CH667874A5

CH667874A5 - Polypeptide synthetique biodegradable et son utilisation pour la preparation de medicaments.

Info

Publication number: CH667874A5
Application number: CH5436/85A
Authority: CH
Inventors: Daniel Bichon; Bernard Lamy; William Borloz
Original assignee: Battelle Memorial Institute
Priority date: 1985-12-19
Filing date: 1985-12-19
Publication date: 1988-11-15
Also published as: US4892733A; EP0250492A1; JPS63502037A; WO1987003891A1

Description

DESCRIPTION La présente invention a pour objet un polypeptide biodégradable hydrosoluble non toxique utilisable en biologie et pour diverses applications thérapeutiques, notamment pour servir de support à des médicaments, ceux-ci étant, ensuite, libérés progressivement dans l'organisme au fur et à mesure de la dégradation biochimique du polymère.

Depuis plusieurs années, on connaît des polymères biodégradables non-toxiques pouvant servir de réservoir de médicaments et permettant la libération progressive contrôlée de ceux-ci dans l'organisme lors de la dégradation du polymère porteur. On trouve des informations générales sur de tels produits dans l'ouvrage: «Fundamental Aspects of Bio-

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compatibility» par D.F. WILLIAMS, CRC Press (1981). Voir aussi brevet US-P 4 093 709.

Parmi ces polymères, on cite plus particulièrement les Polypeptides synthétiques (polyaminoacides) dont la structure est voisine de celle des protéines. Ces polypeptides sont biocompatibles et leurs produits de dégradation (acides aminés) sont résorbables par l'organisme. Ainsi SIDMAN ET AL (J. Membr. SCI (1980), 7 (3), 277-91) ont divulgué un copoly-mère d'acide glutamique et de y-glutamate d'éthyle dont la vitesse de dégradation est fonction de la composition du co-polymère (proportions molaires des segments estérifiés par rapport aux segments non estérifiés) et qui permet d'emmagasiner de nombreux produits, par exemple médicaments anti-malaria, anticancer et autres. De tels polymères peuvent être utilisés sous forme de baguettes contenant, en mélange, le médicament désiré ou sous forme de capsules renfermant le médicament si celui-ci n'est pas miscible avec le polymère. Cependant, les polyglutamates et polyaspartates d'alcoyle (esters simples de ces polyacides) ne sont dégradables en temps utile (d'un ordre de grandeur compatible avec leur utilisation pharmaceutique) que sous forme partiellement hydrolysée (voir par exemple ASANO et al, J. Macromol. Sci. Chem. A21 (5) (1984), 561-582). Pour obtenir de tels polymères partiellement estériffiés, il faut soumettre ces polyglutamates ou polyaspartates à une réaction d'hydrolyse ménagée dont les conditions sont très difficilement reproductibles. Par ailleurs, de très faibles différences dans le degré d'hydrolyse influent considérablement sur la vitesse de bio-dégradabilité ultérieure ce qui constitue un problème additionnel dans l'emploi de tels polymères pour les buts précités.

Aussi, malgré l'intérêt que présentent les produits ci-dessus, on a continué à chercher un produit de qualités améliorées et présentant notamment les propriétés suivantes:

1. Excellente solubilité dans la plupart des solvants inoffensifs courants convenant aux médicaments et même dans l'eau (en effet, les dérivés connus de polyaminoacides ne sont, en général, solubles que dans certains solvants spéciaux (DMF, pyridine, F3CCOOH) dont l'emploi est incommode pour les préparations pharmaceutiques) thermoplastiques.

2. Contrôle amélioré du processus de dégradation. En effet, la vitesse de dégradation des polypeptides synthétiques connus est liée de façon stricte à leur structure chimique et notamment au taux d'estérification. Ainsi, dans un cas donné (voir, SIDMAN K.R., et al., PB 81-132136 NTIS (1980), p. 42) une variation du taux d'estérification de l'ordre de 10% fait passer la vitesse de dégradation de 1 au centuple (voir également la référence: SIDMAN citée plus haut), ce qui pose des problèmes pour la préparation d'échantillons reproductibles.

Le polymère de l'invention (et ses copolymères avec d'autres acides aminés) a permis de réaliser ces objectifs et d'autres encore, non moins importants, comme on le verra par la suite. Il s'agit d'un polypeptide estérifié de formule:

-(nh-ch-co)x-

cooh

(ch_) -co(-nh-chr-co) -nhch(ch.,) -cooh ù n m 2 p tiellement estérifié par un alcoyle inférieur ou totalement estérifié.

Dans la formule I qui précède, n vaut 1 ou 2, m est égal à 0 ou un entier de 1 à 4, p vaut zéro, 1 ou 2 et x est tel que la 5 masse moléculaire du polymère soit d'au moins 5000 D. La liaison amide reliant le carbone latéral du polyacide et le reste de la chaîne latérale est dénommée liaison «isopeptide».

On voit, de par la formule I qui précède que, dans le cas où m égale zéro, le polymère est un dérivé de la polyglutami-10 ne et, notamment lorsque p vaut zéro, la poly-y-malonylglut-amine. Lorsque p vaut 1, on a la poly-y-succinylglutamine et lorsque p vaut 2, la poly-y-glutarylglutamine asymétrique.

Lorsque m est différent de zéro, la molécule comporte un chaînon mono- ou oligopeptidique intercalé entre le groupe 15 CO de la polyglutamine et le groupe amino-substitué terminal. L'existence d'un ou plusieurs groupes peptidiques dans la chaîne latérale du présent polymère correspond à la présence d'un ou plusieurs sites d'attaque hydrolytique enzyma-tique conduisant à la dégradation du polymère en fragments 20 résorbables par l'organisme dans lequel le polymère est incorporé. On peut donc, en jouant sur le nombre et le type des aminoacides constituant ledit chaînon, exercer un contrôle précis sur la vitesse de dégradation du polymère dans une application donnée. Parmi les aminoacides qu'on préfère 25 pour constituer ces chaînons, on peut citer la glycine, l'alani-ne, la phénylalanine, les acides aspartiques et glutamiques estérifiés ou non estérifiés, la leucine, la tyrosine, la méthionine et autres.

Le polymère de l'invention peut également se présenter 30 sous la forme de copolymère avec d'autres polyaminoacides. Dans ce cas, on aura un copolymère de formule:

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r'

-(nh-çh-co) -(nh-ch-co), y z

:ooh

î

(ch9)-co(nh-chr-co) -nhch-(ch9) -cooh z n m 2 p

(I)

dans laquelle R est un reste d'amino-acide quelconque mais, de préférence, un hydrogène (glycine), méthyle (alanine), benzyle (Phenylalanine), etc. Cependant R peut également désigner des restes d'aminoacides comportant des fonctions OH, SH, NH2 (correspondant à d'autres amino-acides), ainsi que - COOH (correspondant aux acides glutamiques et aspartiques), ce groupe carboxylique pouvant être libre, paroù R' est un reste d'acide aminé quelconque, non carboxylé ou carboxylé; dans ce dernier cas, les groupes COOH peu- • vent être libres, partiellement estérifiés ou totalement estéri-45 fiés, les groupes R' des unités - (NH-CHR'-CO) pouvant être identiques ou différents dans la chaîne du copolymère, avec y + z = x, la valeur de x étant toujours choisie pour que le copolymère ait une masse moléculaire moyenne d'au moins 5000 D. La définition de R' peut donc correspondre à 50 celle de R. En règle générale, on préfère pour R' avoir des groupements tels que, par exemple méthyle (alanine), iso-propyle (valine), isobutyle (leucine et isoleucine), benzyle (phénylalanine), etc. . En principe, tous les autres acides aminés sont également possibles, quoique, pour des raisons évi-55 dentes, on n'ait pu les essayer tous. R' peut également désigner un reste d'acide glutamique ou aspartique non estérifié, ou estérifié partiellement par un alcool quelconque, par exemple MeOH ou EtOH, c'est-à-dire, par exemple, -CH2)n-COOH ou -(CH2)n-COOMe, n valant 1 ou 2. II est à remar-60 quer que si R' désigne un reste d'acide glutamique ou aspartique libre, on peut représenter le polymère par la formule I, mais en admettant que le degré de substitution (amidation du carboxylé) est inférieur à 100%; bien entendu, ce cas est également représentable par la formule II avec R' = (CH2)n-65 COOH et y/(z+y) étant égal au degré de substitution.

On pourra également avoir, indifféremment, des acides aminés de la série L ou D. Les acides aminés de la série L (ou naturels) sont les plus intéressants car les polypeptides

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les contenant sont dégradables par les enzymes (protéases) du corps humain, alors que les polypeptides constitués d'unités D ne le sont pas. On peut mettre à profit cette différence grâce à des copolymères comprenant des aminoacides D et L, ceci afin de disposer de polymères dont la vitesse de dégradation est modifiée suivant un schéma préétabli.

Revenant à des considérations plus générales, il faut noter que la proportion molaire, dans le copolymère II, de l'autre polyaminoacide libre ou partiellement estérifié permet également dans une notable mesure de régler la vitesse de biodégradation du copolymère en fonction des agents présents dans l'organisme au site de destination du mélange de copolymère et du médicament à administrer, (c'est-à-dire dans l'organe où le médicament doit agir). Ainsi, par exemple, si le copolymère est un copolymère de polyglutamine I et de leucine, on choisira la proportion molaire relative des deux constituants en fonction de la vitesse relative de dégradation, au lieu considéré, de la polyglutamine et de la poly-leucine. En règle générale, le rapport z/y peut varier de 1 à 30, mais ces limites peuvent être dépassées si besoin est.

Bien entendu, dans le cas où le groupe R' ne désigne pas un groupe de nature unique dans la chaîne du copolymère, c'est-à-dire, pare exemple lorsque l'un des R' désigne un reste d'acide aminé libre et qu'un autre R' désigne un reste d'ami-no-acide estérifié, on pourra, pour plus de commodité désigner les variantes de R' par les signes R", R'" etc. La formule générale d'un tel copolymère peut alors être schématisée comme suit:

r r R'"

-(NH-CH-CO)y-(NH-CH-CO)z-(NH-CH-CO)u-(NH-CH-CO)v

(CH7) -CO(NH-CHR-CO) -NHCH-COOH (IIA)

£ n m i v '

(CH„) -COOH l n où la somme des y, z, u, v,..., etc est égale à x; u, v, etc. peuvent être bien entendu nuls si le reste désigné par R' est de nature unique. Un cas typique où le copolymère présente des R' et R" distincts est celui où ces groupes désignent des restes 5 d'acide glutamique et/ou aspartique estérifiés et non estérifiés, la formule schématique d'un tel polymère (dans le cas d'espèce, partiellement méthylé) se présentant comme suit:

<CH„) -COOH (CH0) -COOMe

| I

-(NH-CH-CO) -(NH-CH-CO)z (NH-CH-CO)u~

I

(CH0) -CO(NH-CHR-CO) NHCH-COOH 15 2 n m |

(CH9) -COOH 2 p

Il est bien entendu que, du point de vue isomérie optique, les polymères de l'invention peuvent comprendre des élé-20 ments de configuration L ou D ou des mélanges racémiques ou, encore, des polymères où une des configurations domine. Les propriétés biochimiques de ces divers assemblages ne sont, bien évidemment, par identiques, les polymères où dominent les formes naturelles L étant plus accessibles à la dé-25 gradation enzymatique. On peut donc, comme déjà mentionné ci-dessus, en contrôler la dégradabilité en dosant, dans le copolymère les proportions relatives de l'une et l'autre forme.

Les polymères I et copolymères II sont solubles dans 30 l'eau (même à PH acide, contrairement à l'acide polygluta-mique) (à moins que les groupes COOH ne soient estérifiés) et généralement solubles dans un ou plusieurs des solvants tels que le diméthylformamide, l'acide trifluoroacétique, l'acide dichloroacétique, le trifluoroéthanol 35 La biodégradation du polymère I peut être schématisée comme suit:

-(nh-cjh-co)

cooh

(ch?) -co(nh-chr-co) j-nhch-(ch,) -cooh z n m 2 p

0 h2o

Enzymes m(h2n-chr-cooh)

-(nh-cjh-co)-

(ch ) -cooh + h„n-ch-(ch„) -cooh n 2 2 p cooh t

(D

h2o peptidases cooh h0n-ch-(ch„) -cooh 2 » n

La réaction (2) est consécutive à la réaction (1) et, de ce fait, la biodégradation du polymère sera d'autant plus rapide que la vitesse d'hydrolyse de la chaîne latérale est plus grande.

Dans le schéma réactionnel ci-dessus, on a indiqué par des petites flèches les liaisons où se produisent les scissions par hydrolyse enzymatique (par exemple par la y-glutamyl-transpeptidase présente dans l'organisme); aussi, par une sélection appropriée des aminoacides constituant cette chaîne latérale, on peut, en fonction des conditions d'hydrolyse au lieu d'administration au polymère, régler sa vitesse de dégra-60 dation et, partant, celle de libération des médicaments qui lui sont associés. On pourra trouver une bonne illustration des propriétés d'hydrolyse enzymatique des peptides greffés dans la référence suivante: J. KOPECEK et al., Enzymatically Degradable Bonds in Synthetic Polymers dans Controlied 65 Drug Delivery, Vol. I, basic concepts, CRC Press, page 81, (1983).

On peut préparer le polymère I et son copolymère II par diverses voies. Ainsi, par exemple dans le cas où m = 0 (ab-

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sence de chaînons de pontage entre le carbonyle du polyacide et le groupe azote substitué de la glutamine) on fait réagir le polyaminoacide IV ou co-polyaminoacide correspondant désiré avec un aminomalonate, aspartate ou glutamate d'alcoyle III (de tertbutyle, par exemple) en présence de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) ce qui fournit l'ester correspon(NH-CH-CO)x~ + H2N-CH-C00Y

dant du polyacide I ou II, ce dernier étant ensuite hydrolysé par les moyens habituels.

Le schéma réactionnel de cette voie de préparation figure ci-dessous. Dans ce schéma, le signe Y désigne un groupe ester, par exemple, méthyle, butyle, benzyle, etc...

DCC

-(NH-CH-CO),

<CR,) -COOY I 2 p

(CH2)n-co°H

(IV)

(CH2)p-COOY (III)

(CH2)n-CO-NH-ÇH

COOY

H+,OH"

(I) ^

DMF

Dans le cas où on intercale un chaînon intermédiaire de processus dans lequel le diester III dérive de l'acide amino-

pontage dans la chaîne latérale (m = 0), on peut, suivant malonique et les chaînons intermédiaires dérivent, successi-

une forme d'exécution, constituer d'abord cette chaîne laté- vement, de la phénylalamine et de la glycine. On notera que raie à partir du diester III, en y fixant, progressivement un 30 pour ajouter ces chaînons intermédiaires, on protège la fonc-

ou plusieurs amino acides suivant les moyens habituels, puis tion amino de ces aminoacides par un groupe benzoxycar-

relier cette chaîne au polyaminoacide comme dans le schéma bonyl (Z) et on utilise, conjointement à la dicyclohexylcarbo-

ci-dessus. diimide (DCC), de l'hydroxybenzotriazole (HOBt), un réac-

On donne ci-dessous un exemple schématique d'un tel ^ tif permettant d'éviter les racémisations

Z Phe

H2N-CH(C00Y)2 + BzOCO-NH-CH-COOH DCC, HOBt

(III), p = O Y = Méthyle

Z-Phe-NH-CH(COOY)2 débenzylation . H-Phe-NH-CH-(C00Y)2

H2/Pd-C

HPhe-NHCH<C00Y)2 + ZGlyOH DCC, HOBt ZGly-Phe-NHCH(C00Y)9

débenzylation ^ HGly-Phe-NHCH(COOY)2 H2/Pd-C

+ -(NH-CH-CO)-.. DCC. HOBt

I X ' 3-

(CH9) -COOH l n

-(NH-CH-C0)-x hydrolyse

(CH2)n-C0-Gly-Phe-NHCH(C00Y)2 ÖF ^

-(NH-ÇH-C0)-x

(CH2)-nC0NH-CH2-C0NH-CH(Bz)-C0NH(COOH)2 (I) m = 2; = H; R2 = Bz; p = 0

Z-Gly-Phe-NHCH(C00Y)2 HGly-Phe-NHCH(COOY)2

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Suivant une seconde form d'exécution, on peut procéder dans un sens inverse, c'est-à-dire, dans le cas d'exemple ci-dessus, faire réagir le polyacide de départ en présence de DCC avec la glycine (celle-ci ayant été préalablement estérifiée). éliminer le groupe ester protecteur, faire réagir le polymère ainsi obtenu avec un ester de phénylalanine, et ainsi de suite, jusqu'à obtention de la chaîne finale. Les étapes d'une telle forme d'exécution étant évidentes en soi pour l'homme de métier, notamment le spécialiste des synthèses peptidi-ques, il n'est pas nécessaire de les détailler plus avant ici.

Bien entendu, les techniques utilisées pour la préparation du polymère I conviennent identiquement dans le cas des copolymères II, la différence concernant simplement le choix du polyacide de départ, c'est-à-dire le remplacement du polyacide IV par un copolyacide correspondant, par exemple

-(nh-ch-co) -(HN-CHR'-CO)z

' (v)

(CH2)n~(C00H)

Le polyaminoacide IV ou co-polyaminoacide V utilisé comme produit de départ pour la préparation du polymère I ou du copolymère II s'obtient facilement par les moyens habituels comprenant l'estérification par un alcool inférieur du carboxylé latéral d'un acide de formule h„n-ch-cooh

/. I

(ch.,) -cooh,

l n la transformation de l'ester en N-carboxyanhydride correspondant (NCA) par le phosgène en milieu dioxanne ou THF, la polymérisation du NCA en polyaminoacide estérifié et l'hydrolyse du groupe ester protecteur en milieu alcalin ou par l'acide trifluoroacétique. De telles méthodes sont connues en soi (voir par exemple Encyclopedia of Polymer Science and Technology; N-carboxyanhydride, vol II, page 837). Lorsqu'on désire parvenir à un copolymère ou R' désigne un carboxylé latéral partiellement estérifié (R' = -(CH2)n-COOH et R" = -(CH2)n-COOAlk) on prendra soin que l'hydrolyse du groupe ester protecteur ne soit que partielle. Ainsi, par exemple, le produit de départ (V) qu'on mettra en jeu sera un copolymère d'acide H2N-CH[(CH2)n-COOH]-COOH et d'ester HN,-CH[(CH2)n-COOAlkj-COOH.

En raison de la présence, le long de la chaîne, de deux groupes carboxyliques, les polymères I et II peuvent fixer certains ions métalliques, tels le Ca+ 2, plus fermement que les acides monocarboxyliques.

Une telle propriété se rencontre auprès de certains polypeptides naturels présents dans l'organisme, tels la prothrombine, le facteur Xa du sang, l'ostéocalcine des os et des cartilages; ces composés présentent des restes y-carboxygluta-miques (Gla) susceptibles de lier le Ca + 2 (voir J.P. BUR-NIER et al., Molecular and Cellular Biology 39 (1981), 191-199). En particulier, l'ostéocalcine présente une grande affinité pour Yhydroxyapatite et, quoique son rôle physiologique soit encore mal connu, elle joue probablement un rôle important dans le contrôle de la croissance osseuse.

En ce qui concerne la prothrombine, celle-ci présente, dans sa molécule, dix restes Gla permettant à la prothrombine de se fixer, en présence de calcium, aux phospholipides constituants des membranes cellulaires. Dans de telles conditions, la prothrombine présente la propriété de se convertir, en présence du facteur Xa, en thrombine laquelle provoque la coagulation du sang en catalysant la transformation de fi-

brimogène en fibrine. En l'absence des restes Gla la prothrombine perd toute activité.

Or, certains composés de l'invention, et notamment l'acide poly-(y-malonylglutamique)

-(nh-ch-co) -t K < ch2)2~conh-ch(cooh)2,

présentent une structure très similaire à celle des restes Gla

-(nh-ch-co)-

!

ch2-ch(cooh)2

et des propriétés analogues.

Ainsi, ils sont utilisables pour la fabrication de prothèses d'os et de cartilages intégralement biocompatibles et biodégradables sans formation de résidus toxiques. On peut réaliser de telles prothèses par moulage de mélanges d'hydroxy-apatite en poudre avec, comme liants, les polymères de l'invention, en tout ou en mélanges avec d'autres polymères biodégradables. On préfère utiliser, pour un tel but, des polymères I ou II dans lesquels p = 0. De telles prothèses sont mécaniquement très rigides, mais se résorbent progressivement au fur et à mesure de la régénération de l'os consolidé. Ainsi, l'intervention finale habituelle destinée à éliminer la prothèse après la guérison peut-elle être évitée.

Les présents polypeptides carboxyliques sont utilisables pour fournir des anhydrides cycliques, lorsque p est égal à 1 ou 2, par exemple par traitement des polyacides I ou II avec un carbodiimide tel que le DCC, comme indiqué ci-dessous:

-(nh-ch-co) -

dcc j x -

co-o / \

(ol) -conhch co / n \ /

(Cll2)p

(IA)

Cette transformation a pour effet de fournir des polymères insolubles dans l'eau, mais solubles dans le nombreux solvents organiques usuels, tels que acétone, méthyléthyl cé-tone, THF, dioxanne, éthyl acétate, monoglyme et autres, ce qui permet leur transformation aisée en billes, bâtonnets, fibres, filaments, microcapsules etc... par les procédés d'ex-trusion, de coulage, d'évaporation etc. Par hydrolyse, les polymères IA, ainsi que leurs homoloques IIA obtenus identiquement à partir de II, redonnent les polyacides I et II.

Les polymères et copolymères IA et IIA sont biodégradables et biocompatibles lors de leur utilisation pour le relargage lent et contrôlé de médicaments par exemple à partir de films minces préparés par coulée d'une solution de polymère et de médicament sur un support suivie d'un séchage par évaporation des solvants de la solution. De telles techniques sont décrites dans «Controlied Release of Macromolecules from Polymers par R. LANGER et al., Biomédical Polymers, Ed. GOLDBERG et NAKAJIMA, Academic Press, 1980). Après séchage du film, le médicament peut se trouver à l'état dissous ou sous forme de suspension de particules.

Le polymère IA et le copolymère IIA sont utilisables comme réservoir de médicaments de diverses manières. Ain-

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si, par exemple, on peut employer les présents polymers IA plus nécessaire de prévoir, comme on le fait actuellement,

et copolymères IIA pour fabriquer des microcapsules conte- une nouvelle opération pour enlever le matériau de renforce-

nant un médicament. De telles microcapsules comprennent ment et de consolidation.

une membrane polymérique et contiennent une solution Les polymères et copolymères de l'invention sont égale-

aqueuse ou huileuse dans laquelle le médicament est en sus- 5 ment utilisables pour la préparation de pansements chirurgi-

pension, ou en solution. On peut également fabriquer des eaux biodégradables. De tels pansements sont constitués par microsphères, c'est-à-dire des particules solides ou billes con- une ou plusieurs couches successivement obtenues à partir de tenant le médicament à l'état dispersé ou à l'état de solution solutions de ces polymères dans un solvant déposées sur un solide dans la matrice de polymère. On peut également fabri- support et solidifiés par évaporation ou séchage.

quer des produits microporeux dénommés microéponges. En 10 On peut par exemple constituer de tels pansements par général, on pourra mettre en œuvre, au moyen des présents coulées des solutions sur un support (ces solutions conte-polymères, toutes les techniques de fabrication de mèdica- nant, ou non, un ou plusieurs médicaments, par exemple un ments retard, c'est-à-dire ayant la propriété de relâcher (re- désinfectant) dans des conditions stériles, en éliminant le sol-larguer) le médicament de manière prolongée au fur et à me- vant, par exemple par la chaleur ou sous vide, puis en déta-sure de la dégradation du support. On trouvera un descrip- 15 chant ensuite le film insolubilisé du support et le séchant en-tion de ces techniques dans les ouvrages suivants: «Biodegra- core éventuellement avant emploi (ou en l'emballant de ma-dables and Delivery Systems for Contraception», E.S.E. nière stérile si son utilisation immédiate n'est pas prévue). HAFEZ, MTP Press limited (1980); «Controlied Release De tels pansements sont constitués par une ou plusieurs Technologies = Methods, Theory and Applications» Vol, I couches successives obtenues à partir de solutions de ces po-et II, A.F. KYDONIEUS, CRC Press (1980) et «Microen- 20 lymères dans un solvant hydrocompatible déposées sur un capsulation - New Techniques and Applications» par Ta- support et solidifiés par extraction à l'eau du solvant en motsu KONDO, Techno Inc. (1979) Japan. La solubilité des question. Une telle extraction peut se faire par mise en con-présents polymères dans de nombreux solvants, miscibles ou iact avec de l'eau, par exemple par lavage ou immersion, non à l'eau, est un avantage pour leur application selon les On peut constituer de tels pansements par coulées des so-techniques décrites dans ces références. Il est également pos- 25 lutions sur un support (ces solutions contenant, ou non, un sible de préparer des fils constitués de ces polymères en ex- ou plusieurs médicaments, par exemple un désinfectant) dans trudant une solution de ceux-ci dans une filière et en précipi- des conditions stériles, en traitant le tout à l'eau puis en déta-tan le fil, soit par évaporation, soit par un bain de non-sol- chant ensuite le film insolubilisé du support et le séchant vant, selon les techniques habitudes de filage. Des filaments éventuellement avant emploi (ou en l'emballant de manière préparés ainsi peuvent être tricotés, noués ou tissés pour for- 30 stérile si son utilisation immédaite n'est pas prévue). L'avan-mer des sutures, des ligatures ou des structures tubulaires tage intrinsèque des polypeptides IA et IIA sur les polyalky-pouvant servir d'artères artificielles, de veines, de conduits glutamates ou aspartates de l'art antérieur réside dans le ca-ou d'organes internes à fonctionnement temporaire. Les po- ractère instable des fonctions anhydrides, ce qui permet d'as-lymères de l'invention peuvent également servir, soit directe- surer la dissolution/biodégradation du polymère sous sa forment, soit en mélange avec un plastifiant, à la fabrication de 35 me hydrophobe d'anhydride.

films ou de prothèses chirurgicales servant, par exemple, à la Les composés anhydrides IA et IIA sont également utiles consolidation d'os fracturés, comme des agrafes, des aiguil- en tant que «vecteur de médicament» (drug vector) pour files, des vis, des plaques de renforcement, des tampons etc. .., xer, de manière covalente, des médicaments présentant une ces matériaux pouvant être réalisés par coulage ou moulage fonction réactive avec ce cycle (celle d'une enzyme, d'une de solution, thermoformage ou par usinage de blocs de poly- 40 protéine ou d'un polypeptide), par exemple une fonction mère solides. De telles prothèses étant résorbables, elles sont amino, comme indiqué ci-dessous où M désigne la molécule progressivement éliminées dans l'organisme et il n'est alors d'un médicament à fixer sur le présent polymère:

-(nh-ch-co)x_ conh-m

(ia) + h2n-m » (ch2)n-co(wh-chr-co)m-nhch-(ch2) -cooh f r

Le polymère ainsi modifié par liaison avec le médicament 50 - Polymerie Drugs, Ed. DONARUMA et VOGI, Aca-

M peut être en général manipulé comme décrit précédem- demie Press, 1978).

ment et administré de même, de façon qu'il agisse à son lieu Ainsi, ont été décrits des polymères pharmacologique-de destination dans l'organisme. Une telle action pharmaco- ment actifs de type vinylique (acrylique) qui présentent le délogique pourra, dans certains cas être due au polymère ainsi faut majeur de ne pas être biodégradables. Par contre, on a modifié lui-même, mais, le plus souvent le médicament ne se- 55 greffé des substances pharmacologiquement actives sur des ra actif qu'après avoir été séparé, par exemple par hydrolyse, Polysaccharides dégradables (Dextrane, par exemple) (voir, de son support. Dans le schéma ci-dessus, les flèches indi- par exemple, HASHIDA et al; Drug Metab. Dispos. 12 queir les liaisons suseptibles de se scinder par hydrolyse. (1984), 492-499).

En ce qui concerne l'état de la technique dans ce domai- On a également utilisé des polyaminoacides comme sup-

ne, on notera que le greffage de molécules pharmacologique- 60 ports de médicaments, notamment en cancerothérapie. Ain-

ment actives sur des supports macromoléculaires solubles est si, la poly L-lysine, a été utilisée comme support de médica-

connu; on trouve en particulier de nombreuses références sur ments anticancéreux (SHEN and RYSER, Molecul. Phar-

les techniques de greffage mises en œuvre et les avantages des macol. 16, (1979), 614-622). L'acide polyaspartique a égale-

produits qu'on en obtient, ceux-ci étant généralement appe- ment été employé (ZUNINO et al, Int. J. Cancer 30, (1982)

lés «polymères pharmacologiquement actifs». On peut citer, 65 465-470) pour fixer de la daunorubicine. Par ailleurs, on a par exemple, les ouvrages suivants traitant de tels sujets: signalé l'utilisation de l'acide polyglutamique comme sup-

- Polymers in medicine Advances Polym. Science, No port de la noréthindrone (produit anticonceptionnel) (ZU-

57, Springer Ed. 1984, PON et al, J. Pharmac. Science 72, (1983), 1323-1326) de

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même que comme base d'un médicament-cible antitumoral par sa conjugaison avec un anticorps (ROWLAND et al, Nature (Lond), 255 (1975), 487-488; WILCHEK, Makro-mol. Chem. Suppl 2 (1979), 207-214). Plus récemment, on a synthétisé de nouveau polymères antitumoraux à base de mi-tomycine C. ROOS et al., Int. J. of Pharmaceutics 22 (1984), 75—87) en partant d'acide polyglutamique ou aspartique et de polylysine. De plus, KATO et al ont divulgué une méthode de couplage entre la daunomycine et un anticorps et leur fixation sur l'acide polyglutamique (J. Med. Chem. 27, (1984), 1602-1607).

On a également fixé l'adriamycine (médicament anticancéreux) sur l'acide polyglutamique (Van Heeswijk et al., Journal of Controlied Release 1_, 301 (1985) ).

On a, par ailleurs, souvent utilisé des copolymères d'anhydride maléique et d'un autre monomère vinylique pour des applications médicales. Ces polymères ont d'une part une activité pharmacologique intrinsèque après hydrolyse (c'est notamment le cas pour l'anhydride divinyl-ether-maléique DIVEMA qui agit comme activateur de macrophages). D'autre part, sous la forme d'anhydride, ils sont capables de servir de supports de médicaments, notamment par réaction de la fonction anhydride avec un groupe R-OH ou R-NH2 d'un principe actif à l'instar des anhydrides dérivés des polyacides de l'invention; HIRANO et al, Makro-mol. Chem. J_80 1125 (1979). Ces polymères de l'état de la technique ont toutefois l'inconvénient de n'être pas biodégradables et de s'accumuler dans les lysosomes, ce qui provoque à la longue une affection dénommée «Syndrome macromoléculaire» ou thesaurosis (W.C. HUEPER Arch. Path. 28, 510, 1939).

Les polymères de l'invention ainsi que les anhydrides correspondants peuvent être employés pour former des macromolécules solubles portant un principe actif et permettant un relargage lent de ce principe actif. On notera que, par rapport aux exemples connus de la technique décrits ci-des-sus, ils présentent les avantages suivants:

- simplicité d'emploi (les agents intermédiaires de couplage sont inutiles)

- bonne solubilité dans l'eau même avec des taux de fixation élevés, en raison de la formation, lors de la réaction de fixation du médicament (couplage), d'un groupe -COOH (hydrophile).

Comme on l'a vu plus haut, les polymères I et II présentent un intérêt considérable en raison de leur pouvoir com-plexant (chélatant) vis-à-vis de certains ions métalliques, notamment le Ca*2 cette propriété étant due à la présence des groupements latéraux dicarboxyliques. Des groupes dicarb-oxyliques -CH (COOH)2, susceptibles de chélater le calcium, font partie de l'acide y-carboxyglutamique qu'on trouve dans certaines protéines humaines (voir J.P. BURNIER et al.. Gamma carboxyglutamic acid, Molecular and Cellu-lar Biology 39, 191-199, (1981), notamment dans les os et les cartilages.

Cette propriété de fixer le calcium, particulièrement développée dans le cas du dérivé aspartique (I, p = 1), rend les composés de l'invention particulièrement utiles pour la fabrication de prothèses d'os et de cartilages entièrement biocompatibles et résorbables. Une telle prothèse peut par exemple être réalisée par moulage d'un mélange d'hydroxyapatite Caio(P04)6(ÓH)2 en poudre et d'un liant constitué par le polymère ou copolymère de l'invention dans lequel p est, de préférence, zéro. Une telle prothèse, quoique de grande rigidité mécanique à l'application, se résorbe lentement au fur et à mesure de la régénération naturelle du membre consolidé et permet d'éviter l'intervention habituelle destinée à son élimination après consolidation définitive.

Les exemples qui suivent illustrent l'invention en détail.

Le dessin annexé est un graphique illustrant le pouvoir complexant du calcium des polymères suivant l'invention.

Méthodes générales de synthèse

On synthétise les polymères et copolymères de l'invention de la manière suivante: on prépare tout d'abord de l'acide poly-L-glutamique ou de l'acide poly-L-aspartique, de manière classique, par la méthode des N-carboxyanhydrides. (Voir par exemple le demande de brevet CH-5021/84).

D'une manière générale, on préfère partir, pour préparer l'acide polyglutamique de la N-carboxyanhydride du y-benzylglutamate d'alcoyle (y-benzylglutamate NCA) qui permet d'obtenir des polymères de hauts poids moléculaires. Le poly-y-benzylglutamate ainsi obtenu est ensuite débenzylé par HBr dans le benzène pour donner l'acide poly-L-glutamique.

On préparera l'acide polyaspartique de la même manière, par polymérisation du ß-benzylaspartate NCA et ensuite de-benzylation du polyacide estérifié. Les poids moléculaires des polymères obtenus sont généralement plus bas dans le cas du polyaspartate que dans celui du polyglutamate.

Exemple 1

Synthèse de poly-[y-L-aspartyl-L-glutamine] et de son anhydride.

On utilise comme polymère de départ du poly[Glu (OMe)20Glu(OH)80], c'est-à-dire un polyacide représentable par la formule (V) dans laquelle R' = (CH2)-COOMe, y = 0,8 et z = 0,2 (x étant bien entendu rapporté à l'unité). Ce copolymère est préparé par hydrolyse incomplète de po-ly[Glu(OMe)] dans l'acide trifluoroacétique aqueux (ce polymère comporte donc dans son squelette 20% d'unité glutamate de méthyle).

On dissout 3,8 g de poly[Glu(OMe)20 Glu(OH)S0] dans 30 ml de dimethylformamide (DMF) ce qui correspond à 23,04 mmole de groupes -COOH. On ajoute 25 mmole d'hydroxybenzotriazole (HOBt) à 8% d'H20, soit 3,67 g,

puis 25 mmoles de di-t-butyl-L-aspartate. HCL, soit 7,04 g, ainsi que 6 ml de tributylamine (TBA) et 5,16 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC). On laisse sous agitation 20 heures à température ambiante puis on centrifuge le mélange. On lave le culot (dicyclohexylurée) avec du CHC13 (50 ml) et on ajoute l'extrait au surnageant. On ajoute encore à celui-ci 100 ml de CHC13 et on lave successivement cette phase avec H-.0 (3 fois 100 ml), NaHCOj IN (2 fois 100 ml), H-,0 (100 ml), HCl 1% (3 x 100 ml) et H20 (2 x 100 ml). Ön sèche le phase organique sur Na2S04 et on la concentre à 40 ml. On rajoute 100 ml d'éther et d'hexane jusqu'à apparition d'un trouble et on verse le tout dans 550 ml d'un mélange d'hexane-éther de pétrole (35-45 ) ce qui provoque une précipitation. Le précipité est redissous dans 20 ml de CHC13, on ajoute 100 ml d'éther, on filtre sur celite, on rajoute de l'hexane dans le filtrat, on précipite et on sèche le produit sous vide. On obtient 5,72 g de polymère dont la majeure partie, correspond à la formule:

-(NH-CH-CO) -!

CH2)2-CONH-CH(COO-t.Bu)CH2-C00-t.Bu

On dissout les 5,72 g de polymère dans 20 ml d'acide tri-fluoracétique (TFA) et on rajoute 40 ml de CHC13, puis quelques ml d'acétone jusqu'à apparition d'un trouble. On verse cette solution dans 400 ml d'acétone sous violente agitation. On reprend le précipité fin obtenu dans 200 ml d'acétone + 200 ml d'éther, on filtre et on sèche. On obtient 3,68 g de polymère (IIA) (rendement = 90%), correspondant à la formule suivante (théorique):

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

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-(NH-CH-CO) - - (NH-CH-CO) „- -(NH-CH-CO) -

1 I I

(CH2)2"C0NHCH_CH2C00H (CH2)2-COOMe (CH2)2-C00H

COOH

Un échantillon de polymère est hydrolysé 12 h dans HCl 6N à 120 °C. Par analyse de la composition en acides aminés de la solution, on constate la présence de 3 moles d'acide aspartique pour 4 moles d'acide glutamique, ce qui permet d'attribuer les valeurs suivantes aux indices moléculaires: y = 0,75, z = 0,2, u = 0,05. Par ailleurs, le spectre RMN du polymère en solution TFA correspond bien à la structure proposée. Le produit ainsi obtenu est très hygroscopique et doit être conservé au dessicateur.

On dissout 0,927 g du poly[Glu(OMe)Glu(OH)Glu

-(NH-CH-CO)075-

C00.

I / \

(CH9)„-CONH-CH CO

L & \ /

(Asp)] ci-dessus dans 10 ml de DMF et on ajoute 3 mmole de DCC. Après 20 heures sous agitation, on filtre et on ajoute au filtrat 30 ml d'éther. On verse ensuite ce liquide dans 10 350 ml d'éther et on ajoute au mélange 200 ml d'éther de pétrole ce qui occasionne la séparation d'un solide. On centrifuge et on sèche le culot ainsi obtenu ce qui fournit 0,73 g d'un polymère insoluble dans l'eau mais soluble dans le CHC13. Le spectre IR de ce polymère confirme la présence de 15 fonctions anhydrides (5 = 1800 cm-1) et sa formule est donc

- ( NH-CH-CO) Qf2~ ~( NH-CH-CO ) Q ^ Q 5

(CH2)2-COOMe (CH2)2-COOH

Exemple 2

Synthèse de la poly[y-L-glutamyl-glutamine] et de son anhydride.

On dissout 2,5 g d'acide poly-L-glutamique (0,0192 moles COOH) dans 50 ml de DMF et on ajoute dans l'ordre 2,85 g d'hydroxybenzo-triazole 3,63 g de tributylamine 0,7 g de chlorhydrate de dibenzyl glutamate et 3,95 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC). On laisse 24 heures sous agitation à température ambiante. On filtre la dicyclohexylurée formée et on évapore le filtrat (40 CC/1 Torr). Le précipité est redissous dans du chloroforme (50 ml) et lavé successivement avec NaHC03 0,1 N, H2Q, HCl 1% et H20 saturée de sel (100 ml). On centrifuge à chaque lavage pour séparer les phases organiques et aqueuses. On sèche finalement la phase organique sur MgS04, on filtre et on fait précipiter la solution par adjonction d'un excès d'éther. Le polymère est redissous dans du MeOH (20 ml), on ajoute de l'acide acétique (30 ml) et 5 ml d'H20; on ajoute 2 g de palladium sur charbon actif et on fait barboter de l'hydrogène 15 heures dans cette solution. Après filtration du charbon actif, on dialyse la solution 3 jours dans l'eau distillée, puis on effectue une lyophilisation ce qui fournit 3,5 g de poly (y-L-glutamyl-glut-amine].

Le polymère peut être stocké sous sa forme diacide carb-oxylique ou on peut le cycliser de la manière suivante:

On dissout 1,44 g de ce polymère dans 200 ml de DMF et on ajoute 2,3 g de DCC. On laisse le tout 24 h en agitation; à 70 C on filtre la dicyclohexylurée (DCU) et on ajoute de l'éther ce qui fait précipiter le polymère. Le spectre IR d'un film mince de ce polymère, obtenu par dépôt d'une couche de sa solution dans le CHC13 sur une plaque de verre, montre la présence de la fonction anhydride (1 pic à 1830 cm-1).

25

-(NH-CH-CO)y-(NH-CH(iso-Bu)-CO-)z~

En procédant comme dans l'exemple 1 qui précède, mais en remplaçant l'acide polyglutamique par l'acide polyaspar-tique correspondant, on obtient la poly[y-L-aspartyl-L-as-partamine]. Celle-ci peut être cyclisée en anhydride correspondant par les moyens sus-indiqués.

De même, en utilisant comme polyacide de départ un copolymère 50/50 d'acide glutamique et de leucine, on obtient tout d'abord un copolymère de formule

(CH2)2-CONH-(j:H-( CH2) 2-COOH 30 COOH

où y = z = 0,5 avec x = 1, puis l'anhydride correspondant par les moyens sus-indiqués.

35 Exemple 3

Fixation de composés aminés sur les polyglutamine-anhydrides.

Les réactions suivantes ont été effectuées avec des polyacides de l'invention sous la forme d'anhydrides et certains 40 acides aminés: On a ajouté goutte à goutte à des solutions des polypeptides dans le DMF des solutions aqueuses (ou DMF) des acides aminés. On a laissé sous agitation pendant 14 heures, après quoi on a salifié le polymère obtenu par NaHC03 N/10 et on a procédé à 24 h de dialyse dans H20 45 suivie d'une lyophilisation. On a analysé des échantillons des produits obtenus (après hydrolyse dans HCl 6 N) pour déterminer le taux de fixation des acides aminés. Les résultats figurent au tableau ci-dessous. On peut remarquer d'après ces résultats que le taux de fixation dépend en partie de la so-50 lubilité des produits de départ dans le milieu réactionnel.

Polypeptide anhydride

Composé aminé

milieu réactionel taux de fixation %

55

glycine me-thyl-ester

Alanine

DMF (bonne 75% solubilité

DMF + H20 20%

poly(Glu-glutamine)-anhydride poly(Glu-60 glutamine)-anhydride poly(Asp (anh)glut-amine

65 En général, il faut choisir comme milieu réactionnel un solvant où mélange de solvant tel que la réaction du groupe -NH2 de la substance à fixer soit favorisée par rapport à celle du l'hydrolyse du cycle anhydride.

Glycine

DMF + H20 50%

(solubilité

moyenne)

667 874

10

Exemple 4

Poly[y-2-(dicarboxy-l,3-propyl)glutamine]

Il s'agit du polyglutamide de l'acide 2-aminomalonique dont le nom, suivant la nomemclature IUPAC est poly[imi-no[l-oxo-2( 1 ', 3'-dicarboxy-2'-iminocarbonyléthylène)-éthy-lène]].

On dissout 5 g d'acide polyglutamique (PGA) dans 100 ml de DMF; on ajoute ensuite 7,16 g de tributylamine, 7,10 g de chlorhydrate d'aminomalonate diméthylique (0,0387 moles) et, 5,23 g d'HOBt. On refroidit vers 0 °C et on ajoute 7,97 g de DCC dissous dans 20 ml de DMF. Après 24 heures on filtre et on précipite le polymère par adjonction d'H20. On redissout le solide dans de l'acétone et on reprécipite par l'eau. On redissout dans CHC13 et on sèche la solution sur MgS04. On filtre sur gooch en verre fritté et on précipite par l'éther. On obtient 5,8 g de polymère estérifié ayant la formule suivante:

-(NH-CH-CO)

I x~

CH7

i 2

co i

NH

I

CH3OOC-CH-COOCH3

Le spectre RMN du polymère en solution dans l'acide trifluoracétique correspond à la formule ci-dessus. (5 = 3,15 ppm, OCH3). On ajoute le polymère (3 g) à 30 ml de KOH N/10 dans le MeOH. On ajoute ensuite 25 ml d'H20. Le polymère se dissout peu à peu. Après 17 heures, le pH est ramené à 7 et la solution est dialysée 1 jour dans H20 puis HCl à 1 %. On lyophilise le tout et on obtient ainsi 2,45 g du polymère de formule:

-(NH-CH-CO) -

I

(CH2)2-CONH-CH(COOH)2

On mesure la proportion des amino-acides d'un échantillon après hydrolyse totale de celui-ci dans une solution HCl 6N (24 h) d'où on déduit que le taux de fixation du radical malonylamido est de 85%. L'analyse consiste à doser la glycine qui se forme, lors de l'hydrolyse, par décarboxylation du reste aminomalonique.

Exemple 5

Poly-(y-aspartyl-anhydride-glycine-glutamine)

On prépare tout d'abord le dipeptide de formule

OtBu l

Z-Gly-Äsp-OtBu par couplage classique à la dicyclohexylcarbodiimide de Z-Gly(OH) et de H2N-Asp(OtBu)2. Ce dipeptide est ensuite soumis à une debenzylation catalytique parl'hydrogène/pal-ladium pour donner H-Gly-Asp(OtBu)2. Ce peptide est cristallisé sous forme de sel de dibenzylsulfimide (HN(S02-Bz)2 dans l'éther. On le couple ensuite à l'acide polyglutamique comme décrit dans les exemples précédents. On filtre la DCU formée, on précipite le polymère dans NAHC03 0,1N, on le lave avec H20 et on le dissout dans du dioxanne saturé d'HCl (4 N). Après 20 minutes, le polymère précipite. On

évapore à sec et on dissout le produit dans un tampon carbonate pH 7. On filtre pour éliminer les parties insolubles et on dialyse le polymère contre H20 pendant 24 heures, puis contre HCl 1 % 24 heures. On lyophylise la solution et on obtient un polymère ayant la formule suivante:

-HN-CH(CO-)(CH2)2-CONH-CH2CONHCH(COOH)-

ch2cooh

Ce polymère est repris dans le DMF et, à la solution, on ajoute 1,5 équivalent de DCC. Après 24 heures de réaction, on filtre la DCU, on évapore le DMF et on redissout le polymère dans un minimum de chloroforme. On filtre à nouveau pour éliminer les traces restantes de DCU, on précipite le polymère dans un mélange 50/50 éther/éther de pétrole et on sèche sous vide. Le spectre IR d'un film de ce polymère obtenu à partir d'une solution dans l'acide trifluoroacétique montre la présence de groupements anhydride (X = 1830 cm.)

L'analyse des acides aminés résultant de l'hydrolyse totale du polymère montre que le taux de greffage est de 78%.

Exemple 6

Le but de cet exemple est de mettre en évidence le pouvoir complexant de divers polymères suivant l'invention vis-à-vis des ions calcium.

On a introduit dans une série d'enveloppes de dialyse (boyaux) des portions de 1 ml de solution aqueuse contenant du Ca+2 radioactif, 100 jj.1 de 45Ca 10-3M, et des quantités variables de divers polymères suivant l'invention (ainsi qu'un contrôle). Les polymères étudiés étaient: acide polyglutamique (contrôle A); poly-(malonyl-glutamine) B; poly-(aspar-tylglutamine) C; poly-(glutaryl-glutamine) D.

On a placé ces enveloppes dans 7 ml de tampon phosphate à pH 7,5 et on a laissé la dialyse s'effectuer jusqu'à l'équilibre (24 h); on a mesuré au moyen d'un compteur à scintillation les concentrations de calcium dans le tampon de dialyse, à l'extérieur de la membrane, et dans la solution dialysée à l'intérieur de la membrane. On a ensuite déterminé le rapport (%) entre le calcium lié au polymère par rapport au calcium total. Les résultats sont rassemblés au graphique annexé en fonction (abcisse) de la quantité de polymère exprimée en mMoles/1 de restes porteurs de groupes carboxyliques et montrent que l'acide polyglutamique n'a qu'un pouvoir de fixation du calcium très limité par rapport aux polypeptides dicarboxyliques de l'invention.

Exemple 7

Cet exemple est destiné à montrer que le dérivé poly(y-malonylglutamine) se lie en présence de Ca+2, aux surfaces lipidiques comme le fait la prothrombine - (voir par exemple S.P. BAJAJ et al., Journal of Biol. Chemistry, 250(6), 2150-2156(1975)).

On a opéré de la manière suivante:

On a préparé tout d'abord une suspension de liposomes en dissolvant 250 mg de lécithine dans 36 ml de CHC13, en ajoutant 10 ml de tampon (20 mM Tris, HCl + 40 mMol NaCl, pH 7,5) et en soumettant ce mélange aux ultrasons à 50 °C. Après évaporation du CHC13, on a rajouté 30 ml de tampon, on a ajusté le volume total à 40 ml et on a centrifugé >/2 heure à 60 000 rpm. On a repris le culot dans 41,6 ml de tampon ce qui a fourni une suspension de liposomes à 6 mg/ml.

On a introduit ensuite dans une série de tubes à essai des solutions aqueuses 10 mM en ions Ca contenant chacune 2 mg/ml de liposomes et des quantités croissantes (de 0,025 à 1 mg/ml) de poly(y-malonylglutamine) marquée au 14C.

(Pour marquer la poly(y-malonylglutamine), on a fait réagir

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

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celle-ci avec du glycinate de méthyle radioactif l4C en présence de EEDQ, (2-éthoxy-l-éthoxy-carbonyl-l,2-dihydroqui-noléine) de manière à substituer environ 1 % des restes ma-loniques par le glycinate et obtenir ainsi une activité spécifique de 37 000 dpm/mg (désintégrat/min) de polymère.

Après 30 minutes, on a centrifugé les liposomes et on a mesuré ensuite la radioactivité présente dans le surnageant, cette quantité caractérisant le pourcentage de poly(y-ma-Ionylglutamine) non fixé par les liposomes.

Le tableau suivant rassemble les résultats obtenus:

No polymère Ca++ liposomes % polymère tube

(mg/ml)

(mM)

(mg/ml)

non fixé

1

10

0

95,7

2

0,025

0

2

92,0

3

0,025

10

2

5,0

4

0,05

10

2

21,8

5

0,1

10

2

48,2

6

0,25

10

2

76,3

7 0,5 10 2 84,4

8 0,75 10 2 90,0

9 1 10 2 92,2

5 Ces résultats montrent que 1 mg de liposomes fixe 0,5 mg de poly(y-malonyl glutamine) en présence de calcium. On voit aussi (essai No 2, qu'en l'absence de Ca+2, il n'y a pas de fixation du polymère sur les liposomes. Le comportement de ce polymère, dans les conditions susmentionnées, est donc io analogue à celui, naturel, d'une protéine du sang.

Exemple 8

Les polymères suivants: poly(y-glutamylglutamine); poly(y-aspartylglutamine); poly(y-malonylglutamine) ont 15 été dissous dans une solution NaCl isotonique à pH 7,4 (0,01 M phosphate) à une concentration de 100 mg/ml.

Les solutions ont e injectées i.p. à des souris blanches (25-30 g) jusqu'à une dose de 2000 mg/kg (5 tests par dose). Après une période d'observation de 4 semaines, on n'a cons-20 taté effet létal sur les animaux d'expérience, et ceci jusqu'à la dose de 2000 mg/kg.

C

1 feuille dessins

Claims

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2

REVENDICATIONS

1. Polypeptide carboxylé hydrosoluble biodégradable de formule

-(nh-ch-co) -

l100" (I)

(ch.,) -co-(nh-chr-co) -nhch-(ch7)-cooh z n m / p ou de formule r'

-(nh-ch-co) -(nh-ch-co)z~

cooh (h)

(ch2)n-co-(nh-chr-co)m-nhch-(ch2 > -cooh où les groupes R et R', identiques ou différents, sont des restes d'aminoacides comportant, ou non, un ou plusieurs groupes COOH libres ou estérifiés; m est un nombre entier de 0 à 5, p est égal à 0, 1 ou 2, n vaut 1 ou 2 et x ou y + z sont choisis pour que la masse moléculaire du polypeptide ne soit pas inférieure à 5000 D, le polypeptide se présentant sous forme d'acide libre ou d'anhydride cyclique.
2. Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que R est choisi parmi les restes méthyle, éthyle, iso-butyle, phényle et benzyle.
3. Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que, les chaînons intermédiaires d'indice m sont choisis parmi les amino acides suivants: glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phénylalanine, tyrosine, sérine, cystéine, méthionine, lysine, arginine.
4. Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'ossature du composé I est choisie parmi les acides polyglutamiques et aspartiques et que l'ossature du composé II est choisie parmi les copolymères des acides glutami-que et/ou aspartique avec un ou plusieurs autres acides aminés choisis parmi l'alanine, la leucine, la valine et la phénylalanine.
5. Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le polymère II est choisi parmi les copolymères des polyglutamines ou aspartamines avec, comme co-monomè-res, respectivement, l'acide glutamique et/ou les glutamates d'alcoyles inférieurs et l'acide aspartique et/ou les aspartates d'alcoyles inférieurs.
6. Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que les groupes carboxyliques sont salifiés par des cations métalliques alcalins ou alcalino-terreux, par des aminés primaires, secondaires ou tertiaires ou qu'il sont sous forme d'anhydrides cycliques.
7. Polypeptide suivant la revendication 1, en tant que médicaments antiviraux et antitumoraux.
8. Utilisation du polypeptide I et II suivant les revendications 1 à 6 pour préparer des médicaments à effet retard dans l'organisme, dans lequel le polypeptide joue le rôle de support.
9. Utilisation suivant la revendication 8, caractérisée par le fait qu'on mélange ledit médicament et ledit polymère de façon homogène et qu'on façonne ce mélange sous une forme pharmaceutiquement acceptable.
10. Utilisation suivant la revendication 8, caractérisée par le fait qu'on plastifie le polymère par un plastifiant, notamment un polyalcoylène glycol, qu'on y ajoute un médicament, puis qu'on moule par la chaleur le produit thermoplastique ainsi obtenu sous forme de granulés, bâtonnets, capsules ou autres particules aptes à être administrées par toutes voies habituelles.
11. Utilisation suivant la revendication 8, caractérisée par le fait qu'on fait réagir les polymères I et II sous leur forme d'anhydride cyclique avec une substance susceptible de réagir avec les anhydrides et, partant, de se fixer par une liaison covalente sur lesdits polymères.
12. Utilisation suivant la revendication 11, caractérisée par le fait que ladite substance réagit avec l'anhydride par l'intermédiaire d'une fonction amino, amido, hydroxy ou thiohydroxy.
13. Utilisation des polymères I et II, suivant la revendication 1, pour fabriquer des implants et prothèses biodégradables utilisables en chirurgie.
14. Utilisation suivant la revendication 13, pour la préparation d'implants ou prothèses d'os biodégradables, caractérisée par le fait qu'on constitue de telles prothèses d'hydro-xyapatite liée par lesdits polymères I ou IL
15. Procédé de préparation des polymères I et II suivant la revendication 1 où m = o, caractérisé par le fait qu'on fait réagir un polyacide de formule IV: -(NH-CH[(CH2)n-COQH]-CO-)x, ou le copolyacide correspondant de formule V: -(NH-CH[(CH)n-COOH]-CO)-y(NH-CHR'-CO-)z où n, x, y, z et R' ont le sens précité, avec un ester d'aminoacide de formule III: H2N-CH [(CH2)p-COOY]-COOY où p a le sens précité et Y désigne un alcoyle d'estérification, en présence de dicyclohexylcarbodiimide, de manière à obtenir les polymères I ou II sous forme estérifiée, puis qu'on soumet ces polymères-ester à une désalcoylation par hydrolyse ou hydrogénolyse catalysée de façon à les convertir en acides carboxyliques libres.
16. Procédé de préparation des polymères I et II suivant la revendication 1, applicable au cas ou m = O, caractérisé par le fait qu'on fait réagir un polyacide de formule IV: -(NH-CH[(CH2)n-COOH]-CO)-x, ou le copolyacide correspondant de formule V: (NH-CH[(CH2)n-COOH]-CO)v-(NH-CHR'-CO)z- où n, x, y, z et R' ont le sens précité avec un diester de formule VI: H2N- CHR-CO-(NH-CHR-CO)m

NH- CH[(CH2)p-COOY]-COOY où les R, identiques ou différents, ainsi que m et p ont le sens précité, et y désigne un alcoyle d'estérification, en présence de dicyclohexyl-carbodi-imide, de manière à obtenir les polymères I ou II sous forme estérifiée, puis qu'on soumet ces polymères-ester à une désalcoylation par hydrolyse et/ou hydrogénolyse catalysée afin de les convertir en acides carboxyliques libres.
17. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé par le fait que le diester de formule VI est obtenu par couplages successifs sur le diester III indiqué dans la revendication 15, en présence de dicyclohexylcarbodiimide, d'aminoacides dont le NH2 est temporairement désactivé par un groupe protecteur, ce groupe protecteur étant éliminé par déshydro-génation après chacun desdits couplages.