CH662426A5

CH662426A5 - Verfahren und vorrichtung zur umsetzung von festen und fluessigen phasen.

Info

Publication number: CH662426A5
Application number: CH1073/83A
Authority: CH
Inventors: Ei Mochida; Takashi Kudo; Minoru Tsumura
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1981-08-27
Filing date: 1983-02-25
Publication date: 1987-09-30
Also published as: GB2105462A; US4482636A; DE3231994C2; CA1197666A; NL8300089A; JPS6161857B2; FR2512207B1; BR8204980A; GB2105462B; NL191322C; SE8207486L; SE8307238L; SE435999B; SE454466B; JPS5836631A; NL191322B; DE3231994A1; SE8207486D0; AR231029A1; SE8307238D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren gemäss dem Oberbegriff von Anspruch 1 und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Immunologische Verfahren zur quantitativen Bestimmung von sehr kleinen Mengen einer Substanz in Körperflüssigkeiten oder zur Bestimmung der Konzentration von verabreichten Medikamenten im Blut oder Harn in einem Organismus unter Anwendung einer Antigen-Antikörperre-aktion sind bekannt. Verschiedene Verfahren, die auf verschiedenen Bestimmungsprinzipien beruhen, sind bekannt und werden in der Praxis angewendet. Solche Verfahren sind z.B. Radioimmunassay (RIA), Enzymimmunassay (EIA) und Fluoreszenzimmunassay (FIA), die wegen ihrer hohen Empfindlichkeit und Leistungsfähigkeit bei der quantitativen Bestimmung oft verwendet werden. Bei der Ausführung dieser Bestimmungen wird entweder nach der sogenannten Sandwich-Methode oder der kompetitiven Methode gearbeitet. Die Sandwich-Methode wird besonders oft verwendet, da sie einen hohen Grad an analytischer Empfindlichkeit bietet und leicht ausführbar ist.

Nach der Sandwich-Methode wird das zu bestimmende Antigen mit dem entsprechenden unlöslich gemachten Antikörper umgesetzt (erste Reaktion), wobei ein Antigen-Anti-körper-Komplex gebildet wird. Dieser Komplex wird mit einem mit einem Markierungsmittel markierten Antikörper, der mit dem zu bestimmenden Antigen reagieren kann, umgesetzt (zweite Reaktion). Dann wird der markierte Antikörper in zwei Teile aufgeteilt, wovon ein Teil mit dem Antigen-Antikörper-Komplex reagiert und der andere Teil nicht reagiert hat; die Aktivität des Markierungsmittels wird in den beiden Teilen gemessen. Ähnliche Vorgehen werden mit einem Antigen bei bekannten Konzentrationen ausgeführt, um eine Eichkurve zu erhalten. Die Menge des zu bestimmenden Antigens wird der Eichkurve entnommen. Als Markierungsmittel kann beispielsweise ein Enzym oder eine radioaktive oder fluoreszierende Substanz eingesetzt werden.

Nach der kompetitiven Methode, die als erste bei der Radioimmunassay eingesetzt wurde, wird die Bestimmung wie folgt ausgeführt :

Wenn das zu bestimmende Antigen und eine bestimmte Menge des markierten Antigens mit dem dem zu bestimmenden Antigen entsprechenden unlöslich gemachten Antikörper umgesetzt werden, reagieren beide Antigene kompe-titiv konkurrierend mit dem unlöslich gemachten Antikörper. Danach wird das markierte Antigen in zwei Teile aufgeteilt, wovon ein Teil mit dem unlöslich gemachten Antikörper reagiert hat und der andere nicht reagiert hat ; die Aktivität des Markierungsmittels in beiden Teilen wird gemessen. Ähnliche Vorgehen werden mit einem Antigen bei bekannten Konzentrationen wiederholt, um eine Eichkurve zu erstellen. Die Menge des zu bestimmenden Antigens wird der Eichkurve entnommen.

Bei der Ausführung dieser Reaktionen wird als Träger für eine reaktionsfähige Substanz, wie ein unlöslich zu machender Antikörper, vorteilhaft die Innenwand eines

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Gefässes verwendet. Beispielsweise wird oft ein Kunststoffreagenzglas verwendet, da es sowohl als Träger für das Unlöslichmachen wie auch als Reaktionsgefäss dient und leicht zu handhaben ist. Die Verwendung der Innenwand des Reak-tionsgefässes ist jedoch insofern nachteilig, als dass ihre Oberfläche, an die der Antikörper oder eine andere reaktionsfähige Substanz fixiert wird, kleiner ist als jene von anderen Trägern, wie Kunststoffperlen, Filterpapier oder Celluloseteilchen und deshalb nur eine kleine Menge der reaktiven Substanz tragen kann. Folglich verlängert sich die Reaktionszeit, wenn, wie üblich, das Reagenzglas oder ein anderes Reaktionsgefäss, das eine unlöslich-gemachte reaktionsfähige Substanz an seiner Innenwand trägt, aufrecht und ruhig gehalten wird oder sein Inhalt von Zeit zu Zeit gerührt wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur wirksamen Umsetzung einer an eine feste Phase gebundenen reaktionsfähigen Substanz mit einer reaktionsfähigen Substanz in einer flüssigen Phase vorzuschlagen.

Vorzugsweise soll erfindungsgemäss ein verbessertes Umsetzungsverfahren zur Bestimmung der Menge einer reaktiven Substanz in einer flüssigen Phase mittels einer an eine feste Phase gebundenen reaktionsfähigen Substanz vorgeschlagen werden.

Insbesondere soll die Erfindung eine schnelle Reaktionsmethode für die Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers in einer flüssigen Phase mittels eines an eine feste Phase gebundenen Antikörpers oder Antigens oder eines Komplexes dieser beiden vorschlagen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Vorrichtungen zur Durchführung des obigen Verfahrens zu schaffen, auf denen Reaktionsgefässe in geneigter Stellung gedreht werden. Die Zeichnungen und die nachfolgende Beschreibung veranschaulichen die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen. Es zeigen:

Fig. 1 eine graphische Darstellung von Eichkurven, deren eine nach dem erfindungsgemässen Verfahren und deren andere nach dem Stand der Technik erhalten wurde;

Fig. 2 eine graphische Darstellung, die zeigt, dass die Reaktionszeit erfindungsgemäss verkürzt werden kann ;

Fig. 3 eine graphische Darstellung einer Eichkurve nach der AFP assay in Beispiel 1 ;

Fig. 4 eine graphische Darstellung einer Eichkurve für die CEA assay in Beispiel 2;

Fig. 5 eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemässen Vorrichtung;

Fig. 6 ein Kraftübertragungssystem für eine Vorrichtung gemäss Fig. 5 ;

Fig. 7 eine perspektivische Ansicht einer weiteren erfindungsgemässen Vorrichtung; und

Fig. 8 und 9 vergrösserte Teilansichten der Befestigung der Reaktionsgefässe in einer Vorrichtung der Fig. 7.

Die Erfinder haben ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, um die oben beschriebenen Nachteile des bekannten Verfahrens unter Verwendung eines Reaktionsgefässes als Träger für das Unlöslichmachen zu vermeiden. Sie haben nun gefunden, dass eine höhere Empfindlichkeit und eine Verkürzung der Reaktionszeit erzielt werden kann, wenn das Reaktionsgefäss während der Umsetzung um einen bestimmten Winkel geneigt und mit einer bestimmten Geschwindigkeit gedreht wird und nicht wie bisher ruhig aufrechtgehalten oder von Zeit zu Zeit gerührt wird.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren, welches im Anspruch 1 definiert ist und Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens, welche in den Ansprüchen 18 und 22 definiert sind. Nachfolgend wird als Reaktionsgefäss ein Rea3

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genzglas, als an die Innenwand des Reaktionsgefässes gebundene Substanz ein Antikörper und als Substanz in der flüssigen Phase ein Antigen verwendet. Diese Kombination dient jedoch nur der Vereinfachung der Beschreibung und selbstverständlich sind andere Kombinationen erfindungsgemäss auch möglich.

Substanzen in Körperflüssigkeiten kommen im allgemeinen in sehr kleinen Mengen vor und die Körperflüssigkeiten selber sind oft nur in kleinen Mengen erhältlich. Deshalb muss jedes Verfahren zur Bestimmung dieser Substanzen eine hohe analytische Empfindlichkeit für eine in nur kleiner Menge vorhandenen Probe aufweisen. Deshalb wird im allgemeinen ein Antikörper an die Innenwand eines Reagenzglases nur in der Nähe von dessen Boden, beispielsweise bis zu einer Höhe von 1 cm über dem Boden des Reagenzglases, gebunden.

Demgegenüber kann erfindungsgemäss ein Antikörper an eine grössere Fläche, einschliesslich des oberen Teils eines Reagenzglases, gebunden werden, da eine Probe, sogar mit einem kleinen Volumen, in eine grossflächige Berührung mit dem Antikörper gebracht werden kann, wenn das Reaktionsgefäss in einer geneigten Stellung, wie weiter unten beschrieben wird, gedreht wird. Ausserdem beträgt die Drehung des Reagenzglases zum Rühren seines Inhaltes bei, wodurch eine Bestimmung mit grosser Empfindlichkeit in kurzer Zeit ermöglicht wird.

Tabelle 1 zeigt die Beziehung zwischen dem Neigungswinkel des Reaktionsgefässes und der erforderlichen relativen Menge der Probe zur Benetzung des den Antikörper tragenden Teils des Reaktionsgefässes, wenn die mit Antikörper bedeckte Fläche im Reaktionsgefäss konstant ist. Tabelle 2 zeigt die Beziehung zwischen dem Neigungswinkel des Reaktionsgefässes und der Berührungsfläche zwischen der Probe und der Innenwand, wenn die Menge der Probe konstant gehalten wird.

Tabelle 1

Neigungswinkel Erforderliches Relativvolumen der Probe

90° (aufrecht) 1

45° etwa Vi

30° etwa lA

20° etwa Vs

10° etwa '/io

Tabelle 2

Neigungswinkel Relative Grösse der Berührungsfläche

90° (aufrecht) 1

40° etwa 1.5

30° etwa 2

20° etwa 3

10° etwa 4

Es ist allgemein zutreffend, dass Reagenzien umso wirksamer miteinander umgesetzt werden können, je grösser ihre Berührungsfläche ist. Wie aus Tabelle 1 klar ersichtlich ist, nimmt bei Verkleinerung des Neigungswinkels des Reaktionsgefässes gegen eine horizontale Stellung das zur Benützung einer konstanten Berührungsfläche erforderliche Probevolumen ab. Folglich ist es erwünscht, das Reaktionsgefäss, so weit wie es ohne Ausfliessen der Reaktionsflüssigkeit möglich ist, anzunähern. Sogar wenn die Neigung des Reaktionsgefässes sehr nahe bei der Horizontalen liegt, beispielsweise 5° über der Horizontalen, besteht keine Gefahr, dass die Probe den Boden des Gefässes nicht berührt, es sei denn, dass das Probenvolumen ausserordentlich klein ist.

Obwohl es keine obere Grenze bezüglich des Neigungswinkels des Reaktionsgefässes gibt, wird er vorzugsweise kleiner als 45°, insbesondere 10 bis 20°, gehalten, um Probenvolumen zu sparen und die analytische Empfindlichkeit zu erhöhen.

Vorzugsweise wird das geneigte Reaktionsgefäss mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 100, insbesondere 25 bis 55, Umdrehungen/min. gedreht. Wenn die Rotationsgeschwindigkeit 100 Umdrehungen/min. übersteigt, fliesst die Probe nicht mehr der Wand des Reaktionsgefässes entlang nach unten, sondern dreht sich mit dem Reaktionsgefäss zusammen, wobei keine vollständige Berührung der Probe mit den Antikörper erzielt wird. Eine Drehgeschwindigkeit von weniger als 10 Umdrehungen/min. verursacht auf der anderen Seite eine beträchtliche Verminderung der durch Drehung des Gefässes verursachten Rührwirkung.

Das erfindungsgemässe Verfahren hat die nachfolgenden Vorteile:

(i) Das kontinuierliche Drehen des Reaktionsgefässes sichert ein ausreichendes Rühren des Reaktionsgemisches, verbesserte Leistungsfähigkeit der Reaktion und hohe Empfindlichkeit und verbesserte Genauigkeit der Bestimmung.

(ii) Um ein Bestimmungssystem mit hoher Empfindlichkeit zu erhalten, wurde bis jetzt ein grösseres Probenvolumen eingesetzt. Erfindungsgemäss können jedoch Proben, die nur Vi bis Vio des üblichen Probenvolumens entsprechen, wie in Tabelle 1 gezeigt wurde, eingesetzt werden. Dabei wird der gleiche Wirkungsgrad erzielt, wie wenn nach dem bekannten Verfahren eine Probe mit dem zweifachen oder zehnfachen des üblicherweise verwendeten Volumens eingesetzt wird.

(iii) Wenn nach dem bekannten Verfahren mit kleinen Probenvolumen gearbeitet wird, wird die Steigung der Eichkurve kleiner, wodurch die Genauigkeit der Messungen nach diesem Verfahren beeinträchtigt wird. Erfindungsgemäss kann jedoch die Berührungsfläche zwischen Probe und Innenfläche des Reaktionsgefässes auf die 1,5- bis 4-fache der bisherigen erhöht werden, sogar dann, wenn ein kleines Probenvolumen eingesetzt wird, wie in Tabelle 2 gezeigt wird. Da der Antikörper an eine vergrösserte Fläche gebunden werden kann, kann ein Bestimmungssystem mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit erhalten werden. Tabelle 3 zeigt die Resultate der Bestimmung von a-Fetoprotein (AFP) unter Verwendung des gleichen Reagenzes und des gleichen Probenvolumens. Die Versuche wurden 5mal bei jeder Konzentration nach dem erfindungsgemässen Verfahren und nach dem bekannten Verfahren wiederholt. Fig. 1 zeigt die Eichkurven, die auf den Resultaten der Tabelle 3 basieren. Es zeigt sich, dass die Eichkurve, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten wurde, eine grössere Steigung als diejenige nach dem bekannten Verfahren aufweist und dass das erfindungsgemässe Verfahren eine höhere Genauigkeit ermöglicht. Diese Bestimmungen von AFP wurden in einem Reaktionsgefäss mit einem Neigungswinkel von 10° und einer Drehgeschwindigkeit von 30 Umdrehungen/min. ausgeführt.

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Tabelle 3

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AFP-Konzentration 0 1 10 100

(ng/ml)

Bekanntes Verfahren

Optische (£± SE) 0.193 ±0.007 0.240 ± 0.007 0.346 ±0.009 0.639 ±0.019 Dichte

CV% 8.5 6.2 6.0 6.7

Erfindungsgem. Verfahren

Optische (X±SE) 0.025±0.001 0.154±0.002 0.412±0.105 0.970±0.006 Dichte

CV% 7.4 2.4 2.6 1.3

(iv) Die Reaktionszeit kann stark verkürzt werden. Bei- mende Antigen und das markierte Antigen mit dem spielsweise zeigt Tabelle 4 einen Vergleich zwischen den bei unlöslich gemachten Antikörper umgesetzt werden. Selbst-

den Bestimmungen zur Erzielung ähnlicher analytischer 20 verständlich kann das erfindungsgemässe Verfahren und die

Empfindlichkeit und Genauigkeit, d.h. Eichkurven mit ähn- erfindungsgemässe Vorrichtung auch für andere Umset-

lichen Steigungen, erforderliche Zeiten bei der Verwendung zungen eingesetzt werden.

des gleichen Reagenzes für die Bestimmung von AFP. Das Das erfindungsgemässe Verfahren kann mit irgendeiner Reaktionsgefäss hatte einen Neigungswinkel von 20° Vorrichtung, die das Reaktionsgefäss in der vorgeschrie-gegenüber der Horizontalen und es wurde mit einer 2s benen geneigten Stellung halten und mit der vorgeschrie-Geschwindigkeit von 50 Umdrehungen/min. gedreht. Die benen Geschwindigkeit drehen kann, verwendet werden. Es erhaltenen Eichkurven werden in Fig. 2 gezeigt. Die Verkür- kann jedoch vorteilhaft sein, die erfindungsgemässe Vorrich-zung der Messzeit war so gross, dass die Reaktionen, welche tung hierfür zu verwenden, mit der das Verfahren leicht und nach dem konventionellen Verfahren insgesamt 12 Stunden einfach durchgeführt werden kann. Die erfindungsgemässe erforderten, erfindungsgemäss in einer Stunde beendet 30 Vorrichtung zum Drehen eines Reaktionsgefässes in einer waren. Eine Verkürzung der Reaktionszeit nach dem geneigten Stellung weist eine oder mehrere seitliche Reihen bekannten stehenden Verfahren ergab eine Eichkurve mit von im gleichen Abstand voneinander angeordneten Halteeiner sehr kleinen Steigung, die in Fig. 2 unter C gezeigt wird dementen, die aus der Aussenfläche eines Gestells heraus-und konnte deshalb keine Messresultate liefern. ragen, Mittel zum gleichsinnigen Drehen der Halteelemente

35 mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit und Positionie-

Tabelle 4 rungsmittel für das Gestell, mit dem die Halteelemente gegenüber der Horizontalen nach oben geneigt werden

Bekanntes Verfahren Erfindungsgemässes können auf.

(aufrechtes, nicht Verfahren (geneigtes und Die Vorrichtung wird nachfolgend anhand der Zeichbewegtes Gefass) gedrehtes Gefass) .. . . , , , . . „ , . . . ...., 40 nungen im einzelnen beschrieben. Figur 5 zeigt eine Ausfuhrungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung. Im Erste Reaktion 60 Min. 20 Min. gleichen Abstand angeordnete längliche Halter 1 erstrecken Zweite Reaktion 60 Min. 20 Min. sich seitlich von einem Gestell 2 und tragen Reaktionsgefässe Enzym-Reaktion 10 Stunden 20 Min. a. Die Halter 1 werden von einem Motor 3 mittels eines 45 Kraftübertragungssystems, das in Fig. 6 dargestellt ist, gleichsinnig gedreht. Die Drehgeschwindigkeit der Halter kann Das erfindungsgemäss zu verwendende Reaktionsgefäss mittels eines Schalters 7 im Bereich von 10 bis 100 Umdre-kann beispielsweise ein Reagenzglas, eine optische Zelle oder hungen/min. eingestellt werden. Das Gestell 2 ist mit einer eine Probenküvette sein, an dessen oder deren Innenfläche Schraube 5 mit einem feststehenden Träger 4 verbunden, so eine reaktionsfähige Substanz für die Reaktion mit einer 50 dass die Halter 1, die sich vom Gestell 2 weg erstrecken, kleinen Probenmenge gebunden ist. Das Reaktionsgefäss ist gegen die Horizontale um einen Winkel von 0 bis 90° nach vorzugsweise zylindrisch oder prismatisch und wird aus Glas oben geneigt werden können. Die Halter 1 können mit oder Kunststoff mit einem Innendurchmesser von 5 bis Hüllen von gewünschtem Durchmesser versehen werden, 20 mm hergestellt. Das erfindungsgemässe Verfahren kann um die Entfernung zwischen benachbarten Haltern 1 derart beispielsweise in den folgenden Fällen eingesetzt werden : (i) 55 einzustellen, dass sie Reaktionsgefässe eines gewünschten für die Umsetzung eines an die Innenfläche*des Reaktionsge- Durchmessers tragen und drehen können.

fässes gebundenen Antikörpers mit einem Antigen in einer Fig. 6 zeigt die Vorrichtung gemäss Fig. 5 von ihrer den flüssigen Phase, beispielsweise auch für EIA mit der Haltern 1 entgegengesetzten Rückseite und ihr Kraftübertra-

Sandwich-Methode, (ii) für die Umsetzung eines markierten gungssystem. Die Drehung des Motors wird durch ein

Antikörpers mit dem Antikörper-Antigenkomplex, der 60 Reduktionsgetriebe 6 auf ein vorgeschriebenes Niveau redu-

durch die unter (i) beschriebene Reaktion gebildet wurde, ziert und durch ein Kegelrad 8 auf eines der Zahnräder 9, die wobei ein Komplex gebildet wird, das das unlöslich gemachte koaxial mit den Haltern angeordnet sind, übertragen. Die

Antikörper-Antigen, das bestimmt werden soll und den mar- Drehung des koaxialen Zahnrades 9 wird an die benach-

kierten Antikörper enthält oder (iii) für die Umsetzung eines barten koaxialen Zahnräder 9 durch Zwischenzahnräder 10,

Enzymsubstrates mit einem Komplex gemäss (ii) zur Durch- 65 welche die Drehrichtung bestimmen, übertragen, wobei die führung einer Enzymreaktion. Halter 1 gleichsinnig gedreht werden. Wenn ein grosser verti-

Bei der kompetitiven Methode kann das erfindungsge- kaler Abstand zwischen benachbarten Reihen von Haltern 1

mässe Verfahren eingesetzt werden, wenn das zu bestim- gewünscht wird, kann die Entfernung zwischen den Reihen

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der Zwischenzahnräder 10 an der Rückseite des Gestells ver-grössert und zwischen einem Zwischenzahnrad in einer ersten Reihe und einem Zwischenzahnrad in einer zweiten Reihe eine Kette angeordnet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch mit einer anderen Vorrichtung ausgeführt werden, die eine Fördereinrichtung, wie eine Förderkette, mit einer Förderfläche, an der frei drehbare Walzen befestigt sind, Mittel zum Antreiben der Fördereinrichtung in eine Richtung in einem vorbestimmten Geschwindigkeitsbereich, einem Riemen, der durch seine Bewegung die Reaktionsgefässe in eine bestimmte Richtung mit einer bestimmten Geschwindigkeit durch Berühren der an den Walzen angebrachten Reaktionsgefässe dreht und Halter zum Halten der Reaktionsgefässe in einer gegenüber der Horizontalen um einen vorbestimmten Winkel geneigten Stellung, wobei die Öffnungen der Reaktionsgefässe nach oben weisen, aufweist.

Diese Vorrichtung wird anhand der Zeichnungen im einzelnen beschrieben, Fig. 7 zeigt eine andere Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung und die Fig. 8 und 9 vergrösserte Teilansichten, aus denen ersichtlich ist, wie die Reaktionsgefässe in der Vorrichtung in der Fig. 7 angeordnet sind. An der Förderfläche einer Förderkette 101 sind frei drehbare Walzen 117 angeordnet. Die Reaktionsgefässe A sind auf die Walzen 117 abgestützt. Die Kette 101 wird mit einem Motor 106 über ein Reduktionsgetriebe 105,. Zahnräder 104, Wellen 103 und Kettenräder 102 angetrieben, um das Reaktionsgefäss fortlaufend in eine Richtung zu bewegen. Die Zeit, die eine Walze braucht, um in die benachbarte Stellung zu gelangen, kann mit einem Schalter 107 beliebig, vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 5 Minuten gewählt werden.

Die Reaktionsgefässe werden vom Riemen 109, der von Druckwalzen 108 gegen die Reaktionsgefässe gedrückt wird, gedreht. Der Riemen 109 wird von einem Motor 114 über ein Reduktionsgetriebe 113, Zahnräder 112, Kolben 111 und Riemenscheiben 110 angetrieben. Die Geschwindigkeit des Riemens 109 kann mit einem Schalter 115 von 10 bis 100 Umdrehungen/min. eingestellt werden. Die Vorrichtung ist beispielsweise an einem Träger 116 derart befestigt, dass die Achsen der Reaktionsgefässe um einen Winkel von 0 bis 90° gegen die Horizontale mit ihren Öffnungen nach oben geneigt sind.

Mit der Vorrichtung können die Reaktionsgefässe nacheinander automatisch unter kontinuierlichem Drehen und Rühren ihres Inhaltes gefördert werden. Entsprechend können beispielsweise eine Anzahl von Reaktionsgefässen, die je eine flüssige Probe enthalten, nacheinander auf die Förderkette, die sich in Ausgangsstellung befindet, angeordnet werden, wobei die Reaktion unter Drehen und automatischem Vorwärtsbewegen der Reaktionsgefässe beendet wird und die Resultate der Reaktion in einer vorbestimmten Stellung automatisch, beispielsweise mittels eines Spektrophotometers ermittelt werden. Deshalb ist die letztbeschriebene erfindungsgemässe Vorrichtung für die Automatisierung des Bestimmungssystems besonders gut geeignet. Das erfindungsgemässe Verfahren wird nachfolgend anhand von Beispielen veranschaulicht.

Beispiel 1 (Bestimmung von AFP)

(a) Herstellung der Reagenzgläser für die Reaktion

2 ml monoklonaler anti-AFP Antikörper [A] (1 mg/ml) wurden in je ein Polystyrol-Reagenzglas mit 12 mm Durchmesser und 100 mm Länge gegeben und während 20 Minuten bei 50 °C inkubiert. Dann wurde jedes Reagenzglas mit 0,05 M mit einem Phosphat auf den pH-Wert von 6,4 gepufferten Salzlösung (PBS) gewaschen, wodurch ein mit dem Antikörper [A] sensibilisiertes Reagenzglas erhalten wurde. Ein anderer monoklonaler Antikörper [B] aus einem vom Klon [A] verschiedenen Klon wurde nach der Methode Nakane et al.J. Histochem. Cytochem. 22, 1084 (1974) mit Meerrettich-peroxidase (Boehringer Mannheim Grade I), das nachfol-dend als HRPO bezeichnet wird, markiert. Der Antikörper wurde mit PBS 49:1 verdünnt und 1 ml des verdünnten Antikörpers wurde in jedes der mit dem Antikörper [A] versehenen Polystyrolreagenzgläser gegeben. Danach wurden die Reagenzgläser lyophilisiert und dicht verschlossen, d.h. sie ergaben Reagenzgläser für die Bestimmung von AFP.

(b) Bestimmung von AFP

In Reagenzgläser für die AFP-Bestimmung, die gemäss (a) erhalten wurden, wurden 0,9 ml PBS gegeben. In jedes Reagenzglas wurden 0,1 ml Standard-AFP-Lösung, die durch Verdünnen von AFP mit normalem Humanserum auf ein Gehalt von 1,10,100 oder 1000 ng AFP pro ml erhalten wurden, gegeben. Die Reagenzgläser wurden an den Haltern der Vorrichtung gemäss Fig. 5 in einer gegenüber der Horizontalen um 20° nach oben geneigten Stellung befestigt. Die Umsetzung wurde während 30 Minuten unter Drehen der Reagenzgläser mit einer Drehzahl von 50 Umdrehungen/ min. ausgeführt. Nach der Umsetzung wurden die Reagenzgläser mit physiologischer Salzlösung, enthaltend 0,005% Tween 20 (nachfolgend Waschmittel genannt) gewaschen. In jedes Reagenzglas wurden dann 2 ml einer Enzymsubstratlösung, enthaltend 50 mg/dl 5-Amino-salicylsäure und 0,01% Wasserstoffperoxid, gegeben. Die Reagenzgläser wurden erneut an den Haltern mit einer Neigung von 20° gegenüber der Horizontalen befestigt, und die Umsetzung wurde während 30 Minuten ausgeführt, währenddem die Reagenzgläser mit einer Drehzahl von 50 Umdrehungen/min. gedreht wurden.

Danach wurden 50 jj.1 2-%iges Natriumazid zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Die Extinktion des Reaktionsgemisches wurde bei einer Wellenlänge von 500 nm spektrophoto-metrisch gemessen. Die erhaltene Eichkurve wird in Fig. 3 gezeigt.

Beispiel 2 (Bestimmung von CEA)

(a) Herstellung von Reagenzgläsern für die Reaktion

In jedes Polyesterreagenzglas von 8 mm Durchmesser und 100 mm Länge wurden 2 ml eines monoklonalen anticarci-noembryonischen Antigens (CEA) Antikörpers [A'] (1 mg/ml) gegeben und während 20 Minuten bei 56 °C inkubiert. Dann wurden die Reagenzgläser mit PBS gewaschen. Die erhaltenen Reagenzgläser waren mit CEA Antikörper [A'] sensibilisiert.

Ein anderer monoklonaler Antikörper [B'] von einem von [A'] verschiedenen Klon wurde, wie in Beispiel 1 unter (a) beschrieben, mit HRPO markiert. Der Antikörper wurde auf das 50fache seines Volumens mit PBS verdünnt und jedes der mit dem CEA Antikörper [A'] versehenen Reagenzgläser wurde mit 1 ml des verdünnten Antikörpers versetzt. Danach wurden die Reagenzgläser lyophilisiert und dicht verschlossen. Die erhaltenen Reagenzgläser können für die CEA-Bestimmung eingesetzt werden.

(b) Bestimmung von CEA

In die gemäss (a) hergestellten Reagenzgläser wurden 0,9 ml PBS und 0,1 ml Standard-CEA-Lösung gegeben, die durch Verdünnen von CEA mit normalem Humanserum auf einen Gehalt von 1,3,10,30 oder 100 ng CEA/ml erhalten wurden. Die Reagenzgläser wurden auf der Förderkette der Vorrichtung gemäss Fig. 7 in einer gegenüber der Horizontalen um einen Winkel von 10° nach oben geneigten Stellung befestigt. Die Reaktion wurde während 20 Minuten unter

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Drehen der Reagenzgläser mit einer Drehzahl von 30 Umdrehungen/min. ausgeführt. Danach wurden die Reagenzgläser mit dem Waschmittel gewaschen und 2 ml einer Enzymsubstratlösung, enthaltend 100 mg/dl o-Phenylen-diamin und eine 0,3%ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid wurden zugegeben. Die Reagenzgläser wurden dann wiederum an der Förderkette mit einer Neigung von 10°

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gegenüber der Horizontalen befestigt. Die Reaktion wurde während 20 Minuten unter Drehen der Reagenzgläser mit 30 Umdrehungen/min. ausgeführt. Danach wurden 0,5 ml 4N-Salzsäure zur Beendigung der Reaktion zugegeben. Die s Extinktion des Reaktionsproduktes wurde bei einer Wellenlänge von 492 nm mit einem Spektrophotometer gemessen. Die erhaltene Eichkurve wird in Fig. 4 gezeigt.

B

4 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Umsetzung einer ersten reaktionsfähigen Substanz, die an die Innenwand eines Reaktionsge-fässes gebunden ist und einer zweiten reaktionsfähigen Substanz in einer flüssigen Phase, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Flüssigkeit, enthaltend die zweite reaktionsfähige Substanz, in das Reaktionsgefäss gibt und das Reaktionsge-fäss mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 100 Umdrehungen/min. um seine Achse dreht, die einen Winkel von 5 bis 45° mit der Horizontalen bildet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgefäss mit der Horizontalen einen Winkel zwischen 10 und-2Ó° bildet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Reaktionsgefäss mit einer Geschwindigkeit von 25 bis 55 Umdrehungen/min. dreht.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als erste reaktionsfähige Substanz ein Antigen oder einen Antikörper und als zweite reaktionsfähige Substanz einen entsprechenden Antikörper oder ein entsprechendes Antigen verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als erste reaktionsfähige Substanz einen Antikörper und als zweite reaktionsfähige Substanz eine Mischung eines entsprechenden Antigens und eines markierten Antigens verwendet, wobei letzteres durch Markieren des Antigens mit einem Markierungsmittel aus der Gruppe von radioaktiven Isotopen, Enzymen und fluoreszierenden Substanzen erhalten wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als erste reaktionsfähige Substanz einen Komplex eines unlöslich gemachten Antikörpers mit einem entsprechenden Antigen und als zweite reaktionsfähige Substanz einen der unlöslich gemachten reaktionsfähigen Substanz entsprechenden markierten Antikörper verwendet, wobei das Markierungsmittel aus der Gruppe von radioaktiven Isotopen, Enzymen und fluoreszierenden Substanzen ausgewählt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als erste reaktionsfähige Substanz einen Komplex eines unlöslich gemachten Antikörpers mit einem entsprechenden markierten Antigen und als zweite reaktionsfähige Substanz ein Enzymsubstrat verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als erste reaktionsfähige Substanz einen Komplex eines unlöslich gemachten Antikörpers, eines entsprechenden Antigens und eines mit einem Enzym markierten Antikörpers und als zweite reaktionsfähige Substanz ein Enzymsubstrat verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zylindrisches; Reaktionsgefäss mit einem kreisrunden Boden und einem Innendurchmesser von 5 bis 20 mm aus Glas oder Kunststoff verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zylindrisches Reaktionsgefäss mit einem polygonalen Boden und einem Innendurchmesser von 5 bis 20 mm aus Glas oder Kunststoff verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als erste reaktionsfähige Substanz ein Antigen oder einen Antikörper und als zweite reaktionsfähige Substanz einen entsprechenden Antikörper oder ein entsprechendes Antigen verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als erste reaktionsfähige Substanz einen Antikörper und als zweite reaktionsfähige Substanz eine Mischung eines entsprechenden Antigens und eines markierten Antigens verwendet, wobei letzteres durch Markieren des Antigens mit einem Markierungsmittel aus der Gruppe von radioaktiven Isotopen, Enzymen und fluoreszierenden Substanzen erhalten wird.
13. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als erste reaktionsfähige Substanz einen Komplex eines unlöslich gemachten Antikörpers mit einem entsprechenden Antigen und als zweite reaktionsfähige Substanz einen der unlöslich gemachten reaktionsfähigen Substanz entsprechenden markierten Antikörper verwendet, wobei das Markierungsmittel aus der Gruppe von radioaktiven Isotopen, Enzymen und fluoreszierenden Substanzen ausgewählt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als erste reaktionsfähige Substanz einen Komplex eines unlöslich gemachten Antikörpers mit einem entsprechenden markierten Antigen und als zweite reaktionsfähige Substanz ein Enzymsubstrat verwendet.
15. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als erste reaktionsfähige Substanz einen Komplex eines unlöslich gemachten Antikörpers, eines entsprechenden Antigens und eines mit einem Enzym markierten Antikörpers und als zweite reaktionsfähige Substanz ein Enzymsubstrat verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zylindrisches Reaktionsgefäss mit einem kreisrunden Boden und einem Innendurchmesser von 5 bis

20 mm aus Glas oder Kunststoff verwendet.
17. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zylindrisches Reaktionsgefäss mit einem polygonalen Boden und einem Innendurchmeser von 5 bis 20 mm aus Glas oder Kunststoff verwendet.
18. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 zum Drehen eines oder mehrerer Heaktionsge-fässe in einer geneigten Stellung, gekennzeichnet durch ein Gestell, von dessen einer Seite wenigstens eine Reihe im gleichen Abstand angeordnete Halter sich erstrecken, wobei Mittel zum gleichsinnigen Drehen der Halter mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit sowie Mittel, um das Gestell derart zu Positionieren, dass die Halter, um einen vorbestimmten Winkel gegen die Horizontale nach oben geneigt werden können, vorgesehen sind.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die vorbestimmte Geschwindigkeit 10 bis 100 Umdrehungen/min. und der vorbestimmte Winkel 5 bis 45° beträgt.
20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die vorbestimmte Geschwindigkeit 25 bis 55 Umdrehungen/min. beträgt.
21. Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass der vorbestimmte Winkel 10 bis 20° beträgt.
22. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 zum Drehen von mindestens einem Reaktionsgefäss in geneigter Stellung, gekennzeichnet durch eine Fördereinrichtung mit einer Förderfläche, auf welcher freidrehbare Walzen befestigt sind, Mittel zum Antreiben der Fördereinrichtung in einer Richtung in einem vorbestimmten Geschwindigkeitsbereich, einem mit dem an den Walzen angebrachten Reaktionsgefäss in Berührung stehenden Riemen, der durch seine Bewegung das Reaktionsgefäss in einer vorbestimmten Richtung und mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit dreht und Mittel zum Festhalten des Reak-tionsgefässes in einer nach oben geneigten Stellung, die mit der Horizontalen einen vorbestimmten Winkel bildet.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die vorbestimmte Geschwindigkeit 10 bis 100 Umdrehungen/min. und der vorbestimmte Winkel 5 bis 45° beträgt.
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekenn2

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zeichnet, dass die vorbestimmte Geschwindigkeit 25 bis 55 Umdrehungen/min. beträgt.
25. Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass der vorbestimmte Winkel 10 bis 20° beträgt.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Fördermittel eine Förderkette ist.