CH663094A5 - Verfahren zur bestimmung des glukosegehaltes von nicht-enzymatisch glukosylierten proteinen und ein kit zur durchfuehrung des verfahrens. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spektrophotome-trischen Bestimmung von nicht-enzymatisch glukosylierten Proteinen und ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.
Proteine können an ihren reaktiven Gruppen (insbesondere an den N-Terminalen Aminogruppen und den e-Amino-gruppen der Lysin-Seitenkette) aspezifisch in Abhängigkeit vom Glukosegehalt des umgebenden Mediums mehr oder weniger Glukose binden. Dieser, sich in vivo und in vitro abspielender Vorgang ist deshalb von grosser Wichtigkeit, weil bestimmte Eigenschaften der glukosylierten Proteine (z.B. die funktionelle Aktivität, immunologische charakteristische Merkmale und die Stabilität) ändern können. Die Wichtigkeit des in vivo Vorganges ist vor allem der im Diabetes mellitus entstandenen, erhöhten, nicht-enzymatischen Glukosylierung zuzuschreiben, welche in der Bildung der späteren Komplikationen dieser Krankheit eine wesentliche Rolle spielt. Die Verfolgung des in vitro Vorganges ist für die Lagerung und Wiederanwendung von verschiedenen Proteinen, insbesondere von Flüssigkeiten biologischen Ursprungs (z.B. Blut, Milch usw.) wichtig.
Bei der Behandlung von an Diabetes mellitus leidenden Patienten und bei der Verhütung der chronischen Komplikationen ist die Kontrolle des Einstellungsgrades des Blutzuckerspiegels von grundlegender Wichtigkeit. Die aktuelle
Blutzuckerspiegelmessung wird nämlich durch den tägigen Kohlenhydratverbrauch stark beeinflusst, so dass diese Messung über den Kohlenhydratstoffwechsel des Organismus keine zuverlässige Informationen gibt. Auch über die Lage s der dem Versuch vorangehenden Periode werden keine Angaben geliefert. Als geeignete Kontrollmethode wird seit einigen Jahren die Bestimmung der Menge des an einer bestimmten Stelle (N-Terminal der ß-Kette) glukosylierten Hämoglobins (Hämoglobin Aie; weiterhin HbAicgenannt), io d.h. der Menge der schnellen Hämoglobinkomponenten angenommen.
Das HbAic und die anderen glukosylierten Hämoglobine werden im Laufe der postsynthetischen Glukosylierung gebildet; ihre Menge ist zu dem Glukosegehalt des Blutes i5 proportional. Diese glukosylierten Hämoglobine werden während der Lebensdauer der Erythrozyten ständig gebildet, so dass ihre Menge den durchschnittlichen Wert des etwa dreimonatigen Kohlenhydratstoffwechsels widerspiegelt. Die letztere Angabe stellt den wichtigsten diagnostischen 20 Wert der Bestimmung dar.
Die obigen Verfahren ruhen vor allem auf der Bestimmung der glukosylierten Hämoglobinkomponenten, und zwar der HbAic Komponente und sind zur Bestimmung von anderen glukosylierten Proteinen ungeeignet (L.A. Trivelli, 25 H.M. Ranny, H.T. Lai: New England Jour. ofMed. 1971.
Band 2S4, Seite 353). Die Mehrheit dieser Methoden fusst auf der chromatographischen Trennung des glukosylierten Hämoglobins; es wird deshalb nicht die Gesamtmenge der an Hämoglobin gebundenen Glukose, sondern der auf das nur 30 an der N-terminalen Aminogruppe der-Seitenkette glukosy-lierte Hämoglobin (HbAic) kalibrierte Wert angegeben. Die im Handelsverkehr befindlichen Reagenskite sind nur zum obigen speziellen Zweck - d.h. zur Bestimmung von HbAic -geeignet und sind gegenüber bestimmten Umgebungsfak-35 toren (z.B. Temperatur der Laboratorien) sehr empfindlich. Die von Flückiger und Winterhalter ausgearbeitete kolori-metrische Methode [FEBS Letters 71,356(1976)) ist im Vergleich zur chromatographischen Methode einfach und zur Serienmessungen geeignet. Das Wesen dieser Methode •fo besteht darin, dass die an den Aminogruppen der Proteine durch eine Kondensationsreaktion gebundene und einer Amadori-Umlagerung untergegangene Glukose unter Einwirkung einer sauren Wärmebehandlung in Form von 5-Hydroxymethylfurfurol abgespaltet wird; dieses Aldehyd 45 wird mit Thiobarbitursäure bestimmt. Die Methode ist in dieser Form nur zur Bestimmung von zu wasserlöslichen Proteinen gebundener Glukose geeignet. Nach dem ursprünglichen Verfahren wurde die Bestimmung auf das Ergebnis der chromatographischen Methode kalibriert und so die Methode wurde deshalb ausschliesslich auf die Bestimmung von HbAic abgezielt. Es wurde entgegen den obigen Feststellungen erfindungsgemäss gefunden, dass diese Methode auch auf in Zellen geschlossene oder wasserunlösliche Proteine erweitert werden kann, falls man diese Pro-55 teine vorherig mit einem verdünnten ionischen oder nichtionischen Detergent in Lösung bringt. Die obige Erkenntnis ermöglicht die Bestimmung des Glukosegehaltes von anderen glukosylierten Proteinen ausser dem Hämoglobin.
Andererseits wird die Auswertung des erfindungsge-60 mässen Verfahrens nicht auf die chromatographische HbAic Methode rückbezogen, sondern es wird ausschliesslich der Extinktionskoeffizient des Glukosederivates und das Verhältnis zwischen der Entstehung und Zersetzung unabhängig vom Protein berücksichtigt. Die Methode wird dadurch auf «s alle Proteine erweitert und ist zur Bestimmung der Gesamtmenge der an Proteinen gebundenen Glukose geeignet.
Ein weiteres neues Merkmal des erfindungsgemässen Verfahrens liegt darin, dass eine höhere Säurekonzentration als
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der entsprechende, bei den bekannten Methoden übliche Wert von 0,6 M kombiniert mit einer unter Überdruck durchgeführten Wärmebehandlung verwendet wird. Die saure Hydrolyse kann mit Hilfe einer einzigen Säure oder mit einem Gemisch von organischen oder anorganischen s Säuren vollzogen werden. Man kann gegebenenfalls in Gegenwart eines Katalysators arbeiten. Als Säure kann vorteilhaft Oxalsäure und als Säuregemisch eine Mischung von Oxalsäure und Essigsäure oder Oxalsäure und Schwefelsäure Verwendung finden. Als Katalysator kann z.B. HgCL2 einge- io setzt werden. Diese Ausführungsform des Verfahrens kürzt einerseits die Zeitdauer der Bestimmung ab und führt andererseits zu in sämtlichen Fällen gut reproduzierbaren Ergebnissen.
Es wurde erfindungsgemäss weiterhin gefunden, dass die is bei der Deproteinierung bisher ausschliesslich verwendete Trichloressigsäure durch Sulfosalicylsäure erfolgreich ersetzt werden kann. Dieses Reagens ist viel einfacher behandelbar und bietet deshalb technologische Vorteile.
Es wurde weiterhin gefunden, dass die bei den koloreme- 20 trischen Bestimmungen bisher ausschliesslich verwendete Thiobarbitursäure durch sämtliche aromatische Verbindungen ersetzt werden kann, welche mit der Aldehydgruppe des bei der sauren Zersetzung gebildeten 5-Hydroxymethyl-furfurols kondensieren und dabei unter Bildung eines ausge- 25 dehnten Doppelbindungssystems (delokalisierte 7t-Elek-trone) ein farbiges Produkt bilden. Die Barbitursäure hat sich besonders vorteilhaft erwiesen. Es wurde weiterhin gefunden, dass im Fall der mit Thiobarbitursäure durchgeführten Entwicklung die Genauigkeit der Messung erhöht 30 werden kann, falls man die Auswertung bei 360 nm durchführt.
Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren, welches zur Serienmessung des gesamten gebundenen Glukosegehaltes von irgendwelchen nicht-enzymatisch glukosylierten 35 Proteinen geeignet ist. Das Wesen des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass man die in Zellen geschlossenen oder wasserunlöslichen Proteine mit Hilfe eines ionischen oder nichtionischen Detergens in Lösung bringt, die Glukose aus den gelösten Proteinen durch unter Überdruck 40 durchgeführte saure Hydrolyse in Form von 5-Hydroxy-methyl-furfurol abspaltet, nach Deproteinierung das Aldehyd durch Kondensation mit einer geeigneten organischen Verbindung in ein farbiges Produkt überführt und dessen Konzentration spektrophotometrisch bestimmt. 45
Gegenstand ist weiterhin ein Kit, mit welchem die Serienmessung stets mit derselben Genauigkeit durchgeführt werden kann.
Die Zusammensetzung des Kits kann variiert werden, weil derselbe chemische Vorgang mit verschiedenen Reagenzien durchgeführt werden kann.
Bei unseren Versuchen wurde zuerst der Wirkungsgrad der Reaktion geprüft; die Behandelbarkeit der verwendeten Reagenzien und die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens wurden jedoch ebenfalls berücksichtigt. Es wurde weiterhin gefunden, dass das vorteilhafteste Kit zu einer Bestimmung als Detergent 2 ml eines 0,l%igen Natriumdodecylsulfats. als Hydrolysierungsmittel 1 ml 1 N Oxalsäure, als Deproteinie-rungsmittel 1 ml 20%iger Sulfosalicylsäure und als das farbige Produkt bildende Verbindung 0,5 ml 0,05 molarer Barbitursäure enthält.
Die vorteilhafte Zusammensetzung des Reagenzienkits für 50 Messungen ist also wie folgt:
100 ml 0,l%iges Natriumdodecylsulfat 50 ml 1 N Oxalsäure 50 ml 20%ige Sulfoalicylsäure 25 ml 0,05 molare Barbitursäure.
Im Reagenskit kann die hämolysierende Lösung anstatt Natriumdodecylsulfat auch ein anderes Detergens (z.B. Triton X 100) enthalten. Die Oxalsäure kann durch 2 N Essigsäure, Schwefelsäure oder eine andere starke Säure ersetzt werden. Zur Entfernung der Proteine kann auch Trichloressigsäure dienen. In der Farbreaktion kann anstatt der Barbitursäure auch Thiobarbitursäure oder eine andere, mit Hydroxymethylfurfurol ein farbiges Produkt bildende Verbindung verwendet werden.
Im Reagenskit optimaler Zusammensetzung beträgt das Verhältnis der zur Bestimmung der an Protein verknüpfte Glukose notwendigen Reagenzien wie folgt (auf 1 g Protein bezogen):
Natriumdodecylsulfat: Oxalsäure, Sulfosalicylsäure: Barbitursäure = 0,02:0,9:2,00:0,04.
Weitere Einzelheiten der vorliegenden Erfindung sind den nachstehenden Beispielen zu entnehmen, ohne den Schutz-umfang auf diese Beispiele einzuschränken.
Beispiel 1
Bestimmung des Glukosegehaltes von nichtenzymatisch glukosyliertem Hämoglobin a) 3 ml hepariniertes Blut werden mit 10 ml physiologischer Salzlösung gewaschen, wonach zu 1 ml gewaschenen Erythrozyten 2 ml einer 0,l%igen Natriumdodecylsuiüdö-sung zugegeben werden. Die Hämoglobinkonzentration des entstandenen Hämolysats wird bestimmt; zu 2 ml davon w ird 1 ml einer 1 N Oxalsäurelösung zugegeben und die Mischung wird bei 112-115°C und unter einem Druck von 1,62- 10-Pa 2,5 Stunden lang einer Wärmebehandlung unterworfen. Dem Hydrolysat wird 1 ml einer 20%igenSulfosalicylsäurelö-sung unter starkem Schütteln tropfenweise zugegeben (Temperatur 40°C). Die entstandene Suspension wird zentrifugiert und die Lichtabsorption dersupernatanten Flüssigkeit bei 398 nm abgelesen (Ei-Wert). Zu 2 ml dieser Flüssigkeit wird 0,5 ml einer 0,05 molaren Barbitursäurelösung zugegeben und das Gemisch wird bei 40 C° 40 Minuten lang inkubiert. Die Mischung wird abgekühlt und die Lichtabsorption binnen 10 Minuten bei 398 nm gegen eine ohne Hämolysat hergestellte Blindprobe abgelesen (E:-Wert).
Der Glukosegehalt (G) wird gemäss der folgenden Formel ausgerechnet:
so
55
G . 2,40 E2f398) - °'8 EI(398) - °'2° x 10-2 „0l
(F) Glukose/100 ml
Hämoglobin
(F) = Hämoglobinkonzentration (Mole/1). Falls man die Hämoglobinkonzentration mit der Methode
Die Konstante enthält den molaren Extinktionskoeffi- 6s von Drabkin bestimmt, zu 5 ml Reagens 0,02 ml Hämolysat zienten der Thiobarbitursäure, den Korrektionsfaktor des bei zufügt und die Lichtabsorption bei 540 nm misst (E540), ist die der sauren Zersetzung stattgefundenen 5-Hydroxymethyl- Formel wie folgt;
furfural-Verlustes und die Verdünnung.
663094
4
E
G = 4,53
2(398)
- 0,8 E
1(398)
- 0,20
Mol Glukose/100 ml Hämoglobin
Im Falle von Hämoglobin beträgt der normale Wert 7,5-12,0 Mole Glukose/100 Mole Hemoglobin.
b) Man verfährt wie im Beispiel a) mit dem Unterschied,
dass man zur Bestimmung der Glukose 0,05 molare Thiobarbitursäure verwendet und die Reaktion bei 443 nm verfolgt.
Zur Auswertung werden die folgenden Formeln verwendet:
G = 1,5
E2(445) " 0,8 El(443) ~ x 10"2
(F)
Mol '
Glukose/100 ml Hämoglobin
E
G = 2,83
2(443)
- 0,8 E
1(443)
- 0,14
(E540)
Mol Glukose/100 ml Hämoglobin c) Man verfährt wie im Beispiel a), mit dem Unterschied, von 360 nm verfolgt. In diesem Falle werden die folgenden dass man die Reaktion bei dem mehr empfindlichen Wert Formeln verwendet :
E
G = 1,05
2(360) " 0,8 El(360) ~ °'14 (F)
x 10~2 Mol
Glukose/100 Mole Hämoglobin bzw.
G = 1,98 2(^6°) ìl5§0) — Mol Glukose/ICO Mole
<X,Ln)
J540^
Hämoglobin
Mit Rücksicht darauf, dass nach dieser Methode die an Hämoglobin gebundene Gesamtglukosemenge bestimmt wird, ist das erhaltene Ergebnis höher als der chromatographisch bestimmte oder darauf rückbezogene, international anerkannt verwendete HbAic Wert. Der Umrechnungsfaktor zwischen den beiden Methoden beträgt G/HbAic = 1,8.
Beispiel 2
Bestimmung von nicht-enzymatisch glukosylierten Proteinen des Erythrozytenmembrans a) 10 ml heparinisiertes Blut werden dreimal mit je 50 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen, wonach der Niederschlag mit einem achtfachen Volumen einer eiskalten Hämolyiserungslösung geschüttelt und 5 Minuten lang stehengelassen wird. Die Suspension wird zentrifugiert, die supernatante Flüssigkeit dekantiert und die zurückgebliebene Membranfraktion viermal gewaschen. Die Hämolysie-rungs- und Waschlösungen werden auf die in J. Physiol. 235,
551 (1973) beschriebene Weise hergestellt. Der Proteingehalt des so erhaltenen hämoglobinfreien Membrans wird bestimmt und die Konzentration der Membransuspension auf einen, 2,5 mg/ml Protein entsprechenden Wert eingestellt. Danach werden zu 2,5 ml Membranfraktion 2 ml 0,l%iges Natriumdodecylsulfat und 1 ml 1 N Oxalsäure zugegeben und das Gemisch wird bei 112-115°C unter Druck 2,5 Stunden lang einer Wärmebehandlung unterworfen. Dem Hydrolysat wird 1 ml einer 20%igenSulfosalicylsäurelösung zugegeben (Temperatur 40°C). Die entstandene Suspension wird zentrifugiert, die Lichtabsorption der supernatanten Flüssigkeit bei 398 nm abgelesen (Ei-Wert). Zu 2 ml davon werden 0,5 ml einer 0,05 molaren Barbitursäurelösung zugegeben und die Mischung wird bei 40°C 40 Minuten lang inkubiert. Das Gemisch wird abgekühlt und die Lichtabsorption bei 398 nm gegen eine ohne Membranfraktion hergestellte Blindprobe innerhalb von 10 Minuten abgelesen (E:-Wert). Der Glukosegehalt (G) wird mit Hilfe der folgenden Formel ausgerechnet:
E
G = 2,40
2(398)
- 0,8 E
1(398)
- 0,20
(F)
x IO"2 Mol
Glukose/100 mg Protein
(F) ist die Konzentration des Membranproteins (in mg/ ml). Die Konstante enthält den molaren Extinktionskoeffizient des Barbitursäurederivates, den Korrektionsfaktor des bei der sauren Zersetzung stattgefundenen 5-Hydroxymethyl furfurol-Verlustes und auch die Verdünnung.
b) Die Vorbereitung des Proteins und die Glukosebestimmung wird auf die im Paragraph a) beschriebene Weise durchgeführt, mit dem Unterschied, dass zur Bestimmung des Zuckerderivates 0,5 ml einer 0,05 molaren Thiobarbitur-säurelösung verwendet wird. Die Reaktion wird bei 360 bzw. 443 m verfolgt.
5 663 094
Zur Auswertung der Messung werden in Abhängigkeit von der Wellenlänge die folgenden Formeln verwendet:
G = 1,05 2^60^ ——L£l§0) — x 10~2 Mol Glukcs/LOO ng
(F) Protein bzw.
E,
G = 1,50 — x IO'* Mol Glukose/100 ng
(F) Protein b2(443) ~ °'5 Ei(Z{.Zj.3) " °)^ __ ^_2
Beispiel 3
Bestimmung der Glukosylierung von Plasmaproteinen
Das Plasma wird aus dem Blut getrennt. Der Proteingehalt von Blutplasma wird bestimmt und die Proteinkonzentration auf 10 mg/ml eingestellt. Zu 2 ml wird 1 ml 1 N Oxalsäurelösung zugegeben und die Mischung bei 112-115°C unter Druck 2,5 Stunden lang einer Wärmebehandlung unterworfen. Dem Hydrolysat wird 1 ml einer 0,6 molaren wäss-rigen Trichloressigsäurelösung tropfenweise zugegeben, die entstandene Suspension wird zentrifugiert und die Lichtabsorption dersupernatanten Flüssigkeit bei 398 nm abgelesen (Ei-Wert). Zu 2 ml davon wird 0,5 ml einer 0,05 molaren Bar-bitursäurelösung zugegeben und das Gemisch bei 40°C 40 Minuten lang inkubiert. Das Gemisch wird abgekühlt und die Lichtabsorption binnen 10 Minuten bei 398 gegen eine ohne Plasmaprotein hergestellte Blindprobe abgelesen (E;-Wert).
Der G lukosegehalt (G) wird auf die im Beispiel 1 a) beschriebene Weise ausgerechnet.
Auch bei der Messung von Plasmaproteinen kann zur Bestimmung des abgespalteten Glukosederivates die Thio-barbitursäurereaktion Verwendung finden. In diesem Falle werden zu 2 ml der supernatanten Flüssigkeit 0,5 ml einer 0,05 molaren Thiobarbitursäurelösung zugegeben. Zur Auswertung werden die Extinktionswerte bei 443 nm abgelesen und die obigen Formeln verwendet.
Beispiel 4
Bestimmung des Glukosegehaltes von nichtenzymatisch glukosyliertem Albumin
Das Plasma wird aus Blut durch Zentrifugieren getrennt. Der pH-Wert des Plasmas wird mit einer 2 molaren Salzsäurelösung auf 6,9 eingestellt. Der Mischung werden unter Rühren 15% Polyäthylenglykol in Form einer 50%igen wäss-20 rigen Lösung tropfenweise zugegeben. Die erhaltene Suspension wird 20 Minuten lang gerührt, zentrifugiert und der pH-Wert der supernatanten Lösung wird auf 4,6 eingestellt. Nach Zugabe von 9% festem Polyäthylenglykol innerhalb einer Stunde wird das Gemisch weitere 30 M inuten lang 25 gerührt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und in einem Tropfen destillierten Wassers gelöst. Die Lösung wird auf eine, mit Acetatpuffer (pH 5,2) in Aequili-brum gebrachte QAE-Sephadex-Säule (20 x 1,6 cm) aufgebracht. Das Polyäthylenglykol wird durch Waschen entfernt 30 und das Albumin mit einem Acetatpuffer (pH 4,8) eluiert. Der Glukosegehalt der Albuminlösung wird bestimmt und zu 2 ml davon wird 1 ml einer 1 N Oxalsäurelösung gegeben. Das Gemisch wird bei 112-115°C unter Druck 2,5 Stunden lang einer Wärmebehandlung unterworfen. Dem Hydrolysat 35 wird 1 ml einer 20%igen Sulfosalicylsäurelösung (Temperatur 40°C) zugefügt, die erhaltene Suspension wird zentrifugiert und die Lichtabsorption dersupernatanten Flüssigkeit bei 398 nm abgelesen (Ei-Wert). Zu 2 ml davon wird 0,5 ml einer 0,05 molaren Barbitursäurelösung zugegeben und die 40 Mischung wird bei 40°C 40 Minuten lang inkubiert. Das Gemisch wird gekühlt und die Lichtabsorption bei 398 nm innerhalb von 10 Minuten gegen eine ohne Albumin hergestellte Blindprobe abgelesen (E:-Wert).
Der Glukosegehalt (G) wird gemäss der folgenden Formel « ausgerechnet:
E,
G = 2,40 =2098) - °'8 El(?98) - x 10-2
/n Glukose/100 mg
Albumin
(A) = Albuminkonzentration in mg/ml.
Die Konstante enthält den molaren Extinktionskoeffizienten des Barbitursäurederivates, den Korrektionsfaktor des bei der sauren Zersetzung stattgefundenen 5-Hydroxy-methyl-furfurol-Verlustes und auch die Verdünnung.
Beispiel 5
Bestimmung der Glukosylierung von Immunoglobulinen Aus gerinnungsgehemmten Blut wird das Plasma abgetrennt. Die Immunoglobuline werden nach Ausfällung mit Rivanol durch Chromatographie an QAE-Sephadex gereinigt.
Zu 2 ml einer 5%igen Immunoglobulinlösung wird 1 ml einer Säuremischung zugegeben (1 N Oxalsäure + 1 N Essigsäure, oder 1 N Oxalsäure + 1 N Schwefelsäure). Die Hydrolyse wird bei 100°C eine Stunde lang durchgeführt und das Protein durch Zugabe von 1 ml 0,6 molarer Sulfosalicylsäure ausgefällt. Der entstandene Niederschlag wird bei 1500 Umdrehungen per Minute zentrifugiert und zu 2 ml der supernatanten Flüssigkeit wird 0,5 ml einer 0,054 molaren Rezorcin, 2 x 10-3 molaren CuSOj Lösung zugegeben. [Vor Zugabe der Reagenzien wird die Lichtabsorption der supernatanten Flüssigkeit bei 405 nm bestimmt (Ei-Wert)]. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten lang bei 100°C erhitzt. Nach Abkühlen wird die Lichtabsorption bei 405 nm wieder abgelesen (E:-Wert).
Glukosegehalt (G) = 37,6 (E2-E1-0,1 ) Mol/100 Mole
60
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Beispiel 6
Bestimmung der Glukosylierung von Hämoglobin Zu 1 ml von mit einer physiologischen Salzlösung gewaschenen Erythrozyten werden 2 ml einer 0, l%igen Natrium-dodecylsulfatlösung zugegeben. Die Konzentration des Hämolysats wird bestimmt (Hb). Zu 2 ml davon wird 1 ml einer 1 N Oxalsäure -10"4 molaren HgCk Lösung zugefügt und die Mischung wird eine Stunde lang bei 100°C erhitzt.
Das Protein wird mit 1 ml einer 20%igen Sulfosalicylsäureiö-sung ausgefällt und durch Zentrifugieren entfernt. Die Lichtabsorption der supernatanten Flüssigkeit wird bei 442 nm bestimmt (Ei). Zu 2 ml davon wird 0,5 ml einer 0,05 molaren Thiobarbitursäurelösung zugegeben. Die Mischung wird bei 40°C 40 Minuten lang inkubiert und die Lichtabsorption erneut bestimmt (E2-Wert).
Ep-E, x 0,8-0,1 p
G = —— x 10"^ Mol /100 Mole
Hb (Mole/1)
Beispiel 7
Schnellverfahren zur Bestimmung des Glukosegehaltes von nicht-enzymatisch glikosyliertem Hämoglobin bei niedriger T emperatur
Mit Heparin gerinnungsgehemmtes Blut wird mit einer physiologischen Salzlösung so lange gewaschen bis die super-natante Flüssigkeit proteinfrei wird. 1 ml von gewaschenen Erythrozyten werden mit 2 ml einer 0, l%igen Natriumdode-cylsulfatlösung zweimal gefroren und auftauen gelassen. Die Konzentration der entstandenen Hämoglobinlösung wird bestimmt, zu 2 ml dieser Lösung werden 1 ml 0,3 N Schwefelsäure und 0,1 ml 10"4 M HgCh Lösung zugefügt und das Gemisch wird 30 Minuten lang bei 40°C stehengelassen. Der
15
Proteingehalt der Lösung wird mit 1 ml 0,6 molarer Sulfosalicylsäure ausgefällt, und der gebildete Niederschlag durch 10-minutiges Zentrifugieren bei 1500 Umdrehungen per Minute entfernt. Die Lichtabsorption der klaren superna-20 tanten Flüssigkeit wird bei 443 nm bestimmt (Ei-Wert). Zu 2 ml der Lösung wird 0,5 ml einer 0,05 molaren Thiobarbitursäurelösung zugegeben. Die Lösung wird 40 Minuten lang bei 40°C stehengelassen. Nach Abkühlung wird die Lichtabsorption innerhalb von 10 Minuten bei 443 nm erneut 25 bestimmt (Ez-Wert).
Der Glukosegehalt (G) wird gemäss der folgenden Formel ausgerechnet:
Ep - E,x0,8 - 0,06 p
G = 1,38 — 10'^ Mol Glukose/100 Mole Hb
Hb (Mole/1)
B
Claims (9)
1. Verfahren zur Bestimmung des Glukosegehaltes von nicht-enzymatisch glukosylierten Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass man die in Zellen geschlossenen oder wasserlöslichen Proteine mit einem ionischen oder nichtionischen Detergens in Lösung bringt, die Glukose unter Druck und unter Anwendung einer mindestens 1 N Säure in Form von 5-Hydroxylmethvl-furfurol abspaltet, das Reaktionsgemisch deproteinisiert. danach das 5-Hydroxymethyl-furfurol mit einer organischen Verbindung, welche mit dem Aldehyd ein farbiges Produkt bildet, kondensiert und schliesslich die Konzentration des erhaltenen Produktes spektrophotometrisch bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Detergens Natriumdodecylsulfat verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die saure Hydrolyse unter einem Druck von 1,22 • 105-2,03 • 10S Pa - vorteilhaft 1,52 -105-1,72 • 105 Pa - mit einer Oxalsäurelösung durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die saure Hydrolyse in Gegenwart eines Katalysators durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die saure Hydrolyse mit einer Säuremischung durchführt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Deproteinisierung mitSulfosa-licylsäure durchführt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -4, dadurch gekennzeichnet, dass man als mit dem Aldehyd ein farbiges Produkt bildende organische Verbindung Barbitursäure verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die spektrophotometrische Bestimmung bei 398 nm durchführt.
9. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Natriumdodecylsulfat, Oxalsäure, Sulfosalicylsäure und Barbitursäure 0,02:0,90:2,0:0,04 beträgt, auf 1 Einheit des zu bestimmenden Proteins bezogen.
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| PL | Patent ceased |