wurden. Tröpfchen in der Grössenordnung von 50 bis 500 |im Durchmesser verlassen die Spitze der Nadel und gelieren sofort beim Eintritt in die Calciumlösung.

Nach 5 Minuten wird die überstehende Löäung durch Absaugen entfernt. Die gelierten Kapseln werden dann in ein Becherglas übergeführt, das 15 ml einer Lösung enthält, die 1 Teil einer 2%igen 2-(Cyclohexylamino)-äthansulfon-säure-Pufferlösung in 0,6%igem Natriumchlorid (isotonisch, pH = 8,2), verdünnt mit 20 Teilen l%igem Calciumchlorid, enthält. Nach 3-minütigem Eintauchen werden die Kapseln zweimal mit 1%-iger Calciumchloridlösung gewaschen.

Die Kapseln werden dann in 32 ml einer Lösung übergeführt, die 0,005% (Gew./Vol.) Polylysin (durchschnittliches Molekulargewicht 43 000 Dalton) in physiologischer Kochsalzlösung enthält. Nach 3 Minuten wird die Polylysinlösung dekantiert. Die resultierenden Kapseln, die «permanente» semipermeable Membranen haben, werden dann zweimal mit 1 %igem Calciumchlorid und zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und mit 10 ml einer 0,03%igen Alginsäurelösung gemischt.

Die Kapseln widerstehen der Klumpenbildung, und bei allen kann festgestellt werden, dass sie Fibroblasten enthalten. Das Gel auf der Innenseite der Kapseln wird wieder verflüssigt, indem man die Kapseln 5 Minuten lang in ein Gemisch aus Kochsalzlösung und Citratpuffer (pH = 7,4) eintaucht. Die vorstehenden Verfahren werden alle bei 22 bis 37 °C ausgeführt.

Unter dem Mikroskop stellt man fest, dass diese Kapseln eine sehr dünne Membran aufweisen, die Zellen einschliesst. Moleküle mit einem Molekulargewicht bis ca. 100 000 können durch die Membran hindurchtreten.

Die resultierenden Kapseln werden in CMLR-1969, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt ist, suspendiert. Nachdem die Kapseln 4 bis 5 Tage lang bei 37 C bebrütet worden sind, stellt man durch Untersuchung unter dem Mikroskop fest, dass sie Fibroblasten enthalten, die innerhalb der Mikrokapseln eine Mitose erfahren haben und eine klassische fibroblastische Morphologie aufweisen.

Die Kapselmembranen können dann ohne Schädigung der Zellen zerstört werden, indem man eine Portion von 10 ml der Mikrokapselsuspension, die ca. 500 bis 1000 Kapseln pro ml enthält, sich absetzen lässt. Nach dem Absaugen des Mediums werden die Kapseln zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Kapseln werden dann mit einem aliquoten Teil von 3,0 ml, der 1000 Einheiten Heparin pro ml und 1,1% (Gew./Vol.) Calciumchlorid enthält, gemischt. Die Suspension wird 3 Minuten lang bei 37 C gerührt, wonach man die Kapseln sich absetzen lässt. Die überstehende Flüssigkeit wird abgesaugt, und die Kapseln werden zweimal mit 3,0 ml 0,15-molarem Natriumchlorid gewaschen. Nach Absaugen der zweiten Waschlösung werden die Kapseln mit 2,0 ml einer gemischten Lösung gemischt, die gleiche Volumen 110-molares Natriumeitrat und 0,15-molares Natriumchlorid enthält (pH = 7,4). Das Gemisch wird eine Minute lang von Hand verwirbelt, um die Auflösung der Membranen zu veranlassen, wonach die Zellen zweimal in dem Medium gewaschen werden.

Die Fibroblasten werden einer Interferon-ß-Superinduk-tion nach dem Verfahren von Vilcek unterworfen. Unter einer 5%igen Kohlendioxydatmosphäre (95% Luft) wird die Zellsuspension in Gegenwart von 100 (ig Poly I-Poly C pro ml, einer doppelsträngigen RNS (bekannter Interferoninduktor), die von PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin, erhältlich ist, und 50 ng Cycloheximid pro ml (Proteinsyntheseinhibitor, Calbiochem, La Jolla, California) 1 Stunde lang bei 37 °C bebrütet. Nach 1 Stunde werden die suspendierten Zellen in dem Medium (CMLR-1969), das 50 Hg Cycloheximid pro ml enthält, gewaschen und dann wieder 3 Stunden lang bei 37 °C unter einer 5%-igen Kohlendioxydatmosphäre in der gleichen Lösung suspendiert. Nach Beendigung dieser Bebrütung wird die Waschstufe wiederholt, worauf die Zellen in dem Medium, das 50 Hg Cycloheximid pro ml und 5 |ig Ac-timomyein D (ein bekannter RNS-Syntheseinhibitor, Calbiochem) pro ml enthält, suspendiert und 2 Stunden lang bei 37 °C unter einer 5%igen Kohlendioxydatmosphäre bebrütet. Die Zellen werden dann zweimal in dem Medium gewaschen und bei 37 °C 18 bis 24 Stunden lang in dem serumfreien Medium suspendiert; während dieser Zeit scheiden die Fibroblasten Interferon-ß aus, das ein Molekulargewicht in der Grössenordnung von 21 000 Dalton hat und aus dem Medium ausserhalb der Kapseln geerntet werden kann.

Bei einem Experiment mit Poly I-Poly C(5S) (Sedimentationswert, Poly I und Poly C, erwärmt unter Bildung von doppelsträngiger RNS) wurden 2500 Einheiten Interferon-ß pro 105 Zellen in der Kultur erzeugt. Eine gleiche Ausbeute wurde in einem zweiten Ansatz erhalten, der unter Verwendung von Poly I-Poly C (12S) (doppelsträngig, wie gekauft) ausgeführt wurde.

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1 Blatt Zeichnungen

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1. Verfahren zum Züchten von Zellen, die normalerweise nur eine Mitose erfahren, wenn sie auf einem Substrat fixiert sind, wobei die Zellen in eine semipermeable Membran eingekapselt werden, dadurch gekennzeichnet, dass man

A. die Zellen in einem Kulturmedium suspendiert, das alle Komponenten a enthält, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten und die Mitose der Zellen zu unterhalten, und die ein Molekulargewicht oberhalb eines vorgegebenen Wertes haben;

B. die Zellen zusammen mit dem Kulturmedium innerhalb mehrerer semipermeabler Membranen einkapselt, die eine Obergrenze der Durchlässigkeit haben, die genügt, um den Durchtritt der Komponenten a zu verhindern und es zu ermöglichen, dass Moleküle mit einem Molekulargewicht unterhalb des vorgegebenen Wertes die Membranen durchqueren;

C. das Produkt aus Stufe B in einem Kulturmedium suspendiert, das alle Komponenten b enthält, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten und die Mitose der Zellen zu unterhalten, und die ein Molekulargewicht unterhalb des vorgegebenen Wertes haben;

und

D. die Zellen innerhalb der Membranen eine Mitose erfahren lässt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Fixierungssubstrat mit einem Molekulargewicht oberhalb des vorgegebenen Wertes, vorzugsweise ein Protein, insbesondere Kollagen, in die Suspension der Stufe A einverleibt.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Fixierungssubstrat Kalbshautkollagen verwendet und dieses in einer Konzentration zwischen 10 (ig/ml und 1,0 mg/ml in die Suspension einverleibt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Membranen nach der Stufe D selektiv zerstört, um die Zellen freizusetzen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Zellen Fibroblasten, vorzugsweise menschliche Fibroblasten, die Interferon auszuscheiden vermögen, verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Komponente a Serumkomponenten verwendet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man während der Einkapselungsstufe B sphäroidale Membranen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 100 bis 500 |xm erzeugt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Fixierungssubstrat ein Protein mit mehreren freien kationischen Gruppen verwendet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der vorgegebene Wert unter 2 x 105 Dalton, vorzugsweise unter 1 x 105 Dalton, liegt.

10. Verfahren zur Herstellung von Interferon, dadurch gekennzeichnet, dass man

A. Fibroblasten, die Interferon auszuscheiden vermögen, in einem Kulturmedium suspendiert, das alle Komponenten a enthält, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit der Fibroblasten aufrechtzuerhalten und die Mitose der Fibroblasten zu unterhalten, und die ein Molekulargewicht oberhalb eines vorgegebenen Wertes haben;

B. die Fibroblasten zusammen mit dem Kulturmedium innerhalb mehrerer semipermeabler Membranen einkapselt, die eine Obergrenze der Durchlässigkeit haben, die genügt, um den Durchtritt der Komponenten a zu verhindern und es zu ermöglichen, dass Moleküle mit einem Molekulargewicht unterhalb des vorgegebenen Wertes die Membranen durchqueren;

C. das Produkt aus Stufe B in einem Kulturmedium suspendiert, das alle Komponenten b enthält, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit der Fibroblasten aufrechtzuerhalten und die Mitose der Fibroblasten zu unterhalten, und die ein Molekulargewicht unterhalb des vorgegebenen Wertes haben;

D. die Fibroblasten innerhalb der Membranen eine Mitose erfahren lässt;

E. die Membranen nach der Stufe D selektiv zerstört, um die Fibroblasten freizusetzen;

F. die Fibroblasten einem Interferoninduktionsprozess unterwirft;

G. die Fibroblasten, die aus der Stufe F stammen, in einem Kulturmedium bebrütet; und

H. aus dem Kulturmedium von Stufe G Interferon erntet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Fixierungssubstrat mit einem Molekulargewicht oberhalb des vorgegebenen Wertes, vorzugsweise ein Protein, insbesondere Kollagen, in die Suspension der Stufe A einverleibt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als Fixierungssubstrat, Kalbshautkollagen verwendet und dieses in einer Konzentration zwischen 10 |ig/ ml und 1,0 mg/ml in die Suspension einverleibt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass man als Fibroblasten menschliche Fibroblasten, die Interferon auszuscheiden vermögen, verwendet.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass man als Komponenten a Serumkomponenten verwendet.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass man während der Einkapselungsstufe sphäroidale Membranen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 100 bis 500 |im erzeugt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass man als Fixierungssubstrat ein Protein mit mehreren freien kationischen Gruppen verwendet.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der vorgegebene Wert unter 2 x 105 Dalton, vorzugsweise unter 1 x 105 Dalton, liegt.