CH671778A5 - - Google Patents

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CH671778A5
CH671778A5 CH725/85A CH72585A CH671778A5 CH 671778 A5 CH671778 A5 CH 671778A5 CH 725/85 A CH725/85 A CH 725/85A CH 72585 A CH72585 A CH 72585A CH 671778 A5 CH671778 A5 CH 671778A5
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CH
Switzerland
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nucleic acid
fragments
combinations
acid fragments
series
Prior art date
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CH725/85A
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English (en)
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Airi Marjatta Palva
Tuula Marjut Ranki
Hans Erik Soederlund
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Orion Yhtymae Oy
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Description

BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Hybridisierungsverfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuren, das im Patentanspruch 1 definiert ist, sowie Anwendungen dieses Verfahrens, die in den Patentansprüchen 7 und 9 definiert sind. Im folgenden bedeutet der Ausdruck «eine Reihe» (von Nucleinsäurefragmenten) eine Kombination von Nucleinsäurefragmenten, die homolog zu den alternierenden Bereichen der zu identifizierenden Nucleinsäure sind,
aber nicht homolog zueinander sind, oder ein einzelnes Nuclein-säurefragment, das zu dieser Kombination gehört, und der Ausdruck «Serie» bedeutet einen Satz von Nucleinsäurefragmenten, die sich auf irgendeine Weise von dem Rest der Fragmente unterscheiden, die zu der betreffenden Kombination gehören.
Verschiedene Hybridisierungs-Verfahren wurden bereits für die Identifizierung und die Untersuchung von Nucleinsäuren angewendet. Einige Beispiele sind die direkten Hybridisierungsverfahren, bei denen die die zu identifizierende Nucleinsäure enthaltende Probe entweder in einer Lösung (Brautigam et al., J.
Clin. Microbiol. 12,226-234 [1980] und GB-OS 2 019 408) oder an einen festen Träger gebunden vorliegt (US-PSen 4 139 346, 4 302 204,4 358 535,4 395 486, GB-OSen 2 034 323,2 095 833, EP-A-62 286,62 237 und 61 740) und mit einem markierten Nucleinsäure-Reagenz nachgewiesen wird, das mit der zu identifizierenden Nucleinsäure hybridisiert.
Zu weiteren bekannten Hybridisierungs-Verfahren gehören das zweistufige «Sandwich»-Hybridisierungs-Verfahren von Dunn und Hassell (Cell 12,23-36 [1977]) und die einstufigen «Sand-wich»-Hybridisierungs-Verfahren der EPA-79 139. Bei der Identifizierung von Nucleinsäuren durch die «Sandwich»-Verfahren werden zwei getrennte Nucleinsäure-Reagenzien zum Nachweis der Nucleinsäuren in der Problemlösung benötigt. Eines dieser Reagenzien ist an ein festes Trägermaterial gebunden, das andere ist markiert. Sowohl die Nucleinsäure-Reagenzien, die an das feste Trägermaterial gebunden sind, als auch die, die markiert sind, sind dadurch gekennzeichnet, dass ihre Nucleotidsequenz komplementär oder nahezu komplementär zu der zu identifizierenden Nucleinsäure ist, d.h. sie ist homolog. Die verwendeten Nucleinsäure-Reagenzien sind entweder natürliche Nucleinsäuren oder Fragmente von diesen. Die Fragmente werden beispielsweise mit Restriktionsenzymen hergestellt. Nucleinsäure-Reagen-zien wurden auch bereits synthetisch oder mit Hilfe von DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellt. Auch natürliche Plasmide (US-PS 4 358 535), Nucleinsäuren aus Bakteriophagen (US-PS 4 543 535), Ribosomale-RNA und Boten-RNA (US-PS 4 302 204) oder Nucleinsäuren aus verschiedenen Viren (Stäl-handske et al., curr. top. Microbiol. Virol. 104 [1983]) wurden bereits als Nucleinsäure-Reagenzien verwendet. Das gesamte Virus-Genom wurde beispielsweise bereits zur Identifizierung der Anteile verschiedener Viren in der mRNA eines Hybrid-Virus verwendet (Dunn und Hassell, Cell 12,23-36 [1977]). Ebenso wurden Nucleinsäure-Reagenzien bereits mit DNA-Rekombinations5
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verfahren hergestellt (US-PS 4 395 486 und 4 395 535, EP-A-79 139 und GB-OS 2 034 323 sowie EP-A-62 286). Mit DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellte Nucleinsäure-Reagenzien vurden entweder als definierte, aus dem Vektor herausgeschnitene und von dessen DNA abgetrennte DNA-Fragmente oder als rekombinante DNA-Moleküle, also verbunden mit verschiedenen Rektoren, hergestellt. Die im Stand der Technik verwendeten, mit DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellten Nucleinsäure-Reagenzien bestehen aus einem kontinuierlichen, zur Identifizierung verwendeten Nucleinsäure-Fragment oder aus verschiedenen jetrennten Klonen.
Erfindungsgemäss wurden neue, empfindlichere Nuclein->äure-Reagenzien entwickelt, die mindestens eine «Reihe» von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, die aus zu der zu identifizierenden Nucleinsäure homologen DNA-Segmenten gewonnen Verden. Aus verschiedenen zu der zu identifizierenden Nuclein-iäure homologen DNA-Sequenzen gewonnene Reihen von Fragmenten können zu einer «Serie» zusammengestellt werden, wobei die einzelnen Fragmente ganz oder zum Teil miteinander verbunden werden können. Vorzugsweise enthält das Nucleinsäure-Reagenz mindestens zwei derartige Serien, wobei die Fragmente ier Serien nicht miteinander hybridisieren.
Nucleinsäure-Reagenzien, die solche Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, sind bei «Sandwich»-Hybridisie-rungs-Verfahren mindestens doppelt so empfindlich wie die im Stand der Technik verwendeten Nucleinsäure-Reagenzien. Bei Verwendung der Nucleinsäure-Reagenzien oder ihrer Kombinationen ist es möglich, geringere Nucleinsäure-Mengen als früher lachzuweisen und sie sind besonders gut für «Sandwich»-Hybri-disierungs-Verfahren geeignet.
Die höhere Empfindlichkeit der Nucleinsäure-Reagenzien bei «Sandwich»-Hybridisierungs-Verfahren beruht teilweise darauf, dass die Verwendung verschiedener Sondenmoleküle die Menge der markierten Hybride auf dem festen Trägermaterial erhöht. Fedes hybridisierende Sondenmolekül kann auch vom Vektor ibgeleitete markierte Nucleinsäure enthalten (Fig. 1 und 2). In Fïg. 1 und 2 ist Vektor-DNA mit v gekennzeichnet, die zu identifizierende Nucleinsäure mit x, die markierte Probe mit b, das an das feste Trägermaterial gebundene identifizierende Nucleinsäue-Reagens mit a und der Filter mit F. Wenn mehrere Sondenmoleküle verwendet werden, steigt die Menge markierter, vom Vektor ibgeleiteter Nucleinsäure-Anteile und mehr Markierung wird an die sich bildenden Hybride gebunden. Deshalb sind die Hybride leichter nachzuweisen.
Wenn die Reihe der Nucleinsäure-Fragmente bei «Sand-ivich»-Hybridisierungs-Verfahren verwendet wird, werden mindestens zwei oder, wie in Fig. 1 abgebildet, drei identifizierende Nucleinsäure-Fragmente an das feste Trägermaterial gebunden. Je nach Ausmass der Reaktion können in diesem Fall verschiedene Bereiche des nachzuweisenden Nucleinsäure-Stranges x an die an das feste Trägermaterial gebundenen Nucleinsäure-Fragmente, beispielseise ai, a2 und a3, an einem oder mehreren Stellen hybridisieren. Wenn die Reaktion ihr Endstadium erreicht, kann eine Situation, wie sie in Fîg. 1 beschrieben ist, vorliegen. Dabei bildet der nachzuweisende Strang eine oder mehrere Schleifen an die îin oder mehrere Sondenmoleküle hybridisieren, in Fig. 1 sind dies beispielsweise bi und b2. Zu diesem Zeitpunkt nimmt die Entfernung von vom Vektor abgeleiteten Nucleinsäure-Bereichen rom Hybridisierungs- Verbindungs-Punkt (1) (Fig. 1) ab und das Hybrid ist stabiler als ein aus einem Reagenz-Paar gebildetes [Stand der Technik, Fig. 2). Das einzelne Reagenz-Paar-Hybrid hat dabei die gleiche Grösse wie der Gesamtbereich der Reihe ron Nucleinsäure-Fragmenten. Die Vektorbereiche des aus einem Reagenz-Paar gebildeten Hybrids werden beispielsweise durch mechanische Beanspruchung (z.B. Schütteln) leicht zerstört.
Dabei wird die bereits an das Hybrid gebundene Markierung freigesetzt.
Da die verbesserten Nucleinsäure-Reagenzien empfindlicher sind als die im Stand der Technik verwendeten Nucleinsäure-Reagenzien, sind sie zum Nachweis von Chromosomen-Umlage-rungen und von Erbkrankheiten geeignet.
Die Beispiele und Zeichnungen erläutern die Erfindung.
Fig. 1 zeigt eine Reihe von «Sandwich»-Hybriden.
Fig. 2 zeigt ein «Sandwich»-Hybrid, das aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Fig. 3 zeigt die Bereiche von zwei alternierenden Abschnitten einer Nucleinsäure, die für die Herstellung von zwei Reihen von Nücleinsäue-Fragmenten (für zwei verschiedene Serien) ausgewählt wurde.
Fîg. 4 zeigt die entsprechenden Bereiche von Abschnitten für die Herstellung von drei Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten (für drei verschiedene Serien).
Fig. 5 zeigt die in Fig. 3 beschriebenen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten, die getrennt (a), miteinander verbunden (b) und sowohl getrennt als auch miteinander verbunden (c) vorliegen.
Fig. 6 zeigt verschiedene Ausführungen von «Sand-wich»-Hybriden.
Fig. 6a zeigt ein «Sandwich»-Hybrid, das bei der Verwendung getrennter b-Fragmente entsteht,
Fig. 6b zeigt ein «Sandwich»-Hybrid, das bei Verwendung verbundener b-Fragmente entsteht und
Fig. 6c zeigt ein «Sandwich»-Hybrid, das bei Verwendung sowohl getrennter als auch verbundener b-Fragmente entsteht.
Fîg. 7 zeigt eine aus drei Reihen bestehende Serie von Nucleinsäure-Fragmenten zur Identifizierung verschiedener Nucleinsäuren.
Fig. 8 zeigt «Sandwich»-Hybride, die bei Verwendung der in Fîg. 7 beschriebenen, verschiedene Nucleinsäuren identifizierenden Serie von Nucleinsäure-Fragmenten entstehen.
Fig. 9 zeigt Hybride, die bei direkter Hybridisierung entstehen.
Fîg. 10 zeigt das rekombinante Plasmid pKIH1220.
Fîg. 11 zeigt ein «Sandwich»-Hybrid, das bei Verwendung einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten aus dem rekombinan-ten Plasmid pKTH1220 entsteht.
Fig. 12 zeigt das rekombinante Plasmid pKTH1271.
Fîg. 13 zeigt ein «Sandwich»-Hybrid, das bei der Verwendung von Nucleinsäure-Fragmenten des rekombinanten Plasmids pKIH1271 entsteht.
Die Nucleinsäue-Reagenzien enthalten mindestens einen Satz von Nucleinsäure-Fragmenten. Vorzugsweise umfassen die Sätze von Nucleinsäure-Fragmenten mindestens zwei, vorzugsweise jedoch mehrere (bis zu zwanzig), alternierende Nucleinsäure-Fragmente, die sich von einer oder mehreren Nucleinsäuren ableiten, welche homolog genug zur zu identifizierenden Nucleinsäure sind. Dabei erhält man mindestens zwei Sätze alternierender Reihen von Nucleinsäue-Fragmenten, die nicht miteinander hybridisieren dürfen.
Die Reihen von Nucleinsäure-Reagenzien können synthetisch hergestellt werden. In diesem Fall dürfen die Fragmente der beiden alternierenden Serien von Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten nicht miteinander homolog sein. Sie müssen jedoch ausreichend homolog zu alternierenden Bereichen in den zu identifizierenden Nucleinsäuren sein. Diese Fragmente können leicht durch vollautomatische Maschinen nach der Charakterisierung der Nucleinsäure-Sequenz der zu identifizierenden Nucleinsäure hergestellt werden.
Die Nucleinsäure-Reagenzien setzen sich aus einzelnen oder miteinander verbundenen oder sowohl aus einzelnen und miteinander verbundenen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten zusammen. Die einzelnen oder miteinander verbundenen Nucleinsäure-Fragmente, die Reihen und/oder die Serien von Nucleinsäure-Fragmenten können in einen Vektor eingebaut sein, können Teile von Vektoren umfassen oder können ohne jeglich Vektor-Bereich* vorliegen.
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Die verwendeten Nucleinsäure-Fragmente haben eine Mindestlänge von 15 Nucleotiden. Für die Länge gibt es keine obere Grenze, vorzugsweise werden jedoch Fragmente mit einer Länge von 20 bis 5000 Nucleotiden verwendet. Die erfindungsgemäss zu verwendenden Nucleinsäure-Fragmente werden entweder vom zu identifizierenden Genom oder von einem Teil des Genoms abgeleitet, beispielsweise von einem verhältnismässig grossen Clon, der éinen gewissen Teil des Genoms repräsentiert. Die erfindungsgemäss zu verwendenden Reihen von Nucleinsäure-Frag-menten können somit aus verschiedenen unabhängigen genomischen Bereichen hergestellt werden, die nicht direkt benachbart sind. Die so hergestellten Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten werden kombiniert und für dasselbe Reagenz verwendet. Die Reihen von Nulceinsäure-Fragmenten können ebenso aus DNA isoliert werden, die nicht identisch, jedoch ausreichend homolog mit der zu identifizierenden Nucleinsäure ist, so dass stabile Hybride zwischen dem Reagenz und der zu identifizierenden Nucleinsäure gebildet werden. Die Herstellung geeigneter Reihen von Nuclein-säue-Fragmenten ist nicht auf die Isolierung geeigneter Nucleinsäure-Fragmente des Genoms beschränkt. Es gibt viele ebensogut geeignete Verfahren zur Herstellung solcher Reihen von Fragmenten. Der Durchschnittsfachmann kann Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten auch durch synthetische oder semisynthetische Verfahren gewinnen.
Die Reagenzien werden so isoliert, dass mindestens zwei Serien alternierender Nucleinsäure-Fragmente erhalten werden, d.h. ab a2, a3 usw. und b1; b2, b3 usw. Die Nucleinsäure-Frag-mente der Serie aj, a2, a3 usw. bestehen aus Fragmenten, die sehr nahe beieinanderliegen, jedoch nicht direkt benachbart sind. Die Nucleinsäure-Fragmente der Serie bls b2, b3 usw. bestehen ebenfalls aus Nucleinsäure-Fragmenten, die nahe beieinanderliegen, jedoch nicht direkt benachbart sind. Die Nucleinsäure-Fragmente der Serie a,, a2, a3 usw. und die der Serie b1; b2, b3 usw. dürfen nicht miteinander homolog sein. Vorzugsweise werden die Nucleinsäuren der Serie al5 a2, a3 usw. und die der Serie bl5 b2, b3 usw. so isoliert, dass jedes zweite Fragment zur a-Serie und jedes zweite Fragment zur b-Serie gehört (s. Hg. 3). In Hg. 3 sind al5 a2, a3 usw. und bl5 b2, b3 usw. Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten, die ausreichend homolog zur zu identifizierenden Nucleinsäure sind. Wie in Fig. 4 dargestellt, ist es natürlich auch möglich, dass sogar eine dritte Nucleinsäure-Fragment-Serie, cb oj, c3 usw. aus der gleichen Nucleinsäure isoliert wird. Vorzugsweise folgen die alternierenden zwei Nucleinsäure-Reagenzien direkt aufeinander, jedoch ist dies erfindungsgemäss keine notwendige Voraussetzung.
Die vorstehend beschriebene Serie von Nucleinsäue-Fragmenten kann entweder als voneinander getrennte Fragmente ab a2, a3 usw. und bi, b2, b3 usw. (Fig. 5a) oder als miteinander zu längeren Strängen verbundene Fragmente ai-a2-a3 usw. und bi-b2-b3 usw. (Fig. 5b) verwendet werden. Natürlich ist es auch möglich, alle Arten von Zwischenprodukten herzustellen, wie beispielsweise eine a-Serie, in welcher ai ein getrenntes Fragment ist und a2-a3 miteinander verbunden sind sowie solche der b-Serie, bei der beispielsweise bi-b2 miteinander verbunden sind und b3 getrennt vorliegt (Fig. 5c).
In Fig. 6 sind «Sandwich»-Hybride dargestellt, bei denen das Reagenz aus zwei Serien mit je einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten besteht. Fig. 6a zeigt ein «Sandwich»-Hybrid, bei dem die Fragmente in den Reihen getrennt vorliegen. Fig. 6b zeigt ein Hybrid, bei dem die Fragmente der markierten Reihe miteinander verbunden sind. In Fig. 6c ist ein Fall dargestellt, bei dem eine Reihe von «Sandwich»-Hybriden sowohl aus miteinander verbundenen als auch aus voneinander getrennten markierten Fragmenten gebildet wird. In Fig. 6 ist x die zu identifizierende Nucleinsäure; bi, b2 und b3 sind das markierte Sondenmolekül und ah a: und a3 sind die an ein festes Trägermaterial gebundenen Fragmente.
Zur b-Serie gehörende Nucleinsäue-Fragmente können beispielsweise so markiert werden, dass ein Sondenmolekül B als markiertes Nucleinsäure-Reagenz erhalten wird. Die Nucleinsäu-rereihe der a-Serie kann so an ein festes Trägermaterial gebunden werden, dass ein Nucleinsäue-Reagenz A erhalten wird. Umgekehrt ist es natürlich auch möglich ein markiertes Nucleinsäue-Reagenz A herzustellen und das entsprechende Nucleinsäue-Reagenz B an ein festes Trägermaterial zu binden.
Solche Nucleinsäure-Paare A und B oder B und A, die markiert und entsprechend an ein festes Trägermaterial gebunden sind, können für einige verschiedene zu identifizierende Nucleinsäuren hergestellt werden. Sie können in geeigneten Nuclein-säure-Reagenz-Kombinationen miteinander kombiniert werden, die verschiedene Nucleinsäure-Reagenz-Paare Aiund Bi, A2 und B2, A3 und B3 usw. oder Bi und Ab B2 und A2, B3 und Ä3 usw. enthalten. Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten-enthaltende Reagenzien zur Identifizierung verschiedener Nucleinsäuren können auch so kombiniert werden, dass ein Sondenmolekül Ax-Ay-Az erhalten wird, welches beispielsweise eine Reihe von Nuclein-säure-Fragmenten (ai-a2-a3)x-(ai-a2-a3)y-(ai-a2-a3)z enthalten (s. Fig. 7), in welcher aIx, a2x und a3xReihen von Nucleinsäure-Frag-menten Ax sind, die die Nucleinsäure x identifizieren; aiy, a2y und a3y Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten Ay sind, die die Nucleinsäure Ay identifizieren; alz, a2z und a3z Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten Az sind, die die Nucleinsäure z identifizieren und in der v ein aus dem Vektor stammender Nuclein-säure-Bereich ist. Miteinander verbundene Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können natürlich ebenso als getrennte Fragmente in geeigneten Gemischen verwendet werden.
Die in Fig. 8 abgebildeten «Sandwich»-Hybride werden mit den in Fig. 7 abgebildeten Reagenzien erhalten. Wenn gleichzeitig die Identifizierung mehrerer verschiedener Nucleinsäuren beabsichtigt wird, ist es selbstverständlich erforderlich, wie in Fig. 8 abgebildet, verschiedene Filter zu verwenden. Fig. 8a zeigt ein festes Trägermaterial, das die Nucleinsäure x identifiziert, Fig. 8b ein festes Trägermaterial, das die Nucleinsäure y identifiziert und Fig. 8c zeigt ein festes Trägermaterial, das die Nucleinsäure z identifiziert. In den Fig. 8a, 8b und 8c sind blx, b2x und b3x eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist und die die Nucleinsäure x identifiziert; biy, b2y und b3y ist eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist und die die Nucleinsäure y identifiziert; blz, b2z und b3z ist eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist und die die Nucleinsäure z identifiziert und x, y und z sind die zu identifizierenden Nucleinsäuren. Fx, Fy und Fz sind die entsprechenden festen Trägermaterialien oder Filter, Ax-Ay-Az ist ein Sondenmolekül, das gleichzeitig alle drei Nucleinsäuren identifiziert, wenn verschiedene feste Trägermaterialien verwendet werden.
Die vorstehend beschriebenen Nucleinsäure-Fragment-Reihen und -Serien, Reagenzien und Reagenz-Kombinationen können durch an sich bekannte DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellt werden. Eine Reihe unterschiedlich langer Nuclein-säure-Fragmente kann mit Restriktionsenzymen aus der zu identifizierenden Nucleinsäure oder aus einem sie repräsentierenden Bereich ausgeschnitten werden. Wenn die Restriktionskarte des zu identifizierenden Genoms bekannt ist, ist es möglich, aus dem Genom geeignete benachbarte Fragmente auszuwählen. Diese werden mit Restriktionsenzymen ausgeschnitten, isoliert und mit DNA-Rekombinations-Verfahren vermehrt.
Wenn ein unbekanntes Genom untersucht wird, kann ein Zwischenprodukt für die Herstellung der Reagenzien verwendet werden. In diesem Fall wird ein verhältnismässig grosses Restrik-tions-Fragment cloniert, dieses Fragment wird kartiert und die Reihen von Nucleinsäure-Fragment-Serien als a2, a3 usw. und bb b2, b3 usw. werden auf Grundlage der so erhaltenen Information hergestellt.
Es ist natürlich möglich, Kombinationen der vorstehend genannten Methoden einzusetzen und mehrere grosse, voneinan5
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der getrennt clonierte Restriktions-Fragmente als Ausgangsmaterial zu verwenden sowie mehrere getrennte Serien herzustellen, die zu geeigneten Kombinationen zusammengestellt werden.
Erfindungsgemäss werden die Nucleinsäure-Fragment-Serien ai, a2, a3 usw. und bb b2, b3 usw. vorzugsweise mit DNA-Rekom-binations-Yerfahren hergestellt. Dabei wird die Serie a in einem Vektor cloniert, beispielsweise im Plasmid pBR322. Die Serie b dagegen wird in einem anderen geeigneten Vektor cloniert, der keine zum vorstehenden Vektor homologen Sequenzen enthält. Der Bakteriophage Ml3 ist ein B.eispiel eines solchen zweiten geeigneten Vektors. Die Fragmente, die zu dieser Serie gehören, können miteinander verbunden werden und die verbundene Serie kann in einem Vektor cloniert werden. Beispielsweise können at-a2 miteinander verbunden werden und als kontinuierliche Insertion im gleichen Vektor, nämlich in pBR322 cloniert werden. Entsprechend ist es möglich, eine Reagenz-Serie bj-b2 herzustellen. Bei der Clonierung werden vorzugsweise Vektoren verwendet, in die man grosse Fremd-DNA-Insertionen einsetzen kann. Beispielsweise sind für diese Zwecke der X-Phage und Cosmid-Vektoren geeignet.
Es werden also zwei Reagenz-Paare, die eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, bei dem «Sandwich»-Hybri-disierungs-Verfahren der vorliegenden Erfindung benötigt, nämlich ein Reagenz, das mit der zu identifizierenden Markersubstanz markiert ist, d.h. ein Sondenmolekül und ein sogenanntes Filter-Reagenz, das an ein festes Trägermaterial gebunden ist.
Meistens werden radioaktive Isotope zur Markierung der Sondenmoleküle verwendet. Beispielsweise werden in der GB-OS 2 034 323, den US-PSen 4 358 535 und 4 302 204 die folgenden Isotope verwendet: 32P,125J, 131J und 3H. In der EP-A-79 139 wird das Isotop 125J verwendet. Nucleinsäure-Sondenmoleküle wurden auch anderweitig modifiziert und beispielsweise mit Fluo-reszenz-Markierungen versehen (FR-OS 2 518 755). Auch enzy-matische oder enzymatisch messbare Markierungen werden verwendet (GB-OS 2 019 408, EP-A-63 879 und FR-OS 2 519 005). Die EP-A-70 685 und 70 687 beschreiben eine Licht-emittierende Markierung und ein entsprechendes Markierungsverfahren. Die FR-OS 2 518 755 beschreibt eine immunologisch messbare Markierung. Auch Lanthanidchelate (US-PS 4 374 120), insbesondere Europium, können als Markersubstanzen verwendet werden. Ebenso ist die Biotin-Avidin-Markierung geeignet (Leary et al. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80, 4045-4049 [1983]). Neben den vorstehend genannten, erfindungsgemäss verwendbaren Substanzen zur Markierung von Nucleinsäure-Reagenzien können selbstverständlich auch neu entwickelte, verbesserte Markersubstanzen verwendet werden, die ebenso für die erfindungsgemässe Markierung von Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten geeignet sind. Als Trägermaterial für Filter-Reagenzien sind beispielsweise verschiedene Nitrocellulose-Filter geeignet (US-PS 4 358 535 und GB-OS 2 095 833). In der DD-OS 148 955 ist ein Verfahren zur chemischen Bindung von Nucleinsäuren an das Trägermaterial (Papier) beschrieben. In den US-PSen 4 359 535 und 4 302 204 sind chemisch modifizierte Papierarten beschrieben, die als festes Träger-maerial verwendet werden können. Auch Nylonmembranen und modifizierte Nitrocellulose-Filter können verwendet werden. Natürlich können auch in Zukunft entwickelte Materialien, die noch besser als festes Trägermaterial geeignet sind, erfindungsgemäss verwendet werden. Auch andere feste Trägermaterialien wie verschiedene Chromatographie-Matrizen (beispielsweise Triazin-oder Epoxy-aktivierte Cellulose) oder Latex können erfindungsgemäss verwendet werden. Ausser den nachstehend beschriebenen Beschränkungen gibt es grundsätzlich keine weiteren Beschränkungen für die Auswahl des festen Trägermaterials. Es muss möglich sein, die Nucleinsäure in einzelsträngiger Form so an das feste Trägermaterial zu binden, dass diese einzelsträngigen Nucleinsäuren mit der komplementären Nucleinsäure hybridisieren können. Das feste Trägermaterial muss ausserdem leicht aus der Hybridisierungslösung entfernt werden können oder die
Hybridisierungslösung muss leicht vom festen Trägermaterial entfernt werden können. Schliesslich darf das Sondenmolekül nicht am Trägermaterial selbst anhaften, so dass es nicht mehr abgewaschen werden kann.
Aus den vorstehend beschriebenen Kombinationen von Reihen von Nucleinsäure-Reagenz-Paaren A und B oder B und A, entsprechend markiert und an ein festes Trägermaterial gebunden, und aus für die Identifizierung von verschiedenen Nucleinsäuren hergestellten Nucleinsäure-Paaren kann eine Kombination Ax und Bx, Ay und By, Az und Bz zusammengestellt werden. Diese Kombinationen können für die gleichzeitige Identifizierung der Nucleinsäuren x, y und z durch «Sandwich»-Hybridisierungs-Verfahren verwendet werden.
Die Probe wird so behandelt, dass die Nucleinsäuren in die Hybridisierungs-Lösung abgegeben werden und dass diese in einzelsträngiger Form vorliegen. Die Hybridisierung wird in einer Hybridisierungslösung durchgeführt, zu der sowohl die an ein festes Trägermaterial gebundenen Nucleinsäure-Reagenzien als auch die markierten Nucleinsäure-Reagenzien zugegeben werden. Falls Filter als festes Trägermaterial verwendet wurden, werden diese nach der Hybridisierung aus der Hybridisierungslösung entnommen. Wenn Chromatographie-Matrizen, Latex oder ein vergleichbares Material verwendet wurde, wird die Hybridisierungslösung entnommen. Die festen Trägermaterialien werden mit einer geeigneten Waschlösung abgespült. Die Reihen gebildeter «Sandwich»-Hybride (Fig. 8a, 8b, 8c) werden in an sich bekannter Weise nachgewiesen. Beispielsweise wird die radioaktive Markierung durch Autoradiographie, mit einem Szintillations-Zähler oder einem Gamma-Zähler bestimmt. Eine Enzym-Markierung kann beispielsweise nach einer Farbreaktion, photometrisch oder durch Bestimmung eines Niederschlags gemessen werden. Lant-hanid-Chelate können mit dem sogenannten «time resolved fluo-rescence»-Verfahren nachgewiesen werden. Eine immunologische Markierung wird mit geeigneten immunologischen Methoden nachgewiesen.
Einige verschiedene Gemische können als Hybridisierungs-Lösung verwendet werden. Geeignet sind beispielsweise die in der EP-A-79 139 und in der US-PS 4 302 204 genannten. Selbstverständlich können auch andere Hybridisierungs-Gemische verwendet werden. Die Hybridisierung wird bei 0° bis 80 0 C durchgeführt, günstig ist eine Temperatur von 65 ° C. Eine ausreichende Hybridisierung kann schon nach einer sehr kurzen Zeitspanne vorliegen, günstig ist jedoch eine Hybridisierungs-Zeit von etwa 12 bis 20 Stunden.
Das zweistufige «Sandwich»-Hybridisierungs-Verfahren wird an sich genauso durchgeführt, jedoch wird dabei das an das feste Trägermaterial gebundene Nucleinsäure-Reagenz zuerst zur Hybridisierungs-Lösung zugegeben. Wenn die Hybridisierung abgeschlossen ist, wird das feste Trägermaterial gewaschen und eine zweite Hybridisierung wird durchgeführt, bei der das markierte Nucleinsäure-Reagenz verwendet wird.
Die vorstehend beschriebenen markierten Nucleinsäure-Reagenzien oder Reagenz-Kombinationen Ax, Ay, Az usw. und Bx, By, Bz usw. können natürlich auch für direkte Hybridisierungs-Verfah-ren verwendet werden. Dabei muss die in einer Lösung vorliegende Nucleinsäure-Probe für jede zu identifizierende Nucleinsäure x, y und z geteilt werden. Wenn die Probe an ein festes Trägermaterial gebunden ist, muss für jede Probe eine getrennte, an ein Trägermaterial gebundene Probe hergestellt werden. Die gebildete Reihe von Hybriden (Fig. 9) wird mit an sich bekannten Verfahren nachgewiesen. In Fig. 9 ist F das feste Trägermaterial, d.h. der Filter, x die zu identifizierende Nucleinsäure und v kennzeichnet die vom Vektor abgeleiteten Bereiche. Die verwendeten, markierten Sondenmoleküle al5 a2 und a3 (Fig. 9a), bi und b2 (Fig. 9b) und ai, bb a2, b2; a3 (Fig. 9c).
Wie bereits vorstehend beschrieben wurde, können erfindungsgemäss verschiedene Kombinationen von Nucleinsäure-Reagenzien aus den Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten
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6
zusammengestellt werden. Mit diesen Kombinationen ist es möglich, einige verschiedene Nucleinsäuren gleichzeitig zu identifizieren. Die zu den verschiedenen zu identifizierenden Nucleinsäuren homologen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können in den Gemischen als getrennte Fragmente oder als miteinander verbundene Fragmente so verwendet werden, dass ein Sondenmolekül erhalten wird, mit dem einige verschiedene Nucleinsäuren identifiziert werden können. Natürlich müssen an ein festes Trägermaterial gebundene Nucleinsäure-Reagenzien für eine erfolgreiche Identifizierung getrennt aufbewahrt werden.
Die Hybridisierung mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten kann für die Identifizierung verschiedener menschlicher, tierischer oder pflanzlicher pathogener Mikroorganismen verwendet werden. Durch das Verfahren ist es möglich, Nahrungsmittelvergif-tungen-hervorrufende Mikroorganismen in Nahrungsmitteln nachzuweisen, beispielsweise Clostridien, Salmonellen oder Sta-phylococcen. Das Verfahren ist auch für die Identifizierung von Kontaminationen in Wasser, beispielsweise durch Enterobakte-rien oder Enteroviren, geeignet.
Da der «Sandwich»-Hybridisierungs-Test mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten ein quantitatives Verfahren ist, kann es beispielsweise auch für die Bestimmung und die Messung von Genamplifikationen verwendet werden. Dieses Merkmal ist beispielsweise für den Nachweis und die Behandlung von Krebs von Bedeutung. Zur Bildung einer stabilen Reihe von Hybriden sollten die homologen Sequenzen des Sondenmolekül-Reagenz und des Filter-Reagenz im Proben-Strang massig voneinander entfernt sein, vorzugsweise weniger als 5 kb (Kilobasen). Zwischen diesen beiden Bereichen auftretende Entfernungsveränderungen sind mit diesem Verfahren deutlich zu beobachten. Deshalb ist das Verfahren ebenso für den Nachweis veränderter mRNA, von chromosomalen Umlagerungen, von bei Immunglobulin-Genen für die Expression ablaufenden Umlagerungen und von Erbkrankheiten geeignet. Es ist also möglich, verschiedene Reagenz-Kombinationen aus den Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten zu konstruieren. Beispielsweise können für die Identifizierung von Geschlechtskrankheiten-verursachenden Stoffen Analysebestecke hergestellt werden, die ein Sondenmolekül mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, mit denen Gonorrhö, Syphilis, Herpes und Chlamydien nachgewiesen werden können. In diesem Fall ist die Identifizierung durch Verwendung getrennter Filter für Gonorrhö, Syphilis,. Herpes und Chlamydien möglich.
Erfindungsgemäss verwendet man insbesondere Nucleinsäure-Fragmente, die in den rekombinanten Plasmiden pKIH1220 und pKTH1271 enthalten sind. Das rekombinante Plasmid pKTH1220 besteht aus dem Plasmid-Vektor pBR322 und aus DNA von Chlamydia trachomatis L2, die für die Chlamydien spezifisch ist. Dieses rekombinante Plasmid wird in Escherichia coli K12 HB101 cloniert. Das rekombinante Plasmid 1271 enthält im Plasmid-Vektor pBR 325 DNA aus dem Çytome-galovirus AD169. Dieses rekombinante Plasmid wird im Wirt Escherichia coli Kl 2 HB 101 cloniert. Die die rekombinanten Plasmide pKTH1220 und pKTH1271 enthaltenden Wirte wurden bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, am 15. Dezember 1983 hinterlegt. Die Hinterlegungs-Nummer des rekombinanten Plasmids pKTH1220 ist DSM2825 und die Hinterlegungs-Nummer des rekombinanten Plasmids pKTH1271 istDSM2826.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Die Struktur der Nucleinsäuren von Eucaiyoten und Procaiyoten (DNA und RNA) ist ähnlich. Deshalb sind die nachstehenden Beispiele auch mit Nucleinsäuren von Tieren (dazu gehörtin diesem Zusammenhang auch der Mensch), Pflanzen, Mikroorganismen oder Viren ausführbar. Die Reagenzien können also zum Nachweis von Nucleinsäuren des Menschen, von Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen und Viren verwendet werden. Die Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können auch synthetisch hergestellt werden. Die zu identifizierende Nucleinsäure-Sequenz kann bestimmt werden, und homologe Reihen von Fragmenten können mit geeigneten Maschinen automatisch hergestellt werden.
Beispiel 1
a) Reihen von Nucleinsäure-Reagenzien aus Chlamydia trachomatis und ihre Herstellung
Für die Diagnose der Chlamydia trachomatis-Gruppe wurden geeignete DNA-Fragmente aus der DNA von Chlamydia trachomatis Serotyp L2 hergestellt. Die DNA wurde isoliert, in an sich bekannter Weise fragmentiert, die resultierenden DNA-Fragmente wurden im Plasmid pBR322 cloniert und in an sich bekannter Weise in den Wirtsorganismus Escherichia coli K12 HB 101 eingebracht. Das Ergebnis dieses Clonierungsvorgangs war eine Genbank des Bakteriums Chlamydia trachomatis L2, d.h. eine grosse Anzahl rekombinanter Plasmide, die jeweils ein bestimmtes BamHI-Restriktions-Fragment der Chlamydia-DNA tragen. Zur Reagenz-Herstellung wurden aus der Chlamydia-Genbank rekombinante Plasmide mit grösstmöglichen DNA-Insertionen ausgewählt. Eines dieser Plasmide wurde pKTH1220 genannt. Es wurde bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungs-Nummer DSM 2825 hinterlegt. Durch einen direkten Hybridisierungs-Test wurde gezeigt, dass dieses Plasmid als Reagenz geeignet ist. In diesem Test identifizierte pKIH1220 alle aus Chlamydia trachomatis-Serotypen gewonnenen Nucleinsäuren, jedoch keine anderen Nucleinsäuren.
Die verwendbaren Fragmente wurden aus dem Plasmid pKTH1220 mit verschiedenen Restriktions-Enzymen gewonnen. Einige dieser Fragmente wurden im Plasmid pAT153 subcloniert (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratoiy Manual, Cold String Harbor Laboratoiy, S. 6,1982). Andere Fragmente wurden im Phagen M13 subcloniert. Fig. 10 zeigt das rekombinante Plasmid pKIH1220, das eine Länge von 14 kb hat. In Fig. 10 sind BamHI, Sali und Clal die verwendeten Restriktions-Enzyme, und ai, &2, bi, b2 und b3 kennzeichnen die Grösse und die relative Lage zueinander der mit den vorstehend genannten Restriktions-Enzymen gewonnenen Fragmente. Die Fragmente der Serie b sind markierte Sondenmoleküle. In Tabelle 1 sind die Grössen der Fragmente und die für die Subclonierung verwendeten Vektoren die Namen der rekombinanten Plasmide und ihre Anwendung zusammengefasst.
Tabelle 1
Fragment Grösse Vektor Rekombinantes Verwendung
Plasmid al
Clal-Sall
3.0kb pAT153
pKTH1252
Filter a2
Sall-Clal
2.9kb p ATI 53
pKIH1250
Filter bi
Sall-BamHI
0.7kb
M13mp8
mKIH1242
Markier b2
BamHI-Sall
1.4kb
M13mp8
mKTH1239
tes b3
Clal-Clal
1.7kb
M13mp8
mKTH1248
Sonden bi-b2 BamHI-
2.1kb
M13mp8
mKIH1245
molekül
BamHI
Die in Tabelle 1 aufgeführten Fragmente wurden durch Elek-troelution aus einem Agarosegel isoliert und in an sich bekannter Weise in mit geeigneten Restriktions-Enzymen gespaltenen und in Tabelle 1 aufgeführten Vektoren subcloniert.
Das 2,1 kb-BamHI-BamHI-Fragment wurde folgendermas-sen hergestellt: Das 1,4 kb-BamHI-Sall-Fragment und das 0,7 kb-Sall-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pKTH1220 wurden in einem Agarosegel elektrophoretisch getrennt und anschliessend aus dem Gel isoliert. Die gereinigten Fragmente wurden mit T4-Ligase miteinander verbunden. Von den dabei gebildeten 2,lkb-langen DNA-Fragmenten wurden die mit freien BamHI-
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Enden in die BamHI-Restriktions-Spaltstelle doppeisträngiger DNA des Phagen M13mp8 eingebaut. Die auf diese Weise hergestellte rekombinante Phagen-DNA (mKTH1245) enthält also zwei verschiedene DNA-Fragmente von Chlamydia trachomatis, die in dessen Genom nicht benachbart sind. Sie liegen jedoch im 5 Chlamydia trachomatis Genom benachbart zu den DNA-Reagenzien pKIH1250 und pKTH1252, die an den Filter gebunden werden (Fig. 11). Fig. 11 zeigt eine Reihe von «Sandwich»-Hybriden, die entstehen, wenn die in Tabelle 1 aufgeführten rekombinanten Plasmide und rekombinanten Phagen als Reihen von Nuclein- io säure-Reagenzien verwendet werden.
b) Nachweis der Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien aus Chlamydia trachomatis unter Verwendung des «Sandwich»-Hybridisierungs-Verfahrens
Die Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagen- 15 zien, verglichen mit einem einzelnen kontinuierlichen Reagenz-Paar, wurde mit dem «Sandwich»-Hybridisierungs-Verfahren untersucht. Der Test wurde mit Filtern durchgeführt, die jeweils 10uMoleküle sowohl von pKIH1250 (a2)- als auch von pKTH1252 (a^-Einzelstrang-DNA enthielten. Die zu untersu- 20 chende Probe war das Plasmid pKIH1220, welches für den Test durch 5minütiges Erhitzen in 0,17 M NaOH, anschliessendes Abschrecken bei 0 0 C und durch Neutralisierung mit einer äqui-molaren Menge Essigsäure in die Einzelstrangform überführt wurde. Die folgenden mit 125J markierten und in Tabelle 1 aufge- 25 führten Sondenmoleküle wurden bei den Tests verwendet: mKTH1242(bi), mKIH1239(b2), mKIH1248(b3) und mKTH1245(b(-b2).
Die Hybridisierung wurde 17 Stunden bei + 65 0 C in einer Hybridisierungs-Lösung der folgenden Zusammensetzung durch- 30 geführt: 4 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% SDS und 200 ng/ml Hering-Spermien DNA. Die Filter wurden 2 Stunden bei 50 °C mit einer Waschlösung der folgenden Zusammensetzung gewaschen: 0,1 x SSC, 0,2% SDS. Anschliessend wurden sie in einem Gamma-Zähler gezählt. Die Ergebnisse sind 35 in Tabelle 2 zusammengefasst und sind jeweils der Mittelwert von fünf Parallelversuchen.
Tabelle 2 4
Probe Hybridisierte Radioaktivität mit (b) als Sondenmolekül
Moleküle/Test bi b2 b3 bi, b2 (bi-b2) (bi-b2), b3
0
37 37 33
49
39
52
106
48 44 48
93
68
140
107
226 236 232
396
416
686
108
1475 1415 1456
2912
2637
3580
bi
380,000 cpm/Test;
5 x
107 cpm/ugDNA
b2
340,000 cpm/Test;
4x
107 cpm/jigDNA
b3
350,000 cpm/Test;
5 x
107 cpm/jigDNA
bj-b2
310,000 cpm/Test;
7 x
107 cpm/(igDNA
bi, b2
700,000 cpm/Test;
(bi—b2), b3
700,000 cpm/Test;
Bei der statistischen Berechnung wurden 95% der ohne Probe durchgeführen Tests (= negative Kontrollen) als untere Grenze für eine positive Reaktion gewertet. Diese Werte waren 52-54 cpm, wenn das Sondenmolekül bi, b2 oder b3 war, 58 cpm, wenn das Sondenmolekül bi oder b2 war, 56 cpm, wenn das Sondenmolekül bi-b2 war und 65 cpm, wenn das Sondenmolekül bi-b2, b3 war.
c) Diagnose von Chlamydia durch «Sandwich»-Hybridisie-rung mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten
Von drei an Urethritis leidenden Männern sowie von drei an Cervicitis leidenden Frauen wurden Proben für den Test genommen. Aus Urethra der Männer und Cervix der Frauen wurde Chlamydia trachomatis isoliert. Zusätzlich wurde eine Reihe von
ähnlichen Proben aus Patienten untersucht, aus denen Chlamydia nicht isoliert wurde. Die zu untersuchenden Proben wurden mit Wattestäbchen genommen, die in einen Chlamydia-Probenauf-nahme-Puffer eingetaucht waren, der 0,2 M Saccharose, 20 mM Phosphatpuffer, 3% fötales Kälberserum, 10 ug/ml Gentamicin, 100 (ig/ml Vancomycin und 25 IU/ml Nystatin enthielt.
Aus den Proben wurde Chlamydia gezüchtet. Die ursprünglichen Proben wurden ausserdem durch «Sandwich»-Hybridisie-rung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten untersucht. Die Proben wurden mit 2-Butanol konzentriert. Dabei wurde soviel Flüssigkeit entfernt, dass das Endvolumen 80 ul betrug und die Proben damit drei- bis siebenfach konzentriert waren. Danach wurde den Proben 70 mM EDTA, 0,7% SDS, 200 [ig/ml Proteinase K zugesetzt und sie wurden 15 Minuten bei 5 5 0 C und 45 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Proben wurden dann 5 Minuten in 0,175 M NaOH gekocht. Die gekochten Proben wurden bei 0 0 C abgeschreckt, mit einer äquimolaren Menge Essigsäure neutralisiert und getestet. Die in Beispiel lb) beschriebenen Filter und Hybridisierungs-Bedingungen wurden bei diesem Test verwendet. Das bei der Hybridisierungs-Reaktion verwendete Sondenmolekül war mKIH1245 (bj-b2) mit einer Radioaktivität von 300 000 cpm/400 [xl. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3
45
Probe
Hybridisierte
Ergebnis der
Radioaktivität
Chlamydia-Kultur
Männl. Probant
1.
151
+
2.
164
+
3.
154
+
4.
61
—
5.
76
—
6.
55
—
Weibl. Probant
1.
343
+
2.
509
+
3.
362
+
4.
57
—
5.
58
—
6.
81
—
Puffer, x4
30-55
Chi. trachomatis
L2 Bakterium, 106
419
+
Die Grenze für die positive Beurteilung des Tests war 104 cpm.
Die Ergebnisse aus Tabelle 3 zeigen, dass die «Sand-wich»-Hybridisierung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten für die Diagnose von Geschlechtskrankheiten geeignet ist. Proben mit negativem Ergebnis beim Kultur-Test zeigten auch bei 55 der «Sandwich»-Hybridisierung ein negatives Ergebnis.
Beispiel 2
a) Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien des Cytomegalovirus und ihre Herstellung 60 Für die Diagnose des Cytomegalovirus geeignete DNA-Fragmente wurden aus dem Cytomegalovirus (AD 169, ATCC VR-538)-(CMV) hergestellt. Die DNA wurde isoliert und in an sich bekannter Weise fragmentiert. Das etwa 9 kb lange EcoRI-Fragment I (definiert von Spector et al., J. virol. 42, 558-582 [1982]) 65 wurde nach der Grössentrennung der EcoRI-Restriktions-Frag-mente auf einem Agarosegel durch Elektroelution isoliert. Die eluierte DNA wurde mit Phenol extrahiert und anschliessend mit Äthanol gefällt. Die so gereinigte DNA wurde mitT4-Ligase in
671 778
mit dem Enzym EcoRI-gespaltene DNA des Plasmids pBR325 iigiert. Die erhaltene rekombinante DNA wurde in E. coli K12HB101 überfuhrt. Aus den Ampicillin- und Tetracyclin-resistenten Jedoch Chloramphenicol-sensitiven Clonen wurde ein Glon mit einer Cytomegalovirus-DNA-Insertion der richtigen Grösse ausgewählt. Die Identität der Cytomegalovirus-DNA vvurde durch einen Southern blot bestätigt. Der Test zeigte, dass das beschriebene 9 kb-EcoRI-Fragment aus dem HindIII-D-Fragment der Cytomegalovirus-DNA stammt (Oram et al., J.Gen.Virol. 59, 111-129 [1982]). Das genannte rekombinante Plasmid wurde als pKIH1271 bezeichnet und bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungs-Nummer DSM 2826 hinterlegt. Das rekombinante Plasmid wurde in an sich bekannter Weise vermehrt und gereinigt.
Weitere Clonierungsschritte wurden in an sich bekannter Weise unter Verwendung des Plasmids pBR322 und der Phagen M13mp7 und M13mp8 durchgeführt. Fig. 12 zeigt das hybride Plasmid pKTH1271 mit einer Länge von etwa 9 kb. Die in Fig. 12 gezeigte Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI, Clal und Pstl hergestellt. Fig. 12 zeigt die mit Restriktions-Enzymen erhaltenen Fragmente und ihre relative Lage und Grösse. In Tabelle 4 sind die Grössen der in Frage kommenden Fragmente und die für ihre Subclonie-rung verwendeten Vektoren, die Bezeichnung der so erhaltenen Plasmide und ihre Verwendung entweder als Filter-Reagenzien oder als markierte Sondenmoleküle aufgeführt. Fig. 13 zeigt eine Reihe von «Sandwich»-Hybriden, die gebildet wird, wenn die in Tabelle 4 aufgeführte Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten verwendet wird.
Tabelle 4
Restriktions-Fragment
Vektor
Bezeichnung
Verwendung ai
EcoRI-Pstl
(3.3 kb)
pBR322
pKTH1273
Filter
3.T
Clal-BamHI
(3.0 kb)
pBR322
pKTF1274
Filter bi
Pstl-Pstl
(0.6 kb)
M13mp7
mKTH1277
Markiertes b2
Pstl-Clal
(1.0 kb)
M13mp8
mKTH1278
Sonden b3
BamHI-
(1.0 kb)
M13mp8
mKTH1279
molekül
EcoRI
b) Nachweis der Empfindlichkeit einer Reihe von Nuclein-säure-Reagenzien des Cytomegalovirus mit dem «Sandwich» - Hybridisierungs-Verfahren
Die Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäue-Reagenzien im Verhältnis zur Empfindlichkeit eines Paares kontinuierlicher Reagenzien wurde mit dem «Sandwich»-Hybridisierungs-Verfahren untersucht. Die Proben mit den Tests waren CMV-DNA, die in 0,17 M NaOH 5 Minuten gekocht wurde und anschliessend gemäss Beispiel 1 b) neutralisiert wurde. Die Filter enthielten alle 10uMoleküle sowohl von pKIH1273(ai)-DNA als auch von pKTH1274(a2)-DNA, die in die einzelsträngige Form überführt worden war. Die folgenden mit 125J markierten, in Tabelle 4 aufgeführten Sondenmoleküle wurden verwendet: m 10111277^!), mKTH1278(b2) und mKIH1279(b3). Die Proben enthielten jeweils 108cpm/|ig DNA. Die Hybridisierung wurde wie in Beispiel 1 b) beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Tabelle 5
Proben Hybridisierte Radioaktivität (b)
Moleküle/Test b2 b3 b1; b2 bj, b2, b3
0
35 33 38 45
53
106
38 44 46 95
125
4xl06
85 135 142 205
292
1.6 x 107
203 254 265 415
645
bi
310.000 cpm/Test
b2
320.000 cpm/Test
b3
300.000 cpm/Test
bi, b2
300.000 cpm bei jedem Test
bi, b2, b3
300.000 cpm bei jedem Test
Die untere Grenze für eine positive Beurteilung des Testergebnisses waren 51-55 cpm, wenn das Sondenmolekül bj, b2 oder b3 war, 59 cpm, wenn das Sondenmolekül bj oder b2 war und 63 cpm, wenn das Sondenmolekül bi, b2 oder b3 war.
Die in Tabelle 5 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass bei einer «Sandwich»-Hybridisierung mit einem einzelnen Sondenmolekül-Reagenz (bi, b2 oder b3) jeweils 4 x 106 CMV-DNA-Moleküle nachgewiesen werden. Andererseits werden bei einer Hybridisierung mit einem Reagenz aus bh b2 oder bi, b2, b3 nur 106 Moleküle CMV-DNA nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien viermal empfindlicher ist als ein einzelnes Nucleinsäure-Reagenz.
c) CMV-Diagnose durch «Sandwich»-Hybridisierung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien
Klinische Proben wurden durch «Sandwich»-Hybridisierung mit einer Reihe von Reagenzien untersucht. Zu diesen Proben gehören auch zwei Urinproben von Kindern mit einem Alter von weniger als einem Jahr. Es wurde angenommen, dass diese Kinder an der congenitalen Cytomegalovirus-Erkrankung leiden.
Eine Lungenbiopsie-Probe aus einem Patienten mit einer CMV-Pulmonar-Infektion wurde ebenso mit der «Sandwich»-Hybridi-sierung untersucht. Sowohl Çytomegalovirus-infizierte als auch nicht-infizierte fötale menschliche Zellen wurden als Proben beim Test verwendet.
Zu 10 ml einer Urin-Probe wurde eine Lösung mit 1% Sarco-syl und 5 mM EDTA sowie 200 ug Kalbsthymus-DNA zugegeben. Dadurch wird die Virus-DNA freigesetzt. Durch Zugabe von 10 ml Isopropanol bei Raumtemperatur wird die DNA zusammen mit dem «carrier» (Kalbsthymus-DNA) ausgefallt. Der DNA-Niederschlag wurde in 200 p.1 TE-Puffer gelöst. Die DNA wurde dann durch 5minütiges Kochen und Abschrecken bei 0 °C in die Einzelstrangform überführt und zur Hybridisierungs-Lösung zugegeben.
Die Lungenbiopsie-Probe (einige mm3) wurde mit einem Messer zerkleinert und 200 |il TE-Puffer mit 1% SDS und 1 mg/ml Proteinase K wurden zugegeben. Bei +37 °C wurde der Abbau 1 Stunde durchgeführt, und die Probe wurde anschliessend zweimal in eine Injektions-Spritze mit einer dünnen Hypo-dermis-Nadel aufgezogen. Die so homogenisierte Probe wurde gekocht und anschliessend zur Test-Lösung zugegeben.
Die mit Cytomegalovirus infizierten Zellen und die nichtinfi-zierten Zellen wurden wie vorstehend beschrieben durch SDS, Proteinase K-Behandlung, Homogenisierung und Kochen aufgeschlossen.
Als Filter-Reagenzien wurden beim Hybridisierungs-Test pKTH1273(a1) und pKTH1274(ai) und als Sondenmoleküle mKTH1277(bi)J mKTH1278(b2) und mKIH1279(b3) mit jeweils 200.000 cpm/Reaktion verwendet. Ansonsten wurde die Hybridisierung, das Waschen der Filter und das Auswerten der Ergebnisse wie vorstehend in Beispiel 1 b) beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse der vorliegenden Hybridisierung sind in Tabelle 6 aufgeführt.
8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
9
671 778
Tabelle 6
Hybridisierte Virus-Isolat
Probe Radioaktivität
Infizierte Zellen (105) 3521 nicht ermittelt
Urin 1 (10 ml) 243 CMV
Urin 2 (10 ml) 3215 CMV Urin einer gesunden
Testperson (10 ml) 52 nicht ermittelt
Lungenbiopsie-Probe 535 CMV
Kontrollzellen (105) 68 nicht ermittelt
Keine Probe 65 nicht ermittelt
Die in Tabelle 6 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, mit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien CMV in verschiedenen klinischen Proben wie Urin, Lungenbiopsie-Pro-' ben und in Zellen nachzuweisen.
s Der Test ist für Cytomegalovirus spezifisch. Er identifiziert keine menschliche DNA, d.h. der Test zeigt keine Interferenzen mit der in der Probe vorhandenen menschlichen DNA. Die Art der Probe spielt überhaupt keine Rolle für die Spezifität des Tests.
Q
4 Blatt Zeichnungen

Claims (11)

  1. 671778
    2
    PATENTANSPRÜCHE
    1. Hybridisierungsverfahren zur Identifizierung von Nuclein-säuren, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Probe mit mindestens einem Reagens umsetzt, das mindestens einen, zu alternierenden Bereichen der zu identifizierenden Nucleinsäure genügend homologen Satz nicht miteinander hybridisierender Nucleinsäurefragmente mit einer Mindestlänge von 15 Nucleoti-den enthält, welcher Satz sich aus a) einzelnen oder b) untereinander verbundenen oder c) sowohl aus einzelnen als auch aus miteinander verbundenen Fragmenten zusammensetzt,
    so dass stabile Hybride entstehen.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine Kombination von Nucleinsäure-Fragmenten verwendet, die Nucleinsäurefragmente enthält, die a) von Vektoren abgeleitete Teile haben oder b) keine von Vektoren abgeleiteten Teile haben.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der verwendeten Kombinationen von Nucleinsäurefragmenten markierte Nucleinsäure-Fragmente aufweist
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der verwendeten Kombinationen von Nucleinsäurefragmenten an ein festes Trägermaterial gebundene Nucleinsäure-Fragmente aufweist.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Nucleinsäurefragmente verwendet, die das rekombinante Plasmid pKIH1220 DSM 2825 aufweisen, das die DNA des Bakteriums Chlamydia trachomatis L2 enthält.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Nucleinsäurefragmente verwendet, die das rekombinante Plasmid pKIH1271 DSM 2826 aufweisen, das die DNA des Çytomegalovirus AD 169 enthält.
  7. 7. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 auf Kombinationen von Nucleinsäurefragmenten, von denen man mindestens eine a) mit DNA-Rekombinations-Verfahren oder b) auf synthetischem Wege oder c) auf semisynthetischem Wege herstellt
  8. 8. Anwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt:
    a) Isolierung einer ausgewählten Nucleinsäure mit geeigneter Länge,
    b) Clonierung der ausgewählten Nucleinsäure in einen geeigneten Vektor,
    c) Fragmentierung der Nucleinsäure mit Restriktions-Enzy-men,
    d) Zuordnung von nicht miteinander hybridisierenden Fragmenten zu verschiedenen Kombinationen von Fragmenten, wobei ' die Fragmente gegebenenfalls kovalent miteinander verbunden werden,
    e) gegebenenfalls Zuordnimg geeigneter Kombinationen von Fragmenten zu Sätzen, wobei die Kombinationen gegebenenfalls kovalent miteinander verbunden werden,
    f) Subclonierung der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen, einer Kombination zugeordneten Fragmente oder der miteinander verbundenen, einem Satz zugeordneten Kombinationen von Fragmenten in geeignete Vektoren, wobei Fragmente oder Kombinationen von Fragmenten, die verschiedenen Sätzen angehören, vorzugsweise in verschiedenen, nicht miteinander hybridisierenden Vektoren subcloniert werden,
    g) gegebenenfalls Bindimg der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen Fragmente einer Kombination oder eines Satzes an ein festes Trägermaterial, und h) Markierung der getrennt vorliegenden oder miteinander veibundenen Fragmente einer anderen Kombination oder eines anderen Satzes.
  9. 9. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Identifizierung von Nucleinsäuren in diagnostischen Hybridisierungs-Verfahren.
  10. 10. Anwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur Identifizierung mehrerer vrschiedener Nucleinsäuren geeignete Kombinationen von Nucleinsäure-Reagenzien aus Kombinationen von Nucleinsäure-Fragmenten zusammengestellt werden, die ausreichend homolog zu diesen verschiedenen Nucleinsäuren sind.
  11. 11. Anwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung als diagnostisches «Sand-wich»-Hybridisierungs-Verfahren durchgeführt wird.
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